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Immunology and Infection

Generazione ad alta efficienza di cellule T Topo primario specifico dell'antigene per test funzionali in un modello di diabete autoimmune

doi: 10.3791/59985 Published: August 16, 2019

Summary

Questo articolo descrive un protocollo per la generazione di cellule T CD8 specifiche dell'antigene e la loro espansione in vitro, con l'obiettivo di produrre un numero elevato di cellule T funzionali da utilizzare in vitro e in vivo.

Abstract

Il diabete di tipo 1 (T1D) è caratterizzato da un'autoimmunità specifica dell'iletto che porta alla distruzione delle cellule beta e alla perdita assoluta della produzione di insulina. Nel modello di topo spontaneo del diabete non obesi (NOD), l'insulina è l'obiettivo primario e la manipolazione genetica di questi animali per rimuovere un singolo epitopo insulinico chiave previene la malattia. Pertanto, l'eliminazione selettiva delle cellule professionali che presentano antigeni (APC) recanti questo epitopo patogeno è un approccio per inibire le risposte autoimmuni indesiderate specifiche dell'insulina e probabilmente ha un maggiore potenziale traslazionale.

I recettori degli antigeni chimerici (CR) possono reindirizzare le cellule T a colpire selettivamente gli antigeni che causano la malattia. Questa tecnica è fondamentale per i recenti tentativi di utilizzare l'ingegneria cellulare per la terapia cellulare adottiva per il trattamento di tumori multipli. In questo protocollo, descriviamo un retrovirus a cellule T ottimizzato (RV) e un protocollo di espansione in vitro che genera un numero elevato di cellule CD8 CAR-T specifiche dell'antigene funzionale a partire da un basso numero di cellule ingenue. In precedenza sono stati descritti più protocolli cellulari CAR-T, ma in genere con efficienza di trasduzione relativamente bassa e vitalità cellulare dopo la trasduzione. Al contrario, il nostro protocollo fornisce fino al 90% di efficienza di trasduzione e le cellule generate possono sopravvivere più di due settimane in vivo e ritardare significativamente l'insorgenza della malattia a seguito di una singola infusione. Forniamo una descrizione dettagliata del protocollo di manutenzione e trasduzione delle cellule, in modo che i passaggi critici possano essere facilmente seguiti. L'intera procedura dall'isolamento cellulare primario all'espressione CAR può essere eseguita entro 14 giorni. Il metodo generale può essere applicato a qualsiasi modello di malattia del topo in cui l'obiettivo è noto. Allo stesso modo, l'applicazione specifica (mirata a un complesso patogeno di peptidi/Classe MHC II) è applicabile a qualsiasi altro modello di malattia autoimmune per il quale è stato identificato un complesso chiave.

Introduction

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Dato il probabile rischio ridotto di effetti off-target indesiderati, le terapie immunitarie specifiche dell'antigene (ASI) sono trattamenti promettenti per malattie autoimmuni come il T1D. Sempre più prove suggeriscono che le risposte immunitarie all'insulina (prepro)possono essere particolarmente importanti nel T1D1. Nell'ultimo decennio, studi condotti da più gruppi, incluso il nostro, suggeriscono fortemente che la presentazione di un epitopo contenente aminoacidi della catena di insulina B da 9 a 23 da specifiche molecole MHC di classe II (B:9-23/MHCII), svolge un ruolo importante nello sviluppo del T1D in topi e esseri umani2,3,4,5. Per indirizzare selettivamente il complesso B:9-23/MHCII, abbiamo generato un anticorpo monoclonale, chiamato mAb287, che non ha alcuna reattività incrociata all'ormone insulina o complessi contenenti altri peptidi6. MAb287 blocca la presentazione dell'antigene in vitro, e la somministrazione settimanale di mAb287 ai topi NOD pre-diabetici ha ritardato lo sviluppo di T1D nel 35% dei topi trattati6. Per bloccare la presentazione dell'antigene in vivo, sono in genere necessarie iniezioni frequenti per mantenere un'alta concentrazione circolante. Abbiamo ipotizzato che avremmo potuto superare questa difficoltà sfruttando l'alta specificità di Ab287 per riprogrammare le cellule T, fornendo così una migliore terapia con cellule T specifico dell'antigene per T1D7.

