Высокоэффективная генерация антигена-специфических первичных мышей цитотоксических Т-клеток для функционального тестирования в модели аутоиммунного диабета
Summary
Эта статья описывает протокол для поколения антиген-специфических CD8 T-клеток, и их расширение в пробирке, с целью приносить большое количество функциональных Т-клеток для использования in vitro и in vivo.
Abstract
Диабет типа 1 (T1D) характеризуется аутоиммунным газолетами, ведущим к разрушению бета-клеток и абсолютной потере производства инсулина. В спонтанной не-ожирения диабета (NOD) мыши модели, инсулин является основной целью, и генетические манипуляции этих животных, чтобы удалить один ключевой эпитоп инсулина предотвращает болезнь. Таким образом, селективная ликвидация профессиональных антигенов, представляющих клетки (АПК), несущие этот патогенный эпитоп является подход омрачать нежелательные инсулин-специфические аутоиммунные реакции, и, вероятно, имеет больший трансляционный потенциал.
Химерные рецепторы антигена (ЦАР) могут перенаправлять Т-клетки на выборочно еле-причиняемые болезни антигены. Этот метод имеет основополагающее значение для недавних попыток использовать клеточной инженерии для приемной клеточной терапии для лечения нескольких видов рака. В этом протоколе мы описываем оптимизированный ретровирус Т-клеток (РВ) трансдукции и протокол расширения in vitro, который генерирует большое количество функциональных антиген-специфических клеток CD8 CAR-T, начиная с низкого числа наивных клеток. Ранее было описано несколько протоколов CAR-T-клеток, но, как правило, с относительно низкой эффективностью трансдукции и жизнеспособностью клеток после трансдукции. В отличие от этого, наш протокол обеспечивает до 90% эффективности трансдукции, и клетки могут выжить более двух недель in vivo и значительно задержать начало болезни после одного вливания. Мы предоставляем подробное описание протокола обслуживания клеток и трансдукции, так что критические шаги могут быть легко выполнены. Вся процедура от первичной изоляции клеток до экспрессии ЦАР может быть выполнена в течение 14 дней. Общий метод может быть применен к любой модели болезни мыши, в которой цель известна. Аналогичным образом, конкретное применение (таргетинг патогенного пептида/MHC класса II комплекса) применимо к любой другой модели аутоиммунных заболеваний, для которых был определен ключевой комплекс.
Introduction
Учитывая вероятный снижение риска нежелательных вне цели эффекты, антиген-специфические иммунные терапии (АСИ) являются перспективными лечения аутоиммунных заболеваний, таких как T1D. Накопление доказательств свидетельствует о том, что иммунные реакции на (препро) инсулин может быть особенно важно в T1D1. В последнее десятилетие, исследования из нескольких групп, в том числе наших собственных, настоятельно рекомендуем, что представление эпитопа, содержащего аминокислоты цепи инсулина B 9 до 23 конкретными молекулами класса MHC II (B:9-23/MHCII), играет важную роль в развитии T1D в мышейи людей 2,3,4,5. Чтобы избирательно нацелиться на комплекс B:9-23/MHCII, мы создали моноклонированное антитело, названное mAb287, которое не имеет перекрестной реактивности гормона инсулина или комплексов, содержащих другие пептиды6. MAb287 блокирует антиген презентации в пробирке, и еженедельное введение mAb287 до диабетических НОД мышей задержали развитие T1D в 35% обработанных мышей6. Чтобы блокировать антиген презентации in vivo, частые инъекции, как правило, требуется для того, чтобы поддерживать высокую концентрацию циркулирующих. Мы предположили, что мы могли бы преодолеть эту трудность, воспользовавшись высокой специфичностью Ab287 перепрограммировать Т-клетки, тем самым обеспечивая улучшенную антиген-специфическую Т-клеточную терапию для T1D7.
