Generación de alta eficiencia de células T citotóxicas de ratón primario específicas de antígenos para pruebas funcionales en un modelo de diabetes autoinmune
Summary
Este artículo describe un protocolo para la generación de células T CD8 específicas de antígenos, y su expansión in vitro, con el objetivo de producir un alto número de células T funcionales para su uso in vitro e in vivo.
Abstract
La diabetes tipo 1 (T1D) se caracteriza por una autoinmunidad específica de los islos que conduce a la destrucción de células beta y a la pérdida absoluta de la producción de insulina. En el modelo de ratón espontáneo de diabetes no obesa (NOD), la insulina es el objetivo principal, y la manipulación genética de estos animales para eliminar un único epítopo de insulina clave previene la enfermedad. Por lo tanto, la eliminación selectiva de células que presentan antígenos profesionales (AAP) que llevan este epítopo patógeno es un enfoque para inhibir las respuestas autoinmunes no deseadas específicas de insulina, y probablemente tiene un mayor potencial traslacional.
Los receptores de antígeno quimérico (CAR) pueden redirigir las células T a diana selectivamente los antígenos causantes de la enfermedad. Esta técnica es fundamental para los recientes intentos de utilizar la ingeniería celular para la terapia celular adoptiva para tratar múltiples cánceres. En este protocolo, describimos una transducción optimizada del retrovirus de células T (RV) y un protocolo de expansión in vitro que genera un alto número de células CD8 CAR-T específicas del antígeno funcional a partir de un bajo número de células ingenuas. Anteriormente se han descrito múltiples protocolos de células CAR-T, pero típicamente con una eficiencia de transducción relativamente baja y viabilidad celular después de la transducción. Por el contrario, nuestro protocolo proporciona hasta un 90% de eficiencia de transducción, y las células generadas pueden sobrevivir más de dos semanas in vivo y retrasar significativamente la aparición de la enfermedad después de una sola perfusión. Proporcionamos una descripción detallada del mantenimiento celular y el protocolo de transducción, para que los pasos críticos se puedan seguir fácilmente. Todo el procedimiento desde el aislamiento de células primarias hasta la expresión CAR se puede realizar en un plazo de 14 días. El método general se puede aplicar a cualquier modelo de enfermedad del ratón en el que se conozca el objetivo. Del mismo modo, la aplicación específica (dirigida a un complejo patógeno de péptido/clase II de MHC) es aplicable a cualquier otro modelo de enfermedad autoinmune para el que se haya identificado un complejo clave.
Introduction
Dado el riesgo probablemente reducido de efectos fuera del objetivo no deseados, las terapias inmunitarias específicas de antígenos (ASI) son tratamientos prometedores para enfermedades autoinmunes como la T1D. La acumulación de evidencia sugiere que las respuestas inmunitarias a (prepro)insulina pueden ser particularmente importantes en T1D1. En la última década, estudios de múltiples grupos, incluido el nuestro, sugieren fuertemente que la presentación de un epítopo que contiene aminoácidos de cadena De insulina 9 a 23 por moléculas específicas de Clase II de MHC (B:9-23/MHCII), juega un papel importante en el desarrollo de T1D en ratones y humanos2,3,4,5. Para atacar selectivamente el complejo B:9-23/MHCII, generamos un anticuerpo monoclonal, llamado mAb287, que no tiene reactividad cruzada a la hormona insulina o complejos que contienen otros péptidos6. MAb287 bloquea la presentación de antígenos in vitro, y la administración semanal de mAb287 a ratones NOD prediabéticos retrasó el desarrollo de T1D en el 35% de los ratones tratados6. Para bloquear la presentación de antígeno in vivo, normalmente se requieren inyecciones frecuentes para mantener una alta concentración circulante. Hemos planteado la hipótesis de que podríamos superar esta dificultad aprovechando la alta especificidad de Ab287 para reprogramarlas células T, proporcionando así una terapia mejorada de células T específicas de antígenos para T1D 7.
