Summary
本文介绍了一种用于生成抗原特异性CD8 T细胞及其在体外扩张的协议，目的是产生大量功能性T细胞，用于体外和体内。
Abstract
1型糖尿病（T1D）的特点是小岛特异性自身免疫，导致β细胞破坏和胰岛素生产绝对损失。在自发的非肥胖糖尿病（NOD）小鼠模型中，胰岛素是主要目标，而这些动物的基因操作，以去除单键胰岛素表位预防疾病。因此，选择性地消除带有这种致病性表位的专业抗原呈现细胞（APC）是抑制不需要的胰岛素特异性自身免疫反应的方法，并且可能具有更大的转化潜力。
嵌合抗原受体（CARs）可以重定向T细胞，选择性地靶向致病抗原。这项技术是最近尝试使用细胞工程治疗多种癌症的基础。在此协议中，我们描述了优化的T细胞逆转录病毒（RV）转导和体外扩张协议，该协议产生大量功能抗原特异性CD8 CAR-T细胞，从少量幼化细胞开始。以前已经描述了多个CAR-T细胞协议，但转导后转导效率和细胞生存能力通常相对较低。相比之下，我们的方案提供高达90%的转导效率，产生的细胞可以在体内存活两周以上，并在一次输注后显著延缓疾病的发病。我们提供了细胞维护和转导协议的详细说明，以便轻松遵循关键步骤。从主细胞分离到CAR表达的整个过程可以在14天内执行。通用方法可应用于已知目标的任何小鼠疾病模型。同样，具体应用（针对致病肽/MHC II 类复合物）适用于已识别关键复合物的任何其他自身免疫疾病模型。
Introduction
鉴于不必要的脱靶效应可能降低的风险，抗原特异性免疫疗法（ASI）有望治疗T1D等自身免疫性疾病。累积的证据表明，在T1D1中，对（前亲）胰岛素的免疫反应可能特别重要。在过去十年中，来自多个组（包括我们自己的组）的研究表明，由特定的MHC II类分子（B：9-23/MHCII）呈现含有胰岛素B链氨基酸9至23的表位在T1D的发展中起着重要作用。老鼠和人类2，3，4，5。为了有选择地瞄准B：9-23/MHCII复合物，我们产生了一种名为mAb287的单克隆抗体，这种抗体对含有其他肽6的激素胰岛素或复合物没有交叉反应。MAb287阻断体外抗原的呈现，每周给糖尿病前期NOD小鼠的mAb287分，延迟了35%的受治疗小鼠T1D的发育。为了阻断体内抗原的呈现，通常需要频繁注射以保持高循环浓度。我们假设，我们可以克服这一困难，利用Ab287的高特异性重新编程T细胞，从而为T1D7提供更好的抗原特异性T细胞治疗。
据报道，细胞毒性T细胞能够杀死他们的目标，即使一个单一的副本，他们的共生配体表示8，9，10。因此，B：9-23/MHCII 特异性CD8 T细胞在消除不需要的抗原表达方面比母抗体具有更高的效率，后者可能需要与同一APC上的多个复合物结合以发挥其作用。CAR T细胞已用于治疗多种人类癌症11，12，13，也可能有效在自身免疫14。然而，对致病性肽-MHC复合物具有特异性的CAR-T细胞迄今尚未用于改变T1D的进展。通过使用下面描述的优化的CD8 T细胞转导技术，我们最近证明了原理证明，这确实代表了一种可行的方法7。
在此协议中，我们概述了一种高效、简化的转导和扩展方法。我们的协议适用于需要高效生成小鼠 CD8 CAR T 细胞的其他研究。
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Protocol
小鼠在转基因小鼠设施的特定无病原体条件下进行，所有动物实验均按照贝勒医学院动物护理和使用委员会批准的规程进行。
注：实验需要同时制备病毒和T细胞。表 1总结了协议。关键试剂和缓冲液列在材料表中。我们专注于生成和扩展针对该协议中特定 APC 人群的 CAR-T 细胞。
1. 单链Fab抗体（scFab）-CARs的生成和验证。
注：CARs通常包含3个关键域——抗原靶向域、间隔/跨膜域和细胞质信号域。每个 CAR 的精确设计取决于预期目标，因此，除了与逆转录病毒生成相关的构造的关键功能外，本协议中不会详细描述。用于下述研究的 CARs 的整体设计如图1所示。简而言之，靶向域包括由半刚性链接器链接的母单克隆抗体的重链的整个轻链和可变和CH1域。隔距/跨膜域来自鼠标 CD28，信令域是包含鼠标 CD28、CD137 （4-1BB） 和 CD247 （CD3*） 元素的融合。这些元素通过标准分子生物学程序组装，如拼接重叠聚合酶链反应（PCR），或合成适当的"基因块"。mAB287 CAR的产生详情载于张等人7。cDNA序列可应请求从作者那里获得。