Цитотоксические Т-клетки, как сообщается, быть в состоянии убить своюцель, если даже одна копия их коньяк лиганд выражается 8,9,10. Таким образом, B:9-23/MHCII конкретных CD8 Т-клеток, как ожидается, имеют более высокую эффективность в устранении нежелательных антигена презентации, чем родительское антитело, которое, вероятно, необходимо привязать к нескольким комплексам на том же APC, чтобы оказать его эффект. CAR Т-клетки были использованы для лечения нескольких раковых заболеваний человека11,12,13, а также может быть эффективным в аутоиммунных14. Однако, CAR-T-клетки со специфичностью для патогенных пептид-MHC комплексов до сих пор не были использованы для изменения прогрессирования T1D. С помощью оптимизированной cd8 T-клеточной техники трансдукции, описанной ниже, мы недавно продемонстрировали доказательство принципа, что это действительно представляет собой жизнеспособный подход7.
В этом протоколе мы излагаем эффективный и рационализированный метод трансдукции и расширения. Наш протокол применим к другим исследованиям, требующим генерации мыши CD8 CAR T-ячеек с высокой эффективностью.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает эффективный метод для производства антиген-специфических клеток CD8 CAR-T путем ретровирусной трансдукции. Эффективность трансдукции нашего протокола, как правило, высока, и надежное выражение ЦАР, как правило, наблюдается. Расширенные Т-клетки CAR сохраняют основн…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано JDRF гранты 1-INO-2015-74-S-B, 2-SRA-2016-238-S-B, и SRA-2-S-2018-648-S-B, Диабет образования и действий премии, и Каролин Wiess юридический фонд для исследований в молекулярной медицине в Baylor колледж медицины. Сортировка клеток была поддержана Цитометрией и ядром сортировки клеток в Медицинском колледже Бейлора с финансированием из NIH (S10RR024574 и P30CA125123). Все тетрамеры пептида-MHC были получены из основного фонда NIH Tetramer.
Materials
| 2-Mercaptoethanol (50mM) | Gibco | 21985-023 | 50 uM |
| 5’ RACE PCR | Clontech | 634859 | |
| anti-mouse CD28 antibodies | eBioscience | 14-0281-86 | final concentration at 1µg/ml |
| anti-mouse CD3e antibody | eBioscience | 145-2C11 | final concentration at 1µg/ml |
| Biotin Rat Anti-Mouse IFN-γ | BD Biosciences | 554410 | Working concentration at 0.5 µg/ml |
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Endo-free Maxi-Prep kit | Qiagen | 12362 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | Final 50 µg/ml. |
| Heat inactivated FCS | Hyclone | SH30087.03 | Final 10% FCS |
| HEPES (100X) | Gibco | 15630-080 | 1X |
| IAg7-CLIP tetramer-BV421 | NIH tetramer Facility at Emory | per approval | Working concentration at 6 µg/ml |
| IAg7-insulin P8E tetramer-BV421 | NIH tetramer Facility at Emory | per approval | Working concentration at 6 µg/ml |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS 100x) | ThermoFisher | 51500056 | Final concentraion is 1x |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Separation Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit | Miletenyi Biotec Inc | 130-104-075 | |
| Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit | Miltenyi Biotec | 130-104-075 | |
| Opti-MEM medium | ThermoFisher | 31985070 | |
| Penicillin-Streptomycin (5000U/ml) | ThermoFisher | 15070063 | 50 U/ml |
| Phoenix-ECO cells | ATCC | CRL-3214 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| pMIG II | Addgene | 52107 | |
| pMSCV-IRES-GFP II | Addgene | 52107 | |
| Purified Rat Anti-Mouse IFN-γ | BD Biosciences | 551216 | Working concentration at 3 µg/ml |
| Red cell lysis buffer | Sigma | R7767 | |
| RetroNectin | Takara | T100A | Working concentration at 50 µg/ml in PBS |
| rhIL-2 (stock concentration 105 IU/ul) | Peprotech | 200-02 | Final concentration at 200 IU/ml |
| rmIL-7 ( stock concentration 50ng/ul) | R&D | 407-ML-005 | Final concentration at 0.5ng/ml |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Sterile Cell Strainers | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Tryple | Gibco | 12605-028 |
References
- Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. Type 1 Diabetes. Lancet. 383, 69-82 (2014).
