Summary
本稿では、抗原特異的CD8 T細胞の生成のためのプロトコルと、インビトロおよびインビボで使用する機能性T細胞の数が多いことを目的としたインビトロでの増殖について説明する。
Abstract
1型糖尿病(T1D)は、β細胞破壊およびインスリン産生の絶対喪失につながる細胞特異的自己免疫を特徴とする。自発的非肥満糖尿病(NOD)マウスモデルでは、インスリンが主な標的であり、これらの動物の遺伝子操作により単一のキーインスリンエピトープを除去することが疾患を予防する。従って、この病原性エピトープを有する専門抗原提示細胞(APC)の選択的排除は、望ましくないインスリン特異的自己免疫応答を阻害するアプローチであり、かつより大きな翻訳可能性を有する可能性が高い。
キメラ抗原受容体(CA)は、T細胞を疾患を引き起こす抗原を選択的に標的にするようにリダイレクトすることができます。この技術は、複数の癌を治療するために養子細胞療法に細胞工学を使用する最近の試みの基礎である。このプロトコルでは、少数のナイーブ細胞から始まる機能性抗原特異的CD8 CAR-T細胞の数が多く生成される最適化されたT細胞レトロウイルス(RV)伝達およびインビトロ拡張プロトコルについて説明する。以前は複数のCAR-T細胞プロトコルが記載されていたが、典型的には、トランスダクション後のトランスダクション効率および細胞生存率が比較的低い。対照的に、当社のプロトコルは最大90%のトランスダクション効率を提供し、生成された細胞は生体内で2週間以上生存し、単回注入後の疾患発症を著しく遅らせることができます。重要な手順を簡単に実行できるように、細胞の維持および伝達プロトコルの詳細な説明を提供します。一次細胞分離からCAR式までの手順全体は、14日以内に実行できます。一般的な方法は、標的が知られている任意のマウス疾患モデルに適用されてもよい。同様に、特定の用途(病原性ペプチド/MHCクラスII複合体を標的とする)は、主要複合体が同定された他の自己免疫疾患モデルに適用可能である。
Introduction
望ましくないオフターゲット効果のリスクが減少する可能性が高いことを考えると、抗原特異的免疫療法(ASI)はT1Dなどの自己免疫疾患に対する有望な治療法です。蓄積された証拠は、(プレプロ)インスリンに対する免疫応答がT1D1において特に重要であるかもしれないことを示唆している。過去10年間、当社を含む複数のグループからの研究は、特定のMHCクラスII分子(B:9-23/MHCII)によるインスリンB鎖アミノ酸9~23を含むエピトープの提示がT1Dの開発において重要な役割を果たしていることを強く示唆している。マウスとヒト2,3,4,5.B:9-23/MHCII複合体を選択的に標的にするために、mAb287という名前のモノクローナル抗体を生成し、他のペプチド6を含むホルモンインスリンまたは複合体に対する交差反応性を有しない。MAb287はインビトロでの抗原提示をブロックし、mAb287を糖尿病前NODマウスに毎週投与すると、処置されたマウス6の35%におけるT1Dの発達を遅らせた。生体内の抗原の提示をブロックするためには、通常、高い循環濃度を維持するために頻繁な注射が必要である。我々は、T細胞を再プログラムするためにAb287の高い特異性を利用してこの困難を克服し、それによってT1D7に対する抗原特異的T細胞療法を改善できると仮定した。
細胞傷害性T細胞は、彼らの認知リガンドの単一のコピーが8、9、10を発現した場合、その標的を殺すことができると報告されている。従って、B:9-23/MHCII特異的CD8T細胞は、親抗体よりも不要な抗原提示を排除する上で高い効率を有することが期待され、その効果を発揮するために同じAPC上の複数の複合体に結合する必要が生じやすい。CAR T細胞は、複数のヒト癌11、12、13の治療に使用されており、また、自己免疫14においても有効であり続けであり、かつ有効でありうる。しかしながら、病原性ペプチド-MHC複合体に対する特異性を持つCAR-T細胞は、これまでT1Dの進行を修飾するために使用されていない。以下に説明する最適化されたCD8 T細胞伝達技術を用いて、我々は最近、これが実際に実行可能なアプローチ7を表す原理の証明を示した。
このプロトコルでは、効率的かつ合理化されたトランスダクションおよび拡張方法の概要を説明する。我々のプロトコルは、高効率のマウスCD8 CAR T細胞の生成を必要とする他の研究にも適用可能である。
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Protocol
マウスはトランスジェニックマウス施設で特定の病原体を含まない条件下で維持され、すべての動物実験はベイラー医科大学動物ケアおよび使用委員会によって承認されたプロトコルに従って行われました。
注:実験では、ウイルスとT細胞を並行して準備する必要があります。表 1は、プロトコルの概要を示しています。主要な試薬とバッファーは、材料の表に記載されています。我々は、このプロトコルにおけるAPCの特定の集団を対象とするCAR-T細胞の生成と拡大に焦点を当てる。
1. 単鎖Fab抗体(scFab)-CAの生成と検証