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组装 CAR 构造
- 分别合成靶向单链Fab抗体（scFab）和组合间隔器/信令域，并使用"3点"连接技术15组装最终结构（图1）。
注：CAR插入的关键要求是，它应该包含侧翼限制内切酶位点，允许结扎到逆转录病毒表达载体pMSCV-IRES-GFP II（pMIG II），或相关的导数15也适当。
- 分别合成靶向单链Fab抗体（scFab）和组合间隔器/信令域，并使用"3点"连接技术15组装最终结构（图1）。
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CAR 表面表达式的验证
- 使用由标准协议（例如，Holst等人16）产生的pMIG II衍生的抗逆转录病毒颗粒，转导杂交细胞。
- 运行流细胞学分析，以检测来自CAR向量17的GFP的表达。
- 使用标记抗体对抗小鼠的CAR的染色表面表达（例如，克隆RMK-45）17。
注：18。
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CAR 特异性验证
- 用适当的板束或细胞抗原刺激转导杂交细胞。经过一夜共培养收集上生和分泌细胞因子，并通过酶连结免疫吸附剂测定（ELISA）7。
注：理想情况下，每个CAR在用于转导之前应独立验证。在此步骤中，实验可能会暂停并稍后重新启动。
- 用适当的板束或细胞抗原刺激转导杂交细胞。经过一夜共培养收集上生和分泌细胞因子，并通过酶连结免疫吸附剂测定（ELISA）7。
2. 病毒产生细胞的转染（第-4天至第3天）
注：逆转录病毒是使用凤凰-ECO细胞（见材料表）19、20产生。对潜在传染性药物（最好包括指定的BSL-2机柜和用于培养转染/转导细胞的单独培养箱）采取适当的预防措施。
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解冻凤凰细胞（第4天）
- 解冻 2 x 106凤凰-生态细胞。如果计划多个转导，则扩大凤凰细胞的数量。
- 用10mL的培养皿（Dulbecco的改性鹰培养基（DMEM）含有10%胎儿小牛血清（FCS））将其盘在10厘米的组织培养皿中。
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通道凤凰细胞（第-3天）
- 去除介质，用5 mL的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS）清洗。
- 加入3 mL 0.25%胰蛋白酶，在37°C下10%CO2大气孵育3分钟。
- 在200 x g下通过离心粒收获细胞3分钟。用10mL新鲜培养基重新盘细胞，在37°C下孵育。
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凤凰细胞的辐照（第二天-1日下午）
- 为了进一步减少细胞分裂，如步骤2.2所述，收集凤凰细胞，在5mL的介质中重新悬浮，并在冰上（1000 rad）收集伽玛辐照细胞。
注：在辐射工作时应小心谨慎，避免人员接触。 - 离心辐照细胞，在新鲜介质中重新悬浮，在2 x 106细胞（在10mL的介质中）/板/CAR，并孵育。
- 为了进一步减少细胞分裂，如步骤2.2所述，收集凤凰细胞，在5mL的介质中重新悬浮，并在冰上（1000 rad）收集伽玛辐照细胞。
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转染（第0天 - 上午）
- 从凤凰细胞中吸出上清液，用5mL的磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤，并小心地将7mL的减量血清介质（例如Opti-MEM）滴到板的侧壁上，以避免干扰单层。将细胞转移回孵化器。
- 取两个14 mL圆底聚丙烯管，并为每个甲烷中加入1.5 mL的减压血清介质。在一根管子中，加入40μL的转染试剂（见材料表）。
- 另一管中，加入15μgAb-CAR质粒（在步骤1中生成）和5μg包络和包装质粒（5μg pCL-Eco）。在室温下孵育管5分钟。
- 将步骤 2.4.2 滴入第二管的转染试剂混合物，无需接触管侧，然后通过上下轻轻移液 3 次混合。在室温下孵育至少20分钟。
- 将3 mL的混合物滴滴到凤凰细胞中，并放入组织培养箱中。
