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Immunology and Infection

Geração de alta eficiência de células T Cytotoxic do rato preliminar antígeno-específico para o teste funcional em um modelo auto-imune do diabetes

Published: August 16, 2019 doi: 10.3791/59985
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 3, 1, 2
1Barbara Davis Center for Childhood Diabetes, University of Colorado Denver, 2Department of Medicine, Endocrinology, Diabetes & Metabolism, Baylor College of Medicine, 3Scientific Center, Shandong Provincial Hospital affiliated to Shandong University

Summary

Este artigo descreve um protocolo para a geração de pilhas CD8 T antígeno-específicas, e sua expansão in vitro, com o objetivo de render números elevados de pilhas de T funcionais para o uso in vitro e in vivo.

Abstract

O diabetes tipo 1 (T1D) é caracterizado por autoimunidade específica de Islet, levando à destruição de células beta e perda absoluta da produção de insulina. No modelo espontâneo do rato do diabetes não-obeso (nod), o insulin é o alvo preliminar, e a manipulação genética destes animais para remover um único epítopo mapeado chave da insulina impede a doença. Assim, a eliminação seletiva de pilhas de apresentação do antígeno profissional (APCs) que carregam este epítopo patogénico é uma aproximação para inibir as respostas auto-imunes insulin-específicas indesejadas, e tem provavelmente o maior potencial translacional.

Os receptores de antígeno Quimérico (CARs) podem redirecionar as células T para segmentar seletivamente antígenos causadores de doenças. Esta técnica é fundamental para tentativas recentes de usar a engenharia celular para terapia celular adotiva para tratar vários cânceres. Neste protocolo, nós descrevemos uma transdução aperfeiçoada do retrovírus de célula T (RV) e o protocolo in vitro da expansão que gera números elevados de pilhas CD8 antígeno-específicas funcionais do Car-T que partem de um baixo número de pilhas ingênuas. Os protocolos previamente múltiplos da pilha de CAR-T foram descritos, mas tipicamente com eficiência relativamente baixa da transdução e viabilidade da pilha depois da transdução. Em contrapartida, nosso protocolo fornece até 90% de eficiência de transdução, e as células geradas podem sobreviver mais de duas semanas in vivo e atrasar significativamente o início da doença após uma única infusão. Nós fornecemos uma descrição detalhada do protocolo da manutenção e da transdução da pilha, de modo que as etapas críticas possam facilmente ser seguidas. Todo o procedimento do isolamento da célula primária para a expressão CAR pode ser realizado dentro de 14 dias. O método geral pode ser aplicado a qualquer modelo de doença do mouse no qual o alvo é conhecido. Da mesma forma, a aplicação específica (visando um complexo de peptídeo patogênico/MHC classe II) é aplicável a qualquer outro modelo de doença auto-imune para o qual um complexo-chave foi identificado.

Introduction

Dado o provável risco reduzido de efeitos indesejados fora do alvo, as terapias imunes antígeno-específicas (ASI) são tratamentos prometedores para doenças auto-imunes tais como T1D. Evidências acumulantes sugerem que as respostas imunes à insulina (prepro) podem ser particularmente importantes na T1D1. Na última década, estudos de vários grupos, incluindo os nossos, sugerem fortemente que a apresentação de um epítopo contendo aminoácidos de cadeia de insulina B 9 a 23 por moléculas específicas de classe II de MHC (B: 9-23/MHCII), desempenha um papel importante no desenvolvimento de T1D em camundongos e humanos2,3,4,5. Para segmentar seletivamente o complexo B: 9-23/MHCII, geramos um anticorpo monoclonal, denominado mAb287, que não tem reatividade cruzada para a insulina hormonal ou complexos contendo outros peptídeos6. MAb287 bloqueia a apresentação do antígeno in vitro, e a administração semanal de mAb287 a camundongos NOD pré-diabéticos atrasou o desenvolvimento de T1D em 35% dos camundongos tratados6. Para obstruir a apresentação do antígeno in vivo, as injeções freqüentes são exigidas tipicamente a fim manter uma concentração de circulação elevada. Nós supor que nós poderíamos superar esta dificuldade tirando proveito da especificidade elevada de Ab287 para reprogramar pilhas de T, assim fornecendo uma terapia antígeno-específica melhorada da pilha de T para T1D7.

As células T citotóxicas são relatadas para serem capazes de matar seu alvo se até mesmo uma única cópia de seu ligante cognato é expressa8,9,10. Assim, B: as pilhas CD8 T específicas de 9-23/MHCII são esperadas ter uma eficiência mais elevada em eliminar a apresentação indesejada do antígeno do que o anticorpo do pai, que precisará provavelmente de ligar aos complexos múltiplos no mesmo APC para exercer seu efeito. As pilhas de T do carro foram usadas tratando cancros humanos múltiplos11,12,13, e podem igualmente ser eficaz na autoimunidade14. No entanto, as células CAR-T com especificidade para complexos peptídeos-MHC patogênicos ainda não foram utilizadas para modificar a progressão da T1D. Ao usar a técnica de transdução de células T CD8 otimizada descrita abaixo, demonstramos recentemente uma prova de princípio de que isso representa, de fato, uma abordagem viável7.