注:CA は通常、抗原ターゲティング ドメイン、スペーサー/膜ドメイン、および細胞質シグナル伝達ドメインの 3 つの重要なドメインを含みます。各CARの正確な設計は、意図されたターゲットに依存するので、レトロウイルスの生成に関連する構造体の主要な特徴とは別に、このプロトコルでは詳細に説明されません。以下に説明するスタディに使用される CA の全体的な設計を図 1に示します。簡単に言えば、標的ドメインは、半剛性リンカーによって連結された親モノクローナル抗体からの重鎖の全軽鎖および可変およびCH1ドメインを含む。スペーサ/膜ドメインはマウスCD28からであり、シグナリングドメインはマウスCD28、CD137(4-1BB)、およびCD247(CD3)からの要素を含む融合である。これらの要素は、スプライスオーバーラップポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、または適切な「遺伝子ブロック」の合成などの標準的な分子生物学手順によって組み立てられる。mAB287 CARの生成の詳細は、Zhangら7.cDNA配列は、要求に応じて著者から得ることができます。
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CAR コンストラクトの組み立て
- 標的単鎖Fab抗体(scFab)と結合スペーサー/シグナリングドメインを別々に合成し、最終的な構築物を組み立てる「3点」ライゲーション技術15を用いて最終構成を組み立てる(図1)。
注:CARインサートの主な要件は、レトロウイルス発現ベクターpMSCV-IRES-GFP II(pMIG II)、または関連する誘導体15へのライゲーションを可能にする側面制限エンドヌクレアーゼサイトを含むべきである。適切。
- 標的単鎖Fab抗体(scFab)と結合スペーサー/シグナリングドメインを別々に合成し、最終的な構築物を組み立てる「3点」ライゲーション技術15を用いて最終構成を組み立てる(図1)。
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CAR サーフェス式の検証
- 標準プロトコルによって生成されたpMIG II由来レトロウイルス粒子を用いてハイブリドーマ細胞をトランスデュースする(例えば、Holst et al.16)。
- CARベクトル17からGFPの発現を検出するフローサイトメトリー分析を実行する。
- マウスκ鎖に対する標識抗体を用いたトランスプリドハイブリドーマのCARの染色表面発現(例えば、クローンRMK-45)17。
注: 18.
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CAR 特異性の検証
- 適切なプレート結合または細胞抗原を用してトランスプリエドマ細胞を刺激する。一晩共培養後、上清と分泌サイトカインを採取し、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)7によりアッセイした。
注:理想的には、各 CAR は、トランスダクションに使用する前に個別に検証する必要があります。この手順では、実験を一時停止し、後で再開できます。
- 適切なプレート結合または細胞抗原を用してトランスプリエドマ細胞を刺激する。一晩共培養後、上清と分泌サイトカインを採取し、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)7によりアッセイした。
2. ウイルス産生細胞のトランスフェクション(-4~3日目)
注:レトロウイルスは、フェニックス-ECO細胞を使用して生成されます (材料の表を参照)19,20.感染の可能性のある薬剤の生成に適切な予防措置を使用する(好ましくは、指定されたBSL-2キャビネットとトランスフェクト/トランスネクテッド細胞を培養するための別個のインキュベーターを含む)。
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フェニックス細胞の解凍(日-4)
- 解凍 2 x 106フェニックスエコセル.複数のトランスダクションが計画されている場合は、フェニックスセルの数をスケールアップします。
- 10cmの組織培養皿に10mLの培地(10%胎児子牛血清(FCS)を含むダルベッコの改変イーグル培地(DMEM))でプレートする。
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パッセージフェニックス細胞(日-3)
- 培地を取り出し、ダルベッコのリン酸緩衝生理食生(DPBS)を5mLで洗浄します。
- 0.25%トリプシンの3mLを加え、37°Cで10%CO2雰囲気下で3分間インキュベートします。
- 細胞を収穫し、200 x gで3分間遠心分離によってペレットを収穫する。10 mLの新鮮な培地で細胞を再プレートし、37°Cでインキュベートします。
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フェニックス細胞の照射(1日目の午後)
- さらなる細胞分裂を最小限に抑えるために、ステップ2.2に記載されているようにフェニックス細胞を集め、培地の5mLで再中断し、氷上にガンマ照射細胞(1000rad)を照射する。
注:人的暴露を避けるために放射線作業には注意が必要です。 - 照射した細胞を遠心分離し、新鮮な培地で再中断し、2 x 106細胞(培地10mL)/プレート/CARでプレートを再濁させ、インキュベートする。
- さらなる細胞分裂を最小限に抑えるために、ステップ2.2に記載されているようにフェニックス細胞を集め、培地の5mLで再中断し、氷上にガンマ照射細胞(1000rad)を照射する。
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トランスフェクション(0日目~朝)