Le cellule T citotossiche sono segnalate per essere in grado di uccidere il loro bersaglio se anche una singola copia del loro ligando cognato è espresso8,9,10. Pertanto, si prevede che le cellule T CD8 specifiche di B:9-23/MHCII avranno una maggiore efficienza nell'eliminare la presentazione indesiderata dell'antigene rispetto all'anticorpo genitore, che probabilmente dovrà essere associato a più complessi sullo stesso APC per esercitarne l'effetto. Cellule CAR T sono state utilizzate per il trattamento di più tumori umani11,12,13, e può anche essere efficace in autoimmunità14. Tuttavia, le cellule CAR-T con specificità per i complessi patogeni di peptidi-MHC non sono state finora utilizzate per modificare la progressione del T1D. Utilizzando la tecnica ottimizzata di trasduzione delle cellule T CD8 descritta di seguito, abbiamo recentemente dimostrato la prova di principio che questo rappresenta effettivamente un approccio praticabile7.

In questo protocollo, illustreremo un metodo di trasduzione ed espansione efficiente e semplificato. Il nostro protocollo è applicabile ad altri studi che richiedono la generazione di cellule T CD8 CD8 per topi con alta efficienza.

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Protocol

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I topi sono stati mantenuti in condizioni specifiche prive di agenti patogeni presso uno strumento di topo transgenico, e tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con i protocolli approvati dal Baylor College of Medicine per la cura e l'uso degli animali.

NOTA: L'esperimento richiede la preparazione parallela del virus e delle cellule T. Nella tabella 1 il protocollo è riepilogato. I reagenti chiave e i buffer sono elencati nella tabella dei materiali. Ci concentriamo sulla generazione e l'espansione di cellule CAR-T mirate a popolazioni specifiche di APC in questo protocollo.

1. Generazione e convalida di anticorpi Fab a catena singola (scFab)-CAT.

NOTA: i CAP contengono in genere 3 domini critici: un dominio destinato all'antigene, un dominio distanziale/transmembrana e un dominio di segnalazione citopplasma. Il design preciso di ogni RCA dipende dal bersaglio previsto, e quindi, a parte le caratteristiche chiave del costrutto rilevanti per la generazione del retrovirus, non sarà descritto in dettaglio in questo protocollo. La progettazione complessiva dei CR utilizzati per gli studi descritti di seguito è illustrata nella figura 1. In breve, il dominio di targeting comprende l'intera catena luminosa e il dominio variabile e CH1 della catena pesante dall'anticorpo monoclonale padre collegato da un linker semirigido. Il dominio distanziale/transmembrana proviene dal mouse CD28 e il dominio di segnalazione è una fusione contenente elementi del mouse CD28, CD137 (4-1BB) e CD247. Questi elementi sono assemblati da procedure di biologia molecolare standard come la reazione a catena della polimerasi di sovrapposizione delle giunzioni (PCR) o la sintesi di un appropriato "blocco genico". I dettagli della generazione del mAB287 CAR sono contenuti in .hang et al.7. Le sequenze cDNA possono essere ottenute dagli autori su richiesta.

  1. Assemblaggio del costrutto CAR
    1. Sintetizzare separatamente l'anticorpo Fab a catena singola di destinazione (scFab) e i domini distanziali combinati e utilizzare una tecnica di legatura "3 punti"15 per assemblare il costrutto finale (Figura 1).
      NOTA: Il requisito chiave per l'inserto CAR è che dovrebbe contenere siti endonuclease di restrizione laterale che consentano la legatura nel vettore di espressione retrovirale pMSCV-IRES-GFP II (pMIG II), o un relativo derivato15 sono anche appropriato.
  2. Convalida dell'espressione di superficie CAR
    1. Traduci le cellule ibrideoma utilizzando particelle retrovirali derivate da pMIG II generate da un protocollo standard (ad esempio, Holst et al.16).
    2. Eseguire l'analisi della citometria di flusso per rilevare l'espressione di GFP dal vettore CAR17.
    3. Espressione superficiale della macchia dell'RC degli ibridi transdotti utilizzando anticorpi etichettati contro la catena del topo (ad esempio, clone RMK-45)17.
      NOTA: 18.
  3. Convalida della specificità CAR
    1. Stimolare le cellule ibrideoma trasdotte con adeguati antigeni a piastre o cellulari. Dopo una notte la co-cultura raccoglie i supernatanti e le citochine secrete, e ha formulato dal saggio immunosorbent legato agli enzimi (ELISA)7.
      NOTA: Idealmente, ogni RCA deve essere convalidata in modo indipendente prima di essere utilizzata per la trasduzione. In questo passaggio, l'esperimento potrebbe essere sospeso e riavviato in un secondo momento.

