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Immunology and Infection

एक Autoimmune मधुमेह मॉडल में कार्यात्मक परीक्षण के लिए Antigen-विशिष्ट प्राथमिक माउस Cytotoxic टी कोशिकाओं के उच्च दक्षता पीढ़ी

doi: 10.3791/59985 Published: August 16, 2019

Summary

यह आलेख एंटीजन-विशिष्ट CD8 टी कोशिकाओं की पीढ़ी के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, और इन विट्रो में उनके विस्तार, इन विट्रो में और विवो में उपयोग के लिए कार्यात्मक टी कोशिकाओं की उच्च संख्या उपज के उद्देश्य से.

Abstract

प्रकार 1 मधुमेह (T1D) आइलेट-विशिष्ट autoimmunity बीटा सेल विनाश और इंसुलिन उत्पादन की पूर्ण हानि के लिए अग्रणी द्वारा विशेषता है. सहज गैर मोटापे से ग्रस्त मधुमेह (NOD) माउस मॉडल में, इंसुलिन प्राथमिक लक्ष्य है, और इन जानवरों के आनुवंशिक हेरफेर एक एकल कुंजी इंसुलिन epitope को दूर करने के लिए रोग से बचाता है. इस प्रकार, पेशेवर एंटीजन पेश कोशिकाओं (APCs) इस रोगजनक एपिटोप असर के चयनात्मक उन्मूलन अवांछित इंसुलिन विशेष autoimmune प्रतिक्रियाओं को बाधित करने के लिए एक दृष्टिकोण है, और संभावना अधिक से अधिक अनुवाद क्षमता है.

चिमेरिक प्रतिजन रिसेप्टर्स (CARs) टी कोशिकाओं चुनिंदा रोग पैदा करने वाले प्रतिजनों को लक्षित करने के लिए अनुप्रेषित कर सकते हैं. इस तकनीक को कई कैंसर के इलाज के लिए दत्तक कोशिका चिकित्सा के लिए सेलुलर इंजीनियरिंग का उपयोग करने के लिए हाल ही में प्रयास करने के लिए मौलिक है. इस प्रोटोकॉल में, हम एक अनुकूलित टी-सेल रेट्रोवायरस (आरवी) transduction और इन विट्रो विस्तार प्रोटोकॉल है कि कार्यात्मक प्रतिजन-विशिष्ट CD8 CAR-T कोशिकाओं की एक कम संख्या से शुरू की उच्च संख्या उत्पन्न करता है का वर्णन पहले एकाधिक कार-टी सेल प्रोटोकॉल वर्णित किया गया है, लेकिन आम तौर पर अपेक्षाकृत कम transduction दक्षता और सेल व्यवहार्यता के साथ transduction के बाद. इसके विपरीत, हमारे प्रोटोकॉल 90% transduction दक्षता प्रदान करता है, और उत्पन्न कोशिकाओं vivo में दो सप्ताह से अधिक जीवित रह सकते हैं और काफी एक जलसेक के बाद रोग शुरुआत में देरी. हम सेल रखरखाव और transduction प्रोटोकॉल का एक विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं, ताकि महत्वपूर्ण कदम आसानी से पालन किया जा सकता है. प्राथमिक सेल अलगाव से कार अभिव्यक्ति के लिए पूरी प्रक्रिया 14 दिनों के भीतर किया जा सकता है. सामान्य विधि किसी भी माउस रोग मॉडल है जिसमें लक्ष्य जाना जाता है के लिए लागू किया जा सकता है. इसी प्रकार, विशिष्ट अनुप्रयोग (रोगजनक पेप्टाइड/एमएचसी श्रेणी द्वितीय परिसर को लक्षित करना) किसी भी अन्य ऑटोम्यून्यून रोग मॉडल पर लागू होता है जिसके लिए एक प्रमुख परिसर की पहचान की गई है।

Introduction

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अवांछित ऑफ-लक्ष्य प्रभाव ों की संभावना कम जोखिम को देखते हुए, एंटीजन-विशिष्ट प्रतिरक्षा उपचार (एएसआई) T1D जैसे ऑटोम्यून्यून रोगों के लिए उपचार का वादा कर रहे हैं। संचित साक्ष्य से पता चलता है कि (प्रीप्रो) इंसुलिन के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं T1D1में विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो सकती हैं। पिछले दशक में, कई समूहों से अध्ययन, हमारे अपने सहित, दृढ़ता से सुझाव है कि विशिष्ट MHC वर्ग द्वितीय अणुओं द्वारा इंसुलिन बी श्रृंखला अमीनो एसिड युक्त एक epitope की प्रस्तुति 9 से 23 (B:9-23/MHCII), में T1D के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है चूहे और मनुष्य2,3,4,5. चुनिंदा लक्ष्य B:9-23/MHCII परिसर, हम एक monoclonal एंटीबॉडी उत्पन्न, mAb287 नाम, कि हार्मोन इंसुलिन या अन्य पेप्टाइड्स युक्त परिसरों के लिए कोई पार प्रतिक्रियाहै 6. MAb287 ब्लॉक एंटीजन प्रस्तुति इन विट्रो में, और mAb287 के साप्ताहिक प्रशासन पूर्व मधुमेह NOD चूहों इलाज चूहों के 35% में T1D के विकास में देरी6. विवो में प्रतिजन प्रस्तुति ब्लॉक करने के लिए, अक्सर इंजेक्शन आम तौर पर एक उच्च घूम एकाग्रता बनाए रखने के लिए आवश्यक हैं। हम hypothesized है कि हम Ab287 की उच्च विशिष्टता का लाभ लेने के लिए टी कोशिकाओं reprogram द्वारा इस कठिनाई को दूर कर सकता है, जिससे T1D7के लिए एक बेहतर प्रतिजन विशेष टी सेल थेरेपी प्रदान .

बताया जाता है कि यदि उनके कोग्नेट लिगन्ड की एक प्रति भी8,9,10व्यक्त की जाती है तो कोशिका विषाक् त टी कोशिकाएं अपने लक्ष् य को मार सकती हैं . इस प्रकार, B:9-23/MHCII विशिष्ट CD8 टी कोशिकाओं को माता पिता एंटीबॉडी की तुलना में अवांछित प्रतिजन प्रस्तुति को नष्ट करने में उच्च दक्षता है, जो संभावना एक ही एपीसी पर कई परिसरों के लिए बाध्य करने की आवश्यकता होगी अपने प्रभाव लागू करने की उम्मीद कर रहे हैं. कई मानव कैंसरों के उपचार के लिए कार टी कोशिकाओं का उपयोग किया गया है11,12,13, और यह भी autoimmunity14में प्रभावशाली हो सकता है . तथापि, रोगजनक पेप्टाइड-एमएचसी परिसरों के लिए विशिष्टता वाली सीएआर-टी कोशिकाओं का अभी तक टी 1 डी की प्रगति को संशोधित करने के लिए उपयोग नहीं किया गया है। अनुकूलित CD8 टी सेल transduction तकनीक नीचे वर्णित का उपयोग करके, हम हाल ही में सिद्धांत का सबूत है कि यह वास्तव में एक व्यवहार्य दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है7का प्रदर्शन किया.

