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Immunology and Infection

Génération à haut rendement de cellules T cytotoxiques cytotoxiques de souris primaires spécifiques à l'antigène pour les tests fonctionnels dans un modèle de diabète auto-immun

doi: 10.3791/59985 Published: August 16, 2019

Summary

Cet article décrit un protocole pour la génération des cellules T CD8 antigène-spécifiques, et leur expansion in vitro, dans le but de produire un nombre élevé de lymphocytes T fonctionnels pour une utilisation in vitro et in vivo.

Abstract

Le diabète de type 1 (T1D) est caractérisé par une auto-immunité spécifique aux islets entraînant la destruction des cellules bêta et la perte absolue de production d'insuline. Dans le modèle spontané de souris de diabète non-obèse (NOD), l'insuline est la cible primaire, et la manipulation génétique de ces animaux pour enlever un épitope d'insuline clé simple empêche la maladie. Ainsi, l'élimination sélective des cellules professionnelles de présentation d'antigène (APC) portant cet épitope pathogène est une approche pour inhiber les réponses autoimmunes insulino-spécifiques non désirées, et a probablement un plus grand potentiel translationnel.

Les récepteurs d'antigènes chimériques (RAC) peuvent rediriger les lymphocytes T vers des antigènes pathogènes de manière sélective. Cette technique est fondamentale pour les tentatives récentes d'utiliser l'ingénierie cellulaire pour la thérapie cellulaire adoptive pour traiter les cancers multiples. Dans ce protocole, nous décrivons un protocole optimisé de rétrovirus à cellule T (RV) et de transduction in vitro qui génère un grand nombre de cellules CD8 CAR-T fonctionnelles spécifiques à l'antigène à partir d'un faible nombre de cellules naïves. Auparavant, plusieurs protocoles de cellules CAR-T ont été décrits, mais généralement avec une efficacité de transduction relativement faible et la viabilité cellulaire après la transduction. En revanche, notre protocole fournit jusqu'à 90% d'efficacité de transduction, et les cellules générées peuvent survivre plus de deux semaines in vivo et retarder considérablement l'début de la maladie à la suite d'une seule perfusion. Nous fournissons une description détaillée du protocole d'entretien et de transduction des cellules, de sorte que les étapes critiques peuvent être facilement suivies. L'ensemble de la procédure de l'isolement cellulaire primaire à l'expression de la RCA peut être effectuée dans les 14 jours. La méthode générale peut être appliquée à n'importe quel modèle de maladie de souris dans lequel la cible est connue. De même, l'application spécifique (ciblant un complexe pathogène de classe II peptide/MHC) s'applique à tout autre modèle de maladie auto-immune pour lequel un complexe clé a été identifié.

Introduction

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Étant donné le risque probablement réduit d'effets non désirés hors cible, les thérapies immunitaires spécifiques aux antigènes (ASI) sont des traitements prometteurs pour les maladies auto-immunes telles que le DT1. L'accumulation de preuves suggère que les réponses immunitaires à l'insuline (prépro) peuvent être particulièrement importantes dans le DT11. Au cours de la dernière décennie, des études de plusieurs groupes, y compris le nôtre, suggèrent fortement que la présentation d'un épitope contenant des acides aminés de la chaîne de l'insuline B 9 à 23 par des molécules spécifiques de classe II du MHC (B:9-23/MHCII), joue un rôle important dans le développement du DT1 souris et les humains2,3,4,5. Pour cibler sélectivement le complexe B:9-23/MHCII, nous avons généré un anticorps monoclonal, nommé mAb287, qui n'a aucune réactivité croisée à l'insuline hormonale ou aux complexes contenant d'autres peptides6. MAb287 bloque la présentation d'antigène in vitro, et l'administration hebdomadaire de mAb287 aux souris prédiabétiques de NOD a retardé le développement du T1D dans 35% des souris traitées6. Pour bloquer la présentation d'antigène in vivo, des injections fréquentes sont généralement nécessaires afin de maintenir une concentration circulante élevée. Nous avons émis l'hypothèse que nous pourrions surmonter cette difficulté en profitant de la grande spécificité d'Ab287 pourreprogrammer les lymphocytes T, fournissant ainsi une thérapie à cellule T spécifique à l'antigène améliorée pour le DT7 .

Les lymphocytes T cytotoxiques seraient capables de tuer leur cible si même une seule copie de leur ligand cognate est exprimée8,9,10. Ainsi, on s'attend à ce que les lymphocytes T CD8 spécifiques B:9-23/MHCII aient une plus grande efficacité en éliminant la présentation indésirable d'antigène que l'anticorps parent, qui devra probablement se lier à plusieurs complexes sur le même APC pour exercer son effet. Les cellules T de CAR ont été employées pour traiter les cancers humains multiples11,12,13,et peuvent également être efficaces dans l'autoimmunité14. Cependant, les cellules CAR-T avec la spécificité pour les complexes pathogènes peptide-MHC n'ont pas été jusqu'ici employées pour modifier la progression du DT1. En utilisant la technique optimisée de transduction de cellules T CD8 décrite ci-dessous, nous avons récemment démontré la preuve de principe que cela représente en effet une approche viable7.

Dans ce protocole, nous dénoncions une méthode de transduction et d'expansion efficace et rationalisée. Notre protocole s'applique à d'autres études nécessitant la génération de cellules T CD8 CAR de souris à haut rendement.