2. Trasfezione delle cellule produttrici virali (dal giorno dal -4 al giorno 3)

NOTA: Il retrovirus viene prodotto utilizzando cellule Phoenix-ECO (vedere la Tabella deiMateriali)19,20. Utilizzare precauzioni adeguate per la generazione di agenti potenzialmente infettivi (preferibilmente includendo un cabinet BSL-2 designato e un incubatore separato per la coltura di cellule trafette/trasdotte).

  1. Celle di Phoenix (giorno -4)
    1. Scongelare 2 x 106 cellule Phoenix-Eco. Aumentare il numero di cellule Phoenix se sono pianificate più trasduzioni.
    2. Placcarli in un piatto di coltura tissutale di 10 cm con 10 mL di media (il mezzo Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) contenente il 10% di siero di vitello fetale (FCS)).
  2. Passaggio delle cellule Phoenix (Giorno -3)
    1. Rimuovere il mezzo e lavare con 5 mL di Salina con buffer di fosfato di Dulbecco (DPBS).
    2. Aggiungere 3 mL di 0,25% di prova e incubare a 37 gradi centigradi sotto il 10% di CO2 atmosfera per 3 min.
    3. Raccogliere le cellule poi pellet per centrifugazione per 3 min a 200 x g. Ri-piastra cellule con 10 mL di mezzo fresco e incubare a 37 gradi centigradi.
  3. Irradiazione delle cellule di Phoenix (giorno -1pomeriggio)
    1. Per ridurre al minimo l'ulteriore divisione cellulare, raccogliere le cellule Phoenix come descritto al passo 2.2, rimettere in sospensione in 5 mL di media e gamma di cellule irradiate sul ghiaccio (1000 rad).
      NOTA: Per evitare l'esposizione al personale, è necessario prestare attenzione alle radiazioni.
    2. Centrifugare le cellule irradiate, ripartire nel mezzo fresco, piastra a 2 x 106 cellule (in 10 mL di media)/piastra/CAR, e incubare.
  4. Trasfezione (Giorno 0 - mattina)
    1. Aspirare il soldatore dalle cellule di Phoenix, lavare con 5 mL di salina tampone fosfato (PBS), e aggiungere con attenzione 7 mL di ridotto mezzo di siero (ad esempio, Opti-MEM) dropwise alla parete laterale della piastra per evitare di disturbare il monostrato. Trasferire le cellule nell'incubatrice.
    2. Prendere due tubi di polipropilene inferiore rotondi da 14 mL e aggiungere 1,5 mL di mezzo siero ridotto a ciascuno. In un tubo, aggiungere 40 L di reagente di trasfezione (vedere la Tabella dei materiali).
    3. All'altro tubo, aggiungere 15 g di Ab-CAR-plasmid (generato al punto 1) e 5 g di busta e plasmide da imballaggio (5 g pCL-Eco). Incubare i tubi a temperatura ambiente per 5 min.
    4. Aggiungere la miscela reagente di trasfezione dal passo 2.4.2 dropwise al secondo tubo senza contattare i lati del tubo, e mescolare perpipeando la soluzione su e giù delicatamente 3 volte. Incubare a temperatura ambiente per almeno 20 min.
    5. Aggiungere 3 mL della miscela dropwise alle cellule Phoenix, e mettere in un incubatore di coltura del tessuto.
    6. Dopo 4-5 h aggiungere 1 mL di FCS. Cellule di coltura durante la notte a 37 gradi centigradi.
  5. Variazione media (Giorno 1)
    1. Rimuovere il supernatante contenente i complessi di reagente di plasmide/trasfezione e smaltirli in conformità con le procedure istituzionali per la movimentazione di materiale infettivo. Aggiungere 4 mL di fresco, mezzo di coltura preriscaldata alle cellule.
  6. Virus del raccolto per la trasduzione (giorno 2)
    1. Raccogliere il mezzo contenente virus dalle cellule di Phoenix con una siringa sterile, filtrare (0,45 m) per rimuovere i detriti delle cellule residue e raccogliere in un nuovo tubo.
    2. Aggiungere lo stock rhIL-2 a una concentrazione finale di 200 IU/mL. Utilizzare immediatamente il virus per la trasduzione (passaggio 5.3). Aggiungere 4 mL di mezzo fresco alle cellule di Phoenix e posizionarlo nell'incubatrice.
  7. Ripeti raccolta di virus (Giorno 3)
    1. Ripetere il passaggio 2.6, ma scartare le cellule Phoenix come rifiuti infettivi invece di aggiungere un mezzo fresco. Questo supernatante viene utilizzato nel passaggio 5.4.