इस प्रोटोकॉल में, हम एक कुशल और सुव्यवस्थित transduction और विस्तार विधि रूपरेखा. हमारे प्रोटोकॉल उच्च दक्षता के साथ माउस CD8 कार टी कोशिकाओं की पीढ़ी की आवश्यकता होती है अन्य अध्ययनों के लिए लागू है.

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Protocol

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चूहे एक ट्रांसजेनिक माउस सुविधा में विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त शर्तों के तहत बनाए रखा गया था, और सभी पशु प्रयोगों चिकित्सा पशु देखभाल और उपयोग समिति के Baylor कॉलेज द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार प्रदर्शन किया गया.

नोट: प्रयोग समानांतर में वायरस और टी कोशिकाओं की तैयारी की आवश्यकता है. तालिका 1 प्रोटोकॉल को सारांशित करता है. कुंजी अभिकर्मकों और बफरों को सामग्री तालिकामें सूचीबद्ध किया जाता है । हम इस प्रोटोकॉल में APCs की विशिष्ट आबादी को लक्षित सीएआर-टी कोशिकाओं की पीढ़ी और विस्तार पर ध्यान केंद्रित करते हैं।

1. पीढ़ी और एकल श्रृंखला फैब एंटीबॉडी (scFab)-CARs के सत्यापन.

नोट:CARs में आम तौर पर 3 महत्वपूर्ण डोमेन-एक एंटीजन लक्ष्यीकरण डोमेन, एक स्पेसर/ट्रांसमेम्ब्रेन डोमेन, और एक साइटोप्लाज्मिक संकेतन डोमेन होता है. प्रत्येक कार का सटीक डिजाइन लक्षित लक्ष्य पर निर्भर करता है, और इसलिए, इसके अलावा रेट्रोवायरस की पीढ़ी के लिए प्रासंगिक निर्माण की प्रमुख विशेषताओं के अलावा, इस प्रोटोकॉल में विस्तार से वर्णित नहीं किया जाएगा। नीचे वर्णित अध्ययनों के लिए प्रयुक्त सीएआर का समग्र डिजाइन चित्र 1में दर्शाया गया है. संक्षेप में, लक्ष्यीकरण डोमेन में एक अर्द्ध-rigid linker द्वारा जुड़े माता-पिता monoclonal एंटीबॉडी से भारी श्रृंखला के पूरे प्रकाश श्रृंखला और चर और CH1 डोमेन शामिल हैं. spacer/transmembrane डोमेन माउस CD28 से है, और संकेतन डोमेन माउस CD28, CD137 (4-1BB), और CD247 (CD3 $) से तत्वों युक्त संलयन है। इन तत्वों को मानक आणविक जीव विज्ञान प्रक्रियाओं जैसे जोड़ ओवरलैप पॉलिमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर), या एक उपयुक्त "जीन ब्लॉक" के संश्लेषण द्वारा इकट्ठा किया जाता है। mAB287 कार की पीढ़ी का विवरण झांग एट अल में निहितहैं. cDNA दृश्यों अनुरोध पर लेखकों से प्राप्त किया जा सकता है.

  1. कार निर्माण को इकट्ठा करना
    1. लक्ष्यीकरण एकल श्रृंखला फैब एंटीबॉडी (scFab) और संयुक्त spacer/signaling डोमेन अलग से संश्लेषित करें, और एक "3 बिंदु" लिगेशन तकनीक का उपयोगकरें 15 अंतिम निर्माण इकट्ठा करने के लिए (चित्र 1).
      नोट:कार डालने के लिए महत्वपूर्ण आवश्यकता यह है कि यह retroviral अभिव्यक्ति वेक्टर pMSCV-IRES-GFP द्वितीय (PMIG II) में ligation की अनुमति पार्श्व प्रतिबंध endonuclease साइटों को शामिल करना चाहिए, या एक संबंधित व्युत्पन्न15 भी कर रहे हैं उपयुक्त.
  2. CAR सतह अभिव्यक्ति का सत्यापन
    1. एक मानक प्रोटोकॉल द्वारा उत्पन्न रेट्रोवायरल कणों व्युत्पन्न pMIG द्वितीय का उपयोग कर संकरमा कोशिकाओं transduce (उदा., Holst एट अल.16)..
    2. सीएआर वेक्टर17से GFP की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण चलाएँ।
    3. ट्रांसड्यूस्ड हाइब्रिडो के सीएआर के दाग सतह अभिव्यक्ति माउस के खिलाफ लेबल एंटीबॉडी का उपयोग कर - श्रृंखला (उदा., क्लोन RMK-45)17.
      नोट: 18.
  3. सीएआर विशिष्टता का सत्यापन
    1. उचित प्लेट बाध्य या सेलुलर प्रतिजनों के साथ ट्रांसड्यूस्ड हाइब्रिडोमा कोशिकाओं को उत्तेजित करें। रात भर सह संस्कृति supernatants इकट्ठा करने और साइटोकिन्स स्रावित होने के बाद, और एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसॉरबेंट परख (एलिसा)7द्वारा परख.
      नोट:आदर्श रूप में, प्रत्येक कार स्वतंत्र रूप से transduction के लिए इस्तेमाल किया जा रहा से पहले मान्य किया जाना चाहिए. इस चरण पर, प्रयोग रोक दिया और बाद में पुनरारंभ किया जा सकता है।

2. वायरल निर्माता कोशिकाओं के संक्रमण (दिन -4 से दिन 3)

नोट:रेट्रोवायरस फीनिक्स-ईसीओ कोशिकाओं का उपयोग करके उत्पादित किया जाता है (सामग्री की तालिकादेखें )19,20. संभावित संक्रामक एजेंटों की पीढ़ी के लिए उचित सावधानियों का उपयोग करें (अधिमानतः एक नामित बीएसएल-2 कैबिनेट और अलग इनक्यूबेटर सहित transfected /transduced कोशिकाओं culturing के लिए).