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Protocol

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Les souris ont été maintenues dans des conditions spécifiques exemptes d'agents pathogènes dans un établissement de souris transgéniques, et toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par le Comité des soins et de l'utilisation des animaux du Baylor College of Medicine.

REMARQUE : L'expérience nécessite la préparation du virus et des lymphocytes T en parallèle. Le tableau 1 résume le protocole. Les réactifs et tampons clés sont répertoriés dans le Tableau des matériaux. Nous nous concentrons sur la génération et l'expansion des cellules CAR-T ciblant des populations spécifiques d'APC dans ce protocole.

1. Génération et validation de l'anticorps Fab à chaîne unique (scFab)-RAC.

REMARQUE: Les RAC contiennent généralement 3 domaines critiques : un domaine de ciblage antigène, un domaine spatial/transmembrane et un domaine de signalisation cytoplasmique. La conception précise de chaque RAC dépend de la cible visée et, en dehors des caractéristiques clés de la construction pertinente à la génération du rétrovirus, ne sera pas décrite en détail dans ce protocole. La conception globale des RAC utilisées pour les études décrites ci-dessous est illustrée à la figure 1. En bref, le domaine de ciblage comprend l'ensemble de la chaîne légère et variable et CH1 domaine de la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal parent lié par un maillon semi-rigide. Le domaine spacer/transmembrane provient de la souris CD28, et le domaine de signalisation est une fusion contenant des éléments de souris CD28, CD137 (4-1BB) et CD247 (CD3). Ces éléments sont assemblés par des procédures de biologie moléculaire standard telles que l'épissure chevauchement de réaction en chaîne de polymérase (PCR), ou la synthèse d'un « bloc génétique » approprié. Les détails de la génération de la CAR mAB287 sont contenus dans Zhang et al.7. Les séquences d'ADNc peuvent être obtenues auprès des auteurs sur demande.

  1. Assemblage de la construction centrafricaine
    1. Synthétiser séparément l'anticorps Fab à chaîne unique de ciblage (scFab) et les domaines combinés espaceur/signalisation, et utilisez une technique de ligature « 3 points »15 pour assembler la construction finale (Figure 1).
      REMARQUE: L'exigence clé de l'encart CAR est qu'il contienne des sites d'endonucléase de restriction de l'accompagnement permettant la ligature dans le vecteur d'expression rétrovirale pMSCV-IRES-GFP II (pMIG II), ou un dérivé connexe15 sont également approprié.
  2. Validation de l'expression de surface de la RCA
    1. Transduce les cellules hybridome à l'aide de particules rétrovirales dérivées de pMIGII générées par un protocole standard (p. ex. Holst et al.16 ).
    2. Analyse de cytométrie du débit d'exécution pour détecter l'expression du GFP à partir du vecteur CAR17.
    3. Expression de surface de tache de la RCA des hybridomas transducés à l'aide d'anticorps étiquetés contre la chaîne de la souris (p. ex., clone RMK-45)17.
      NOTE: 18.
  3. Validation de la spécificité CAR
    1. Stimulez les cellules hybrides transductées avec des antigènes cellulaires ou cellulaires appropriés. Après la co-culture de nuit recueillir supernatants et cytokines sécrétés, et admis par l'analyse immunosorbent enzymatique (ELISA)7.
      REMARQUE: Idéalement, chaque RCA doit être validé de façon indépendante avant d'être utilisé pour la transduction. À cette étape, l'expérience peut être interrompue et redémarrée plus tard.

2. Transfection des cellules productrices virales (jour -4 au jour 3)

REMARQUE: Le rétrovirus est produit à l'aide de cellules Phoenix-ECO (voir le Tableau des matériaux)19,20. Prendre les précautions appropriées pour la génération d'agents potentiellement infectieux (y compris de préférence un cabinet BSL-2 désigné et un incubateur séparé pour la culture des cellules transfectées/transduced).