Neste protocolo, nós esboçamos um método eficiente e aerodinamizado da transdução e da expansão. Nosso protocolo é aplicável a outros estudos que exigem a geração de pilhas CD8 do carro T do rato com eficiência elevada.

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Protocol

Os camundongos foram mantidos condições específicas livres de patógenos em uma instalação do rato transgênico, e todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê de cuidados e uso de animais da faculdade de medicina Baylor.

Observação: o experimento requer a preparação do vírus e as células T em paralelo. A tabela 1 resume o protocolo. Os reagentes e os bufferes chaves são alistados na tabela dos materiais. Nós nos concentramos na geração e expansão de células CAR-T visando populações específicas de APCs neste protocolo.

1. geração e validação de única cadeia Fab anticorpo (scFab)-carros.

Nota: os carros contêm tipicamente 3 domínios críticos — um domínio alvejando do antígeno, um domínio do espaçador/transmembrane, e um domínio de sinalização cytoplasmic. O projeto preciso de cada carro depende do alvo pretendido, e assim, aparte das características chaves do constructo relevante à geração do retrovirus, não será descrito em detalhe neste protocolo. O desenho geral dos carros utilizados para os estudos descritos abaixo é mostrado na Figura 1. Em suma, o domínio de segmentação compreende toda a cadeia de luz e a variável e o domínio CH1 da cadeia pesada do anticorpo monoclonal pai vinculado por um vinculador semirígido. O domínio de espaçador/transmembrana é do mouse CD28, e o domínio de sinalização é uma fusão contendo elementos do mouse CD28, CD137 (4-1BB) e CD247 (CD3ζ). Estes elementos são montados por procedimentos padrão da biologia molecular tais como a reacção em cadeia da polimerase da sobreposição da tala (PCR), ou a síntese de um "bloco genético apropriado". Os detalhes da geração do mAB287 CAR estão contidos em Zhang et al.7. As seqüências do cDNA podem ser obtidas dos autores em cima do pedido.

  1. Montagem do constructo CAR
    1. Sintetizar o anticorpo fab de cadeia única de segmentação (scFab) e os domínios de espaçador/sinalização combinados separadamente e usar uma técnica de ligadura de "3 pontos"15 para montar a construção final (Figura 1).
      Nota: a exigência chave para a inserção do carro é que deve conter os locais do endonuclease da limitação de flanquear permitindo a ligadura no vetor da expressão retroviral pMSCV-ires-GFP II (pmig II), ou um derivado relacionado15 é igualmente Apropriado.
  2. Validação da expressão de superfície CAR
    1. Transduce as células de hibridoma usando partículas retrovirais derivadas de pMIG II geradas por um protocolo padrão (por exemplo, Holst et al.16).
    2. Executar a análise de citometria de fluxo para detectar a expressão de GFP do vetor CAR17.
    3. Expressão de superfície da mancha do carro dos hybridomas transvados usando anticorpos etiquetadas de encontro à corrente do κ do rato (por exemplo, clone RMK-45)17.
      Nota: 18.
  3. Validação da especificidade do CAR
    1. Estimular as células de hibridoma transgénios com antígenos de placa ou celular apropriados. Após a cocultura durante a noite, colete sobrenadantes e citocinas secretadas e ensaiadas por ensaio imunoenzimático (ELISA)7.
      Nota: idealmente, cada carro deve ser validado independentemente antes de ser usado para a transdução. Nesta etapa, o experimento pode ser pausado e reiniciado posteriormente.

2. transfecção de células produtoras virais (dia-4 a dia 3)

Nota: retrovirus é produzido usando células Phoenix-eco (ver a tabela de materiais)19,20. Use as precauções apropriadas para a geração de agentes potencialmente infecciosos (preferencialmente incluindo um gabinete BSL-2 designado e uma incubadora separada para a cultura de células transfectadas/trantransadas).