- 4~5小时后添加1 mL的FCS。在37°C下培养细胞过夜。
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中等变化（第 1 天）
- 去除含有质粒/转染试剂复合物的上清液，并按照处理传染性物质的机构程序处理它们。向细胞中加入4 mL的新鲜预加热培养基。
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转导的收获病毒（第2天）
- 用无菌注射器从凤凰细胞收集含病毒的培养基，过滤（0.45 μm）以清除残留的细胞碎片，并收集到新的管中。
- 将 rhIL-2 库存添加到 200 IU/mL 的最终浓度中。立即使用病毒进行转导（步骤 5.3）。向凤凰细胞中加入4mL的新鲜培养基，并放入孵化器中。
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重复病毒收集（第 3 天）
- 重复步骤2.6，但丢弃凤凰细胞作为传染性废物，而不是添加新鲜的培养基。此上清液在步骤 5.4 中使用。
3. 初级 CD8 T 细胞分离和激活（天 -1 到第 0 天）
注：以前，在4~5周时从雌性NOD小鼠身上收集CD8 T细胞，在小岛炎症开始前的一个时间点21、22。按照IACUC批准的协议处理所有小鼠。CD8 T 细胞使用商业负选择试剂盒从血细胞中丰富。
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带有 CD3/CD28 抗体的涂层板（第-1 天）
- 在24孔板的每个孔中加入1mL的抗小鼠CD3和CD28抗体混合物（在PBS中均为1μg/mL），并在4°C下孵育过夜。
- 第二天，在加入鼠CD8 T细胞（步骤4.1）之前，用1mL的无菌PBS清洗板3次。
注：每个实验的涂井数量会有所不同，具体取决于所需的激活 CD8 T 细胞的总数。
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splecy细胞集合（第0天）
- 使用CO2吸入，对两只4-5周为年龄为4-5周的NOD雌性小鼠实施安乐死，然后斩首。收获脾脏，并把它们放在细胞过滤器浸泡在10 mL PBS在冰上的细胞培养皿。
- 在细胞培养罩中，将每个脾脏切成3~5片，用3或5 mL注射器的无菌柱塞压榨组织，迫使脾脏碎片分开，让细胞通过铁丝网。
- 通过在1：4稀释的红细胞裂解缓冲液中重新悬浮血细胞（1 mL的裂解缓冲液，在3 mL的PBS中用于一个脾脏），并在室温下孵育5分钟，轻轻去除红血球。
- 然后，用锥形蓝色染料溶液稀释细胞悬浮液10μL，用造血仪计算细胞，并在350 x g下离心7分钟，将其余细胞颗粒。
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CD8 T 细胞的浓缩（第 0 天）
- 按照制造商的说明，使用鼠标 CD8 T 细胞隔离套件通过负选择丰富 CD8 T 细胞。
注：为确保高纯度，在计算要添加的生物素化抗体体积时，始终将细胞数量四舍五入（例如，使用108个细胞建议的试剂体积计算为计算出的9.1 x 107细胞）。 - 每1 x 108细胞在400μL缓冲液中悬浮细胞颗粒和100μL生物素抗体鸡尾酒，在冰箱（4°C）中混合5分钟，允许抗体结合。
- 每1 x 108细胞加入300μL的标签缓冲液和200μL的抗生物素微珠，混合良好，在4°C下孵育10分钟。
- 在等待微珠绑定时，将分离列设置到分隔符上。用3 mL的标签缓冲液冲洗柱子清洗柱。
- 在加载到分离柱以去除细胞聚合体之前，通过 40 μm 细胞过滤器将 1000 μL 的珠/细胞混合物通过。将柱流收集到预冷却的 15 mL 管中。
- 按照制造商的指示清洗柱子，将所有污水收集到同一管中。确定细胞数（与步骤3.2.4相同），通过离心在350 x g收集5分钟。 洗涤细胞，在2 mL的完整T细胞培养基（RPMI-1640中含有FCS，2-汞醇，rhIL-2（200 U/mL），mIL-7（0.5纳克/mL），ITS，HEPES和青霉素-链霉素）和离心在350 x g5分钟。
- 以0.25~0.5 x 106/mL的浓度将细胞重新悬浮在预热前（37°C）完整的T细胞培养基中。
- 按照制造商的说明，使用鼠标 CD8 T 细胞隔离套件通过负选择丰富 CD8 T 细胞。