  1. Décongélation des cellules Phoenix (Jour -4)
    1. Décongeler 2 x 106 cellules Phoenix-Eco. Échelle du nombre de cellules Phoenix si plusieurs transductions sont planifiées.
    2. Les déposer dans un plat de culture tissulaire de 10 cm avec 10 ml de milieu (le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) contenant 10 % de sérum fœtal de veau (FCS)).
  2. Cellules De Phoenix de passage (Jour -3)
    1. Retirer le milieu et laver à l'huile de 5 ml de salin tamponné par le phosphate (DPBS) de Dulbecco.
    2. Ajouter 3 ml de trypsine de 0,25 % et incuber à 37 oC sous 10 % d'atmosphère de CO2 pendant 3 min.
    3. Récolter les cellules puis pelleter par centrifugation pendant 3 min à 200 x g. Re-plaquer les cellules avec un milieu frais de 10 ml et incuber à 37 oC.
  3. Irradiation des cellules Phoenix (Jour -1 après-midi)
    1. Pour minimiser la division cellulaire, recueillir les cellules Phoenix telles que décrites à l'étape 2.2, resuspendre dans 5 ml de milieu, et les cellules d'irradiation gamma sur la glace (1000 rad).
      REMARQUE: La prudence doit être utilisée pour les travaux de radiothérapie afin d'éviter l'exposition du personnel.
    2. Centrifuger les cellules irradiées, resuspendre dans un milieu frais, plaquer à 2 x 106 cellules (dans 10 ml de milieu)/plaque/CAR, et incuber.
  4. Transfection (Jour 0 - matin)
    1. Aspirez le supernatant des cellules Phoenix, lavez-le avec 5 ml de saline tamponnée par phosphate (PBS), et ajoutez soigneusement 7 ml de milieu sérique réduit (p. ex., Opti-MEM) dans le sens de la chute à la paroi latérale de la plaque pour éviter de déranger la monocouche. Transférer les cellules à l'incubateur.
    2. Prendre deux tubes de polypropylène à fond rond de 14 ml et ajouter 1,5 ml de milieu sérique réduit à chacun. Dans un tube, ajouter 40 l de réactif de transfection (voir le Tableau des matériaux).
    3. Dans l'autre tube, ajouter 15 g d'Ab-CAR-plasmide (généré à l'étape 1) et 5 g d'enveloppe et de plasmide d'emballage (5 g pCL-Eco). Incuber les tubes à température ambiante pendant 5 min.
    4. Ajouter le mélange de réactif de transfection de l'étape 2.4.2 goutte à la deuxième tube sans entrer en contact avec les côtés du tube, et mélanger en pipetting la solution de haut en bas doucement 3 fois. Incuber à température ambiante pendant au moins 20 min.
    5. Ajouter 3 ml du mélange dans le sens de la goutte aux cellules Phoenix, et placer dans un incubateur de culture tissulaire.
    6. Après 4 à 5 h ajouter 1 ml de FCS. Cellules de culture pendant la nuit à 37 oC.
  5. Changement moyen (Jour 1)
    1. Retirez le supernatant contenant les complexes de réactifs plasmides/transfection et éliminez-les conformément aux procédures institutionnelles de manipulation des matières infectieuses. Ajouter 4 ml de milieu de culture frais et préréchauffé aux cellules.
  6. Virus de la récolte pour la transduction (Jour 2)
    1. Recueillir le milieu contenant le virus des cellules Phoenix avec une seringue stérile, un filtre (0,45 m) pour enlever les débris de cellules résiduelles, et recueillir dans un nouveau tube.
    2. Ajouter le bouillon de rhIL-2 à une concentration finale de 200 UI/mL. Utilisez le virus immédiatement pour la transduction (étape 5.3). Ajouter 4 ml de milieu frais aux cellules Phoenix et placer dans l'incubateur.
  7. Collecte répétée de virus (Jour 3)
    1. Répétez l'étape 2.6, mais jetez les cellules Phoenix comme déchets infectieux au lieu d'ajouter du milieu frais. Ce supernatant est utilisé à l'étape 5.4.

3. Isolation et activation des lymphocytes T CD8 primaires (jour -1 au jour 0)

REMARQUE: Auparavant, recueillir des lymphocytes T CD8 à partir de souris femelles de NOD à 4-5 semaines, un point de temps avant que l'inflammation d'islet commence21,22. Manipulez toutes les souris suivant les protocoles approuvés par l'IACUC. Les lymphocytes T CD8 sont enrichis à partir de splenocytes à l'aide d'un kit de sélection négative commerciale.

  1. Plaques de revêtement avec anticorps CD3/CD28 (Jour -1)
    1. Ajouter 1 ml d'un mélange d'anticorps Anti-souris CD3 et CD28 (tous deux à 1 g/mL en PBS) à chaque puits d'une plaque de 24 puits, et couver à 4 oC pendant la nuit.
    2. Le lendemain, lavez les plaques avec 1 ml de PBS stérile 3 fois avant d'ajouter les lymphocytes T Murine CD8 (étape 4.1).
      REMARQUE: Le nombre de puits à enduire varie pour chaque expérience, selon le nombre total de lymphocytes T CD8 activés requis.
  2. Collection de splenocytes (Jour 0)
    1. Euthanasiez deux souris femelles NOD âgées de 4 à 5 semaines en utilisant l'inhalation de CO2 suivie de la décapitation. Récoltez les rates et mettez-les sur une passoire cellulaire trempée dans 10 mL de PBS dans un plat de culture cellulaire sur la glace.
    2. Dans une hotte de culture cellulaire, couper chaque rate en 3 à 5 morceaux, presser les tissus avec un piston stérile d'une seringue de 3 ou 5 ml pour forcer les fragments de rate à part et permettre aux cellules de passer à travers le treillis métallique.
    3. Enlever délicatement les globules rouges en rependant les splenocytes dans un tampon dilué de lyse des cellules rouges dilués (1 ml de tampon de lyse dans 3 ml de PBS pour une rate), et en couvant pendant 5 minutes à température ambiante.
    4. Ensuite, diluer 10 l de la suspension cellulaire avec la solution de colorant bleu trypan pour compter les cellules avec un hémocytomètre, et pelleter le reste des cellules par centrifugation à 350 x g pendant 7 min.
  3. Enrichissement des lymphocytes T CD8 (Jour 0)
    1. Enrichissez les lymphocytes T CD8 par sélection négative à l'aide d'un kit d'isolation des cellules T CD8 de souris, suivant les instructions du fabricant.
      REMARQUE: Pour assurer une grande pureté, arrondissons toujours le nombre de cellules lors du calcul du volume d'anticorps biotinylated à ajouter (p. ex., utiliser le volume de réactifs suggérés pour 108 cellules pour un calcul de 9,1 x 107 cellules).
    2. Suspendre les granulés cellulaires dans 400 l de tampon et 100 l de cocktail biotine-anticorps par 1 x 108 cellules, bien mélanger et incuber pendant 5 min au réfrigérateur (4 oC) pour permettre la fixation des anticorps.
    3. Ajouter 300 l de tampon d'étiquetage et 200 l de micro-perles d'antibiotine par 1 x 108 cellules, bien mélanger et incuber pendant 10 min à 4 oC.
    4. En attendant la liaison micro-perle, configurez la colonne de séparation sur le séparateur. Laver la colonne en rinçant avec 3 ml de tampon d'étiquetage.
    5. Passer 1000 l de mélange perlé/cellule à travers une passoire cellulaire de 40 m avant de charger sur la colonne de séparation pour enlever les agrégats cellulaires. Recueillir le flux de la colonne dans un tube pré-réfrigéré de 15 ml.
    6. Laver la colonne selon les instructions du fabricant, en recueillant tous les effluents dans le même tube. Déterminer le numéro de cellule (même étape 3.2.4) et recueillir par centrifugation à 350 x g pendant 5 min. Laver les cellules en reconpendant 2 ml de milieu cellulaire T complet (RPMI-1640 contenant DU SFC, 2-mercaptoethanol, rhIL-2 (200 U/mL), mIL-7 (0,5 ng/mL), ITS , HEPES et pénicilline-streptomycine) et centrifuge à 350 x g pendant 5 min.
    7. Resuspendre les cellules dans le milieu cellulaire T complet pré-chauffé (37 oC) à une concentration de 0,25 à 0,5 x 106/mL.