  1. Thawing फीनिक्स कोशिकाओं (दिन -4)
    1. Thaw 2 x 106 फीनिक्स-इको कोशिकाओं. फीनिक्स कोशिकाओं की संख्या को स्केल करें यदि एकाधिक ट्रांस्क्शन की योजना बनाई जाती है।
    2. उन्हें 10 सेमी ऊतक संस्कृति पकवान में प्लेट मध्यम के 10 एमएल के साथ (Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) युक्त 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस)).
  2. मार्ग फीनिक्स कोशिकाओं (दिन -3)
    1. मध्यम निकालें, और Dulbecco के फॉस्फेट-बफर नमकीन (DPBS) के 5 एमएल के साथ धो लें।
    2. 3 0.25% ट्रिप्सिन के 3 एमएल जोड़ें और 3 मिनट के लिए 10% सीओ2 वातावरण के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    3. कोशिकाओं को फसल कटाई तो 200 x gपर 3 मिनट के लिए centrifugation द्वारा गोली . 10 एमएल ताजा मध्यम और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट के साथ कोशिकाओं को फिर से प्लेट।
  3. फीनिक्स कोशिकाओं के विकिरण (दिन -1 दोपहर)
    1. आगे सेल विभाजन को कम करने के लिए, चरण 2.2 में वर्णित के रूप में फीनिक्स कोशिकाओं को इकट्ठा, मध्यम के 5 एमएल में resuspend, और गामा बर्फ पर विकिरण कोशिकाओं (1000 रेड).
      नोट:सावधानी विकिरण काम के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए कर्मियों जोखिम से बचने के लिए.
    2. विकिरणित कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें, ताजा माध्यम में पुन: स्फूर्त, 2 x 106 कोशिकाओं पर प्लेट (मध्यम के 10 एमएल में) /प्लेट/CAR, और इनक्यूबेट।
  4. ट्रांसफेक्शन (दिन 0 - सुबह)
    1. फीनिक्स कोशिकाओं से supernatant aspirate, फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) के 5 एमएल के साथ धोने, और ध्यान से कम सीरम मध्यम के 7 एमएल जोड़ें (जैसे, Opti-MEM) प्लेट के sidewall के लिए dropwise मोनोलेयर परेशान करने से बचने के लिए. कोशिकाओं को वापस इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें.
    2. दो 14 एमएल गोल नीचे पॉलीप्रोपीलीन ट्यूब लें, और प्रत्येक के लिए कम सीरम मध्यम के 1.5 एमएल जोड़ें। एक नली में 40 डिग्री सेल्सियस ट्रांसफेलेशन अभिकर्मक जोड़ें (सामग्री की सारणीदेखें)।
    3. अन्य ट्यूब करने के लिए, अब-कार-प्लाज्मिड के 15 डिग्री ग्राम जोड़ें (चरण 1 में उत्पन्न) और लिफाफा और पैकेजिंग प्लाज्मिड के 5 डिग्री ग्राम (5 ग्राम पीसीएल-इको)। 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट ट्यूब।
    4. ट्यूब पक्षों से संपर्क किए बिना दूसरी ट्यूब के लिए चरण 2.4.2 dropwise से transfection अभिकर्मक मिश्रण जोड़ें, और धीरे से 3 बार ऊपर और नीचे solution पाइप िंग द्वारा मिश्रण. कम से कम 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
    5. फीनिक्स कोशिकाओं के लिए मिश्रण dropwise के 3 एमएल जोड़ें, और एक ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में जगह है.
    6. 4-5 ज के बाद एफसीएस का 1 एमएल जोड़ें। संस्कृति कोशिकाओं को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर.
  5. मध्यम परिवर्तन (दिन 1)
    1. अधिनापत्यानंद को हटा दें जिसमें प्लाज्मिड/ट्रांसफेक्शन रिएजेंट परिसरों को हटा दें और संक्रामक सामग्री से निपटने के लिए संस्थागत प्रक्रियाओं के अनुसार उनका निपटान करें। कोशिकाओं के लिए ताजा, पूर्व गर्म संस्कृति माध्यम के 4 एमएल जोड़ें।
  6. Transduction के लिए हार्वेस्ट वायरस (दिन 2)
    1. अवशिष्ट सेल मलबे को हटाने के लिए, फ़िल्टर (0.45 डिग्री मी) के साथ फीनिक्स कोशिकाओं से वायरस युक्त माध्यम ले लीजिए, और एक नई ट्यूब में इकट्ठा करने के लिए।
    2. 200 IU/mL की अंतिम सांद्रता में RHIL-2 स्टॉक जोड़ें। ट्रांसडक्शन (चरण 5.3) के लिए तुरंत वायरस का उपयोग करें। फीनिक्स कोशिकाओं के लिए ताजा माध्यम के 4 एमएल जोड़ें और इनक्यूबेटर में रखें।
  7. दोहराएँ वायरस संग्रह (दिन 3)
    1. कदम 2.6 दोहराएँ, लेकिन ताजा माध्यम जोड़ने के बजाय संक्रामक अपशिष्ट के रूप में फीनिक्स कोशिकाओं को त्यागें. इस supernatant चरण 5.4 में प्रयोग किया जाता है.

3. प्राथमिक CD8 टी सेल अलगाव और सक्रियण (दिन -1 से दिन 0)

नोट:पहले, 4-5 सप्ताह में मादा NOD चूहों से CD8 टी कोशिकाओं को इकट्ठा, एक समय बिंदु से पहले islet सूजन शुरू होता है21,22. IACU अनुमोदित प्रोटोकॉल के बाद सभी चूहों को संभालें। CD8 टी कोशिकाओं एक वाणिज्यिक नकारात्मक चयन किट का उपयोग splenocytes से समृद्ध हैं.

  1. CD3/CD28 एंटीबॉडी के साथ कोटिंग प्लेटें (दिन -1)
    1. एक 24-अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं में एंटी-माउस CD3 और CD28 एंटीबॉडी (दोनों पर 1 डिग्री सेल्सियस/
    2. अगले दिन, 1 एमएल बाँझ पीबीएस के साथ प्लेटों धोने 3 बार murine CD8 टी कोशिकाओं (कदम 4.1) जोड़ने से पहले.
      नोट:लेपित होने वाले कुओं की संख्या प्रत्येक प्रयोग के लिए अलग-अलग होगी, जो आवश्यक सक्रिय CD8 T कोशिकाओं की कुल संख्या के आधार पर होगी।
  2. स्प्लेनोसाइट्स का संग्रह (दिन 0)
    1. EUthanize दो NOD महिला चूहों आयु वर्ग 4-5 सप्ताह सीओ2 साँस लेना decapitation के बाद का उपयोग कर. तिल्ली फसल और बर्फ पर एक सेल संस्कृति पकवान में 10 एमएल पीबीएस में भिगोने एक सेल छलनी पर डाल दिया।
    2. एक सेल संस्कृति हुड में, 3-5 टुकड़ों में प्रत्येक तिल्ली में कटौती, एक 3 या 5 एमएल सिरिंज के एक बाँझ प्लंजर के साथ ऊतकों प्रेस तिल्ली टुकड़े अलग मजबूर करने के लिए और कोशिकाओं को तार जाल के माध्यम से पारित करने के लिए अनुमति देते हैं।
    3. धीरे से 1:4 पतला लाल सेल lysis बफर में splenocytes ressines द्वारा लाल रक्त कोशिकाओं को दूर (1 एक तिल्ली के लिए पीबीएस के 3 एमएल में lysis बफर के एमएल), और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए incubating.
    4. फिर, एक हेमोसाइटोमीटर के साथ कोशिकाओं की गिनती के लिए trypan नीले रंग समाधान के साथ सेल निलंबन के 10 डिग्री सेल्सियस पतला, और 7 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं के बाकी गोली.
  3. CD8 टी कोशिकाओं का संवर्धन (दिन 0)
    1. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए माउस CD8 T सेल आइसोलेशन किट का उपयोग करके नकारात्मक चयन द्वारा CD8 T कक्षों को समृद्ध करें.
      नोट:उच्च शुद्धता हमेशा सेल संख्या को गोल सुनिश्चित करने के लिए जब biotinylated-antibody की मात्रा की गणना करने के लिए जोड़ा जा करने के लिए (उदाहरण के लिए, एक गणना 9.1 x 107 कोशिकाओं के लिए 108 कोशिकाओं के लिए सुझाव अभिकर्मकों की मात्रा का उपयोग करें).
    2. बफर के 400 डिग्री एल और बायोटिन-एंटीबॉडी कॉकटेल के 100 डिग्री एल में सेल छर्रों को निलंबित करें 1 x 108 कोशिकाओं के प्रति, अच्छी तरह से मिश्रण और रेफ्रिजरेटर में 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट (4 डिग्री सेल्सियस) एंटीबॉडी बंधन की अनुमति देने के लिए।
    3. 1 x 10 8कोशिकाओं के प्रति एंटी-बायोटिन माइक्रो-मोड्स के 300 डिग्री एल और 200 डिग्री सेल्सियस जोड़ें, 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए अच्छी तरह से मिलाएं और इनक्यूबेट करें।
    4. माइक्रो-bead बाइंडिंग के लिए प्रतीक्षा करते समय, विभाजक पर पृथक्करण स्तंभ सेट करें। लेबलिंग बफर के 3 एमएल के साथ rinsing द्वारा कॉलम धो लें।
    5. सेल समुच्चय को हटाने के लिए पृथक्करण कॉलम पर लोड करने से पहले 40 डिग्री सेल छलनी के माध्यम से 1000 डिग्री सेल्सियस भार/सेल मिश्रण पास करें। एक पूर्व ठंडा 15 एमएल ट्यूब में स्तंभ प्रवाह के माध्यम से ले लीजिए.
    6. निर्माता द्वारा दिए गए निर्देश के अनुसार कॉलम को धो लें, सभी बहिस्त्राव को एक ही ट्यूब में इकट्ठा करें। सेल नंबर (चरण 3.2.4 के रूप में ही) का निर्धारण करें और 5 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा एकत्र करें। पूर्ण टी सेल माध्यम के 2 एमएल में फिर से आपूर्ति करके कोशिकाओं को धोएं (आरपीएमआई-1640 जिसमें एफसीएस, 2-मर्केप्टोथेनोल, आरआईएल-2 (200 यू/एमएल), एमआईएल-7 (0.5 एनजी/ , HEPES और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन) और 5 मिनट के लिए 350 x g पर अपकेंद्रण।
    7. 0ण्25-0ण्5 x 106/mL की सांद्रता में कोशिकाओं को पूर्व-वार्म्ड (37 डिग्री सेल्सियस) पूर्ण टी कोशिका माध्यम में पुन: निलंबित करें।