- フェニックス細胞から上清を吸引し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)の5mLで洗浄し、単層を乱さないようにプレートの側壁に7mLの還元血清培地(例えば、Opti-MEM)を慎重に追加します。細胞をインキュベーターに戻します。
- 14 mLの丸い底部ポリプロピレンチューブを2本取り、それぞれに1.5mLの減血液培地を加えます。1つのチューブに40 μLのトランスフェクション試薬を加えます(材料の表を参照)。
- 他のチューブに、Ab-CARプラスミド(ステップ1で生成)の15 μgと5 μgのエンベロープおよび包装プラスミド(5 μg pCL-Eco)を加えます。チューブを室温で5分間インキュベートします。
- ステップ2.4.2からチューブの側面に接触することなく、第2のチューブにドロップワイズでトランスフェクション試薬混合物を追加し、溶液を上下に3回ピペッティングして混ぜます。室温で少なくとも20分間インキュベートする。
- フェニックス細胞に3mLの混合物を滴下し、組織培養インキュベーターに入れます。
- 4-5 hの後、FCSの1 mLを追加します。37°Cで一晩培養する。
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中程度の変更(1日目)
- プラスミド/トランスフェクション試薬複合体を含む上清を取り除き、感染性物質を取り扱うための制度上の手順に従って処分する。細胞に新鮮な、事前に温められた培地の4 mLを追加します。
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トランスダクション用収穫ウイルス(2日目)
- 滅菌注射器でフェニックス細胞からウイルス含有培地を回収し、残留細胞の破片を除去するためにフィルター(0.45 μm)を取り出し、新しいチューブに集めます。
- 200 IU/mLの最終濃度にrhIL-2ストックを追加します。直ちにウイルスを使用して誘導を行います(ステップ5.3)。フェニックス細胞に4mLの新鮮な培地を加え、インキュベーターに入れ。
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繰り返しウイルス収集(3日目)
- 手順 2.6 を繰り返しますが、新鮮な培地を追加する代わりに、感染性廃棄物としてフェニックス細胞を廃棄します。この上清はステップ5.4で使用される。
3. 一次CD8 T細胞の分離と活性化(1日~0日)
注:以前は、4~5週間で雌のNODマウスからCD8T細胞を採取し、21,22日に入り口から点数を採取する。IACUC承認プロトコルに従ってすべてのマウスを処理します。CD8 T細胞は、市販の陰性選択キットを用いて脾細胞から濃縮される。
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CD3/CD28抗体を使用したコーティングプレート(1日目)
- 抗マウスCD3とCD28抗体の混合物の1 mL(PBSでは1μg/mLの両方)を24ウェルプレートの各ウェルに加え、一晩4°Cでインキュベートします。
- 翌日、マウスCD8T細胞を添加する前に、無菌PBSの1mLでプレートを3回洗浄する(ステップ4.1)。
注:コーティングされるウェルの数は、必要な活性化されたCD8 T細胞の総数に応じて、実験ごとに異なります。
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脾細胞の採取(0日目)
- CO2吸入を用いて4〜5週齢の2匹のNOD雌マウスを安楽死させ、その後首を切り落とす。脾臓を収穫し、氷上の細胞培養皿に10 mL PBSに浸漬セルストレーナーに置きます。
- 細胞培養フードで、各脾臓を3~5個に切り、3または5 mLのシリンジの無菌プランジャーで組織を押し、脾臓の断片を強制的に分離し、細胞が金網を通過できるようにします。
- 1:4希釈赤細胞リシスバッファー(1脾臓に対してPBS3mLの3mLのリシスバッファーの1mL)で脾細胞を再濁させ、室温で5分間インキュベートして赤血球を静かに除去する。
- 次いで、血球計で細胞を計数するためのトリパン青色色素溶液で細胞懸濁液の10μLを希釈し、7分間350xgで遠心分離により残りの細胞をペレット化する。
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CD8 T細胞の濃縮(0日目)
- メーカーの指示に従って、マウスCD8 T細胞絶縁キットを使用して、負の選択によってCD8 T細胞を濃縮します。
注:高純度を確保するために、添加するビオチン化抗体の体積を計算する際に常に細胞数を切り上げます(例えば、計算された9.1 x 107細胞に対して108細胞に対して推奨される試薬の体積を使用してください)。 - 1 x 108細胞あたりの400 μLの緩衝液および100 μLのビオチン抗体カクテルで細胞ペレットを中断し、冷蔵庫(4°C)で5分間よく混合してインキュベートし、抗体結合を可能にする。
- 300 μLの標識バッファーと200μLの抗ビオチンマイクロビーズを1 x 108セルにつき加え、よく混合し、4°Cで10分間インキュベートします。
- マイクロビーズのバインドを待っている間、分離列を区切り文字に設定します。ラベリングバッファーの3 mLで洗い流してカラムを洗います。
- 40 μmセルストレーナーを通してビーズ/セル混合物の1000 μLを通過してから分離カラムにロードし、細胞凝集体を除去します。カラムフロースルーを予冷やした15 mLチューブに集めます。