3. Isolamento e attivazione delle celle T CD8 primarie (dal giorno -1 al giorno 0)

NOTA: In precedenza, raccogliere le cellule T CD8 dai topi NOD femminili a 4-5 settimane, un punto temporale prima dell'infiammazione dell'isolotto inizia21,22. Gestisci tutti i topi seguendo i protocolli approvati da IACUC. Le cellule T CD8 sono arricchite da splenociti utilizzando un kit di selezione negativa commerciale.

  1. Piastre di rivestimento con anticorpi CD3/CD28 (Giorno -1)
    1. Aggiungete 1 mL di una miscela di anticorpi anti-topo CD3 e CD28 (entrambi a 1 g/mL in PBS) ad ogni pozzo di una piastra di 24 pozze, e incubate a 4 gradi durante la notte.
    2. Il giorno successivo, lavare le piastre con 1 mL di PBS sterile 3 volte prima di aggiungere le cellule T CD8 murine (passaggio 4.1).
      NOTA: Il numero di pozzetti da rivestire varia per ogni esperimento, a seconda del numero totale di celle T CD8 attivate richieste.
  2. Collezione di splenociti (giorno 0)
    1. Eutanasia due topi femmina NOD di età compresa tra 4 e 5 settimane con inalazione di CO2 seguita da decapitazione. Raccogliere le milza e metterle su un colino ammollo cellulare ammollo in PBS da 10 mL in un piatto di coltura cellulare sul ghiaccio.
    2. In una cappa cellulare, tagliare ogni milza in 3-5 pezzi, premere i tessuti con uno stantuffo sterile di una siringa da 3 o 5 mL per forzare frammenti di milza a parte e consentire alle cellule di passare attraverso la rete metallica.
    3. Rimuovere delicatamente i globuli rossi ridisponendo gli splenociti in 1:4 diluito tampo di lisi rosso (1 mL di lisi tampone in 3 mL di PBS per una milza), e incubando per 5 min a temperatura ambiente.
    4. Quindi, diluire 10 l della sospensione cellulare con soluzione di tintura blu trypan per il conteggio delle cellule con un emocitometro e pelletare il resto delle cellule per centrifugazione a 350 x g per 7 min.
  3. Arricchimento delle cellule T CD8 (Giorno 0)
    1. Arricchire le celle T CD8 mediante una selezione negativa utilizzando un kit di isolamento delle celle T CD8 del mouse, seguendo le istruzioni del produttore.
      NOTA: Per garantire un'elevata purezza, arrotondare sempre i numeri delle celle nel calcolo del volume dell'anticorpo biotinylato da aggiungere (ad esempio, utilizzare il volume di reagenti suggerito per 108 celle per un calcolo calcolato 9,1 x 107 celle).
    2. Sospendere i pellet cellulari in 400 litri di tampone e 100 l di biotina-anticorpo cocktail per 1 x 108 cellule, mescolare bene e incubare per 5 min in frigorifero (4 gradi centigradi) per consentire l'attacco degli anticorpi.
    3. Aggiungere 300 l di tampone di etichettatura e 200 L di micro-perline antibiotine per 1 x 108 cellule, mescolare bene e incubare per 10 min a 4 gradi centigradi.
    4. In attesa del rilegatura micro-perline, impostare la colonna di separazione sul separatore. Lavare la colonna risciacquo con 3 mL di buffer di etichettatura.
    5. Passare 1000 l di miscela di perline/cellule attraverso un colino cellulare da 40 m prima di caricarlo nella colonna di separazione per rimuovere gli aggregati cellulari. Raccogliere la colonna flow-through in un tubo pre-freddo da 15 mL.
    6. Lavare la colonna secondo le istruzioni del produttore, raccogliendo tutti gli effluenti nello stesso tubo. Determinare il numero di cellulare (uguale al passaggio 3.2.4) e raccogliere con centricità a 350 x g per 5 min. Lavare le cellule resussione in 2 mL di supporto completo a cellule T (RPMI-1640 contenente FCS, 2-mercaptoetanolo, rhIL-2 (200 U/mL), mIL-7 (0.5 ng/mL), , HEPES e penicillina-streptomicina) e centrifugando a 350 x g per 5 min.
    7. Risospendere le cellule in un supporto di cellule T completo preriscaldato (37 gradi centigradi) a una concentrazione di 0,25–0,5 x 106/mL.