  1. Thawing pilhas de Phoenix (dia-4)
    1. Thaw 2 x 106 Phoenix-células eco. Dimensione o número de células Phoenix se forem planejadas múltiplas transsecções.
    2. Placa-los em um prato de 10 cm de cultura de tecido com 10 mL de meio (Dulbecco ' s modificado Eagle Medium (DMEM) contendo 10% fetal bezerro serum (FCS)).
  2. Células Passage Phoenix (dia-3)
    1. Remova o meio e lave com 5 mL de soro fisiológico tamponado com fosfato de Dulbecco (DPBS).
    2. Adicionar 3 mL de 0,25% de tripsina e incubar a 37 ° c atmosfera de 10% CO2 durante 3 min.
    3. Colher as células, em seguida, pellet por centrifugação por 3 min em 200 x g. Re-placas de células com 10 mL de meio fresco e incubar a 37 ° c.
  3. Irradiação de células Fênix (dia-1 tarde)
    1. Para minimizar a divisão celular, coletar células Phoenix, conforme descrito na etapa 2,2, ressuscitem em 5 mL de meio, e células gama irradiar no gelo (1000 RAD).
      Nota: o cuidado deve ser usado para o trabalho da radiação para evitar a exposição do pessoal.
    2. Centrifugue as células irradiadas, Ressuspender em meio fresco, placa em 2 x 106 células (em 10 ml de meio)/Plate/Car, e incubar.
  4. Transfection (dia 0-manhã)
    1. Aspirar o sobrenadante das células Fênix, lave com 5 ml de solução salina tampão fosfato (PBS), e adicione cuidadosamente 7 ml de meio de soro reduzido (por exemplo, Opti-mem) gota gota para a parede lateral da placa para evitar perturbar a monocamada. Transfira as células de volta para a incubadora.
    2. Tome 2 14 mL de tubos de polipropileno de fundo redondo e adicione 1,5 mL de meio sérico reduzido a cada um. Para um tubo, adicione 40 μL de reagente de transfecção (ver a tabela de materiais).
    3. Para o outro tubo, adicionar 15 μg de AB-CAR-plasmídeo (gerado no passo 1) e 5 μg de envelope e plasmídeo de embalagem (5 μg pCL-eco). Incubar tubos à temperatura ambiente durante 5 min.
    4. Adicione a mistura do reagente do Transfection da etapa 2.4.2 gota gota ao segundo tubo sem contatar os lados do tubo, e misture introduzindo com pipting a solução acima e para baixo delicadamente 3 vezes. Incubar à temperatura ambiente durante pelo menos 20 min.
    5. Adicione 3 ml da mistura gota gota às pilhas de Phoenix, e coloc em uma incubadora da cultura do tecido.
    6. Após 4 – 5 h, adicionar 1 mL de FCS. Células de cultura durante a noite a 37 ° c.
  5. Mudança média (dia 1)
    1. Retire o sobrenadante contendo os complexos de reagente de plasmídeo/transfecção e elimine-os de acordo com os procedimentos institucionais para o manuseio de material infeccioso. Adicione 4 mL de meio de cultura fresco e pré-aquecido às células.
  6. Vírus da colheita para a transdução (dia 2)
    1. Colete o meio contendo vírus das células Phoenix com uma seringa estéril, filtre (0,45 μm) para remover restos de células residuais e colete em um novo tubo.
    2. Adicione o estoque de rhIL-2 a uma concentração final de 200 UI/mL. Use o vírus imediatamente para a transdução (etapa 5,3). Adicionar 4 mL de meio fresco para as células de Phoenix e coloque na incubadora.
  7. Repita a coleta de vírus (dia 3)
    1. Repita a etapa 2,6, mas descarte as células Phoenix como resíduos infecciosos em vez de adicionar meio fresco. Este sobrenadante é usado na etapa 5,4.

3. isolamento e ativação da célula T CD8 primária (dia-1 a dia 0)

Nota: anteriormente, coletar células CD8 T de camundongos Nod fêmeas em 4 – 5 semanas, um ponto de tempo antes da inflamação da Ilíada começa21,22. Manuseie todos os camundongos após protocolos aprovados pelo IACUC. Células T CD8 são enriquecidas a partir de esplenócitos usando um kit de seleção negativa comercial.

  1. Placas de revestimento com anticorpos CD3/CD28 (dia-1)
    1. Adicione 1 mL de uma mistura de anticorpos CD3 e CD28 do rato (ambos a 1 μg/mL em PBS) a cada poço de uma placa de 24 poços e incubar a 4 ° c durante a noite.
    2. No dia seguinte, lave as placas com 1 mL de PBS estéril 3 vezes antes de adicionar as células T CD8 murina (passo 4,1).
      Nota: o número de poços a serem revestidos variará para cada experimento, dependendo do número total de células T CD8 ativadas necessárias.
  2. Coleção de esplenócitos (dia 0)
    1. Eutanize dois camundongos fêmeas NOD com idade entre 4 e 5 semanas usando a inalação de CO2 seguido de decapitação. Colher os baços e colocá-los em um filtro de células de imersão em 10 mL de PBS em um prato de cultura celular no gelo.
    2. Em uma capa de cultura celular, corte cada baço em 3 – 5 peças, pressione os tecidos com um êmbolo estéril de uma seringa de 3 ou 5 mL para forçar os fragmentos do baço para além e permitir que as células passem através da malha de arame.
    3. Remova suavemente as células vermelhas do sangue pelos esplenocitos ressuscitos em 1:4 tampão de lise de células vermelhas diluídas (1 mL de tampão de Lise em 3 mL de PBS para um baço) e incubando por 5 min à temperatura ambiente.
    4. Em seguida, diluir 10 μL da suspensão celular com solução de corante azul de Tripan para contagem de células com um hemociômetro, e pellet o resto das células por centrifugação em 350 x g por 7 min.
  3. Enriquecimento de células T CD8 (dia 0)
    1. Enriqueça células T CD8 por seleção negativa usando um kit de isolamento de células T CD8 do mouse, seguindo as instruções do fabricante.
      Nota: para garantir alta pureza sempre arredondar os números das células ao calcular o volume de biotinylated-anticorpo a ser adicionado (por exemplo, usar o volume de reagentes sugeridos para 108 células para um calculado 9,1 x 107 células).
    2. Suspender os pellets de células em 400 μL de tampão e 100 μL de cocktail de biotina-anticorpo por 1 x 108 células, misturar bem e incubar durante 5 min no frigorífico (4 ° c) para permitir a ligação de anticorpos.
    3. Adicionar 300 μL de tampão de rotulagem e 200 μL de microesferas antibiotina por 1 x 108 células, misturar bem e incubar durante 10 min a 4 ° c.
    4. Enquanto aguarda a ligação de microesferas, configure a coluna de separação no separador. Lave a coluna enxaguando com 3 mL de tampão de rotulagem.
    5. Passe 1000 μL de mistura de cordão/célula através de um filtro de célula de 40 μm antes de carregar na coluna de separação para remover agregados de células. Colete o fluxo de coluna em um tubo de 15 mL pré-refrigerado.
    6. Lave a coluna conforme instruído pelo fabricante, recolhendo todo o efluente no mesmo tubo. Determine o número da célula (o mesmo que a etapa 3.2.4) e colete por centrifugação em 350 x g por 5 min. Lave as células por ressuscitar em 2 ml de meio de célula T completo (rpmi-1640 contendo FCS, 2-Mercaptoetanol, rhil-2 (200 U/ml), mIL-7 (0,5 ng/ml), sua , HEPES e penicilina-estreptomicina) e centrifugação a 350 x g durante 5 min.
    7. Ressuscitar as células em meio de célula T pré-aquecido (37 ° c) em uma concentração de 0,25 – 0,5 x 106/ml.