- 製造元の指示に従ってカラムを洗い、すべての排水を同じチューブに集めます。細胞数(ステップ3.2.4と同じ)を決定し、350 x gで5分間遠心分離で集める完全なT細胞培地(FCSを含むRPMI-1640、2-メルカプトエタノール、rhIL-2(200 U/mL)、mIL-7(0.5ng/ITSL)の2mLで再中断して細胞を洗浄する、HEPESおよびペニシリン連鎖マイシン)および遠心分離を350 x gで5分間。
- 予温められた(37°C)完全なT細胞培地で細胞を0.25-0.5 x 106/mLの濃度で再中断する。
- メーカーの指示に従って、マウスCD8 T細胞絶縁キットを使用して、負の選択によってCD8 T細胞を濃縮します。
4. T細胞活性化(0~2日目)
- ステップ3.1.2からCD3/CD28抗体コーティングされた24ウェルプレートの各コーティングウェルに細胞懸濁液(0.25-0.5 x 106/mL)の2mLを追加します。細胞を均等に分配するために旋回運動を使用してください。
注:旋回モーションを使用してセルを追加して均等に分散し、エッジ効果を最小限に抑えます。細胞がウェルの端に沿ってクラスター化すると、伝達速度と細胞生存率の両方が減少します。 - 対照として、同じ数のCD8 T細胞をプレートの単一の非コーティングウェルにプレートする。10%CO2ガス化インキュベーターを用いて37°Cで細胞をインキュベートし、48時間使用します。
注:48時間後、顕微鏡を用いて活性化を確認できる。活性化された細胞は、抗CD3/CD28抗体に遭遇しなかった細胞よりも大きくなります。
[図2はこちら]
5. 活性化CD8 T細胞の経度(1~3日目)
注:このプロトコルは、スピントランスダクション方式を使用します。37°Cの内部温度を維持することができるスイングアウトローターおよびティッシュ培養板のアダプターが付いている遠心分離機は要求される。最大の効率を確保するために、トランスダクションの日に、ウイルスを収集する前に遠心分離機を37°Cに事前に温めます。
- 準備ヒトフィブロネクチン断片コーティングプレートの(1日目から2日目)
- 1日目に、24ウェルプレートのウェルにフィブロネクチン(PBSで50 μg/mL)のフィブロネクチン0.5mLを加え、4°Cで一晩インキュベートします。
注:通常、トランスフェクトされたフェニックス細胞のプレートごとに2つのフィブロネクチンコーティングウェルが必要です。 - 2日目にフィブロネクチン溶液を取り出し、PBSで2%ウシ血清アルブミン(BSA)の1mLに置き換える。室温で30分間インキュベートし、非特異的結合部位を「ブロック」します。
- 処理されたウェルを無菌PBSの1 mLで洗浄します。洗浄液を取り除くと、プレートは使用する準備ができています。または、1週間まで4°Cで密封し、保存することができます。
- 1日目に、24ウェルプレートのウェルにフィブロネクチン(PBSで50 μg/mL)のフィブロネクチン0.5mLを加え、4°Cで一晩インキュベートします。
- 活性化CD8 T細胞の回収(2日目)
- 活性化されたCD8 T細胞を収穫し、トリパンブルーまたは適切な自動化された器具を使用して細胞生存率をカウントおよび計算する。
- 遠心分離によって細胞を収集し、5 x 106生存細胞/mLで再中断してトランスダクションします。CO2インキュベーター内の完全なT細胞培地中の培養中の細胞の小さなアリコートを維持し、トランスプリケート細胞のその後の蛍光活性化細胞選別に対する制御を提供する(ステップ6)。
注:48時間の活性化後、細胞の総数は約1.5倍増加し、生存率は95%を超えるはずです。
- トランスダクション(2日目)
- フィブロネクチンコーティングプレートに、活性化CD8細胞懸濁液(0.5 x 106細胞)を100μL添加します。次に、ウイルス含有培地の1.5~2mL(ステップ2.6から)を各ウェルに加えます。渦巻く動きを使って混ぜて細胞を均等に分配する(図2)。
- プレートをジップロックビニール袋に入れ、シールを締め付けます(二次封じ込めを提供します)。遠心分離機 2000 x gで 37 °C で 90 分です。
- 遠心分離機からプレートを取り出します。生物学的安全性では、キャビネットは慎重にビニール袋を取り外し、プレートの外側が媒体で汚染されていないことを確認します。
- 次いでプレートを専用の37°CCO2インキュベーターに移します。4時間後、各ウェルから培地の1 mLを取り出し、予め温めた完全Tセル培地の1mLに置き換えます。CO2インキュベーターのプレートを交換してください。
注:変換された細胞からのすべてのメディアを感染性廃棄物として取り扱います。
- 2回目の経度(3日目)
- 専用の生物学的安全キャビネットでは、蓋の上に置いて、加電細胞を含むプレートを傾斜させ、慎重に媒体のほとんどを取り除き(100〜200 μLを残して)、井戸の底部の細胞に接触しないようにします。
- 手順 2.7 で収集したウイルス含有培地を追加し、手順 5.3.2 ~ 5.3.4 を繰り返します。
注:私たちの経験では、第3のトランスダクションは、めったに全体的な効率を向上しません。さらに、3回目のトランスダクションを使用すると、細胞の生存率が大幅に低下する可能性があります。細胞が0.5 x 106/ウェルよりも高い濃度でめっきされた場合、T細胞は第2のトランスダクションステップに続く一晩インキュベーション後に合流に達してもよい。このイベントでは、3日目に4時間インキュベーション後に細胞を分割する。