4. Attivazione delle celle T (giorno da 0 a 2)

  1. Aggiungere 2 mL della sospensione cellulare (0,25–0,5 x 106/mL) ad ogni pozzetto rivestito dell'anticorpo CD3/CD28 rivestito 24 pozze vita dal punto 3.1.2. Utilizzare un movimento vorticoso per erogare le cellule in modo uniforme.
    NOTA: Aggiungere le celle utilizzando un movimento vorticoso per distribuirle in modo uniforme e ridurre al minimo gli effetti del bordo. Se le cellule si raggruppano lungo il bordo dei pozzi, sia il tasso di trasduzione che la vitalità cellulare diminuiranno.
  2. Come controllo, placcare lo stesso numero di cellule T CD8 in un unico pozzo non rivestito della piastra. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi utilizzando un'incubatrice gassata di CO2 del 10% per 48 h.
    NOTA: Dopo 48 h, l'attivazione può essere confermata al microscopio; le cellule attivate saranno più grandi delle cellule che non hanno incontrato anticorpi anti-CD3/CD28.

[luogo figura 2 qui]

5. Trasduzione delle cellule T CD8 attivate (giorni da 1 a 3)

NOTA: questo protocollo utilizza un metodo di spin-trasduzione. È necessaria una centrifuga con un rotore oscillante e adattatori di piastra di coltura dei tessuti che è in grado di mantenere una temperatura interna di 37 gradi centigradi. Per garantire la massima efficienza, il giorno della trasduzione preriscaldare la centrifuga a 37 gradi centigradi prima di raccogliere il virus.