4. टी सेल सक्रियण (दिन 0 से 2)

  1. सेल निलंबन के 2 एमएल जोड़ें (0.25-0.5 x 106/mL) सीडी 3/CD28 एंटीबॉडी लेपित 24-वेल प्लेट से कदम 3.1.2 के प्रत्येक लेपित करने के लिए। कोशिकाओं को समान रूप से वितरित करने के लिए एक घूमता गति का उपयोग करें।
    नोट:उन्हें समान रूप से वितरित करने और बढ़त प्रभाव को कम करने के लिए एक घूमता गति का उपयोग कर कोशिकाओं को जोड़ें। यदि कोशिकाएं कुओं के किनारे के साथ क्लस्टर, दोनों transduction दर और सेल व्यवहार्यता कम हो जाएगा.
  2. एक नियंत्रण के रूप में, थाली के एक गैर लेपित अच्छी तरह से सीडी 8 टी कोशिकाओं की एक ही संख्या थाली थाली. 48 ज के लिए एक 10% सीओ2 गैस्ड इनक्यूबेटर का उपयोग करके 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    नोट:48 ज के बाद, सक्रियण एक माइक्रोस्कोप का उपयोग कर की पुष्टि की जा सकती है; सक्रिय कोशिकाओं को उन कोशिकाओं से बड़ा होगा जो एंटी-CD3/CD28 एंटीबॉडी का सामना नहीं करते थे।

[स्थान आंकड़ा 2 यहाँ]

5. सक्रिय CD8 टी कोशिकाओं का स्थानांतरण (दिन 1 से 3)

नोट:इस प्रोटोकॉल एक स्पिन-transduction विधि का उपयोग करता है. एक स्विंग-आउट रोटर और ऊतक संस्कृति प्लेट एडेप्टर के साथ एक अपकेंद्रित्र जो 37 डिग्री सेल्सियस के आंतरिक तापमान को बनाए रखने में सक्षम है, की आवश्यकता है। अधिकतम दक्षता सुनिश्चित करने के लिए, वायरस इकट्ठा करने से पहले ट्रांसडक्शन प्री-वार्म सेंट्रीफ्यूज को 37 डिग्री सेल्सियस तक ले जाया जाता है।