- 洗浄細胞(4日目)
- 各ウェルから1mLの培地を取り出し、残りの培地中の細胞を再転移させ、15mLチューブに移す。完全なT細胞培地の1 mLでウェルを洗浄し、各トランスダクションからプールされた細胞を含むチューブに追加します。
- 遠心分離機を350 x gで7分間、その後、完全なT細胞培地の2mLで再中断して2回洗浄し、ペレット化する。最後に培地の2mLで再中断し、細胞数を決定する。
注: 1 x 106 細胞が最初に変換された場合、この段階での収率は ~3 x 106 である必要があります。
- 転送
- 0.5-1 x 106細胞のアリコートを2mLの完全T細胞培地に移し、新しい24ウェルプレートのウェルに移し、37°Cでインキュベートする。約48〜72時間のトランスダクション後の細胞はCAR発現分析および細胞選別の準備ができている。
注:CAR-T 細胞の数は、通常、この段階で各 24 時間を倍増します。彼らを成長させないことは決して重要です。密度が 2 x 106/mL より高い場合(または培地が明るい黄色になる場合)、すぐにセルを分割します。私たちの経験では、CAR-T細胞は、より大きな容器に移された場合よりも24ウェルプレートと12ウェルプレートでより堅牢に増殖します。
- 0.5-1 x 106細胞のアリコートを2mLの完全T細胞培地に移し、新しい24ウェルプレートのウェルに移し、37°Cでインキュベートする。約48〜72時間のトランスダクション後の細胞はCAR発現分析および細胞選別の準備ができている。
6. 蛍光活性化細胞選別(FACS)によるトランスプリケーション細胞の精製(5日目または6日目)
- セルを収集します。
- 上下に複数回ピペッティングして細胞を再中断(泡立てを引き起こさない場合に注意)、15mLチューブに移し、遠心分離機を350 x gで5分間送り換えます。
- 1 x 106細胞/mLでソートバッファー(ゲンタマイシンを含む無菌PBSで2%BSA)を再懸濁する。また、ステップ5.2から対照(未変換)CD8 T細胞を収穫する。
注:2日目に1 x 106細胞から、この時点で〜2 x 107のトランスプリケート細胞の収率が期待される。
- 350 x gで5分間遠心分離してソートバッファーで細胞を1回洗い、ソートバッファーで1 x 107セル/mLで再中断します。Foxp3GFP補正制御用の小さなアリコート(ステップ6.4.1で使用する)を取り除き、残りを標識された抗マウスCD8(クローン53-6.7;抗体/5 x 106細胞の0.2μg)で染色し、4°Cで20分間インキュベートします。
- 同様に、非トランス化されたCD8 T細胞のアリコートを染色し、抗CD8抗体を標識する蛍眼球に対する補償制御を提供する。
注: これは細胞に有毒であるので、任意のバッファーにアジドナトリウムを追加することは避けてください。
- 同様に、非トランス化されたCD8 T細胞のアリコートを染色し、抗CD8抗体を標識する蛍眼球に対する補償制御を提供する。
- 標識された細胞をソートバッファーで2回洗浄し、1 x 107セル/mLでコールドソートバッファで再中断する。
- セルを並べ替えます。
- CD8 GFP+陽性細胞をチルド済み完全なT細胞培地に並べ替える(図3B)。ポストソート分析のために小さなアリコートを取り、純度を決定します。
注:ソートされた細胞の純度を最大化するためにタイトなゲートを使用する必要があります。100 μm のノズルを使用して、高いセルの生存率を確保します。選別されたセルが氷の上に保持される時間を最小限に抑えます。3時間以上氷の上に保持されているT細胞は、2時間未満で冷やされた細胞よりも回復にはるかに長い時間がかかります。したがって、3つの変換された細胞株をソートする必要がある場合は、2番目の行と3番目の行が0°Cで延長時間を費やすのではなく、最初の行がソートされている間に2番目の行を収集し、ラベルを付けます。CD28 や CD3 などの他の T セル マーカーの発現も監視できます (図 3C)が、ソートの目的には必須ではありません。 - (代替ソート戦略)バルク集団を染色する前に、トランスプリケートされたT細胞の小さな集団のCD8発現を分析する。純度が >99% の場合、バルク母集団は GFP 式のみに基づいて安全に並べ替えることができます。
- CD8 GFP+陽性細胞をチルド済み完全なT細胞培地に並べ替える(図3B)。ポストソート分析のために小さなアリコートを取り、純度を決定します。
7. 選別されたCAR-T細胞の拡張(5日目~10日目)
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CAR-Tセル拡張
- 選別されたCAR-T細胞を1回洗浄し、2.5-5 x 105セル/mLで予め温めた完全なT細胞培地に再び流し、24ウェルプレートに2mLアリコートをプレートします。
- 1~2日ごとにセルをカウントして分割します。通常、細胞数は10日まで毎日倍増し、生存率は95%を超えるままである。
注:再刺激なしで、CAR-T細胞は10日目頃に増殖を停止し、最終的に死ぬ。したがって、T細胞機能アッセイおよび養子転移はそれに応じてスケジュールされるべきである。
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代替拡張戦略
- ソート後、200U/mLではなく100U/mLでrhIL-2を含む完全T細胞培地でCAR-T細胞を培養する。