4. T细胞激活（第 0 天至 2 天）
- 从步骤 3.1.2 向 CD3/CD28 抗体涂层 24 孔板的每个涂层孔添加 2 mL 的细胞悬浮液（0.25*0.5 x 106/mL）。使用旋转运动均匀地分配细胞。
注：使用旋转运动添加单元格以均匀分布它们并最小化边缘效果。如果细胞沿着井的边缘聚集，转导率和细胞存活率都会降低。 - 作为对照，将相同数量的CD8 T细胞板放入单个非涂层孔的板中。使用10%CO2气体培养箱在37°C孵育细胞48小时。
注：48小时后，使用显微镜确认激活;活化细胞将大于未接触抗CD3/CD28抗体的细胞。
[此处放置图 2]
5. 激活CD8 T细胞的转导（第1至3天）
注：此协议使用自旋转导方法。需要具有回转转子和组织培养板适配器的离心机，能够保持37°C的内部温度。为确保最大效率，在转导当天将离心机预热至37°C，然后再收集病毒。
- 准备人类纤维化丁片的涂层板（第1天至第2天）
- 在第1天，在24孔板的井中加入0.5 mL的纤维素（PBS中50微克/mL），并在4°C下孵育过夜。
注：通常，每盘转染的凤凰细胞需要两口纤维化涂层孔。 - 第2天，去除纤维素溶液，并在PBS中用1 mL的2%牛血清白蛋白（BSA）代替。在室温下孵育30分钟，以"阻止"非特定结合位点。
- 用1 mL无菌PBS清洗经过处理的井。取出洗涤液后，板即可使用;或者，可以密封并在4°C下储存长达一周。
- 在第1天，在24孔板的井中加入0.5 mL的纤维素（PBS中50微克/mL），并在4°C下孵育过夜。
- 已激活 CD8 T 细胞的集合（第 2 天）
- 使用锥蓝色锥度蓝或合适的自动仪器采集激活的CD8 T细胞，计算细胞活力。
- 通过离心收集细胞，并在5 x 106活细胞/mL处重新悬浮，用于转导。在CO2培养箱中的完整T细胞培养基中保持一小块等分细胞，为转导细胞的后续荧光激活细胞分类提供控制（步骤6）。
注：激活48小时后，细胞总数应增加约1.5倍，且存活能力大于95%。
- 转导（第 2 天）
- 将每孔激活CD8细胞悬浮液（0.5 x 106细胞）加入100 μL活性CD8细胞悬浮液，加入纤维素涂层板。然后向每个井添加 1.5⁄2 mL 的含病毒介质（从步骤 2.6 开始）。使用旋转运动混合以均匀地分配细胞（图2）。
- 将板放在拉链锁塑料袋中并密封（以提供二次密封）。在2000 x g下在37°C下离心90分钟。
- 从离心机中取出板。在生物安全方面，机柜小心地取出塑料袋，并确保板的外侧不会受到任何介质的污染。
- 然后将板转移到专用的 37 °C CO2培养箱。4小时后，从每个孔中取出1 mL的培养基，并更换1 mL的预加热完整T细胞培养基。更换 CO2 培养箱中的板。
注：将转导细胞中的所有介质处理为传染性废物。
- 第二个转导（第3天）
- 在专用的生物安全柜中，通过放在盖子上倾斜包含转导细胞的板，并小心地取出大部分介质（留下 100–200 μL），确保不接触井底的细胞。
- 添加步骤 2.7 中收集的包含病毒的介质，并重复步骤 5.3.2_5.3.4。
注：根据我们的经验，第三个转导很少能提高整体效率。此外，如果使用第三个转导，细胞活力可能会显著下降。如果细胞的浓度高于0.5 x 106/孔，T细胞在第二个转导步骤后过夜孵育后可能达到汇合。在这种情况下，分裂细胞后4小时孵育在第3天。
- 洗涤细胞（第4天）
- 从每个井中取出 1 mL 的介质，将剩余介质中的细胞重新悬浮，并转移到 15 mL 管中。用1 mL的完整T细胞培养基清洗水井，并加入含有每个转导的池细胞的管。
- 在 350 x g 下离心 7 分钟，然后通过重新悬浮在 2 mL 的完整 T 细胞培养基和造粒液中洗涤两次。最后在2mL的介质中重新悬浮，并确定细胞数。
注：如果最初转导了1 x 106个细胞，则此阶段的收率应为+3 x 106。
- 转移
- 将2 mL中2mL中0.5×1 x 106个细胞的等分转移到新24孔板的孔中，并在37°C下孵育。转导后，细胞大约48-72小时，可用于CAR表达分析和细胞排序。
注：在此阶段，CAR-T细胞的数量通常每24小时翻倍。绝不能让他们过度生长。如果密度高于 2 x 106/mL（或者如果介质变为亮黄色），则立即拆分单元格。根据我们的经验，CAR-T细胞在24孔和12孔板中比转移到更大的容器时更有力地增殖。