  1. तैयारी मानव फाइब्रोनेक्टिन टुकड़ा लेपित प्लेटों की (दिन 1 से दिन 2)
    1. पहले दिन, 24-वेल प्लेट के कुओं में 0.5 एमएल फाइब्रोनेक्टिन (50 ग्राम/एमएल) जोड़ें, और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट:आमतौर पर, दो फाइब्रोनेक्टिन लेपित कुओं transfected फीनिक्स कोशिकाओं की थाली प्रति आवश्यक हैं.
    2. 2 दिन fibronectin समाधान को हटाने, और पीबीएस में 2% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (BSA) के 1 एमएल के साथ बदलें. "ब्लॉक" गैर विशिष्ट बाध्यकारी साइटों के लिए 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
    3. इलाज किए गए कुओं को 1 एमएल बाँझ पीबीएस से धोएं। धोने समाधान को हटाने के बाद, थाली उपयोग के लिए तैयार है; या, सील और एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. सक्रिय CD8 टी कोशिकाओं का संग्रह (दिन 2)
    1. सक्रिय CD8 टी कोशिकाओं फसल, गिनती और trypan नीले या एक उपयुक्त स्वचालित साधन का उपयोग कर सेल व्यवहार्यता की गणना।
    2. अपकेंद्रण द्वारा कोशिकाओं को एकत्र करें और transduction के लिए 5 x 106 व्यवहार्य कोशिकाओं/एमएल पर पुन: निलंबित करें। ट्रांसड्यूस कोशिकाओं की मात्रा को सक्रिय करने के बाद फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छँटाई के लिए एक नियंत्रण प्रदान करने के लिए सीओ2 इनक्यूबेटर में पूर्ण टी सेल माध्यम में संस्कृति में कोशिकाओं का एक छोटा सा एलिकोट बनाए रखें (चरण 6)।
      नोट:48 h के लिए सक्रियण के बाद, कोशिकाओं की कुल संख्या लगभग 1.5 गुना से बढ़ जाना चाहिए, और एक व्यवहार्यता से अधिक 95% है.
  3. Transduction (दिन 2)
    1. सक्रिय CD8 सेल निलंबन के 100 $L अच्छी तरह से जोड़ें (0.5 x 106 कोशिकाओं) fibronectin लेपित प्लेट के लिए. फिर प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए वायरस युक्त माध्यम (चरण 2.6) से 1.5-2 एमएल जोड़ें। कोशिकाओं को समान रूप से वितरित करने के लिए चक्करलगाने की गति का उपयोग करके मिलाएं (चित्र 2)।
    2. एक ज़िप ताला प्लास्टिक बैग और सील में थाली प्लेस (माध्यमिक रोकथाम प्रदान करने के लिए). 37 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिनट के लिए 2000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
    3. अपकेंद्रित्र से प्लेट निकालें. जैविक सुरक्षा में, कैबिनेट ध्यान से प्लास्टिक बैग को हटा दें और सुनिश्चित करें कि थाली के बाहर किसी भी माध्यम से दूषित नहीं है।
    4. फिर समर्पित 37 डिग्री सेल्सियस सीओ2 इनक्यूबेटर के लिए प्लेट हस्तांतरण। 4 ज के बाद, प्रत्येक अच्छी तरह से मध्यम के 1 एमएल निकालें और 1 एमएल के साथ पूर्व-वार्म्ड पूर्ण टी सेल माध्यम से बदलें। सीओ2 इनक्यूबेटर में प्लेट को बदलें।
      नोट:संक्रामक अपशिष्ट के रूप में ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं से सभी मीडिया को संभालें।
  4. दूसरा transduction (दिन 3)
    1. समर्पित जैविक सुरक्षा कैबिनेट में, ढक्कन पर आराम करके ट्रांसड्यूस ्ड कोशिकाओं वाली प्लेट को झुकाएं और ध्यान से अधिकांश माध्यम को हटा दें (100-200 $L छोड़कर) यह सुनिश्चित करें कि अच्छी तरह से नीचे कोशिकाओं से संपर्क न करें।
    2. चरण 2.7 में एकत्रित वायरस युक्त माध्यम जोड़ें, और चरण 5.3.2-5.3.4 दोहराएँ.
      नोट:हमारे अनुभव में, एक तिहाई transduction शायद ही कभी समग्र दक्षता में सुधार. इसके अलावा, सेल व्यवहार्यता की संभावना काफी गिरावट अगर एक तिहाई transduction प्रयोग किया जाता है. यदि कोशिकाओं को 0.5 x 106/well से अधिक सांद्रता पर चढ़ाया जाता है, तो टी कोशिकाएं दूसरे ट्रांसडक्शन चरण के बाद रात भर ऊष्मायन के बाद संगम तक पहुंच सकती हैं। इस घटना में, दिन 3 पर 4 एच ऊष्मायन के बाद कोशिकाओं को विभाजित करें।
  5. धोने की कोशिकाओं (दिन 4)
    1. प्रत्येक अच्छी तरह से मध्यम के 1 एमएल निकालें, शेष माध्यम में कोशिकाओं को फिर से निलंबित और एक 15 एमएल ट्यूब के लिए स्थानांतरण. कुओं को 1 एमएल पूर्ण टी सेल माध्यम से धोएं और प्रत्येक ट्रांसडक्शन से पूल्ड कोशिकाओं वाली ट्यूब में जोड़ें।
    2. 7 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज, फिर पूर्ण टी सेल मध्यम और छर्रों के 2 एमएल में दो बार धोने। अंत में 2 एमएल मीडियम में फिर से काम करें और सेल संख्या निर्धारित करें।
      नोट:यदि 1 x 106 कोशिकाओं को मूल रूप से ट्रांसड्यूस किया गया था, तो इस अवस्था में उपज $3 x 106होनी चाहिए।
  6. स्थानांतरण
    1. पूर्ण टी सेल माध्यम के 2 एमएल में 0.5-1 x 106 कोशिकाओं को एक नई 24-वेल प्लेट के कुओं में स्थानांतरित करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। लगभग 48-72 एच पोस्ट-ट्रांसडक्शन कोशिकाओं कार अभिव्यक्ति विश्लेषण और सेल छँटाई के लिए तैयार हैं।
      नोट:कार-टी कोशिकाओं की संख्या आमतौर पर इस स्तर पर प्रत्येक 24 ज दोगुनी हो जाती है। यह उन्हें बढ़ने कभी नहीं करने के लिए महत्वपूर्ण है। यदि घनत्व 2 x 106/mL से अधिक हो (या यदि माध्यम कभी भी चमकीले पीले हो जाता है) कोशिकाओं को तुरंत विभाजित करें। हमारे अनुभव में सीएआर-टी कोशिकाएं 24-वेल और 12-वेल प्लेटों में अधिक मजबूती से बढ़ जाती हैं, जबकि एक बड़े पोत को स्थानांतरित कर दी जाती हैं।

6. फ्लोरोसेंट-सक्रिय सेल-सॉर्टिंग द्वारा ट्रांसड्यूस ्ड कोशिकाओं का शुद्धिकरण (FACS) (दिन 5 या दिन 6)

  1. कोशिकाओं को एकत्र करें.
    1. कोशिकाओं को कई बार पाइपिंग द्वारा और नीचे रखें (ध्यान देने से झाग पैदा न करना), 15 एमएल ट्यूबों को स्थानांतरित करें और 5 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर अपर्णा करें।
    2. 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल पर बाँझ पीबीएस युक्त बाँझ पीबीएस में छँटाई बफर (2% बीएसए) में पुन: निलंबित करें। इसके अलावा कदम से नियंत्रण (un-transduced) CD8 टी कोशिकाओं फसल 5.2).
      नोट:दिन 2 में 1 x 106 कोशिकाओं से, इस समय बिंदु पर $2 x 107 ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं की उपज की संभावना है।
  2. 5 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर centrifuging द्वारा बफर छँटाई द्वारा एक बार कोशिकाओं को धो लें, और बफर छँटाई में 1 x 107 कोशिकाओं / Foxp3GFP मुआवजा नियंत्रण के लिए एक छोटा सा alicot निकालें (चरण 6.4.1 में इस्तेमाल किया जा करने के लिए), और लेबल विरोधी माउस CD8 के साथ शेष दाग (क्लोन 53-6.7; एंटीबॉडी के 0.2 डिग्री /
    1. इसी तरह, गैर-ट्रांसड्यूड सीडी 8 टी कोशिकाओं के एक alicot दाग विरोधी CD8 एंटीबॉडी लेबलिंग फ्लोरोफोर के लिए एक मुआवजा नियंत्रण प्रदान करने के लिए।
      नोट:किसी भी बफर में सोडियम अज़ीड जोड़ने से बचें, क्योंकि यह कोशिकाओं के लिए विषाक्त है।
  3. लेबल किए गए कक्षों को दो बार सॉर्टिंग बफ़र के साथ धोएं, 1 x 107 कक्षों/mL पर ठंडे सॉर्टिंग बफ़र में पुन: निलंबित करें.
  4. कक्षों को सॉर्ट करें.
    1. क्रमबद्ध CD8 GFP+ सकारात्मक कोशिकाओं में पूर्व ठंडा पूरा टी सेल माध्यम (चित्र 3B). शुद्धता का निर्धारण करने के लिए पोस्ट-सॉर्टिंग विश्लेषण के लिए एक छोटा सा एलिकोट लें।
      नोट:हल कोशिकाओं की शुद्धता को अधिकतम करने के लिए तंग फाटकों का इस्तेमाल किया जाना चाहिए. उच्च कोशिका व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए 100 डिग्री मीटर नोजल का प्रयोग करें। हल किए गए कक्षों को बर्फ पर रखे जाने के समय को कम करें. टी कोशिकाओं है कि अधिक से अधिक 3 एच के लिए बर्फ पर रखा गया है बहुत लंबे समय तक लेने के लिए कम से कम 2 एच के लिए ठंडा कोशिकाओं की तुलना में ठीक हो. इस प्रकार, यदि 3 ट्रांसड्यूस्ड सेल लाइनों को सॉर्ट करने की आवश्यकता है, तो दूसरी पंक्ति को एकत्रित और लेबल करें, जबकि पहली बार हल किया जा रहा है और दूसरी और तीसरी लाइनों होने के बजाय 0 डिग्री सेल्सियस पर एक विस्तारित समय खर्च करते हैं। CD28 और CD3 जैसे अन्य T सेल मार्कर्स की अभिव्यक्ति पर भी नजर रखी जा सकती है (चित्र 3C) लेकिन छँटाई उद्देश्यों के लिए आवश्यक नहीं है।
    2. (वैकल्पिक छँटाई रणनीति) थोक आबादी धुंधला करने से पहले, ट्रांसड्यूस टी कोशिकाओं की एक छोटी आबादी की CD8 अभिव्यक्ति का विश्लेषण. यदि शुद्धता है और 99% तो थोक आबादी सुरक्षित रूप से GFP अभिव्यक्ति के आधार पर पूरी तरह से हल किया जा सकता है.