4. ativação da célula T (dia 0 a 2)

  1. Adicione 2 mL da suspensão da pilha (0.25 – 0.5 x 106/ml) a cada poço revestido do anticorpo CD3/CD28 revestido a placa 24-well da etapa 3.1.2. Use um movimento de roda para dispensar as células uniformemente.
    Nota: Adicione as células usando um movimento de roda para distribuí-los uniformemente e minimizar os efeitos de borda. Se as células se aglomeram ao longo da borda dos poços, tanto a taxa de transdução quanto a viabilidade celular serão diminuídas.
  2. Como um controle, a placa do mesmo número de células T CD8 em um único poço não revestido da placa. Incubar as células a 37 ° c usando uma incubadora de 10% CO2 gaseificada por 48 h.
    Nota: após 48 h, a ativação pode ser confirmada usando um microscópio; as células ativadas serão maiores do que as células que não encontram anticorpos anti-CD3/CD28.

[lugar Figura 2 aqui]

5. transdução de células T CD8 ativadas (dias 1 a 3)

Nota: Este protocolo usa um método de spin-transdução. Um centrifugador com um rotor do balanço-para fora e os adaptadores da placa da cultura do tecido que é capaz de manter uma temperatura interna do ° c 37 são exigidos. Para garantir a máxima eficiência, no dia da transdução pré-aqueça a centrífuga a 37 ° c antes de coletar o vírus.