- Bankovich, A. J., Girvin, A. T., Moesta, A. K., Garcia, K. C. Peptide register shifting within the MHC groove: theory becomes reality. Molecular Immunology. 40 (14-15), 1033-1039 (2004).
- Nakayama, M., et al. Prime role for an insulin epitope in the development of type 1 diabetes in NOD mice. Nature. 435, 220-223 (2005).
- Crawford, F., et al. Specificity and detection of insulin-reactive CD4+ T cells in type 1 diabetes in the nonobese diabetic (NOD) mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 16729-16734 (2011).
- Stadinski, B. D., et al. Diabetogenic T cells recognize insulin bound to IAg7 in an unexpected, weak binding register. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10978-10983 (2010).
- Zhang, L., et al. Monoclonal antibody blocking the recognition of an insulin peptide-MHC complex modulates type 1 diabetes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2656-2661 (2014).
- Zhang, L., et al. Chimeric antigen receptor (CAR) T cells targeting a pathogenic MHC class II:peptide complex modulate the progression of autoimmune diabetes. Journal of Autoimmunity. 96, 50-58 (2019).
- Purbhoo, M. A., Irvine, D. J., Huppa, J. B., Davis, M. M. T cell killing does not require the formation of a stable mature immunological synapse. Nature Immunology. 5, 524-530 (2004).
- Huppa, J. B., Davis, M. M. T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nature Reviews. Immunology. 3, 973-983 (2003).
- Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. Direct observation of ligand recognition by T cells. Nature. 419, 845-849 (2002).
- Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. Chimeric antigen receptor therapy for cancer. Annual Review of Medicine. 65, 333-347 (2014).
- Kochenderfer, J. N., Yu, Z., Frasheri, D., Restifo, N. P., Rosenberg, S. A. Adoptive transfer of syngeneic T cells transduced with a chimeric antigen receptor that recognizes murine CD19 can eradicate lymphoma and normal B cells. Blood. 116, 3875-3886 (2010).
- Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors. Nature Reviews Clinical Oncology. 10, 267-276 (2013).
- Fishman, S., et al. Adoptive Transfer of mRNA-Transfected T Cells Redirected against Diabetogenic CD8 T Cells Can Prevent Diabetes. Molecular Therapy. 25 (2), 456-464 (2017).
- Maniatis, T. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (1982).
- Holst, J., et al. Generation of T-cell receptor retrogenic mice. Nature Protocols. 1 (1), 406-417 (2006).
- Johnstone, A., Thorpe, R. . Immunochemistry in practice. , (1996).
- Rowland-Jones, S. L., McMichael, A. J. . Lymphocytes: a practical approach. , (2000).
- Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8392-8396 (1993).
- Sena-Esteves, M., Saeki, Y., Camp, S. M., Chiocca, E. A., Breakefield, X. O. Single-step conversion of cells to retrovirus vector producers with herpes simplex virus-Epstein-Barr virus hybrid amplicons. Journal of Virology. 73 (12), 10426-10439 (1999).
- Carrero, J. A., Calderon, B., Towfic, F., Artyomov, M. N., Unanue, E. R. Defining the transcriptional and cellular landscape of type 1 diabetes in the NOD mouse. PLoS One. 8 (3), e59701 (2013).
- Jansen, A., et al. Immunohistochemical characterization of monocytes-macrophages and dendritic cells involved in the initiation of the insulitis and beta-cell destruction in NOD mice. Diabetes. 43 (5), 667-675 (1994).
- Corbett, A. J., et al. T-cell activation by transitory neo-antigens derived from distinct microbial pathways. Nature. 509 (7500), 361-365 (2014).
- Griffith, I. J., et al. Structural mutation affecting intracellular transport and cell surface expression of murine class II molecules. Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 541-555 (1988).
- Kozono, H., White, J., Clements, J., Marrack, P., Kappler, J. Production of soluble MHC class II proteins with covalently bound single peptides. Nature. 369 (6476), 151-154 (1994).
- Allicotti, G., Borras, E., Pinilla, C. A time-resolved fluorescence immunoassay (DELFIA) increases the sensitivity of antigen-driven cytokine detection. Journal of Immunoassay & Immunochemistry. 24 (4), 345-358 (2003).