7. हल की गई सीएआर-टी कोशिकाओं का विस्तार (दिन 5 से 10)

  1. कार-टी सेल विस्तार
    1. हल की गई कार-टी कोशिकाओं को एक बार धोएं, फिर 2.5-5 x 105 कोशिकाओं/एमएल पर प्री-वार्म्ड पूर्ण टी सेल माध्यम में फिर से स्पेंड करें, और 24-वेल प्लेटमें प्लेट 2 एमएल एलिकोट्स को रखें।
    2. कोशिकाओं को हर 1-2 दिनों में गणना और विभाजित करें। आमतौर पर सेल संख्या $day 10 तक हर दिन डबल्स, व्यवहार्यता 95% से ऊपर शेष के साथ.
      नोट:फिर से उत्तेजना के बिना, सीएआर-टी कोशिकाओं दिन 10 के आसपास proliferating बंद हो जाएगा और अंत में मर जाते हैं. इस प्रकार, टी सेल कार्यात्मक परख और दत्तक स्थानान्तरण तदनुसार निर्धारित किया जाना चाहिए.
  2. वैकल्पिक विस्तार रणनीति
    1. छँटाई के बाद, पूर्ण टी सेल माध्यम में सीएआर-टी कोशिकाओं को 200 यू/एमएल के बजाय 100 यू/एमएल पर आरआईएल-2 युक्त संस्कृति।
      नोट:कार-टी कोशिकाएं इस माध्यम में थोड़ी धीमी दर पर बढ़ जाती हैं। हालांकि, वे अक्सर दिन 11 से 13 तक फिर से उत्तेजना के बिना proliferate जारी रहेगा. इस प्रकार, हालांकि इस वैकल्पिक विस्तार रणनीति कोशिकाओं की एक उच्च संख्या उत्पन्न नहीं करता है यह downstream assays के लिए एक थोड़ा लंबे समय तक समय खिड़की प्रदान करता है प्रदर्शन किया जा करने के लिए.

8. प्रतिजन विशिष्टता और सीएआर टी कोशिकाओं की कार्यक्षमता का सत्यापन.

नोट: पेप्टाइड/एमएचसी परिसरों को लक्षित करने वाली सीएआर टी कोशिकाओं की बाध्यकारी विशिष्टता को टेट्रामर धुंधला7,23द्वारा सत्यापित किया जा सकता है । इसी तरह, उनकी कार्यक्षमता cytokine स्राव या cytotoxicity उनके cognate ligands द्वारा उत्तेजना के बाद मापने के द्वारा पुष्टि की जा सकती है. एमोरी विश्वविद्यालय में NIH Tetramer कोर सुविधा (TCF) "tetramers" और प्रासंगिक धुंधला प्रोटोकॉल की एक सिफारिश स्रोत है.

  1. पेप्टाइड-एमएचसी Tetramer धुंधला|
    1. 2 x 105 ट्रांसड्यूस्ड CAR-T कोशिकाओं के लेबल alicots के साथ incubating बफर की 100 डिग्री सेल्सियस में fluorcently लेबल प्रतिजन-विशिष्ट और नियंत्रण tetramers पर 37 डिग्री सेल्सियस के लिए 2 एच.
    2. 350 x ग्रामपर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा कोशिकाओं को गोली मारें, फिर बफर और पुनः अपकेंद्रण को 0.5 एमएल में फिर से निलंबित करके दो बार धो एंप्लेशन करें। अंत में, 300 डिग्री सेल्सियस में कोशिकाओं को छँटाईबफर में पुनः निलंबित करें और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण करें (चित्र 4)।
      नोट:इन अध्ययनों के लिए, हम आम तौर पर BV421 लेबल IAg7-B:9-23(RE) (परीक्षण) और IAg7-HEL (नियंत्रण) tetramers का उपयोग करें. तथापि, जांच के अंतर्गत सीएआर (एस) के लिए उपयुक्त किसी भी फ्लोरोफोर/टेट्रामर संयोजन का इसके स्थान पर उपयोग किया जा सकता है। इस मामले में, एकाग्रता और धुंधला समय प्रत्येक tetramer इस्तेमाल के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. दोनों हल और संयुक्त राष्ट्र क्रमबद्ध कार-टी कोशिकाओं tetramer धुंधला के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  2. Ligand उत्तेजना द्वारा विशिष्टता माप|
    1. इनक्यूबेट 2 x 105 सॉर्ट किए गए कार-टी कोशिकाओं में 200 डिग्री सेल्सियस साइटोकिन-मुक्त टी सेल माध्यम उपयुक्त प्लेट-बाउंड या सेलुलर लिगन्ड्स के साथ।
    2. के बाद 6-24 एच उपाय साइटोकीन उत्पादन ELISA या intracellular धुंधला निर्माता के प्रोटोकॉल का उपयोग कर के द्वारा.
      नोट:IAg7-B:9-23 पुनः निर्देशित टी कोशिकाओं के बारे में हमारे अध्ययन के लिए, हम संस्कृति सेल रात भर M12C3 murine बी सेल लिंफोमा कोशिकाओं IAg7-B:R3 या "खाली" IAg724,25, फिर महादलितों को इकट्ठा करें और एलिसा26 द्वारा गुप्त माउस इंटरफेरॉन गामा (IFN-$) को मापें (इब्न-जेड) (चित्र 5)।

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Representative Results

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आमतौर पर, इस प्रोटोकॉल का उपयोग transduction दक्षता है $60-90%. चित्र 3में दिखाए गए प्रयोग में, लगभग छँटाई करने से पहले, CD8 T कोशिकाओं के 70% सह-एक्सप्रेस्ड GFP. उन्होंने यह भी सह-एक्सप्रेस्ड CD28 और CD3 (चित्र 3C) . महत्वपूर्ण बात, "परीक्षण" GFP+ कोशिकाओं के सभी भी सह IAg7-B:R3 tetramers के साथ दाग, लेकिन नियंत्रण tetramer के साथ नहीं (चित्र 4). इसी प्रकार, सॉर्ट किए गए परीक्षण और नियंत्रण सीएआर-टी कोशिकाओं में आईएफएन-जेड के उच्च स्तर को केवल सह-संवर्धन के बाद ही स्रावित किया जाता है, जिसमें लक्ष्य कोशिकाओं को अपने cognate ligands व्यक्त किया जाता है (चित्र5)। यह पुष्टि करता है कि ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं में एक सीडी 8 प्रभावक टी सेल फीनोटाइप होता है जो मूल एंटीबॉडी के लक्ष्य की ओर निर्देशित होता है।

