Summary

Génération à haut rendement de cellules T cytotoxiques cytotoxiques de souris primaires spécifiques à l'antigène pour les tests fonctionnels dans un modèle de diabète auto-immun

Published: August 16, 2019
doi:

Summary

Cet article décrit un protocole pour la génération des cellules T CD8 antigène-spécifiques, et leur expansion in vitro, dans le but de produire un nombre élevé de lymphocytes T fonctionnels pour une utilisation in vitro et in vivo.

Abstract

Le diabète de type 1 (T1D) est caractérisé par une auto-immunité spécifique aux islets entraînant la destruction des cellules bêta et la perte absolue de production d’insuline. Dans le modèle spontané de souris de diabète non-obèse (NOD), l’insuline est la cible primaire, et la manipulation génétique de ces animaux pour enlever un épitope d’insuline clé simple empêche la maladie. Ainsi, l’élimination sélective des cellules professionnelles de présentation d’antigène (APC) portant cet épitope pathogène est une approche pour inhiber les réponses autoimmunes insulino-spécifiques non désirées, et a probablement un plus grand potentiel translationnel.

Les récepteurs d’antigènes chimériques (RAC) peuvent rediriger les lymphocytes T vers des antigènes pathogènes de manière sélective. Cette technique est fondamentale pour les tentatives récentes d’utiliser l’ingénierie cellulaire pour la thérapie cellulaire adoptive pour traiter les cancers multiples. Dans ce protocole, nous décrivons un protocole optimisé de rétrovirus à cellule T (RV) et de transduction in vitro qui génère un grand nombre de cellules CD8 CAR-T fonctionnelles spécifiques à l’antigène à partir d’un faible nombre de cellules naïves. Auparavant, plusieurs protocoles de cellules CAR-T ont été décrits, mais généralement avec une efficacité de transduction relativement faible et la viabilité cellulaire après la transduction. En revanche, notre protocole fournit jusqu’à 90% d’efficacité de transduction, et les cellules générées peuvent survivre plus de deux semaines in vivo et retarder considérablement l’début de la maladie à la suite d’une seule perfusion. Nous fournissons une description détaillée du protocole d’entretien et de transduction des cellules, de sorte que les étapes critiques peuvent être facilement suivies. L’ensemble de la procédure de l’isolement cellulaire primaire à l’expression de la RCA peut être effectuée dans les 14 jours. La méthode générale peut être appliquée à n’importe quel modèle de maladie de souris dans lequel la cible est connue. De même, l’application spécifique (ciblant un complexe pathogène de classe II peptide/MHC) s’applique à tout autre modèle de maladie auto-immune pour lequel un complexe clé a été identifié.

Introduction

Étant donné le risque probablement réduit d’effets non désirés hors cible, les thérapies immunitaires spécifiques aux antigènes (ASI) sont des traitements prometteurs pour les maladies auto-immunes telles que le DT1. L’accumulation de preuves suggère que les réponses immunitaires à l’insuline (prépro) peuvent être particulièrement importantes dans le DT11. Au cours de la dernière décennie, des études de plusieurs groupes, y compris le nôtre, suggèrent fortement que la présentation d’un épitope contenant des acides aminés de la chaîne de l’insuline B 9 à 23 par des molécules spécifiques de classe II du MHC (B:9-23/MHCII), joue un rôle important dans le développement du DT1 souris et les humains2,3,4,5. Pour cibler sélectivement le complexe B:9-23/MHCII, nous avons généré un anticorps monoclonal, nommé mAb287, qui n’a aucune réactivité croisée à l’insuline hormonale ou aux complexes contenant d’autres peptides6. MAb287 bloque la présentation d’antigène in vitro, et l’administration hebdomadaire de mAb287 aux souris prédiabétiques de NOD a retardé le développement du T1D dans 35% des souris traitées6. Pour bloquer la présentation d’antigène in vivo, des injections fréquentes sont généralement nécessaires afin de maintenir une concentration circulante élevée. Nous avons émis l’hypothèse que nous pourrions surmonter cette difficulté en profitant de la grande spécificité d’Ab287 pourreprogrammer les lymphocytes T, fournissant ainsi une thérapie à cellule T spécifique à l’antigène améliorée pour le DT7 .

Les lymphocytes T cytotoxiques seraient capables de tuer leur cible si même une seule copie de leur ligand cognate est exprimée8,9,10. Ainsi, on s’attend à ce que les lymphocytes T CD8 spécifiques B:9-23/MHCII aient une plus grande efficacité en éliminant la présentation indésirable d’antigène que l’anticorps parent, qui devra probablement se lier à plusieurs complexes sur le même APC pour exercer son effet. Les cellules T de CAR ont été employées pour traiter les cancers humains multiples11,12,13,et peuvent également être efficaces dans l’autoimmunité14. Cependant, les cellules CAR-T avec la spécificité pour les complexes pathogènes peptide-MHC n’ont pas été jusqu’ici employées pour modifier la progression du DT1. En utilisant la technique optimisée de transduction de cellules T CD8 décrite ci-dessous, nous avons récemment démontré la preuve de principe que cela représente en effet une approche viable7.

