本文介绍了一种用于生成抗原特异性CD8 T细胞及其在体外扩张的协议,目的是产生大量功能性T细胞,用于体外和体内。
1型糖尿病(T1D)的特点是小岛特异性自身免疫,导致β细胞破坏和胰岛素生产绝对损失。在自发的非肥胖糖尿病(NOD)小鼠模型中,胰岛素是主要目标,而这些动物的基因操作,以去除单键胰岛素表位预防疾病。因此,选择性地消除带有这种致病性表位的专业抗原呈现细胞(APC)是抑制不需要的胰岛素特异性自身免疫反应的方法,并且可能具有更大的转化潜力。
嵌合抗原受体(CARs)可以重定向T细胞,选择性地靶向致病抗原。这项技术是最近尝试使用细胞工程治疗多种癌症的基础。在此协议中,我们描述了优化的T细胞逆转录病毒(RV)转导和体外扩张协议,该协议产生大量功能抗原特异性CD8 CAR-T细胞,从少量幼化细胞开始。以前已经描述了多个CAR-T细胞协议,但转导后转导效率和细胞生存能力通常相对较低。相比之下,我们的方案提供高达90%的转导效率,产生的细胞可以在体内存活两周以上,并在一次输注后显著延缓疾病的发病。我们提供了细胞维护和转导协议的详细说明,以便轻松遵循关键步骤。从主细胞分离到CAR表达的整个过程可以在14天内执行。通用方法可应用于已知目标的任何小鼠疾病模型。同样,具体应用(针对致病肽/MHC II 类复合物)适用于已识别关键复合物的任何其他自身免疫疾病模型。
鉴于不必要的脱靶效应可能降低的风险,抗原特异性免疫疗法(ASI)有望治疗T1D等自身免疫性疾病。累积的证据表明,在T1D1中,对(前亲)胰岛素的免疫反应可能特别重要。在过去十年中,来自多个组(包括我们自己的组)的研究表明,由特定的MHC II类分子(B:9-23/MHCII)呈现含有胰岛素B链氨基酸9至23的表位在T1D的发展中起着重要作用。老鼠和人类2,3,4,5。为了有选择地瞄准B:9-23/MHCII复合物,我们产生了一种名为mAb287的单克隆抗体,这种抗体对含有其他肽6的激素胰岛素或复合物没有交叉反应。MAb287阻断体外抗原的呈现,每周给糖尿病前期NOD小鼠的mAb287分,延迟了35%的受治疗小鼠T1D的发育。为了阻断体内抗原的呈现,通常需要频繁注射以保持高循环浓度。我们假设,我们可以克服这一困难,利用Ab287的高特异性重新编程T细胞,从而为T1D7提供更好的抗原特异性T细胞治疗。
据报道,细胞毒性T细胞能够杀死他们的目标,即使一个单一的副本,他们的共生配体表示8,9,10。因此,B:9-23/MHCII 特异性CD8 T细胞在消除不需要的抗原表达方面比母抗体具有更高的效率,后者可能需要与同一APC上的多个复合物结合以发挥其作用。CAR T细胞已用于治疗多种人类癌症11,12,13,也可能有效在自身免疫14。然而,对致病性肽-MHC复合物具有特异性的CAR-T细胞迄今尚未用于改变T1D的进展。通过使用下面描述的优化的CD8 T细胞转导技术,我们最近证明了原理证明,这确实代表了一种可行的方法7。
在此协议中,我们概述了一种高效、简化的转导和扩展方法。我们的协议适用于需要高效生成小鼠 CD8 CAR T 细胞的其他研究。
该协议描述了一种通过抗逆转录病毒转导产生抗原特异性CD8 CAR-T细胞的有效方法。我们协议的转导效率通常很高,通常观察到CAR的强健表达。膨胀的CAR T细胞保留了母细胞激活的T细胞的基本特征和抗体特异性,适用于体外和体内使用。我们已经在NOD小鼠7的1型糖尿病中应用了Ab-CAR CD8 T细胞。
我们的协议包含了对前面描述的方法的一些关键修改。首先,我们使…
The authors have nothing to disclose.
这项研究得到了JDRF资助1-INO-2015-74-S-B、2-SRA-2016-238-S-B和SRA-2-S-2018-648-S-B,糖尿病教育和行动奖,以及贝勒医学院分子医学研究卡罗琳·威斯法律基金的支持。细胞分拣由贝勒医学院细胞测定和细胞分拣核心支持,由NIH(S10RR024574和P30CA125123)资助。所有肽-MHC四联体均从NIH四聚能核心设施获得。
2-Mercaptoethanol (50mM) | Gibco | 21985-023 | 50 uM |
5’ RACE PCR | Clontech | 634859 | |
anti-mouse CD28 antibodies | eBioscience | 14-0281-86 | final concentration at 1µg/ml |
anti-mouse CD3e antibody | eBioscience | 145-2C11 | final concentration at 1µg/ml |
Biotin Rat Anti-Mouse IFN-γ | BD Biosciences | 554410 | Working concentration at 0.5 µg/ml |
BSA | Sigma | A7030 | |
Endo-free Maxi-Prep kit | Qiagen | 12362 | |
Gentamicin | Gibco | 15750-060 | Final 50 µg/ml. |
Heat inactivated FCS | Hyclone | SH30087.03 | Final 10% FCS |
HEPES (100X) | Gibco | 15630-080 | 1X |
IAg7-CLIP tetramer-BV421 | NIH tetramer Facility at Emory | per approval | Working concentration at 6 µg/ml |
IAg7-insulin P8E tetramer-BV421 | NIH tetramer Facility at Emory | per approval | Working concentration at 6 µg/ml |
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS 100x) | ThermoFisher | 51500056 | Final concentraion is 1x |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
MACS Separation Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit | Miletenyi Biotec Inc | 130-104-075 | |
Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit | Miltenyi Biotec | 130-104-075 | |
Opti-MEM medium | ThermoFisher | 31985070 | |
Penicillin-Streptomycin (5000U/ml) | ThermoFisher | 15070063 | 50 U/ml |
Phoenix-ECO cells | ATCC | CRL-3214 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
pMIG II | Addgene | 52107 | |
pMSCV-IRES-GFP II | Addgene | 52107 | |
Purified Rat Anti-Mouse IFN-γ | BD Biosciences | 551216 | Working concentration at 3 µg/ml |
Red cell lysis buffer | Sigma | R7767 | |
RetroNectin | Takara | T100A | Working concentration at 50 µg/ml in PBS |
rhIL-2 (stock concentration 105 IU/ul) | Peprotech | 200-02 | Final concentration at 200 IU/ml |
rmIL-7 ( stock concentration 50ng/ul) | R&D | 407-ML-005 | Final concentration at 0.5ng/ml |
RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | |
Sterile Cell Strainers | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
Tryple | Gibco | 12605-028 |