Figure 1
चित्र 1: कार retroviral निर्माण के Schematic. सीएआर में एक लक्ष्यीकरण डोमेन शामिल है जो उपयुक्त माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के फैब अंश से व्युत्पन्न होता है, और माउस CD28, CD137 और CD247 से स्पेसर/मेम्ब्रेन एंकर/ सिंथेटिक सीडीएएनए को पीएमआईजी-II रेट्रोवायरल एक्सप्रेशन वेक्टर में डाला जाता है। mAb287-CAR जनरेट करने के लिए उपयोग किए गए प्रतिबंध endonuclease साइट्स दिखाए जाते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: सेल वितरण पर विभिन्न चढ़ाना विधियों का प्रभाव। (बाएं) एक घूमता गति का उपयोग कर पाइप किए गए कोशिकाओं को एक भी वितरण दिखाते हैं। (दाएं) कोशिकाओं को सीधे कुएं के केंद्र में पाइप किया गया। छवियाँ 5 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर कताई के बाद कब्जा कर लिया गया. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: ट्रांसड्यूस्ड टी कोशिकाओं का प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण। कोशिकाओं पीई-Cy7 संयुग्मी विरोधी CD8, AF647 संयुग्मी विरोधी CD3, और BV421 संयुग्मी विरोधी CD28, के साथ सह दाग रहे थे के रूप में चरण 6.4 में वर्णित. एकल व्यवहार्य कोशिकाओं पर गेट प्रोफाइल दिखाए जाते हैं. (ए) अन सना हुआ माता पिता सीडी 8 टी कोशिकाओं. (बी) पीई-साइ7/ कार व्यक्त कोशिकाओं GFP रिपोर्टर द्वारा पहचान े ली जाती है. (ग) सना हुआ ट्रांसड्यूड कोशिकाओं पीई-Cy7/GFP डबल सकारात्मकता पर द्वार थे. AF647/BV421 प्रोफ़ाइल दिखाया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: संयुक्त राष्ट्र-क्रमबद्ध सीएआर-टी कोशिकाओं का टेट्रामर धुंधला। कोशिकाओं BV421 संयुग्मी tetramers के साथ दाग के रूप में कदम 8.1 में वर्णित थे. एकल व्यवहार्य कोशिकाओं पर गेट प्रोफाइल दिखाए जाते हैं. () टेस्ट IAg7-insulin टेट्रामर. () नियंत्रण I-Ag7-HEL tetramer. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: कार टी कोशिकाओं द्वारा Antigen-विशिष्ट साइटोकीन स्राव। क्रमबद्ध CD8 टी कोशिकाओं परीक्षण mAb287 या नियंत्रण mAb24.1 कार व्यक्त करने के साथ सह-संस्कृत थे IAg7-B:R3, "खाली" IAg7, या TFR-MBP-DTRL (mAb24.1 के लिए लिगंड) कदम 8.2 में वर्णित के रूप में. 24 ज के बाद, स्रावित IFN-जेड एलिसा ELISA द्वारा परिमाणित किया गया था। दोनों टी सेल लाइनों की विशिष्ट उत्तेजना देखी गई. डेटा 3 दोहराए गए प्रयोगों के एसडी मतलब का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

समय वायरस की तैयारी टी सेल तैयारी
DAY -4 (शुक्र) Thaw फीनिक्स कोशिकाओं (पीएम)
दिन -3 (सात) पुन: प्लेट फीनिक्स
दिन -2 (सूर्य) छुट्टी
दिन-1 (सोम) विकिरण फीनिक्स कोशिकाओं (पीएम) कोट गैर इलाज प्लेट के साथ CD3/
0 दिन (मंगल) Transfecting फीनिक्स कोशिकाओं (AM) स्पल्सकोसाइट्स तैयार करें और CD8 T कक्षों को अलग करें.
टी सेल सक्रियण.
दिन 1 (बुध) 4 मिलीलीटर (AM) के लिए फीनिक्स कोशिकाओं मध्यम बदलें। कोट रेट्रोनेक्टिन
दिन 2 (Thu) वायरस और फिर से भरना ले लीजिए। Transduction, CD8 टी कोशिकाओं
तीसरा दिन (शुक्र) वायरस लीजिए. Transduction, CD8 टी कोशिकाओं
दिन 4 (सात) कोशिकाओं को धोएं और कक्षों का विस्तार करें.
5 दिन (सूर्य) यदि आवश्यक हो तो सेल विस्तार।
दिन 6 (सोम) कार-टी सेल छँटाई.
7 दिन (मंगलवार को दिन) टी सीएआर-कोशिकाओं का विस्तार। प्रयोगों.

तालिका 1: CAR-T पीढ़ी प्रोटोकॉल का सारांश।

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Discussion

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इस प्रोटोकॉल retroviral transduction द्वारा प्रतिजन-विशिष्ट CD8 कार-टी कोशिकाओं के उत्पादन के लिए एक कुशल विधि का वर्णन करता है। हमारे प्रोटोकॉल के transduction दक्षता आम तौर पर उच्च है, और कार की मजबूत अभिव्यक्ति आम तौर पर मनाया जाता है. विस्तारित कार टी कोशिकाओं माता पिता सक्रिय टी कोशिकाओं की आवश्यक सुविधाओं को बनाए रखने, और एंटीबॉडी विशिष्टता, और दोनों इन विट्रो में और विवो उपयोग के लिए उपयुक्त हैं. हम Ab-CAR CD8 टी कोशिकाओं को reprograming प्रकार में लागू किया है 1 NOD चूहों में मधुमेह7.

हमारे प्रोटोकॉल पहले वर्णित तरीकों के लिए कई महत्वपूर्ण संशोधनों को शामिल किया गया. सबसे पहले, हम एक अनुकूलित टी सेल एक विस्तारित सक्रियण समय की अनुमति देता है कि माध्यम culturing का उपयोग करें. पूरा माध्यम वर्णित कई प्रमुख की खुराक के इष्टतम स्तर शामिल हैं, और काफी दोनों टी सेल व्यवहार्यता और सक्रियण के बाद प्रसार की हद तक सुधार. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि माउस आईएल-2 बराबर परिणामों के साथ मानव प्रोटीन के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है, हालांकि वर्तमान में, मानव आईएल -2 अधिक किफायती है. नोट की, एक काफी उच्च transduction दक्षता एक 24 एच सक्रियण कदम का उपयोग किया जाता है की तुलना में 40-48 एच के लिए सक्रिय टी कोशिकाओं का उपयोग कर प्राप्त की है।

दूसरा, हम एक बेहतर transduction प्रक्रिया है कि polybrene बी समाप्त का उपयोग करें (जो टी कोशिकाओं के लिए विषाक्त है) और इसके बजाय fibronectin का उपयोग करता है. इससे सेल की व्यवहार्यता में और सुधार होता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अच्छा transduction दक्षता की गारंटी के लिए यह एक उपयुक्त सेल घनत्व पर एक अनुकूलित माध्यम में टी कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है और ताजा उच्च titer वायरल supernatants का उपयोग करने के बजाय पहले जमे हुए वायरस. हमारे संशोधित प्रक्रिया का उपयोग करना, एक तिहाई transduction कदम अनावश्यक है और वास्तव में व्यवहार्यता के रूप में अवांछनीय है आम तौर पर बूँदें अगर एक तिहाई स्पिन संक्रमण कदम शामिल है. इस बात पर भी बल दिया जाना चाहिए कि विस्तार चरण के दौरान कोशिकाओं को बढ़ने न दें। एक बार कोशिकाओं को बढ़ रहे हैं, वे तेजी से अपने phenotype खो देते हैं और मर जाते हैं.