- 将2 mL中2mL中0.5×1 x 106个细胞的等分转移到新24孔板的孔中，并在37°C下孵育。转导后，细胞大约48-72小时，可用于CAR表达分析和细胞排序。
6. 通过荧光活性细胞分拣（FACS）纯化转导细胞（第5天或第6天）
- 收集单元格。
- 通过多次上下移液（注意不要引起泡沫）重新悬浮细胞，转移到15 mL管，并在350 x g下离心5分钟。
- 在分拣缓冲液中重新悬浮（在含有根霉素的无菌PBS中，2%BSA）在1 x 106细胞/mL处。从步骤 5.2 中采集控制（未转导）CD8 T 细胞。
注：从第2天1 x 106个细胞开始，预计此时会产生±2 x 107转导细胞。
- 用分拣缓冲液清洗一次细胞，在350 x g下离心5分钟，在分拣缓冲液中以1 x 107细胞/mL重新悬浮。取下 Foxp3GFP补偿控制（将在步骤 6.4.1 中使用）的小等分，并在 4°C 下孵育 20 分钟，用标记的抗小鼠 CD8（克隆 53-6.7;0.2 μg 抗体/5 x 106细胞）染色。
- 同样，染色非转导CD8 T细胞的等分，为标记抗CD8抗体的荧光团提供补偿控制。
注意：避免在任何缓冲液中加入阿齐德钠，因为这对细胞有毒。
- 同样，染色非转导CD8 T细胞的等分，为标记抗CD8抗体的荧光团提供补偿控制。
- 用分拣缓冲器清洗标记的细胞两次，在冷排序缓冲液中以1 x 107细胞/mL重新悬浮。
- 对单元格进行排序。
- 将CD8 GFP+阳性细胞分类至预冷冻的完整T细胞培养基（图3B）。取一个小等分进行分拣后分析，以确定纯度。
注：为了最大化分类细胞的纯度，应使用紧门。使用 100 μm 喷嘴确保高细胞活力。尽量减少已分拣的单元格保存在冰上的时间。在冰上保存超过3小时的T细胞比冷冻不到2小时的细胞需要更长的时间才能恢复。因此，如果需要对 3 条转导细胞线进行排序，则在第一行进行排序时收集和标记第二行，而不是让第二行和第三行在 0 °C 处花费较长的时间。也可以监视其他 T 细胞标记（如 CD28 和 CD3）的表达（图 3C），但对于排序目的来说并非必不可少。 - （替代排序策略）在染色散装群体之前，分析一小群转导T细胞的CD8表达。如果纯度为 >99%，则仅根据 GFP 表达式安全地对散装总体进行排序。
- 将CD8 GFP+阳性细胞分类至预冷冻的完整T细胞培养基（图3B）。取一个小等分进行分拣后分析，以确定纯度。
7. 扩展已排序的 CAR-T 单元（第 5 天至第 10 天）
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CAR-T 细胞扩张
- 洗涤已排序的CAR-T细胞一次，然后在预热后以2.5×5 x 5细胞/mL重新悬浮在预加热的完整T细胞培养基中，并在24孔板中将2mL等分板重新悬浮。
- 每1⁄2天对细胞进行计数和分割。通常，细胞数量每天翻倍，直到第10天，生存能力保持在95%以上。
注：如果不再刺激，CAR-T细胞将在第10天左右停止增殖，并最终死亡。因此，T细胞功能测定和收养转移应相应地进行安排。
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替代扩张战略
- 分类后，在含有rhIL-2的完整T细胞培养中培养CAR-T细胞，在100U/mL而不是200U/mL。
注：CAR-T细胞在此介质中增殖速度稍慢。然而，它们通常会继续扩散，直到第11至13天没有再刺激。因此，尽管这种替代扩展策略不会生成更多的单元，但它为下游检测提供了稍长的时间窗口。
- 分类后，在含有rhIL-2的完整T细胞培养中培养CAR-T细胞，在100U/mL而不是200U/mL。
8. 验证CAR T细胞的抗原特异性和功能。
注：CAR T细胞针对肽/MHC复合物的结合特异性可以通过四联体染色7，23进行验证。同样，它们的功能可以通过测量细胞因子分泌或细胞毒性后刺激其共体配体。埃默里大学的NIH四聚能核心设施（TCF）是"四联体"和相关染色协议的推荐来源。
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肽-MHC四联默染色。
- 在100μL分拣缓冲液中，通过用±0.6 μg荧光标记抗原特异性孵育，在37°C下控制四联体2小时，在100μL分拣缓冲液中标记2 x105转导的CAR-T细胞。