注:CAR-T細胞は、この培地でわずかに遅い速度で増殖する。しかし、彼らはしばしば再刺激なしで11日から13日まで増殖し続けます。したがって、この代替膨張戦略は、より多くの細胞を生成しないが、下流アッセイを実行するためのわずかに長い時間枠を提供する。
- ソート後、200U/mLではなく100U/mLでrhIL-2を含む完全T細胞培地でCAR-T細胞を培養する。
8. CAR T細胞の抗原特異性と機能性の検証
注:ペプチド/MHC複合体を標的とするCAR T細胞の結合特異性は、テトラマー染色7、23によって検証することができる。同様に、その機能性は、その認知リガンドによる刺激後のサイトカイン分泌または細胞傷害性を測定することによって確認することができる。エモリー大学のNIHテトラマーコアファシリティ(TCF)は、「テトラマー」および関連する染色プロトコルの推奨ソースです。
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ペプチド-MHCテトラマー染色.
- 2 x 105の培養CAR-T細胞の標識アリコートを100μLのソートバッファーで、蛍光標識抗原特異的および制御テトラマーの約0.6μgを2時間37°Cでインキュベートした。
- 350 x gで5分間遠心分離によって細胞をペレットし、その後、ソートバッファーと再遠心分離の0.5 mLで再中断することによって2回洗浄する。最後に、ソートバッファーの300μLで細胞を再中断し、フローサイトメトリーによって分析する(図4)。
注:これらの研究では、通常、BV421標識 IAg7-B:9-23(RE) (テスト) と IAg7-HEL (対照) テトラマーを使用します。ただし、調査中の CAR に適した蛍動管/テトラマーの組み合わせは、代わりに使用できます。この場合、使用する各テトラマーに対して濃度と染色時間を最適化する必要があります。ソートされたCAR-T細胞と未ソートの両方のCAR-T細胞は、テトラマー染色に使用することができます。
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リガンド刺激による特異性測定
- 適切なプレート結合または細胞リガンドを用いたサイトカインフリーT細胞培地の200μLで2x 105を選別したCAR-T細胞をインキュベートする。
- 6-24時間後にELISAまたはメーカーのプロトコルを使用して細胞内染色によるサイトカイン産生を測定します。
注:IAg7-B:9-23 リダイレクトされたT細胞の研究のために、我々はIAg7-B:R3または「空」IA g724、25を発現するM12C3マウスB細胞リンパ腫細胞で一晩細胞を培養する。次いで、上清を収集し、ELISA26(図5)によって分泌されたマウスインターフェロンガンマ(IFN-γ)を測定する。
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Representative Results
典型的には、このプロトコルを用いたトランスダクション効率は〜60〜90%である。図3に示す実験では、約ソート前に、CD8T細胞の70%がGFPを共発現した。彼らはまた、CD28とCD3(図3C)を共発表現しました。重要なことに、すべての「テスト」GFP+細胞もIA g7-B:R3テトラマーと共染色したが、対照テトラマーとは一致しない(図4)。同様に、並べ替えられたCAR-T細胞は、それぞれのコグネイトリガンドを発現する標的細胞との共培養後にのみ高レベルのIFN-γを分泌した(図5)。これは、トランスプリエテッド細胞が親抗体の標的に向けられたCD8エフェクターT細胞表現型を有することを確認する。
図1:CARレトロウイルス構造の概略図。CARは、適切なマウスモノクローナル抗体のFab断片に由来するターゲティングドメインと、マウスCD28、CD137およびCD247からのスペーサー/膜アンカー/シグナル伝達ドメインを含む。合成cDNAは、pMIG-IIレトロウイルス発現ベクターに挿入される。mAb287-CARの生成に使用される制限エンドヌクレアーゼ部位が示されている。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:細胞分布に対する異なるめっき方法の効果(左)旋回モーションを使用してピペットされたセルは、偶数分布を示します。(右)細胞を井戸の中心に直接ピペットさせた。画像は350 x gで5分間回転した後に撮影されました。
図3:トランスメトリートT細胞のフローサイトメトリック解析細胞は、ステップ6.4に記載されているように、PE-Cy7共役抗CD8、AF647共役抗CD3、およびBV421共役抗CD28と共染色した。単一の実行可能セル上でゲートされたプロファイルが表示されます。(A) 染色されていない親のCD8 T細胞。(B) トランスプリケート細胞のPE-Cy7/GFPプロファイル。CAR発現細胞は、GFPレポーターによって識別される。(C)染色されたトランス化細胞をPE-Cy7/GFP二重陽性にゲートした。AF647/BV421 プロファイルが表示されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:未選分けCAR-T細胞のテトラマー染色。細胞は、ステップ8.1に記載されているようにBV421共役テトラマーで染色した。単一の実行可能セル上でゲートされたプロファイルが表示されます。(A) 試験IAg7-インスリンテトラマー。(B) 制御 I-Ag7-HEL テトラマー。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:CAR T細胞による抗原特異的サイトカイン分泌試験mAb287または対照mAb24.1 CARを発現するソートされたCD8 T細胞を、IA g7-B:R3、「空」IAg7、またはTFR-MBP-DTRL(mAb24.1のリガンド)を表すM12C3細胞と共培養した。24時間後、分泌されたIFN-γ ELISAをELISAにより定量した。両方のT細胞株の特異的刺激が観察された。データは3回の繰り返し実験の平均±SDを表す。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 時間 | ウイルス製剤 | T細胞製剤 |