उपर्युक्त मानकों के अतिरिक्त, कम ट्रांसडक्शन दक्षता/व्यवहार्यता के दो अन्य संभावित कारणों से बचा जाना चाहिए। सबसे पहले, के रूप में एंटीबायोटिक दवाओं transfection कदम के दौरान मौजूद नहीं होना चाहिए यह सुनिश्चित करें कि प्लाज्मिड एक endotoxin मुक्त किट का उपयोग कर तैयार कर रहे हैं बनाने के लिए महत्वपूर्ण है, और बाँझ पानी में भंग, और है कि अच्छा बाँझ तकनीक हर समय प्रयोग किया जाता है. दूसरा, मृत या मर टी कोशिकाओं के उच्च स्तर की उपस्थिति से बचा जाना चाहिए. सक्रिय माता पिता का CD8 टी सेल निलंबन मृत कोशिकाओं या सेल मलबे के उच्च स्तर शामिल हैं, तो यह वाणिज्यिक किट का उपयोग transduction से पहले हटाया जाना चाहिए.

हम जानबूझकर इस प्रोटोकॉल में एक कार-टी सेल ठंड कदम शामिल नहीं है, के रूप में हमारे अनुभव में ट्रांसड्यूस कोशिकाओं का एक महत्वपूर्ण अनुपात cryopservation और thawing के दौरान मर जाते हैं. इसी तरह, हालांकि विस्तारित सीएआर-टी कोशिकाओं को इन विट्रो में फिर से उत्तेजित किया जा सकता है, वे ट्रांसजीन की अभिव्यक्ति को खोने की प्रवृत्ति में वृद्धि हुई है। तदनुसार, प्रसार के उच्च डिग्री हम ताजा हल सीएआर-टी कोशिकाओं का उपयोग कर निरीक्षण को देखते हुए, हम अत्यधिक अनुशंसा करते हैं कि केवल ताजा उत्पन्न सीएआर-टी कोशिकाओं कार्यात्मक परख और दत्तक हस्तांतरण के लिए उपयोग किया जाता है।

सारांश में, इस प्रोटोकॉल का महत्व यह है कि यह एक प्रक्रिया है कि उच्च transduction दक्षता प्रदान करता है और स्वस्थ प्रतिजन विशिष्ट माउस CD8 टी कोशिकाओं की बड़ी संख्या में इन विट्रो में और विवो में उपयोग के लिए उत्पन्न करता है का वर्णन करता है. हमारे प्रोटोकॉल इस प्रकार रोग के माउस मॉडल में कार-टी सेल अध्ययन उपक्रम शोधकर्ताओं के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करता है.

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Disclosures

MAb287 और उसके डेरिवेटिव 2014 में जारी एक अमेरिकी पेटेंट द्वारा संरक्षित हैं.

Acknowledgments

इस अध्ययन JDRF अनुदान 1-INO-2015-S-B, 2-SRA-238-S-B, और SRA-2-S-2018-648-एस-बी, एक मधुमेह शिक्षा और कार्रवाई पुरस्कार, और चिकित्सा के Baylor कॉलेज में आणविक चिकित्सा में अनुसंधान के लिए कैरोलीन Wiess कानून कोष द्वारा समर्थित किया गया था. सेल-सॉर्टिंग NIH (S10RR024574 और P30CA125123) से धन के साथ चिकित्सा के Baylor कॉलेज में Cytometry और सेल छंटनी कोर द्वारा समर्थित किया गया था. सभी पेप्टाइड-MHC tetramers NIH Tetramer कोर सुविधा से प्राप्त किए गए थे.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol (50mM) Gibco 21985-023 50 μM
5’ RACE PCR Clontech 634859
anti-mouse CD28 antibodies eBioscience 14-0281-86 final concentration at 1µg/ml
anti-mouse CD3e antibody eBioscience 145-2C11 final concentration at 1µg/ml
Biotin Rat Anti-Mouse IFN-γ BD Biosciences 554410 Working concentration at 0.5 µg/ml
BSA Sigma A7030
Endo-free Maxi-Prep kit Qiagen 12362
Gentamicin Gibco 15750-060 Final 50 µg/ml.
Heat inactivated FCS Hyclone SH30087.03 Final 10% FCS
HEPES (100X) Gibco 15630-080 1X
IAg7-CLIP tetramer-BV421 NIH tetramer Facility at Emory per approval Working concentration at 6 µg/ml
IAg7-insulin P8E tetramer-BV421 NIH tetramer Facility at Emory per approval Working concentration at 6 µg/ml
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS 100x) ThermoFisher 51500056 Final concentraion is 1x
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
MACS Separation Buffer Miltenyi Biotec 130-091-221
Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit Miletenyi Biotec Inc 130-104-075
Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit Miltenyi Biotec 130-104-075
Opti-MEM medium ThermoFisher 31985070
Penicillin-Streptomycin (5000U/ml) ThermoFisher 15070063 50 U/ml
Phoenix-ECO cells ATCC CRL-3214
Phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 10010-023
pMIG II Addgene 52107
pMSCV-IRES-GFP II Addgene 52107
Purified Rat Anti-Mouse IFN-γ BD Biosciences 551216 Working concentration at 3 µg/ml
Red cell lysis buffer Sigma R7767
RetroNectin Takara T100A Working concentration at 50 µg/ml in PBS
rhIL-2 (stock concentration 105 IU/ul) Peprotech 200-02 Final concentration at 200 IU/ml
rmIL-7 ( stock concentration 50ng/ul) R&D 407-ML-005 Final concentration at 0.5ng/ml
RPMI-1640 Gibco 11875-093
Sterile Cell Strainers Fisher Scientific 22-363-548
Tryple Gibco 12605-028

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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एक Autoimmune मधुमेह मॉडल में कार्यात्मक परीक्षण के लिए Antigen-विशिष्ट प्राथमिक माउस Cytotoxic टी कोशिकाओं के उच्च दक्षता पीढ़ी
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Davidson, H. W., Cepeda, J. R., Sekhar, N. S., Han, J., Gao, L., Sosinowski, T., Zhang, L. High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model. J. Vis. Exp. (150), e59985, doi:10.3791/59985 (2019).More

Davidson, H. W., Cepeda, J. R., Sekhar, N. S., Han, J., Gao, L., Sosinowski, T., Zhang, L. High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model. J. Vis. Exp. (150), e59985, doi:10.3791/59985 (2019).

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