एक Autoimmune मधुमेह मॉडल में कार्यात्मक परीक्षण के लिए Antigen-विशिष्ट प्राथमिक माउस Cytotoxic टी कोशिकाओं के उच्च दक्षता पीढ़ी
Summary
यह आलेख एंटीजन-विशिष्ट CD8 टी कोशिकाओं की पीढ़ी के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, और इन विट्रो में उनके विस्तार, इन विट्रो में और विवो में उपयोग के लिए कार्यात्मक टी कोशिकाओं की उच्च संख्या उपज के उद्देश्य से.
Abstract
प्रकार 1 मधुमेह (T1D) आइलेट-विशिष्ट autoimmunity बीटा सेल विनाश और इंसुलिन उत्पादन की पूर्ण हानि के लिए अग्रणी द्वारा विशेषता है. सहज गैर मोटापे से ग्रस्त मधुमेह (NOD) माउस मॉडल में, इंसुलिन प्राथमिक लक्ष्य है, और इन जानवरों के आनुवंशिक हेरफेर एक एकल कुंजी इंसुलिन epitope को दूर करने के लिए रोग से बचाता है. इस प्रकार, पेशेवर एंटीजन पेश कोशिकाओं (APCs) इस रोगजनक एपिटोप असर के चयनात्मक उन्मूलन अवांछित इंसुलिन विशेष autoimmune प्रतिक्रियाओं को बाधित करने के लिए एक दृष्टिकोण है, और संभावना अधिक से अधिक अनुवाद क्षमता है.
चिमेरिक प्रतिजन रिसेप्टर्स (CARs) टी कोशिकाओं चुनिंदा रोग पैदा करने वाले प्रतिजनों को लक्षित करने के लिए अनुप्रेषित कर सकते हैं. इस तकनीक को कई कैंसर के इलाज के लिए दत्तक कोशिका चिकित्सा के लिए सेलुलर इंजीनियरिंग का उपयोग करने के लिए हाल ही में प्रयास करने के लिए मौलिक है. इस प्रोटोकॉल में, हम एक अनुकूलित टी-सेल रेट्रोवायरस (आरवी) transduction और इन विट्रो विस्तार प्रोटोकॉल है कि कार्यात्मक प्रतिजन-विशिष्ट CD8 CAR-T कोशिकाओं की एक कम संख्या से शुरू की उच्च संख्या उत्पन्न करता है का वर्णन पहले एकाधिक कार-टी सेल प्रोटोकॉल वर्णित किया गया है, लेकिन आम तौर पर अपेक्षाकृत कम transduction दक्षता और सेल व्यवहार्यता के साथ transduction के बाद. इसके विपरीत, हमारे प्रोटोकॉल 90% transduction दक्षता प्रदान करता है, और उत्पन्न कोशिकाओं vivo में दो सप्ताह से अधिक जीवित रह सकते हैं और काफी एक जलसेक के बाद रोग शुरुआत में देरी. हम सेल रखरखाव और transduction प्रोटोकॉल का एक विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं, ताकि महत्वपूर्ण कदम आसानी से पालन किया जा सकता है. प्राथमिक सेल अलगाव से कार अभिव्यक्ति के लिए पूरी प्रक्रिया 14 दिनों के भीतर किया जा सकता है. सामान्य विधि किसी भी माउस रोग मॉडल है जिसमें लक्ष्य जाना जाता है के लिए लागू किया जा सकता है. इसी प्रकार, विशिष्ट अनुप्रयोग (रोगजनक पेप्टाइड/एमएचसी श्रेणी द्वितीय परिसर को लक्षित करना) किसी भी अन्य ऑटोम्यून्यून रोग मॉडल पर लागू होता है जिसके लिए एक प्रमुख परिसर की पहचान की गई है।
Introduction
अवांछित ऑफ-लक्ष्य प्रभाव ों की संभावना कम जोखिम को देखते हुए, एंटीजन-विशिष्ट प्रतिरक्षा उपचार (एएसआई) T1D जैसे ऑटोम्यून्यून रोगों के लिए उपचार का वादा कर रहे हैं। संचित साक्ष्य से पता चलता है कि (प्रीप्रो) इंसुलिन के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं T1D1में विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो सकती हैं। पिछले दशक में, कई समूहों से अध्ययन, हमारे अपने सहित, दृढ़ता से सुझाव है कि विशिष्ट MHC वर्ग द्वितीय अणुओं द्वारा इंसुलिन बी श्रृंखला अमीनो एसिड युक्त एक epitope की प्रस्तुति 9 से 23 (B:9-23/MHCII), में T1D के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है चूहे और मनुष्य2,3,4,5. चुनिंदा लक्ष्य B:9-23/MHCII परिसर, हम एक monoclonal एंटीबॉडी उत्पन्न, mAb287 नाम, कि हार्मोन इंसुलिन या अन्य पेप्टाइड्स युक्त परिसरों के लिए कोई पार प्रतिक्रियाहै 6. MAb287 ब्लॉक एंटीजन प्रस्तुति इन विट्रो में, और mAb287 के साप्ताहिक प्रशासन पूर्व मधुमेह NOD चूहों इलाज चूहों के 35% में T1D के विकास में देरी6. विवो में प्रतिजन प्रस्तुति ब्लॉक करने के लिए, अक्सर इंजेक्शन आम तौर पर एक उच्च घूम एकाग्रता बनाए रखने के लिए आवश्यक हैं। हम hypothesized है कि हम Ab287 की उच्च विशिष्टता का लाभ लेने के लिए टी कोशिकाओं reprogram द्वारा इस कठिनाई को दूर कर सकता है, जिससे T1D7के लिए एक बेहतर प्रतिजन विशेष टी सेल थेरेपी प्रदान .