4. Activation des lymphocytes T (Jour 0 à 2)

  1. Ajouter 2 ml de la suspension cellulaire (0,25 x 0,5 x 106/mL) à chaque puits enduit de l'anticorps CD3/CD28 enduit 24 puits de l'étape 3.1.2. Utilisez un mouvement tourbillonnant pour distribuer les cellules uniformément.
    REMARQUE: Ajoutez les cellules à l'aide d'un mouvement tourbillonnant pour les répartir uniformément et minimiser les effets de bord. Si les cellules se regroupent le long du bord des puits, le taux de transduction et la viabilité des cellules seront diminués.
  2. En tant que contrôle, plaquez le même nombre de lymphocytes T CD8 dans un seul puits non enduit de la plaque. Incuber les cellules à 37 oC à l'aide d'un incubateur gazé co2 de 10 % pendant 48 h.
    REMARQUE: Après 48 h, l'activation peut être confirmée à l'aide d'un microscope; les cellules activées seront plus grandes que les cellules qui n'ont pas rencontré d'anticorps anti-CD3/CD28.

[place figure 2 ici]

5. Transduction des lymphocytes T CD8 activés (jours 1 à 3)

REMARQUE: Ce protocole utilise une méthode de spin-transduction. Une centrifugeuse avec un rotor de balançoire et des adaptateurs de plaque de culture tissulaire qui est capable de maintenir une température interne de 37 oC est nécessaire. Pour assurer une efficacité maximale, le jour de la transduction préchauffe la centrifugeuse à 37 oC avant de recueillir le virus.