| 日-4(金) | フェニックス細胞の解凍(PM) | |
| 3日目(土) | フェニックスのリプレート | |
| 2日目(日) | 休日 | |
| 1日目(月) | フェニックス細胞を照射(PM) | CD3/CD28 Ab付きコーティング非処理プレート |
| 第0日(火) | フェニックス細胞のトランスフェクション(AM) | 脾細胞を調作し、CD8 T細胞を単離する。 |
| T細胞活性化。 | ||
| 1日目(水曜日) | フェニックス細胞を中程度に4ml(AM)に変更する。 | コート レトロネクチン |
| 2日目(木) | ウイルスを収集し、補充。 | 経度、CD8 T細胞 |
| 3日目(金) | ウイルスを収集します。 | 経度、CD8 T細胞 |
| 4日目(土) | 細胞を洗浄し、細胞を膨張させる。 | |
| 5日目(日) | 必要に応じてセルの拡張。 | |
| 6日目(月曜日) | CAR-T セルの並べ替え。 | |
| 7日目~10日目(火~金) | T CAR-セルの拡張。実験。 |
表 1: CAR-T 生成プロトコルの概要。
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Discussion
このプロトコルは、レトロウイルス伝達によって抗原特異的CD8 CAR-T細胞を産生するための効率的な方法を説明する。私たちのプロトコルのトランスダクション効率は一般的に高く、CARの堅牢な発現は一般的に観察されます。拡張されたCAR T細胞は、親活性化T細胞の本質的な特徴、および抗体特異性を保持し、インビトロおよびインビボ使用の両方に適している。NODマウス7における1型糖尿病の再プログラムにAb-CAR CD8 T細胞を適用した。
私たちのプロトコルは、前述の方法にいくつかの重要な変更を組み込んでいます。まず、最適化されたT細胞培養培地を用いて、活性化時間を延長します。記載された完全な培地は、いくつかの主要なサプリメントの最適なレベルを含み、T細胞の生存率と活性化後の増殖の程度の両方を有意に改善する。なお、マウスIL-2は同等の結果を持つヒトタンパク質に置き換えることができるが、現時点では、ヒトIL-2はより手頃な価格である。なお、24時間活性化工程を用いた場合よりも40〜48時間活性化されたT細胞を用いて、著しく高い経導効率が得られる。
第二に、ポリブレンB(T細胞に有毒である)を排除し、代わりにフィブロネクチンを使用する改良されたトランスダクション手順を使用します。これにより、細胞の生存率がさらに向上します。良好な経発性を保証するためには、T細胞を適切な細胞密度で最適化された培地に維持し、以前に凍結したウイルスではなく、新鮮な高力潮ウイルス上清を使用することが重要であることに留意されたい。私たちの修正された手順を使用すると、3番目のトランスダクションステップは不要であり、3番目のスピン感染ステップが含まれている場合、生存率は通常低下するため、実際には望ましくありません。また、膨張段階で細胞が過剰に成長させないことが重要であることを強調する必要があります。細胞が成長し過ぎたら、彼らは急速に表現型を失い、死ぬ傾向があります。
上記のパラメータに加えて、トランスダクション効率/生存率が低い他の2つの潜在的な原因は避ける必要があります。第一に、トランスフェクション段階で抗生物質が存在してはならないため、プラスミドがエンドトキシンフリーキットを使用して調製され、滅菌水に溶解し、常に良好な滅菌技術が使用されることを確認することが重要です。第二に、死死または死死のT細胞の高レベルの存在は避けなければならない。活性化された親のCD8 T細胞懸濁液が死んだ細胞または細胞の破片の高レベルを含んでいる場合、これは商業キットを使用して伝達する前に除去されるべきである。
我々の経験では、凍結保存および解凍中に転移した細胞のかなりの割合が死亡するように、我々は意図的にこのプロトコルにCAR-T細胞凍結ステップを含んでいない。同様に、拡張されたCAR-T細胞はインビトロで再刺激することができるが、それらはトランスジーンの発現を失う傾向が高まっている。したがって、新たに選別されたCAR-T細胞を用いて観察する高い増殖を考えると、機能的アッセイや養子転写には新たに生成されたCAR-T細胞のみを使用することを強くお勧めします。
要約すると、このプロトコルの重要性は、高い伝達効率を提供し、インビトロおよびインビボで使用するための健康な抗原特異的マウスCD8細胞を多数生成する手順を記述することである。我々のプロトコルは、このように病気のマウスモデルでCAR-T細胞研究を行う研究者のための有用なツールを提供します。
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Disclosures
MAb287およびそのデリバティブは、2014年に発行された米国特許によって保護されています。
