Génération à haut rendement de cellules T cytotoxiques cytotoxiques de souris primaires spécifiques à l'antigène pour les tests fonctionnels dans un modèle de diabète auto-immun
Summary
Cet article décrit un protocole pour la génération des cellules T CD8 antigène-spécifiques, et leur expansion in vitro, dans le but de produire un nombre élevé de lymphocytes T fonctionnels pour une utilisation in vitro et in vivo.
Abstract
Le diabète de type 1 (T1D) est caractérisé par une auto-immunité spécifique aux islets entraînant la destruction des cellules bêta et la perte absolue de production d’insuline. Dans le modèle spontané de souris de diabète non-obèse (NOD), l’insuline est la cible primaire, et la manipulation génétique de ces animaux pour enlever un épitope d’insuline clé simple empêche la maladie. Ainsi, l’élimination sélective des cellules professionnelles de présentation d’antigène (APC) portant cet épitope pathogène est une approche pour inhiber les réponses autoimmunes insulino-spécifiques non désirées, et a probablement un plus grand potentiel translationnel.
Les récepteurs d’antigènes chimériques (RAC) peuvent rediriger les lymphocytes T vers des antigènes pathogènes de manière sélective. Cette technique est fondamentale pour les tentatives récentes d’utiliser l’ingénierie cellulaire pour la thérapie cellulaire adoptive pour traiter les cancers multiples. Dans ce protocole, nous décrivons un protocole optimisé de rétrovirus à cellule T (RV) et de transduction in vitro qui génère un grand nombre de cellules CD8 CAR-T fonctionnelles spécifiques à l’antigène à partir d’un faible nombre de cellules naïves. Auparavant, plusieurs protocoles de cellules CAR-T ont été décrits, mais généralement avec une efficacité de transduction relativement faible et la viabilité cellulaire après la transduction. En revanche, notre protocole fournit jusqu’à 90% d’efficacité de transduction, et les cellules générées peuvent survivre plus de deux semaines in vivo et retarder considérablement l’début de la maladie à la suite d’une seule perfusion. Nous fournissons une description détaillée du protocole d’entretien et de transduction des cellules, de sorte que les étapes critiques peuvent être facilement suivies. L’ensemble de la procédure de l’isolement cellulaire primaire à l’expression de la RCA peut être effectuée dans les 14 jours. La méthode générale peut être appliquée à n’importe quel modèle de maladie de souris dans lequel la cible est connue. De même, l’application spécifique (ciblant un complexe pathogène de classe II peptide/MHC) s’applique à tout autre modèle de maladie auto-immune pour lequel un complexe clé a été identifié.
Introduction
Étant donné le risque probablement réduit d’effets non désirés hors cible, les thérapies immunitaires spécifiques aux antigènes (ASI) sont des traitements prometteurs pour les maladies auto-immunes telles que le DT1. L’accumulation de preuves suggère que les réponses immunitaires à l’insuline (prépro) peuvent être particulièrement importantes dans le DT11. Au cours de la dernière décennie, des études de plusieurs groupes, y compris le nôtre, suggèrent fortement que la présentation d’un épitope contenant des acides aminés de la chaîne de l’insuline B 9 à 23 par des molécules spécifiques de classe II du MHC (B:9-23/MHCII), joue un rôle important dans le développement du DT1 souris et les humains2,3,4,5. Pour cibler sélectivement le complexe B:9-23/MHCII, nous avons généré un anticorps monoclonal, nommé mAb287, qui n’a aucune réactivité croisée à l’insuline hormonale ou aux complexes contenant d’autres peptides6. MAb287 bloque la présentation d’antigène in vitro, et l’administration hebdomadaire de mAb287 aux souris prédiabétiques de NOD a retardé le développement du T1D dans 35% des souris traitées6. Pour bloquer la présentation d’antigène in vivo, des injections fréquentes sont généralement nécessaires afin de maintenir une concentration circulante élevée. Nous avons émis l’hypothèse que nous pourrions surmonter cette difficulté en profitant de la grande spécificité d’Ab287 pourreprogrammer les lymphocytes T, fournissant ainsi une thérapie à cellule T spécifique à l’antigène améliorée pour le DT7 .