  1. Préparation des plaques enduites de fragment de fibronetine humaine (Jour 1 au jour 2)
    1. Le jour 1, ajouter 0,5 ml de fibronectin (50 g/mL en PBS) aux puits d'une plaque de 24 puits, et couver toute la nuit à 4 oC.
      REMARQUE: En général, deux puits enduits de fibronectin sont nécessaires par plaque de cellules Phoenix transfectées.
    2. Le jour 2, retirez la solution de fibronectin et remplacez-la par 1 ml d'albumine bovine (BSA) de 2 % dans PBS. Incuber à température ambiante pendant 30 min pour « bloquer » les sites de liaison non spécifiques.
    3. Laver les puits traités avec 1 ml de PBS stérile. Après avoir enlevé la solution de lavage, la plaque est prête à l'emploi; ou, peut être scellé et stocké à 4 oC pendant une semaine.
  2. Collecte de lymphocytes T CD8 activés (Jour 2)
    1. Récoltez les lymphocytes T CD8 activés, comptez et calculez la viabilité cellulaire à l'aide du bleu trypan ou d'un instrument automatisé approprié.
    2. Recueillir les cellules par centrifugation et resuspendre à 5 x 106 cellules viables/mL pour la transduction. Maintenir un petit aliquot de cellules en culture dans le milieu cellulaire T complet dans l'incubateur de CO2 afin de fournir un contrôle pour le tri cellulaire activé par fluorescence ultérieure des cellules transductées (étape 6).
      REMARQUE: Après l'activation pendant 48 h, le nombre total de cellules aurait dû être multiplié par environ 1,5 et avoir une viabilité supérieure à 95 %.
  3. Transduction (Jour 2)
    1. Ajouter 100 l de suspension de cellules CD8 activées par puits (0,5 x 106 cellules) à la plaque enduite de fibronectin. Ajoutez ensuite 1,5 à 2 ml de milieu contenant le virus (à partir de l'étape 2.6) à chaque puits. Mélanger à l'aide d'un mouvement tourbillonnant pour distribuer les cellules uniformément (Figure 2).
    2. Placez la plaque dans un sac en plastique zip-lock et le joint (pour fournir un confinement secondaire). Centrifugeuse à 2000 x g pendant 90 min à 37 oC.
    3. Retirer la plaque de la centrifugeuse. Dans la sécurité biologique, l'armoire retire soigneusement le sac en plastique et s'assure que l'extérieur de la plaque n'est pas contaminé par un support.
    4. Transférer ensuite la plaque dans l'incubateur de CO2 dédié à 37 oC. Après 4 h, retirer 1 ml du milieu de chaque puits et remplacer par 1 ml de milieu cellulaire T complet préréchauffé. Remplacer la plaque dans l'incubateur CO 2.
      REMARQUE: Manipulez tous les médias des cellules transductées comme des déchets infectieux.
  4. Deuxième transduction (Jour 3)
    1. Dans l'armoire de sécurité biologique dédiée, inclinez la plaque contenant les cellules transduisées en se reposant sur le couvercle et retirez soigneusement la majeure partie du milieu (laissant 100 à 200 l) en veillant à ne pas entrer en contact avec les cellules au fond du puits.
    2. Ajoutez le milieu contenant le virus recueilli à l'étape 2.7 et répétez les étapes 5.3.2-5.3.4.
      REMARQUE: D'après notre expérience, une troisième transduction améliore rarement l'efficacité globale. En outre, la viabilité de la cellule diminuera probablement de façon significative si une troisième transduction est utilisée. Si les cellules sont plaquées à une concentration plus élevée que 0,5 x 106/puits, les lymphocytes T peuvent atteindre la confluence après l'incubation de nuit après la deuxième étape de transduction. Dans ce cas, les cellules divisées après l'incubation de 4 h le jour 3.
  5. Cellules de lavage (Jour 4)
    1. Retirer 1 ml de milieu de chaque puits, resuspendre les cellules dans le milieu restant et transférer dans un tube de 15 ml. Laver les puits avec 1 ml de milieu cellulaire T complet et ajouter au tube contenant les cellules mises en commun de chaque transduction.
    2. Centrifugeuse à 350 x g pendant 7 min, puis laver deux fois en rependant 2 ml de milieu cellulaire T complet et de granulés. Enfin resuspendre dans 2 ml de milieu et de déterminer le nombre de cellules.
      REMARQUE: Si 1 x 106 cellules ont été à l'origine transduisées, le rendement à ce stade devrait être de 3 x 106.
  6. transférer
    1. Transférer les aliquots de 0,5 x 1 x 106 cellules dans 2 ml de milieu cellulaire T complet aux puits d'une nouvelle plaque de 24 puits et incuber à 37 oC. Environ 48 à 72 h après la transduction, les cellules sont prêtes pour l'analyse de l'expression de la RCA et le tri cellulaire.
      REMARQUE: Le nombre de cellules CAR-T double habituellement chaque 24 h à ce stade. Il est essentiel de ne jamais les laisser grandir. Divisez les cellules immédiatement si la densité est supérieure à 2 x 106/mL (ou si le milieu devient jaune vif). D'après notre expérience, les cellules CAR-T prolifèrent plus solidement dans des plaques de 24 puits et de 12 puits que si elles étaient transférées à un plus grand vaisseau.

6. Purification des cellules transductées par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) (jour 5 ou jour 6)

  1. Recueillir les cellules.
    1. Resuspendre les cellules en faisant monter et descendre plusieurs fois (en prenant soin de ne pas causer d'écume), transférer à 15 ml de tubes et centrifugeuse à 350 x g pendant 5 min.
    2. Resuspendre dans le tampon de tri (2% BSA en PBS stérile contenant de la gentamicine) à 1 x 106 cellules/mL. Récoltez également les lymphocytes T CD8 témoins (non transducs) à partir de l'étape 5.2).
      REMARQUE: De 1 x 106 cellules au jour 2, un rendement de 2 x 107 cellules transductées est prévu à ce moment-là.
  2. Laver les cellules une fois avec un tampon de tri en centrifugeant à 350 x g pendant 5 min, et resuspendre à 1 x 107 cellules/mL dans le tampon de tri. Retirez un petit aliquot pour le contrôle de compensation Foxp3GFP (à utiliser à l'étape 6.4.1), et tachez le reste avec l'étiquette anti-souris CD8 (clone 53-6.7; 0.2 g d'anticorps/5 x 106 cellules) en couve pendant 20 min à 4 oC.
    1. De même, tacher un aliquot des lymphocytes T CD8 non transducérés pour fournir un contrôle de compensation pour le fluorophore étiquetant l'anticorps anti-CD8.
      REMARQUE: Évitez d'ajouter de l'azide de sodium à n'importe quel tampon, car cela est toxique pour les cellules.
  3. Laver les cellules étiquetées deux fois avec un tampon de tri, resuspendre dans un tampon de tri à froid à 1 x 107 cellules/mL.
  4. Triez les cellules.
    1. Trier le GFP CD8et les cellules positives dans un milieu cellulaire T complet préréfrigéré (figure 3B). Prenez un petit aliquot pour l'analyse post-tri pour déterminer la pureté.
      REMARQUE: Pour maximiser la pureté des cellules triées, des portes serrées doivent être utilisées. Utilisez une buse de 100 m pour assurer une viabilité cellulaire élevée. Réduisez le temps pendant lequel les cellules triées sont conservées sur la glace. Les lymphocytes T qui ont été maintenus sur la glace pendant plus de 3 h prennent beaucoup plus de temps à récupérer que les cellules refroidies pendant moins de 2 h. Ainsi, si 3 lignées cellulaires transductées doivent être triées, collecter et étiqueter la deuxième ligne pendant que la première est triée et ainsi de suite plutôt que d'avoir les deuxième et troisième lignes passer un temps prolongé à 0 oC. L'expression d'autres marqueurs de lymphocytes T tels que CD28 et CD3 peut également être surveillée (figure 3C) mais n'est pas essentielle pour le tri.
    2. (Stratégie de tri alternatif) Avant de tacher la population en vrac, analysez l'expression CD8 d'une petite population de lymphocytes T transductés. Si la pureté est de 99 %, la population en vrac peut être triée en toute sécurité uniquement sur la base de l'expression gFP.