- 在350 x g下通过离心将细胞压离5分钟，然后通过在0.5 mL的分拣缓冲液中重新悬浮和重新离心洗涤两次。最后，在300μL的分拣缓冲液中重新悬浮细胞，并通过流式细胞测定法进行分析（图4）。
注：对于这些研究，我们通常使用标有 BV421 的 IAg7-B：9-23（RE）和 IAg7-HEL （控制） 四联体。但是，可以使用适合所调查的 CAR 的任何荧光/四联体组合。在这种情况下，浓度和染色时间应针对所使用的每个四联体进行优化。已排序和未排序的 CAR-T 细胞都可用于四联体染色。
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通过配体刺激进行特异性测量。
- 在200 μL的无细胞因子T细胞细胞培养基中孵育2 x 105排序的CAR-T细胞，具有适当的板系或细胞配体。
- 6-24 小时后，ELISA 测量细胞因子生产，或使用制造商的协议进行细胞内染色。
注：对于我们研究IAg7-B：9-23重定向T细胞，我们用M12C3小鼠B细胞淋巴瘤细胞在一夜之间培养细胞，这些细胞表达IA g7-B-B：R3或"空"IAg724，25，然后收集上生子，并通过ELISA26（图5）测量分泌的小鼠干扰素伽马（IFN-α）。
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Representative Results
通常，使用该协议的转导效率为+60-90%。在图3所示的实验中，在排序之前，70%的CD8 T细胞共同表达GFP。他们还共同表达了CD28和CD3（图3C）。重要的是，所有的"测试"GFP+细胞也与IA g7-B：R3四联体共同染色，但不与对照四联体（图4）。同样，排序的测试和控制CAR-T细胞每个分泌高水平的IFN-*只有在与靶细胞共同培养后，才表达其共性配体（图5）。这证实转导细胞具有CD8效应器T细胞表型，定向到母抗体的目标。
图1：CAR抗逆转录病毒结构的原理图。CAR 包括从合适的小鼠单克隆抗体的 Fab 片段派生的目标域，以及来自小鼠 CD28、CD137 和 CD247 的间隔/膜锚点/信令域。合成cDNA插入pMIG-II逆转录病毒表达载体。显示了用于生成 mAb287-CAR 的限制内切酶位点。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：不同电镀方法对细胞分布的影响。（左）使用旋转运动移液的细胞显示均匀分布。（右）细胞被直接移入井中心。图像是在 350 x g旋转 5 分钟后拍摄的，请点击此处查看此图的较大版本。
图3：转导T细胞的流式细胞分析。如步骤6.4所述，细胞与PE-Cy7结合抗CD8、AF647结合抗CD3和BV421结合抗CD28共同染色。显示单个可行单元上封闭的配置文件。（A） 未染色的亲CD8 T细胞。（B） 转导细胞的PE-Cy7/GFP配置文件。CAR 表达细胞由 GFP 报告器识别。（C） 染色转导细胞在PE-Cy7/GFP双正率上被封闭。显示 AF647/BV421 配置文件。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：未排序的CAR-T细胞的四联体染色。如步骤8.1所述，细胞被BV421共聚物染色。显示单个可行单元上封闭的配置文件。（A） 测试 IAg7- 胰岛素四联体.（B） 控制 I-Ag7-HEL 四联体。请点击此处查看此图的较大版本。
图5：CAR T细胞的抗原特异性细胞因子分泌。分拣的CD8 T细胞表示测试mAb287或对照mAb24.1 CAR与M12C3细胞共同培养，表达IA g7-B：R3，"空"IAg7，或TFR-MBP-DTRL（mAb24.1的配体），步骤8.2中所述。24小时后，分泌的IFN-eLISA由ELISA量化。观察到两种T细胞系的特定刺激。数据表示 3 个重复实验的平均值 = SD。请点击此处查看此图的较大版本。
| 时间 | 病毒制备 | T细胞制备 |
| -4日（周五） | 解冻凤凰细胞 （PM） | |
| -3日（星期六） | 重新印凤凰 | |
| -2日（星期日） | 假期 | |
| 第1天（星期一） | 辐照凤凰细胞 （PM） | 用 CD3/CD28 Ab 涂覆未经处理的板 |
| 第0天（星期二） | 转染凤凰细胞 （AM） | 准备splecyt和分离CD8T细胞。 |
| T 细胞激活。 | ||
| 第1天（星期三） | 将凤凰细胞培养基更改为4ml（AM）。 | 大衣复古内丁 |