  1. Preparação de placas revestidas de fragmento de fibronectina humana (dia 1 a dia 2)
    1. No dia 1, adicionar 0,5 mL de fibronectina (50 μg/mL em PBS) aos poços de uma placa de 24 poços, e incubar durante a noite a 4 ° c.
      Nota: tipicamente, dois poços fibronectin-revestidos são exigidos por a placa de pilhas transfected de Phoenix.
    2. No dia 2, retire a solução de fibronectina e substitua por 1 mL de albumina sérica bovina de 2% (BSA) em PBS. Incubar à temperatura ambiente por 30 min para "bloquear" locais de ligação não específicos.
    3. Lave os poços tratados com 1 mL de PBS estéril. Após a remoção da solução de lavagem, a placa está pronta para uso; ou, pode ser selado e armazenado a 4 ° c por até uma semana.
  2. Coleção de células T CD8 ativadas (dia 2)
    1. Colha as células T CD8 ativadas, conte e calcule a viabilidade celular usando o azul de Tripan ou um instrumento automatizado adequado.
    2. Coletar células por centrifugação e ressuscição em 5 x 106 células/ml viáveis para transduções. Manter uma pequena alíquota de células em cultura no meio de célula T completo na incubadora de CO2 para fornecer um controle para posterior triagem de célula ativada por fluorescência das células transdoradas (etapa 6).
      Nota: após a ativação para 48 h, o número total de células deve ter aumentado em aproximadamente 1,5 vezes, e ter uma viabilidade maior que 95%.
  3. Transdução (dia 2)
    1. Adicionar 100 μL de suspensão de células CD8 ativadas por poço (0,5 x 106 células) à placa revestida de fibronectina. Em seguida, adicione 1,5 – 2 mL de meio contendo vírus (da etapa 2,6) a cada poço. Misture com um movimento de roda para distribuir as células uniformemente (Figura 2).
    2. Coloque a placa em um saco de plástico zip-lock e vedação (para fornecer contenção secundária). Centrifugador a 2000 x g por 90 min a 37 ° c.
    3. Retire a placa da centrífuga. Na segurança biológica, o armário remove com cuidado o saco de plástico e assegura-se de que a parte externa da placa não esteja contaminada com nenhum meio.
    4. Em seguida, transfira a placa para a incubadora dedicada de 37 ° c CO2 . Após 4 h, retire 1 mL do meio de cada poço e substitua-o por 1 mL de meio de célula T completo pré-aquecido. Substitua a chapa na incubadora CO2 .
      Nota: Manuseie todas as mídias das células transadas como resíduo infeccioso.
  4. Segunda transdução (dia 3)
    1. No gabinete de segurança biológico dedicado, incline a placa contendo as células transdoadas descansando sobre a tampa e Retire cuidadosamente a maior parte do meio (deixando 100 – 200 μL) certificando-se de não entrar em contato com as células na parte inferior do poço.
    2. Adicione o meio contendo vírus coletado na etapa 2,7 e repita as etapas 5.3.2 – 5.3.4.
      Nota: em nossa experiência, uma terceira transdução raramente melhora a eficiência geral. Além disso, a viabilidade celular provavelmente cairá significativamente se uma terceira transdução for usada. Se as pilhas são chapeadas em uma concentração mais elevada do que 0,5 x 106/well, as pilhas de T podem alcangar a confluência após a incubação da noite que segue a segunda etapa da transdução. Neste caso, as células divididas após a incubação de 4 h no dia 3.
  5. Células de lavagem (dia 4)
    1. Retire 1 mL de meio de cada poço, ressuscitem as células no meio remanescente e transfira para um tubo de 15 mL. Lave os poços com 1 mL de meio de célula T completo e acrescente ao tubo que contém as células agrupadas de cada transdução.
    2. Centrifugue a 350 x g durante 7 min e, em seguida, lave duas vezes por ressuscitar em 2 mL de meio de célula T completo e granulação. Finalmente ressuscito em 2 mL de meio e determinar o número da célula.
      Nota: se 1 x 106 células foram originalmente transadas, o rendimento nesta fase deve ser ~ 3 x 106.
  6. Transferência
    1. Alíquotas de transferência de 0,5 – 1 x 106 células em 2 ml de meio de célula T completo para os poços de uma nova placa de 24 poços e incubar a 37 ° c. Aproximadamente 48 – 72 h pós-transdução as células estão prontas para análise de expressão de CAR e triagem celular.
      Nota: o número de células do carro-T normalmente dobra cada 24 h nesta fase. É crítico nunca deixá-los crescer. Divida as células imediatamente se a densidade for superior a 2 x 106/ml (ou se o meio já se torna amarelo brilhante). Na nossa experiência, as células CAR-T proliferam de forma mais robusta em placas de 24 poços e 12 poços do que se transferidas para uma embarcação maior.

6. purificação de células transaccionadas por célula-triagem ativada por fluorescência (FACS) (dia 5 ou dia 6)

  1. Recolher as células.
    1. Ressuscitar as células pipetando para cima e para baixo várias vezes (tendo o cuidado de não causar o frothing), transfira para tubos de 15 mL e centrifugue a 350 x g durante 5 min.
    2. Ressuscitem em tampão de ordenação (2% BSA em PBS estéril contendo gentamicina) em 1 x 106 células/ml. Também colhem as células T CD8 do controle (un-transmóed) da etapa 5,2).
      Nota: a partir de 1 x 106 células no dia 2, um rendimento de ~ 2 x 107 células transmóxas é esperada neste momento.
  2. Lave as células uma vez com a classificação tampão por centrifugação em 350 x g por 5 min, e ressuscitando em 1 x 107 células/ml em buffer de classificação. Remova uma alíquota pequena para o controle de compensação de Foxp3GFP (a ser usado na etapa 6.4.1), e manchar o restante com o rótulo anti-mouse CD8 (clone 53-6.7; 0,2 μg de anticorpo/5 x 106 células) incubando por 20 min a 4 ° c.
    1. Da mesma forma, manchar uma alíquota das células T CD8 não transinadas para fornecer um controle de compensação para o fluoróforo rotulando o anticorpo anti-CD8.
      Nota: evite adicionar azida sódica a qualquer tampão, pois isso é tóxico para as células.
  3. Lave as células rotuladas duas vezes com o buffer de classificação, ressuscita em buffer de classificação a frio em 1 x 107 células/ml.
  4. Ordene as células.
    1. Classifique CD8 GFP+ células positivas em meio de célula T completo pré-refrigerado (Figura 3B). Tome uma pequena alíquota para análise pós-triagem para determinar a pureza.
      Nota: para maximizar a pureza das pilhas ordenadas as portas apertadas devem ser usadas. Use um bocal de 100 μm para assegurar a viabilidade elevada da pilha. Minimize a quantidade de tempo que as células classificadas são mantidas no gelo. As pilhas de T que foram mantidas no gelo por mais de 3 h tomam muito mais por muito tempo para recuperar do que as pilhas refrigeradas por menos de 2 h. Assim, se 3 linhas de células transadas precisam ser classificar, coletar e rotular a segunda linha, enquanto o primeiro está sendo classificado e assim por diante em vez de ter a segunda e terceira linhas passam um tempo prolongado a 0 ° c. A expressão de outros marcadores de célula T, como CD28 e CD3, também pode ser monitorada (Figura 3C), mas não é essencial para fins de classificação.
    2. (Estratégia de triagem alternativa) Antes de manchar a população maioria, analise a expressão CD8 de uma população pequena das pilhas de T transeladas. Se a pureza é > 99% então a população maioria pode com segurança ser classificada unicamente com base na expressão de GFP.