बताया जाता है कि यदि उनके कोग्नेट लिगन्ड की एक प्रति भी8,9,10व्यक्त की जाती है तो कोशिका विषाक् त टी कोशिकाएं अपने लक्ष् य को मार सकती हैं . इस प्रकार, B:9-23/MHCII विशिष्ट CD8 टी कोशिकाओं को माता पिता एंटीबॉडी की तुलना में अवांछित प्रतिजन प्रस्तुति को नष्ट करने में उच्च दक्षता है, जो संभावना एक ही एपीसी पर कई परिसरों के लिए बाध्य करने की आवश्यकता होगी अपने प्रभाव लागू करने की उम्मीद कर रहे हैं. कई मानव कैंसरों के उपचार के लिए कार टी कोशिकाओं का उपयोग किया गया है11,12,13, और यह भी autoimmunity14में प्रभावशाली हो सकता है . तथापि, रोगजनक पेप्टाइड-एमएचसी परिसरों के लिए विशिष्टता वाली सीएआर-टी कोशिकाओं का अभी तक टी 1 डी की प्रगति को संशोधित करने के लिए उपयोग नहीं किया गया है। अनुकूलित CD8 टी सेल transduction तकनीक नीचे वर्णित का उपयोग करके, हम हाल ही में सिद्धांत का सबूत है कि यह वास्तव में एक व्यवहार्य दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है7का प्रदर्शन किया.
इस प्रोटोकॉल में, हम एक कुशल और सुव्यवस्थित transduction और विस्तार विधि रूपरेखा. हमारे प्रोटोकॉल उच्च दक्षता के साथ माउस CD8 कार टी कोशिकाओं की पीढ़ी की आवश्यकता होती है अन्य अध्ययनों के लिए लागू है.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल retroviral transduction द्वारा प्रतिजन-विशिष्ट CD8 कार-टी कोशिकाओं के उत्पादन के लिए एक कुशल विधि का वर्णन करता है। हमारे प्रोटोकॉल के transduction दक्षता आम तौर पर उच्च है, और कार की मजबूत अभिव्यक्ति आम तौर पर मना?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन JDRF अनुदान 1-INO-2015-S-B, 2-SRA-238-S-B, और SRA-2-S-2018-648-एस-बी, एक मधुमेह शिक्षा और कार्रवाई पुरस्कार, और चिकित्सा के Baylor कॉलेज में आणविक चिकित्सा में अनुसंधान के लिए कैरोलीन Wiess कानून कोष द्वारा समर्थित किया गया था. सेल-सॉर्टिंग NIH (S10RR024574 और P30CA125123) से धन के साथ चिकित्सा के Baylor कॉलेज में Cytometry और सेल छंटनी कोर द्वारा समर्थित किया गया था. सभी पेप्टाइड-MHC tetramers NIH Tetramer कोर सुविधा से प्राप्त किए गए थे.
Materials
| 2-Mercaptoethanol (50mM) | Gibco | 21985-023 | 50 uM |
| 5’ RACE PCR | Clontech | 634859 | |
| anti-mouse CD28 antibodies | eBioscience | 14-0281-86 | final concentration at 1µg/ml |
| anti-mouse CD3e antibody | eBioscience | 145-2C11 | final concentration at 1µg/ml |
| Biotin Rat Anti-Mouse IFN-γ | BD Biosciences | 554410 | Working concentration at 0.5 µg/ml |
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Endo-free Maxi-Prep kit | Qiagen | 12362 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | Final 50 µg/ml. |
| Heat inactivated FCS | Hyclone | SH30087.03 | Final 10% FCS |
| HEPES (100X) | Gibco | 15630-080 | 1X |
| IAg7-CLIP tetramer-BV421 | NIH tetramer Facility at Emory | per approval | Working concentration at 6 µg/ml |
| IAg7-insulin P8E tetramer-BV421 | NIH tetramer Facility at Emory | per approval | Working concentration at 6 µg/ml |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS 100x) | ThermoFisher | 51500056 | Final concentraion is 1x |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Separation Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit | Miletenyi Biotec Inc | 130-104-075 | |
| Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit | Miltenyi Biotec | 130-104-075 | |
| Opti-MEM medium | ThermoFisher | 31985070 | |
| Penicillin-Streptomycin (5000U/ml) | ThermoFisher | 15070063 | 50 U/ml |
| Phoenix-ECO cells | ATCC | CRL-3214 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| pMIG II | Addgene | 52107 | |
| pMSCV-IRES-GFP II | Addgene | 52107 | |
| Purified Rat Anti-Mouse IFN-γ | BD Biosciences | 551216 | Working concentration at 3 µg/ml |
| Red cell lysis buffer | Sigma | R7767 | |
| RetroNectin | Takara | T100A | Working concentration at 50 µg/ml in PBS |
| rhIL-2 (stock concentration 105 IU/ul) | Peprotech | 200-02 | Final concentration at 200 IU/ml |
| rmIL-7 ( stock concentration 50ng/ul) | R&D | 407-ML-005 | Final concentration at 0.5ng/ml |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Sterile Cell Strainers | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Tryple | Gibco | 12605-028 |
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