  1. Preparazione di placche rivestite di frammenti di fibronectina umana (dal primo al giorno 2)
    1. Il primo giorno aggiungere 0,5 mL di fibronectina (50 g/mL in PBS) ai pozzetti di una piastra di 24 pozzetti, e incubare peruna pernottamento a 4 gradi centigradi.
      NOTA: In genere, sono necessari due pozzi rivestiti di fibronectina per piastra di cellule Fenice trasfetate.
    2. Il giorno 2 rimuovere la soluzione fibronectina, e sostituire con 1 mL di 2% albumina siero bovino (BSA) in PBS. Incubare a temperatura ambiente per 30 min a "bloccare" siti di legame non specifici.
    3. Lavare i pozzi trattati con 1 mL di PBS sterile. Dopo aver rimosso la soluzione di lavaggio, la piastra è pronta per l'uso; oppure, può essere sigillato e conservato a 4 gradi centigradi per un massimo di una settimana.
  2. Raccolta di cellule T CD8 attivate (Giorno 2)
    1. Raccogliere le cellule T CD8 attivate, contare e calcolare la vitalità cellulare utilizzando trypan blu o uno strumento automatizzato adatto.
    2. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione e risospendere a 5 x 106 cellule vitali/mL per la trasduzione. Mantenere una piccola aliquota di cellule in coltura nell'intero supporto cellulare T nell'incubatrice di CO2 per fornire un controllo per il successivo smistamento delle cellule attivate a fluorescenza delle cellule trasdotte (passaggio 6).
      NOTA: Dopo l'attivazione per 48 h, il numero totale di celle dovrebbe essere aumentato di circa 1,5 volte e avere una redditività superiore al 95%.
  3. Trasduzione (giorno 2)
    1. Aggiungere 100 l di sospensione cellulare CD8 attivata per pozzo (0,5 x 106 cellule) alla piastra rivestita di fibronectina. Aggiungere quindi 1,5-2 mL di mezzo contenente virus (dal punto 2.6) a ciascun pozzetto. Mescolare utilizzando un movimento vorticoso per erogare le cellule in modo uniforme (Figura 2).
    2. Posizionare la piastra in un sacchetto di plastica a chiusura cerniera e guarnire (per fornire un contenimento secondario). Centrifuga a 2000 x g per 90 min a 37 gradi centigradi.
    3. Rimuovere la piastra dalla centrifuga. Nella sicurezza biologica, armadio rimuovere con attenzione il sacchetto di plastica e assicurarsi che l'esterno della piastra non sia contaminato da alcun mezzo.
    4. Trasferire quindi la piastra sull'incubatrice dedicata a 37 gradi centigradi CO 2. Dopo 4 h, rimuovere 1 mL del mezzo da ogni pozzo e sostituire con 1 mL di supporto completo a T preriscaldato. Sostituire la piastra nell'incubatrice CO 2.
      NOTA: Gestire tutti i supporti delle cellule trasdotte come rifiuti infettivi.
  4. Seconda trasduzione (giorno 3)
    1. Nell'armadio di sicurezza biologica dedicato, inclinare la piastra contenente le cellule trasdotte appoggiandosi sul coperchio e rimuovere con attenzione la maggior parte del mezzo (lasciando 100-200 L) assicurandosi di non contattare le cellule nella parte inferiore del pozzo.
    2. Aggiungere il supporto contenente il virus raccolto nel passaggio 2.7 e ripetere i passaggi da 5.3.2–5.3.4.
      NOTA: Nella nostra esperienza, una terza trasduzione raramente migliora l'efficienza complessiva. Inoltre, la vitalità cellulare probabilmente diminuirà in modo significativo se viene utilizzata una terza trasduzione. Se le cellule sono placcate ad una concentrazione superiore a 0,5 x 106/bene, le cellule T possono raggiungere la confluenza dopo l'incubazione notturna dopo la seconda fase di trasduzione. In questo caso, dividere le cellule dopo l'incubazione di 4 h il giorno 3.
  5. Lavare le cellule (giorno 4)
    1. Rimuovere 1 mL di mezzo da ogni pozzo, risospendere le cellule nel mezzo rimanente e trasferire in un tubo da 15 mL. Lavare i pozzetti con 1 mL di mezzo completo per cellule T e aggiungerlo al tubo contenente le cellule raggruppate da ogni trasduzione.
    2. Centrifuga a 350 x g per 7 min, quindi lavare due volte con la resuspending in 2 mL di supporto completo a celle T e pellettazione. Infine resospendio in 2 mL di media e determinare il numero di cella.
      NOTA: Se 1 x 106 cellule sono state originariamente trasdotte, la resa in questa fase dovrebbe essere di 3 x 106.
  6. trasferire
    1. Trasferire aliquote di 0,5–1 x 106 cellule in 2 mL di mezzo a cellule T complete nei pozzi di una nuova piastra di 24 pozzetti e incubare a 37 gradi centigradi. Circa 48-72 h dopo la trasduzione le cellule sono pronte per l'analisi dell'espressione CAR e lo smistamento delle celle.
      NOTA: Il numero di celle CAR-T di solito raddoppia ogni 24 h in questa fase. È fondamentale non lasciarli mai crescere troppo. Dividere le celle immediatamente se la densità è superiore a 2 x 106/mL (o se il mezzo diventa giallo brillante). Secondo la nostra esperienza le cellule CAR-T proliferano in modo più robusto in piastre 24-bene e 12-pozzi che se trasferito su un vaso più grande.