7. Expansion des cellules CAR-T triées (Jour 5 à 10)

  1. Expansion des cellules CAR-T
    1. Laver les cellules CAR-T triées une fois, puis resuspendre dans le milieu complet de cellule T pré-chauffé à 2,5 x 5 x 105 cellules/mL, et la plaque 2 mL aliquots dans des plaques de 24 puits.
    2. Comptez et divisez les cellules tous les 1/2 jours. Habituellement, le nombre de cellules double tous les jours jusqu'au 10e jour, la viabilité restant supérieure à 95 %.
      REMARQUE: Sans restimulation, les cellules CAR-T cesseront de proliférer vers le 10e jour et finiront par mourir. Ainsi, les tests fonctionnels des lymphes T et les transferts d'adoption devraient être planifiés en conséquence.
  2. Stratégie d'expansion alternative
    1. Après le tri, la culture des cellules CAR-T dans le milieu complet de cellule T contenant le rhIL-2 à 100 U/mL plutôt que 200 U/mL.
      REMARQUE: Les cellules CAR-T prolifèrent à un rythme légèrement plus lent dans ce milieu. Cependant, ils continueront souvent à proliférer jusqu'aux jours 11 à 13 sans re-stimulation. Ainsi, bien que cette stratégie d'expansion alternative ne génère pas un plus grand nombre de cellules, elle fournit une fenêtre de temps légèrement plus longue pour les essais en aval à effectuer.

8. Vérification de la spécificité et de la fonctionnalité de l'antigène des lymphocytes T CAR.

REMARQUE: La spécificité de liaison des cellules T CAR ciblant les complexes peptide/MHC peut être vérifiée par la coloration tétramer7,23. De même, leur fonctionnalité peut être confirmée en mesurant la sécrétion de cytokine ou la cytotoxicité après stimulation par leurs ligands cognate. Le NIH Tetramer Core Facility (TCF) de l'Université Emory est une source recommandée de «tetramers» et de protocoles de coloration pertinents.

  1. Peptide-MHC Tetramer coloration.
    1. Étiqueter les aliquots de 2 x 105 cellules CAR-T transduisantes dans 100 l de tampon de tri en couve avec 0,6 g de tétragènes antigènes et de contrôle fluorescents à 37 oC pendant 2 h.
    2. Pelleter les cellules par centrifugation pendant 5 min à 350 x g, puis laver deux fois en reconpendant dans 0,5 ml de tampon de tri et de re-centrirfuging. Enfin, resuspendre les cellules dans 300 l de tampon de tri et d'analyser par cytométrie de flux (Figure 4).
      REMARQUE: Pour ces études, nous utilisons généralement des tétracères BV421-labeled IAg7-B:9-23(RE) (test) et IAg7-HEL (contrôle). Cependant, toute combinaison fluorophore/tétramer qui convient aux CAR(s) à l'étude peut être utilisée à la place. Dans ce cas, la concentration et le temps de coloration doivent être optimisés pour chaque tétramer utilisé. Les cellules CAR-T triées et non triées peuvent être utilisées pour la coloration des tétramères.
  2. Mesure de spécificité par stimulation ligand.
    1. Incuber 2 x 105 cellules CAR-T triées dans 200 L de milieu cellulaire Sans cytokine avec des ligands cellulaires ou liés à des plaques appropriés.
    2. Après 6-24 h mesurent la production de cytokine par ELISA ou coloration intracellulaire utilisant les protocoles du fabricant.
      REMARQUE: Pour nos études de IAg7-B:9-23 redirigés lymphocytes T, nous culture les cellules du jour au lendemain avec M12C3 cellules murines b-cellules lymphome exprimant IAg7-B:R3 ou "vide" IAg724,25, puis collecter les supernatants et mesurer l'interféron de souris sécrétée gamma (IFN-) par ELISA26 (Figure 5).

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Representative Results

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En règle générale, l'efficacité de la transduction à l'aide de ce protocole est de 60-90%. Dans l'expérience montrée dans la figure 3, avant le tri d'environ, 70 % des lymphocytes T CD8 ont co-exprimé le PFG. Ils ont également co-exprimé CD28 et CD3 (figure 3C). Fait important, toutes les cellules « test » De GFPsont également tachées de tétragraphes IAg7-B:R3, mais pas avec le tétramère de contrôle (figure 4). De même, les cellules CAR-T triées testent et contrôlent chacune des niveaux élevés d'IFN- seulement après co-culture avec des cellules cibles exprimant leurs ligands cognates (Figure 5). Ceci confirme que les cellules transduced ont un phénotype de cellule T d'effectuif de CD8 dirigé vers la cible des anticorps parents.