| 第2天（星期四） | 收集病毒并重新填充。 | 转导，CD8 T 细胞 |
| 第3天（星期五） | 收集病毒。 | 转导，CD8 T 细胞 |
| 第4天（星期六） | 清洗细胞和扩展细胞。 | |
| 第5天（星期日） | 如果需要，细胞扩展。 | |
| 第6天（星期一） | CAR-T 单元排序。 | |
| 第7-10天（周二至周五） | T CAR 细胞的扩展。实验。 |
表1：CAR-T生成协议的摘要。
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Discussion
该协议描述了一种通过抗逆转录病毒转导产生抗原特异性CD8 CAR-T细胞的有效方法。我们协议的转导效率通常很高，通常观察到CAR的强健表达。膨胀的CAR T细胞保留了母细胞激活的T细胞的基本特征和抗体特异性，适用于体外和体内使用。我们已经在NOD小鼠7的1型糖尿病中应用了Ab-CAR CD8 T细胞。
我们的协议包含了对前面描述的方法的一些关键修改。首先，我们使用优化的T细胞培养介质，允许延长激活时间。描述的完整介质包含几种关键补充剂的最佳水平， 并显著提高了 T 细胞的生存能力和激活后扩散的程度.应该指出的是，小鼠IL-2可以代替人类蛋白质，但目前人类IL-2更实惠。值得注意的是，使用40-48小时激活的T细胞比使用24小时激活步骤时获得更高的转导效率。
其次，我们使用改进的转导程序，消除多宝仁B（对T细胞有毒），并使用纤维化。这进一步提高了细胞的生存能力。应该指出，为了保证良好的转导效率，在适当的细胞密度下保持T细胞在优化的培养基中，并使用新鲜的高蒂特病毒超生物，而不是先前冻结的病毒，这一点至关重要。使用我们修改的程序，第三个转导步骤是不必要的，确实是不可取的，因为如果包括第三个自旋感染步骤，生存能力通常会下降。还必须强调，在扩张阶段不要让细胞过度生长至关重要。一旦细胞过度生长，它们往往会迅速失去表型并死亡。
除了上述参数外，还必须避免转导效率/可行性低的另外两个潜在原因。首先，由于抗生素在转染步骤中不应存在，因此必须确保质粒使用无内毒素试剂盒制备，并溶解在无菌水中，并且随时使用良好的无菌技术。其次，必须避免高水平死亡或死亡的T细胞的存在。如果激活的亲CD8 T细胞悬浮液含有高水平的死细胞或细胞碎片，则应在使用商业试剂盒转导前将其去除。
我们故意没有在本协议中包括CAR-T细胞冷冻步骤，因为根据我们的经验，有相当一部分转导细胞在冷冻保存和解冻过程中死亡。同样，虽然扩大的CAR-T细胞可以在体外重新刺激，但它们有失去转基因表达的倾向。因此，鉴于我们使用新鲜分类的CAR-T细胞观察到的高度增殖，我们强烈建议只使用新生成的CAR-T细胞进行功能测定和收养转移。
总之，该协议的意义是，它描述了一个过程，提供高转导效率，并产生大量的健康抗原特异性小鼠CD8 T细胞用于体外和体内。因此，我们的实验方案为研究人员在小鼠疾病模型中进行CAR-T细胞研究提供了一个有用的工具。
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Disclosures
MAb287及其衍生物受2014年发布的美国专利的保护。
Acknowledgments
这项研究得到了JDRF资助1-INO-2015-74-S-B、2-SRA-2016-238-S-B和SRA-2-S-2018-648-S-B，糖尿病教育和行动奖，以及贝勒医学院分子医学研究卡罗琳·威斯法律基金的支持。细胞分拣由贝勒医学院细胞测定和细胞分拣核心支持，由NIH（S10RR024574和P30CA125123）资助。所有肽-MHC四联体均从NIH四聚能核心设施获得。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol (50mM) | Gibco | 21985-023 | 50 μM |
| 5’ RACE PCR | Clontech | 634859 | |
| anti-mouse CD28 antibodies | eBioscience | 14-0281-86 | final concentration at 1µg/ml |
| anti-mouse CD3e antibody | eBioscience | 145-2C11 | final concentration at 1µg/ml |