Se ha informado que las células T citotóxicas son capaces de matar a su objetivo si incluso una sola copia de su ligando cognado se expresa8,9,10. Por lo tanto, se espera que las células T CD8 específicas B:9-23/MHCII tengan una mayor eficiencia en la eliminación de la presentación de antígenono no deseado que el anticuerpo principal, que probablemente tendrá que unirse a múltiples complejos en el mismo APC para ejercer su efecto. Las células T CAR se han utilizado para el tratamiento de múltiples cánceres humanos11,12,13, y también pueden ser eficaces en la autoinmunidad14. Sin embargo, las células CAR-T con especificidad para complejos patógenos de péptido-MHC no se han utilizado hasta ahora para modificar la progresión de la T1D. Mediante el uso de la técnica optimizada de transducción de células T CD8 que se describe a continuación, recientemente demostramos una prueba de principio de que esto realmente representa un enfoque viable7.
En este protocolo, delineamos un método de transducción y expansión eficiente y simplificado. Nuestro protocolo es aplicable a otros estudios que requieren la generación de células CD8 CAR T de ratón con alta eficiencia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe un método eficiente para producir células CD8 CAR-T específicas para antígenos por transducción retroviral. La eficiencia de transducción de nuestro protocolo es típicamente alta, y la expresión robusta de la CAR se observa generalmente. Las células T CAR expandidas conservan las características esenciales de las células T activadas por los padres, y la especificidad de los anticuerpos, y son adecuadas tanto para el uso in vitro como in vivo. Hemos aplicado células T Ab-CAR CD8 en la r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por las becas JDRF 1-INO-2015-74-S-B, 2-SRA-2016-238-S-B, y SRA-2-S-2018-648-S-B, un Premio a la Educación y Acción para la Diabetes, y el Fondo de Derecho Caroline Wiess para la Investigación en Medicina Molecular en Baylor College of Medicine. La clasificación celular fue apoyada por el Núcleo de Citometría y Clasificación Celular de Baylor College of Medicine con fondos del NIH (S10RR024574 y P30CA125123). Todos los tetrámeros péptidos-MHC se obtuvieron de la Instalación De Núcleo de Tetramer niH.
Materials
| 2-Mercaptoethanol (50mM) | Gibco | 21985-023 | 50 uM |
| 5’ RACE PCR | Clontech | 634859 | |
| anti-mouse CD28 antibodies | eBioscience | 14-0281-86 | final concentration at 1µg/ml |
| anti-mouse CD3e antibody | eBioscience | 145-2C11 | final concentration at 1µg/ml |
| Biotin Rat Anti-Mouse IFN-γ | BD Biosciences | 554410 | Working concentration at 0.5 µg/ml |
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Endo-free Maxi-Prep kit | Qiagen | 12362 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | Final 50 µg/ml. |
| Heat inactivated FCS | Hyclone | SH30087.03 | Final 10% FCS |
| HEPES (100X) | Gibco | 15630-080 | 1X |
| IAg7-CLIP tetramer-BV421 | NIH tetramer Facility at Emory | per approval | Working concentration at 6 µg/ml |
| IAg7-insulin P8E tetramer-BV421 | NIH tetramer Facility at Emory | per approval | Working concentration at 6 µg/ml |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS 100x) | ThermoFisher | 51500056 | Final concentraion is 1x |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Separation Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit | Miletenyi Biotec Inc | 130-104-075 | |
| Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit | Miltenyi Biotec | 130-104-075 | |
| Opti-MEM medium | ThermoFisher | 31985070 | |
| Penicillin-Streptomycin (5000U/ml) | ThermoFisher | 15070063 | 50 U/ml |
| Phoenix-ECO cells | ATCC | CRL-3214 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| pMIG II | Addgene | 52107 | |
| pMSCV-IRES-GFP II | Addgene | 52107 | |
| Purified Rat Anti-Mouse IFN-γ | BD Biosciences | 551216 | Working concentration at 3 µg/ml |
| Red cell lysis buffer | Sigma | R7767 | |
| RetroNectin | Takara | T100A | Working concentration at 50 µg/ml in PBS |
| rhIL-2 (stock concentration 105 IU/ul) | Peprotech | 200-02 | Final concentration at 200 IU/ml |
| rmIL-7 ( stock concentration 50ng/ul) | R&D | 407-ML-005 | Final concentration at 0.5ng/ml |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Sterile Cell Strainers | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Tryple | Gibco | 12605-028 |
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