7. expansão das células CAR-T classificadas (dia 5 a 10)

  1. Expansão celular CAR-T
    1. Lave as células CAR-T classificadas uma vez e, em seguida, ressuscite em meio de célula T completo pré-aquecido a 2,5 – 5 x 105 células/ml e alíquotas de placa de 2 ml em placas de 24 poços.
    2. Conte e divida as células a cada 1 – 2 dias. Normalmente, o número da célula dobra todos os dias até o dia 10, com viabilidade remanescente acima de 95%.
      Nota: sem re-estimulação, as células Car-T vai parar de proliferar em torno do dia 10 e, eventualmente, morrer. Assim, os ensaios funcionais de célula T e as transferências adoptivas devem ser programados em conformidade.
  2. Estratégia de expansão alternativa
    1. Após a triagem, a cultura das células CAR-T em meio de célula T completo contendo rhIL-2 em 100 U/mL em vez de 200 U/mL.
      Nota: as células T do carro proliferam a uma taxa ligeiramente mais lenta neste meio. No entanto, eles muitas vezes continuarão a proliferar até os dias 11 a 13 sem re-estimulação. Assim, embora esta estratégia alternativa da expansão não gere um número mais elevado de pilhas fornece uma janela de tempo ligeiramente mais longa para que os ensaios a jusante sejam executados.

8. verificação da especificidade e funcionalidade do antígeno das células T do CAR.

Nota: a especificidade de ligação de células T de carro visando complexos peptídeos/MHC pode ser verificada pela coloração de tetrâmero7,23. Similarmente, sua funcionalidade pode ser confirmada medindo a secreção do citocinas ou a citotoxicidade depois da estimulação por seus ligands cognato. A unidade central do Tetramer de NIH (TCF) na Universidade de Emory é uma fonte recomendada de "tetramers" e de protocolos de mancha relevantes.

  1. Peptídeo-MHC Coloração de Tetramer.
    1. Alíquotas de etiquetas de 2 x 105 células de Car-T transmorsas em 100 μl de tampão de triagem incubando-se com ~ 0,6 μg de tetrâmeros antígeno-específicos e de controlo fluorescentamente rotulados a 37 ° c durante 2 h.
    2. Pellet as células por centrifugação para 5 min em 350 x g, em seguida, lave duas vezes por ressuscitar em 0,5 ml de classificação tampão e re-centrifugação. Por fim, ressuscitem as células em 300 μL de tampão de triagem e analisam por citometria de fluxo (Figura 4).
      Nota: para estes estudos, usamos tipicamente BV421-ROTULADOS iaG7-b: 9-23 (re) (teste) e iaG7-Hel (controle) tetramers. Entretanto, toda a combinação do fluorophore/tetramer que for apropriada para o carro (s) a investigação pode ser usada preferivelmente. Neste caso, a concentração e o tempo de coloração devem ser otimizados para cada tetrâmero utilizado. As pilhas de Car-T classificadas e un-classificadas podem ser usadas para a mancha do tetrâmero.
  2. Medida da especificidade pela estimulação do ligante.
    1. Incubar 2 x 105 células de Car-t classificadas em 200 μL de meio de célula t livre de citocinas com ligantes de placas ou celulares apropriados.
    2. Após 6 – 24 h, medir a produção de citocinas por ELISA ou coloração intracelular usando os protocolos do fabricante.
      Nota: para os nossos estudos de iaG7-b: 9-23 redireccionado células T, nós cultura as células durante a noite com M12C3 murino células de linfoma de células-d expressando iaG7-b:R3 ou "vazio" iaG724,25, em seguida, coletar os sobrenadantes e medir a gama de interferon de rato secretado (IFN-γ) por ELISA26 (Figura 5).

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Representative Results

Tipicamente, a eficiência da transdução que usa este protocolo é ~ 60-90%. No experimento mostrado na Figura 3, antes de classificar aproximadamente, 70% das células T CD8 expressaram a GFP. Eles também coexpressaram CD28 e CD3 (Figura 3C). É importante ressaltar que todas as células GFP+ de "teste" também estão cocoradas com os tetramers iaG7-b: R3, mas não com o controle tetrâmero (Figura 4). Da mesma forma, as células CAR-T de teste e controle classificadas secretaram níveis elevados de IFN-γ somente após a cocultura com células alvo expressando seus ligantes cognatos (Figura 5). Isto confirma que as pilhas transadas têm um phenotype de célula T do efetoras CD8 dirigido para o alvo dos anticorpos do pai.