| Biotin Rat Anti-Mouse IFN-γ | BD Biosciences | 554410 | Working concentration at 0.5 µg/ml |
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Endo-free Maxi-Prep kit | Qiagen | 12362 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | Final 50 µg/ml. |
| Heat inactivated FCS | Hyclone | SH30087.03 | Final 10% FCS |
| HEPES (100X) | Gibco | 15630-080 | 1X |
| IAg7-CLIP tetramer-BV421 | NIH tetramer Facility at Emory | per approval | Working concentration at 6 µg/ml |
| IAg7-insulin P8E tetramer-BV421 | NIH tetramer Facility at Emory | per approval | Working concentration at 6 µg/ml |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS 100x) | ThermoFisher | 51500056 | Final concentraion is 1x |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Separation Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit | Miletenyi Biotec Inc | 130-104-075 | |
| Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit | Miltenyi Biotec | 130-104-075 | |
| Opti-MEM medium | ThermoFisher | 31985070 | |
| Penicillin-Streptomycin (5000U/ml) | ThermoFisher | 15070063 | 50 U/ml |
| Phoenix-ECO cells | ATCC | CRL-3214 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| pMIG II | Addgene | 52107 | |
| pMSCV-IRES-GFP II | Addgene | 52107 | |
| Purified Rat Anti-Mouse IFN-γ | BD Biosciences | 551216 | Working concentration at 3 µg/ml |
| Red cell lysis buffer | Sigma | R7767 | |
| RetroNectin | Takara | T100A | Working concentration at 50 µg/ml in PBS |
| rhIL-2 (stock concentration 105 IU/ul) | Peprotech | 200-02 | Final concentration at 200 IU/ml |
| rmIL-7 ( stock concentration 50ng/ul) | R&D | 407-ML-005 | Final concentration at 0.5ng/ml |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Sterile Cell Strainers | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Tryple | Gibco | 12605-028 |
References
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