6. Purificazione delle cellule trasdotte mediante smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) (giorno 5 o giorno 6)

  1. Raccogliere le cellule.
    1. Risospendere le cellule con il pipetting su e giù più volte (prendendo cura di non causare schiuma), trasferimento a tubi da 15 mL e centrifuga a 350 x g per 5 min.
    2. Risospendere nel buffer di ordinamento (2% BSA in PBS sterile contenente gentamicina) a 1 x 106 celle/mL. Raccogliere anche le cellule T CD8 di controllo (non traslate) dal punto 5.2).
      NOTA: Da 1 x 106 celle al giorno 2, è prevista una resa di 2 x 107 celle trasdotte in questo punto temporale.
  2. Lavare le cellule una volta con il buffer di ordinamento centrifundo a 350 x g per 5 min e rimovidire a 1 x 107 celle / mL nel buffer di ordinamento. Rimuovere un piccolo aliquota per il controllo di compensazione Foxp3GFP (da utilizzare nel passaggio 6.4.1), e macchiare il resto con l'etichetta anti-topo CD8 (clone 53-6.7; 0,2 g di anticorpi/5 x 106 celle) incubando per 20 min a 4 gradi centigradi.
    1. Allo stesso modo, macchiare un'aliquota delle cellule T CD8 non transdotte per fornire un controllo di compensazione per il fluoroforo che etichetta l'anticorpo anti-CD8.
      NOTA: Evitare di aggiungere azide di sodio a qualsiasi tampone, in quanto questo è tossico per le cellule.
  3. Lavare le celle etichettate due volte con il buffer di ordinamento, remettere in sospensione nel buffer di smistamento a freddo a 1 x 107 celle / mL.
  4. Ordinare le celle.
    1. Ordinare CD8 GFP: celle positive in un supporto di celle T completo pre-raffreddato (Figura3B). Prendere una piccola aliquota per l'analisi post-ordinamento per determinare la purezza.
      NOTA: Per massimizzare la purezza delle celle ordinate, devono essere utilizzate porte strette. Utilizzare un ugello da 100 m per garantire un'elevata vitalità cellulare. Ridurre al minimo la quantità di tempo in cui le celle ordinate vengono mantenute sul ghiaccio. Le cellule T che sono state tenute sul ghiaccio per più di 3 h richiedono molto più tempo per recuperare rispetto alle cellule raffreddate per meno di 2 h. Pertanto, se 3 linee cellulari trasdotte devono essere ordinate, raccogliere ed etichettare la seconda riga mentre la prima viene smistata e così via, invece di avere la seconda e la terza linea trascorrono un tempo prolungato a 0 gradi centigradi. L'espressione di altri marcatori di celle T come CD28 e CD3 può anche essere monitorata (Figura 3C), ma non è essenziale per scopi di ordinamento.
    2. (Strategia di ordinamento alternativa) Prima di macchiare la popolazione sfusa, analizzare l'espressione CD8 di una piccola popolazione delle cellule T trasdotte. Se la purezza è >99%, la popolazione sfusa può essere ordinata in modo sicuro esclusivamente sulla base dell'espressione GFP.

7. Espansione delle celle CAR-T ordinate (giorno 5-10)

  1. Espansione delle cellule CAR-T
    1. Lavare le cellule CAR-T ordinate una volta, quindi rimettere in modalità T completa preriscaldata a 2,5-5 x 105 celle/mL e piastre 2 mL in piastre di 24 pozzetti.
    2. Contare e dividere le celle ogni 1-2 giorni. Di solito il numero di cellulare raddoppia ogni giorno fino al giorno 10, con la vitalità che rimane sopra il 95%.
      NOTA: Senza ri-stimolazione, le cellule CAR-T smetteranno di proliferare intorno al giorno 10 e alla fine moriranno. Pertanto, i saggi funzionali delle cellule T e i trasferimenti adottivi dovrebbero essere programmati di conseguenza.
  2. Strategia di espansione alternativa
    1. Dopo l'ordinamento, coltura le cellule CAR-T in completo tcello medio contenente rhIL-2 a 100 U/mL anziché 200 U/mL.
      NOTA: Le cellule CAR-T proliferano ad un ritmo leggermente più lento in questo mezzo. Tuttavia, spesso continueranno a proliferare fino ai giorni 11-13 senza ri-stimolazione. Pertanto, anche se questa strategia di espansione alternativa non genera un numero maggiore di celle, fornisce un intervallo di tempo leggermente più lungo per i saggi a valle da eseguire.