Figure 1
Figure 1 : Schéma de la construction rétrovirale de la RCA. Le RAC comprend un domaine de ciblage dérivé du fragment Fab d'un anticorps monoclonal de souris approprié, et un espaceur / membrane ancre / domaine de signalisation de la souris CD28, CD137 et CD247. L'ADNc synthétique est inséré dans le vecteur d'expression rétrovirale pMIG-II. Les sites d'endouclence de restriction utilisés pour la production du mAb287-CAR sont indiqués. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Effet de différentes méthodes de placage sur la distribution cellulaire. (Gauche) Les cellules pipetted utilisant un mouvement tourbillonnant montrent une distribution égale. (Droite) Des cellules ont été pipetted directement dans le centre du puits. Les images ont été capturées après avoir tourné à 350 x g pendant 5 min. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Analyse cytométrique du flux des lymphocytes T transductés. Les cellules ont été co-tachées avec PE-Cy7 conjugué anti-CD8, AF647 conjugué anti-CD3, et BV421 conjugué anti-CD28, comme décrit à l'étape 6.4. Les profils fermés sur des cellules viables simples sont affichés. (A) Cellules T CD8 parentales non tachées. (B) PE-Cy7/GFP profil des cellules transductées. Les cellules exprimantes en RCA sont identifiées par le journaliste du GFP. (C) Les cellules transductées tachées ont été fermées sur la double positivité DE PE-Cy7/GFP. Le profil AF647/BV421 est affiché. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : coloration tetramer de cellules CAR-T non triées. Les cellules ont été tachées avec des tétratiers conjugués BV421 comme décrit dans l'étape 8.1. Les profils fermés sur des cellules viables simples sont affichés. (A) Test IAg7-insulin tetramer. (B) Contrôle I-Ag7-HEL tétramer. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Sécrétion de cytokine spécifique à l'antigène par les lymphocytes T CAR. Les lymphocytes T CD8 triés exprimant le test mAb287 ou le maRC de commande ont été co-cultivés avec des cellules M12C3 exprimant IAg7-B:R3, IAg7« vide », ou TFR-MBP-DTRL (le ligand pour mAb24.1) comme décrit à l'étape 8.2. Après 24 h, l'IFN-ELISA sécrétée a été quantifiée par ELISA. La stimulation spécifique des deux lignées de cellules T a été observée. Les données représentent la moyenne et le SD de 3 expériences répétées. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

temps Préparation du virus Préparation des lymphocytes T
JOUR -4 (ven) Décongeler les cellules Phoenix (PM)
Jour -3 (sam) Re-plaque Phoenix
Jour -2 (soleil) congé
Jour 1 (Lun) Irradier les cellules Phoenix (PM) Assiette non traitée avec CD3/CD28 Ab
Jour 0 (mar) Transfecting Phoenix cells (AM) Préparer des splenocytes et isoler les lymphocytes T CD8.
Activation des lymphocytes T.
Jour 1 (Mer) Changer les cellules Phoenix de milieu à 4 ml (AM). Manteau RetroNectin
Jour 2 (Jeu) Recueillir le virus et remplir. Transduction, lymphocytes T CD8
Jour 3 (ven) Recueillir le virus. Transduction, lymphocytes T CD8
Jour 4 (sam) Laver les cellules et dilater les cellules.
Jour 5 (soleil) Expansion cellulaire si nécessaire.
Jour 6 (Lun) Tri des cellules CAR-T.
Jour 7 -10 (du mardi au vendredi) Expansion des cellules T CAR- Expériences.

Tableau 1 : Sommaire du protocole de génération CAR-T.

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Discussion

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Ce protocole décrit une méthode efficace pour produire des cellules CD8 CAR-T spécifiques à l'antigène par transduction rétrovirale. L'efficacité de la transduction de notre protocole est généralement élevée, et l'expression robuste de la RCA est généralement observée. Les lymphocytes T CAR élargis conservent les caractéristiques essentielles des lymphocytes T activés par les parents, et la spécificité des anticorps, et conviennent à l'utilisation in vitro et in vivo. Nous avons appliqué des lymphocytes T Ab-CAR CD8 dans la reprogrammation du diabète de type 1 chez les souris NOD7.

Notre protocole intègre plusieurs modifications critiques aux méthodes précédemment décrites. Tout d'abord, nous utilisons un milieu de culture de cellules T optimisé qui permet un temps d'activation prolongée. Le milieu complet décrit contient des niveaux optimaux de plusieurs suppléments clés, et améliore considérablement la viabilité des lymphocytes T et l'étendue de la prolifération après l'activation. Il convient de noter que la souris IL-2 peut être substituée à la protéine humaine avec des résultats équivalents, bien qu'à l'heure actuelle, l'homme IL-2 est plus abordable. Il convient de noter qu'une efficacité de transduction significativement plus élevée est obtenue à l'aide de lymphocytes T activés pendant 40-48 h que si une étape d'activation de 24 h est utilisée.

Deuxièmement, nous utilisons une procédure de transduction améliorée qui élimine le polybrene B (qui est toxique pour les lymphocytes T) et utilise la fibronectine à la place. Cela améliore encore la viabilité des cellules. Il convient de noter que pour garantir une bonne efficacité de transduction, il est essentiel de maintenir les lymphocytes T dans un milieu optimisé à une densité cellulaire appropriée et d'utiliser des supernatants viraux frais à haut tigre plutôt que le virus précédemment congelé. En utilisant notre procédure modifiée, une troisième étape de transduction est inutile et en effet n'est pas souhaitable que la viabilité diminue généralement si une troisième étape d'infection spin est inclus. Il faut également souligner qu'il est essentiel de ne jamais laisser les cellules surcroître pendant la phase d'expansion. Une fois que les cellules sont envahies, elles ont tendance à perdre rapidement leur phénotype et à mourir.