Figure 1
Figura 1: esquema da construção anti-retroviral Car. O CAR compreende um domínio de segmentação derivado do fragmento fab de um anticorpo monoclonal de camundongo adequado, e um espaçador/âncora de membrana/domínio de sinalização do mouse CD28, CD137 e CD247. O cDNA sintético é introduzido no vetor da expressão retroviral de pMIG-II. Os locais da endonuclease da limitação usados gerando o mAb287-CAR são mostrados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: efeito de diferentes métodos de chapeamento na distribuição celular. Esquerda Células pipetadas usando um movimento de roda mostram uma distribuição uniforme. Direito As células foram pipetadas diretamente no centro do poço. As imagens foram capturadas após a fiação em 350 x g por 5 min. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: análise citométrica de fluxo de células T transtradas. As células foram coradas com Cy7 conjugados anti-CD8, AF647 conjugados anti-CD3 e BV421 conjugados CD28, conforme descrito na etapa 6,4. Os perfis fechados em únicas células viáveis são mostrados. (A) células T de CD8 parental manchadas de un. (B) perfil PE-CY7/GFP de células transinadas. As células de expressão de CAR são identificadas pelo repórter do GFP. (C) as células transduais coradas foram bloqueadas na positividade dupla PE-CY7/GFP. O perfil AF647/BV421 é mostrado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: coloração de Tetramer de células não classificadas de Car-T. As células foram coradas com BV421 tetrâmeros conjugados conforme descrito na etapa 8,1. Os perfis fechados em únicas células viáveis são mostrados. (A) teste iaG7-insulina tetramer. B) controlo I-AG7-Hel tetramer. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: secreção de citocinas específicas do antígeno por células T de Car. Células T CD8 classificadas expressando o teste mAb287 ou controle MAB 24.1 Car foram cocultivadas com células M12C3 expressando iaG7-b: R3, "vazio" iaG7, ou TFR-MBP-dtrl (o ligante para MAB 24.1) conforme descrito na etapa 8,2. Após 24 h, secretado IFN-γ ELISA foi quantificado por ELISA. A estimulação específica de ambas as linhas de célula T foi observada. Os dados representam média ± DP de 3 experimentos repetidos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tempo Preparação do vírus Preparação de células T
DIA-4 (Sex) Células de Phoenix de Thaw (PM)
Dia-3 (sáb) Re-placa Phoenix
Dia-2 (dom) Férias
Dia-1 (seg) Irradiar pilhas de Phoenix (PM) Revestimento não-tratada placa com CD3/CD28 AB
Dia 0 (ter) Transfecting pilhas de Phoenix (AM) Prepare esplenócitos e isole pilhas de T CD8.
Ativação da célula T.
Dia 1 (qua) Mude o meio das pilhas de Phoenix a 4 ml (AM). RetroNectin do revestimento
Dia 2 (qui) Colete vírus e recarga. Transdução, células T CD8
Dia 3 (Sex) Colete vírus. Transdução, células T CD8
Dia 4 (sáb) Lave as células e expanda as células.
Dia 5 (dom) Expansão celular, se necessário.
Dia 6 (seg) Triagem de célula CAR-T.
Dia 7 -10 (ter a Sex) Expansão das células T CAR-. Experiências.

Tabela 1: síntese do protocolo de geração CAR-T.

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Discussion

Este protocolo descreve um método eficiente para produzir pilhas CD8 antígeno-específicas do CAR-T pela transdução retroviral. A eficiência de transdução do nosso protocolo é tipicamente alta, e a expressão robusta do CAR é geralmente observada. As pilhas de T do carro expandido mantêm as características essenciais das pilhas de T pai-ativadas, e da especificidade do anticorpo, e são apropriadas para in vitro e in vivo uso. Nós aplicamos pilhas do AB-carro CD8 T em reprogramação tipo-1 diabetes em ratos Nod7.

Nosso protocolo incorpora várias modificações críticas aos métodos descritos anteriormente. Primeiro, usamos um meio de cultivo de célula T otimizado que permite um tempo de ativação estendido. O meio completo descrito contém níveis ideais de vários suplementos-chave, e melhora significativamente a viabilidade da célula T e a extensão da proliferação após a ativação. Deve-se notar que o rato IL-2 pode ser substituído para a proteína humana com resultados equivalentes, embora presentemente, o IL-2 humano seja mais disponível. Da nota, uma eficiência significativamente mais elevada da transdução é obtida usando as pilhas de T ativadas para 40-48 h do que se uma etapa da ativação 24 h é usada.

Em segundo, nós usamos um procedimento melhorado da transdução que elimine o Polybrene B (que é tóxico às pilhas de T) e use o fibronectina preferivelmente. Isso melhora ainda mais a viabilidade celular. Deve-se notar que, para garantir a boa eficiência de transdução, é fundamental manter as células T em um meio otimizado em uma densidade celular adequada e usar sobrenadantes virais de alto titro fresco em vez de vírus previamente congelados. Usando nosso procedimento modificado, uma terceira etapa da transdução é desnecessária e é certamente indesejável porque a viabilidade cai tipicamente se uma terceira etapa da infecção da rotação é incluída. Também deve ser enfatizado que é fundamental nunca deixar as células crescerem durante a fase de expansão. Uma vez que as pilhas são overgrown, tendem a perder ràpida seu phenotype e morrem.