Dans ce protocole, nous dénoncions une méthode de transduction et d’expansion efficace et rationalisée. Notre protocole s’applique à d’autres études nécessitant la génération de cellules T CD8 CAR de souris à haut rendement.

Protocol

Les souris ont été maintenues dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes dans un établissement de souris transgéniques, et toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par le Comité des soins et de l’utilisation des animaux du Baylor College of Medicine. REMARQUE : L’expérience nécessite la préparation du virus et des lymphocytes T en parallèle. Le tableau 1 résume le protocole. Les réactif…

Representative Results

En règle générale, l’efficacité de la transduction à l’aide de ce protocole est de 60-90%. Dans l’expérience montrée dans la figure 3, avant le tri d’environ, 70 % des lymphocytes T CD8 ont co-exprimé le PFG. Ils ont également co-exprimé CD28 et CD3 (figure 3C). Fait important, toutes les cellules « test » De GFPsont également tachées de tétragraphes IAg7-B:R3, mais pas avec le tétramère de …

Discussion

Ce protocole décrit une méthode efficace pour produire des cellules CD8 CAR-T spécifiques à l’antigène par transduction rétrovirale. L’efficacité de la transduction de notre protocole est généralement élevée, et l’expression robuste de la RCA est généralement observée. Les lymphocytes T CAR élargis conservent les caractéristiques essentielles des lymphocytes T activés par les parents, et la spécificité des anticorps, et conviennent à l’utilisation in vitro et in vivo. Nous avons appliqué des lymphocy…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette étude a été soutenue par les subventions de la FRDJ 1-INO-2015-74-S-B, 2-SRA-2016-238-S-B, et SRA-2-S-2018-648-S-B, un Prix d’éducation et d’action sur le diabète, et le Fonds de droit Caroline Wiess pour la recherche en médecine moléculaire au Baylor College of Medicine. Le tri cellulaire a été appuyé par le Cytometry and Cell Sorting Core du Baylor College of Medicine grâce à un financement des NIH (S10RR024574 et P30CA125123). Tous les tétratiers peptidiques-MHC ont été obtenus à partir de l’installation de base de Tetramer des NIH.

Materials

2-Mercaptoethanol (50mM) Gibco 21985-023 50 uM
5’ RACE PCR Clontech 634859
anti-mouse CD28 antibodies eBioscience 14-0281-86 final concentration at 1µg/ml
anti-mouse CD3e antibody eBioscience 145-2C11 final concentration at 1µg/ml
Biotin Rat Anti-Mouse IFN-γ BD Biosciences 554410 Working concentration at 0.5 µg/ml
BSA Sigma A7030
Endo-free Maxi-Prep kit Qiagen 12362
Gentamicin Gibco 15750-060 Final 50 µg/ml.
Heat inactivated FCS Hyclone SH30087.03 Final 10% FCS
HEPES (100X) Gibco 15630-080 1X
IAg7-CLIP tetramer-BV421 NIH tetramer Facility at Emory per approval Working concentration at 6 µg/ml
IAg7-insulin P8E tetramer-BV421 NIH tetramer Facility at Emory per approval Working concentration at 6 µg/ml
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS 100x) ThermoFisher 51500056 Final concentraion is 1x
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
MACS Separation Buffer Miltenyi Biotec 130-091-221
Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit Miletenyi Biotec Inc 130-104-075
Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit Miltenyi Biotec 130-104-075
Opti-MEM medium ThermoFisher 31985070
Penicillin-Streptomycin (5000U/ml) ThermoFisher 15070063 50 U/ml
Phoenix-ECO cells ATCC CRL-3214
Phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 10010-023
pMIG II Addgene 52107
pMSCV-IRES-GFP II Addgene 52107
Purified Rat Anti-Mouse IFN-γ BD Biosciences 551216 Working concentration at 3 µg/ml
Red cell lysis buffer Sigma R7767
RetroNectin Takara T100A Working concentration at 50 µg/ml in PBS
rhIL-2 (stock concentration 105 IU/ul) Peprotech 200-02 Final concentration at 200 IU/ml
rmIL-7 ( stock concentration 50ng/ul) R&D 407-ML-005 Final concentration at 0.5ng/ml
RPMI-1640 Gibco 11875-093
Sterile Cell Strainers Fisher Scientific 22-363-548
Tryple Gibco 12605-028

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Davidson, H. W., Cepeda, J. R., Sekhar, N. S., Han, J., Gao, L., Sosinowski, T., Zhang, L. High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model. J. Vis. Exp. (150), e59985, doi:10.3791/59985 (2019).

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