Acknowledgments
本研究は、JDRF助成金1-INO-2015-74-S-B、2-SRA-2016-238-S-B、SRA-2-S-2018-648-S-B、糖尿病教育・行動賞、キャロライン・ウィーズ法基金(ベイロー・カレッジ)の支援を受けています。細胞選別は、NIH(S10RR024574およびP30CA125123)からの資金でベイラー医科大学の細胞メトリーおよび細胞選別コアによってサポートされました。すべてのペプチド-MHCテトラマーは、NIHテトラマーコア施設から得られた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol (50mM) | Gibco | 21985-023 | 50 μM |
| 5’ RACE PCR | Clontech | 634859 | |
| anti-mouse CD28 antibodies | eBioscience | 14-0281-86 | final concentration at 1µg/ml |
| anti-mouse CD3e antibody | eBioscience | 145-2C11 | final concentration at 1µg/ml |
| Biotin Rat Anti-Mouse IFN-γ | BD Biosciences | 554410 | Working concentration at 0.5 µg/ml |
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Endo-free Maxi-Prep kit | Qiagen | 12362 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | Final 50 µg/ml. |
| Heat inactivated FCS | Hyclone | SH30087.03 | Final 10% FCS |
| HEPES (100X) | Gibco | 15630-080 | 1X |
| IAg7-CLIP tetramer-BV421 | NIH tetramer Facility at Emory | per approval | Working concentration at 6 µg/ml |
| IAg7-insulin P8E tetramer-BV421 | NIH tetramer Facility at Emory | per approval | Working concentration at 6 µg/ml |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS 100x) | ThermoFisher | 51500056 | Final concentraion is 1x |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Separation Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit | Miletenyi Biotec Inc | 130-104-075 | |
| Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit | Miltenyi Biotec | 130-104-075 | |
| Opti-MEM medium | ThermoFisher | 31985070 | |
| Penicillin-Streptomycin (5000U/ml) | ThermoFisher | 15070063 | 50 U/ml |
| Phoenix-ECO cells | ATCC | CRL-3214 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| pMIG II | Addgene | 52107 | |
| pMSCV-IRES-GFP II | Addgene | 52107 | |
| Purified Rat Anti-Mouse IFN-γ | BD Biosciences | 551216 | Working concentration at 3 µg/ml |
| Red cell lysis buffer | Sigma | R7767 | |
| RetroNectin | Takara | T100A | Working concentration at 50 µg/ml in PBS |
| rhIL-2 (stock concentration 105 IU/ul) | Peprotech | 200-02 | Final concentration at 200 IU/ml |
| rmIL-7 ( stock concentration 50ng/ul) | R&D | 407-ML-005 | Final concentration at 0.5ng/ml |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Sterile Cell Strainers | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Tryple | Gibco | 12605-028 |
References
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