Além dos parâmetros descritos acima, devem ser evitadas duas outras causas potenciais de baixa eficiência/viabilidade de transdução. Primeiramente, porque os antibióticos não devem estar atuais durante as etapas do transfection é importante certificar-se de que os plasmídeos estão preparados usando um jogo endotoxin-livre, e dissolvido na água estéril, e que a boa técnica estéril está usada em todas as vezes. Em segundo lugar, a presença de altos níveis de células T mortas ou morrendo deve ser evitada. Se a suspensão parental de célula T CD8 ativada contiver altos níveis de células mortas ou detritos celulares, isso deve ser removido antes da transdução usando kits comerciais.

Nós deliberadamente não incluímos um passo de congelamento de célula CAR-T neste protocolo, como em nossa experiência uma proporção significativa das células transadas morrem durante a criopreservação e descongelação. Da mesma forma, embora as células CAR-T expandidas possam ser reestimuladas in vitro, elas têm uma tendência aumentada para perder a expressão do transgene. Assim, tendo em conta o alto grau de proliferação que observamos utilizando células CAR-T recém-classificadas, recomendamos vivamente que apenas as células CAR-T recém-geradas sejam utilizadas para ensaios funcionais e transferência adoptiva.

Em resumo, o significado deste protocolo é que descreve um procedimento que forneça a eficiência elevada da transdução e gerencie o grande número de pilhas CD8 T específicas do rato do antígeno saudável para o uso in vitro e in vivo. Nosso protocolo, portanto, fornece uma ferramenta útil para pesquisadores que empreenderam estudos de células CAR-T em modelos de mouse de doença.

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Disclosures

MAb287 e seus derivados são protegidos por uma patente dos EUA emitida em 2014.

Acknowledgments

Este estudo foi apoiado por JDRF Grants 1-INO-2015-74-S-B, 2-SRA-2016-238-S-B, e SRA-2-S-2018-648-S-B, um prêmio de educação e ação de diabetes, e o fundo de lei Caroline Wiess para pesquisa em medicina molecular na Baylor College of Medicine. O Cell-Sorting foi apoiado pelo núcleo da citometria e da classificação da pilha na faculdade de medicina de Baylor com o financiamento do NIH (S10RR024574 e P30CA125123). Todos os tetrâmeros do peptide-MHC foram obtidos da facilidade do núcleo de tetramer de NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol (50mM) Gibco 21985-023 50 μM
5’ RACE PCR Clontech 634859
anti-mouse CD28 antibodies eBioscience 14-0281-86 final concentration at 1µg/ml
anti-mouse CD3e antibody eBioscience 145-2C11 final concentration at 1µg/ml
Biotin Rat Anti-Mouse IFN-γ BD Biosciences 554410 Working concentration at 0.5 µg/ml
BSA Sigma A7030
Endo-free Maxi-Prep kit Qiagen 12362
Gentamicin Gibco 15750-060 Final 50 µg/ml.
Heat inactivated FCS Hyclone SH30087.03 Final 10% FCS
HEPES (100X) Gibco 15630-080 1X
IAg7-CLIP tetramer-BV421 NIH tetramer Facility at Emory per approval Working concentration at 6 µg/ml
IAg7-insulin P8E tetramer-BV421 NIH tetramer Facility at Emory per approval Working concentration at 6 µg/ml
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS 100x) ThermoFisher 51500056 Final concentraion is 1x
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
MACS Separation Buffer Miltenyi Biotec 130-091-221
Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit Miletenyi Biotec Inc 130-104-075
Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit Miltenyi Biotec 130-104-075
Opti-MEM medium ThermoFisher 31985070
Penicillin-Streptomycin (5000U/ml) ThermoFisher 15070063 50 U/ml
Phoenix-ECO cells ATCC CRL-3214
Phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 10010-023
pMIG II Addgene 52107
pMSCV-IRES-GFP II Addgene 52107
Purified Rat Anti-Mouse IFN-γ BD Biosciences 551216 Working concentration at 3 µg/ml
Red cell lysis buffer Sigma R7767
RetroNectin Takara T100A Working concentration at 50 µg/ml in PBS
rhIL-2 (stock concentration 105 IU/ul) Peprotech 200-02 Final concentration at 200 IU/ml
rmIL-7 ( stock concentration 50ng/ul) R&D 407-ML-005 Final concentration at 0.5ng/ml
RPMI-1640 Gibco 11875-093
Sterile Cell Strainers Fisher Scientific 22-363-548
Tryple Gibco 12605-028

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References

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Imunologia e infecção diabetes tipo 1 especificidade do antígeno anticorpo monoclonal receptor de antígeno quimérico transdução insulina epítopo célula T CD8 mouse NOD
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