En plus des paramètres décrits ci-dessus, deux autres causes potentielles de faible efficacité/viabilité de la transduction doivent être évitées. Tout d'abord, comme les antibiotiques ne doivent pas être présents pendant les étapes de transfection, il est important de s'assurer que les plasmides sont préparés à l'aide d'un kit sans endotoxine, et dissous dans de l'eau stérile, et que la bonne technique stérile est utilisée en tout temps. Deuxièmement, la présence de niveaux élevés de cellules T mortes ou mourantes doit être évitée. Si la suspension de cellule T CD8 parentale activée contient des niveaux élevés de cellules mortes ou de débris cellulaires, cela doit être enlevé avant la transduction à l'aide de kits commerciaux.

Nous n'avons délibérément pas inclus une étape de congélation des cellules CAR-T dans ce protocole, car selon notre expérience, une proportion importante des cellules transductées meurent pendant la cryoconservation et la décongélation. De même, bien que les cellules CAR-T élargies puissent être restimulées in vitro, elles ont une tendance accrue à perdre l'expression du transgène. En conséquence, étant donné le degré élevé de prolifération que nous observons à l'aide de cellules CAR-T fraîchement triées, nous recommandons fortement que seules les cellules CAR-T fraîchement produites soient utilisées pour les essais fonctionnels et le transfert adoptif.

En résumé, l'importance de ce protocole est qu'il décrit une procédure qui fournit une efficacité de transduction élevée et génère un grand nombre de cellules T de souris spécifiques à l'antigène sain CD8 pour une utilisation in vitro et in vivo. Notre protocole fournit ainsi un outil utile pour les chercheurs qui entreprennent des études de cellules CAR-T dans des modèles murins de la maladie.

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Disclosures

MAb287 et ses dérivés sont protégés par un brevet américain délivré en 2014.

Acknowledgments

Cette étude a été soutenue par les subventions de la FRDJ 1-INO-2015-74-S-B, 2-SRA-2016-238-S-B, et SRA-2-S-2018-648-S-B, un Prix d'éducation et d'action sur le diabète, et le Fonds de droit Caroline Wiess pour la recherche en médecine moléculaire au Baylor College of Medicine. Le tri cellulaire a été appuyé par le Cytometry and Cell Sorting Core du Baylor College of Medicine grâce à un financement des NIH (S10RR024574 et P30CA125123). Tous les tétratiers peptidiques-MHC ont été obtenus à partir de l'installation de base de Tetramer des NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol (50mM) Gibco 21985-023 50 μM
5’ RACE PCR Clontech 634859
anti-mouse CD28 antibodies eBioscience 14-0281-86 final concentration at 1µg/ml
anti-mouse CD3e antibody eBioscience 145-2C11 final concentration at 1µg/ml
Biotin Rat Anti-Mouse IFN-γ BD Biosciences 554410 Working concentration at 0.5 µg/ml
BSA Sigma A7030
Endo-free Maxi-Prep kit Qiagen 12362
Gentamicin Gibco 15750-060 Final 50 µg/ml.
Heat inactivated FCS Hyclone SH30087.03 Final 10% FCS
HEPES (100X) Gibco 15630-080 1X
IAg7-CLIP tetramer-BV421 NIH tetramer Facility at Emory per approval Working concentration at 6 µg/ml
IAg7-insulin P8E tetramer-BV421 NIH tetramer Facility at Emory per approval Working concentration at 6 µg/ml
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS 100x) ThermoFisher 51500056 Final concentraion is 1x
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
MACS Separation Buffer Miltenyi Biotec 130-091-221
Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit Miletenyi Biotec Inc 130-104-075
Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit Miltenyi Biotec 130-104-075
Opti-MEM medium ThermoFisher 31985070
Penicillin-Streptomycin (5000U/ml) ThermoFisher 15070063 50 U/ml
Phoenix-ECO cells ATCC CRL-3214
Phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 10010-023
pMIG II Addgene 52107
pMSCV-IRES-GFP II Addgene 52107
Purified Rat Anti-Mouse IFN-γ BD Biosciences 551216 Working concentration at 3 µg/ml
Red cell lysis buffer Sigma R7767
RetroNectin Takara T100A Working concentration at 50 µg/ml in PBS
rhIL-2 (stock concentration 105 IU/ul) Peprotech 200-02 Final concentration at 200 IU/ml
rmIL-7 ( stock concentration 50ng/ul) R&D 407-ML-005 Final concentration at 0.5ng/ml
RPMI-1640 Gibco 11875-093
Sterile Cell Strainers Fisher Scientific 22-363-548
Tryple Gibco 12605-028

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Génération à haut rendement de cellules T cytotoxiques cytotoxiques de souris primaires spécifiques à l'antigène pour les tests fonctionnels dans un modèle de diabète auto-immun
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Davidson, H. W., Cepeda, J. R., Sekhar, N. S., Han, J., Gao, L., Sosinowski, T., Zhang, L. High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model. J. Vis. Exp. (150), e59985, doi:10.3791/59985 (2019).More

Davidson, H. W., Cepeda, J. R., Sekhar, N. S., Han, J., Gao, L., Sosinowski, T., Zhang, L. High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model. J. Vis. Exp. (150), e59985, doi:10.3791/59985 (2019).

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