Les lymphocytes T cytotoxiques seraient capables de tuer leur cible si même une seule copie de leur ligand cognate est exprimée8,9,10. Ainsi, on s’attend à ce que les lymphocytes T CD8 spécifiques B:9-23/MHCII aient une plus grande efficacité en éliminant la présentation indésirable d’antigène que l’anticorps parent, qui devra probablement se lier à plusieurs complexes sur le même APC pour exercer son effet. Les cellules T de CAR ont été employées pour traiter les cancers humains multiples11,12,13,et peuvent également être efficaces dans l’autoimmunité14. Cependant, les cellules CAR-T avec la spécificité pour les complexes pathogènes peptide-MHC n’ont pas été jusqu’ici employées pour modifier la progression du DT1. En utilisant la technique optimisée de transduction de cellules T CD8 décrite ci-dessous, nous avons récemment démontré la preuve de principe que cela représente en effet une approche viable7.
Dans ce protocole, nous dénoncions une méthode de transduction et d’expansion efficace et rationalisée. Notre protocole s’applique à d’autres études nécessitant la génération de cellules T CD8 CAR de souris à haut rendement.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit une méthode efficace pour produire des cellules CD8 CAR-T spécifiques à l’antigène par transduction rétrovirale. L’efficacité de la transduction de notre protocole est généralement élevée, et l’expression robuste de la RCA est généralement observée. Les lymphocytes T CAR élargis conservent les caractéristiques essentielles des lymphocytes T activés par les parents, et la spécificité des anticorps, et conviennent à l’utilisation in vitro et in vivo. Nous avons appliqué des lymphocy…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été soutenue par les subventions de la FRDJ 1-INO-2015-74-S-B, 2-SRA-2016-238-S-B, et SRA-2-S-2018-648-S-B, un Prix d’éducation et d’action sur le diabète, et le Fonds de droit Caroline Wiess pour la recherche en médecine moléculaire au Baylor College of Medicine. Le tri cellulaire a été appuyé par le Cytometry and Cell Sorting Core du Baylor College of Medicine grâce à un financement des NIH (S10RR024574 et P30CA125123). Tous les tétratiers peptidiques-MHC ont été obtenus à partir de l’installation de base de Tetramer des NIH.
Materials
| 2-Mercaptoethanol (50mM) | Gibco | 21985-023 | 50 uM |
| 5’ RACE PCR | Clontech | 634859 | |
| anti-mouse CD28 antibodies | eBioscience | 14-0281-86 | final concentration at 1µg/ml |
| anti-mouse CD3e antibody | eBioscience | 145-2C11 | final concentration at 1µg/ml |
| Biotin Rat Anti-Mouse IFN-γ | BD Biosciences | 554410 | Working concentration at 0.5 µg/ml |
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Endo-free Maxi-Prep kit | Qiagen | 12362 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | Final 50 µg/ml. |
| Heat inactivated FCS | Hyclone | SH30087.03 | Final 10% FCS |
| HEPES (100X) | Gibco | 15630-080 | 1X |
| IAg7-CLIP tetramer-BV421 | NIH tetramer Facility at Emory | per approval | Working concentration at 6 µg/ml |
| IAg7-insulin P8E tetramer-BV421 | NIH tetramer Facility at Emory | per approval | Working concentration at 6 µg/ml |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS 100x) | ThermoFisher | 51500056 | Final concentraion is 1x |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Separation Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit | Miletenyi Biotec Inc | 130-104-075 | |
| Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit | Miltenyi Biotec | 130-104-075 | |
| Opti-MEM medium | ThermoFisher | 31985070 | |
| Penicillin-Streptomycin (5000U/ml) | ThermoFisher | 15070063 | 50 U/ml |
| Phoenix-ECO cells | ATCC | CRL-3214 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| pMIG II | Addgene | 52107 | |
| pMSCV-IRES-GFP II | Addgene | 52107 | |
| Purified Rat Anti-Mouse IFN-γ | BD Biosciences | 551216 | Working concentration at 3 µg/ml |
| Red cell lysis buffer | Sigma | R7767 | |
| RetroNectin | Takara | T100A | Working concentration at 50 µg/ml in PBS |
| rhIL-2 (stock concentration 105 IU/ul) | Peprotech | 200-02 | Final concentration at 200 IU/ml |
| rmIL-7 ( stock concentration 50ng/ul) | R&D | 407-ML-005 | Final concentration at 0.5ng/ml |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Sterile Cell Strainers | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Tryple | Gibco | 12605-028 |
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