8. Verifica della specificità dell'antigene e della funzionalità delle cellule T CAR.

NOTA: La specificità di legame delle cellule CAR T rivolte ai complessi peptidi/MHC può essere verificata mediante colorazione tetramera 7,23. Allo stesso modo, la loro funzionalità può essere confermata misurando la secrezione di citochine o citotossici dopo la stimolazione da parte dei loro ligandi cognati. Il NIH Tetramer Core Facility (TCF) presso Emory University è una fonte raccomandata di "tetramers" e protocolli di colorazione pertinenti.

  1. Peptide-MHC Colorazione Tetramer.
    1. Etichettare aliquote di 2 x 105 cellule CAR-T trasdotte in 100 litri di tampone di smistamento mediante incubazione con 0,6 g di tetrameri antigene e controllo fluorescenti a 37 gradi centigradi per 2 h.
    2. Pellet le cellule per centrifugazione per 5 min a 350 x g, poi lavarsi due volte risusando in 0,5 mL di smistamento tampone e ri-centrifugato. Infine, risospendere le celle in 300 : L di smistamento buffer e analizzare per citometria di flusso (Figura 4).
      NOTA: Per questi studi, in genere utilizziamotetrameri BV421 -B:9-23(RE) (test) e i tetrameri IAg7-HEL (controllo). Tuttavia, qualsiasi combinazione fluoroforo/tetramero appropriata per le CAR in corso di indagine può essere utilizzata invece. In questo caso, il tempo di concentrazione e colorazione deve essere ottimizzato per ogni tetramer utilizzato. Entrambe le celle CAR-T ordinate e non ordinate possono essere utilizzate per la colorazione del tetramero.
  2. Misurazione della specificità mediante stimolazione del ligando.
    1. Incubare 2 x 105 cellule CAR-T ordinate in 200 - L di supporto a cellule T senza citochine con ligando a piastre o cellulari appropriati.
    2. Dopo 6-24 h misurare la produzione di citochine da ELISA o colorazione intracellulare utilizzando i protocolli del produttore.
      NOTA: Per i nostri studi sulle cellule T reindirizzate iAg7-B:9-23, coltiviamo le cellule durante la notte con cellule linfoma M12C3 murine b-cell che esprimono cellule IAg7-B:R3 o "vuote" IAg724,25, quindi raccogliere i supernatanti e misurare la gamma di interferone del topo secreta (IFN-z) da ELISA26 (Figura 5).

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Representative Results

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In genere, l'efficienza della trasduzione che utilizza questo protocollo è del 60-90%. Nell'esperimento illustrato nella Figura 3, prima di eseguire lo smistamento approssimativo, il 70% delle cellule T CD8 coesprimeva GFP. Hanno inoltre co-espresso CD28 e CD3 (Figura3C). È importante sottolineare che tutte le celle GFP "test"sono state co-macchiate con tetrameri IAg7-B:R3, ma non con il tetramero di controllo (Figura 4). Allo stesso modo, le cellule CAR-T ordinate e controllate hanno ciascuna secreto alti livelli di IFN-z solo dopo la co-coltura con bersagli che esprimono i loro ligandi cognati (Figura 5). Ciò conferma che le cellule trasdotte hanno un fenotipo della cellula T effetto CD8 diretto verso il bersaglio degli anticorpi padre.

Figure 1
Figura 1: Schema del costrutto retrovirale CAR. La CAR comprende un dominio target derivato dal frammento Fab di un anticorpo monoclonale murino adatto, e un distanziale / ancora di membrana / dominio di segnalazione dal mouse CD28, CD137 e CD247. Il cDNA sintetico viene inserito nel vettore di espressione retrovirale pMIG-II. Vengono mostrati i siti di endonuclease di restrizione utilizzati per la generazione di mAb287-CAR. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Effetto dei diversi metodi di placcatura sulla distribuzione cellulare. (Sinistra) Le celle reindirizzate usando un movimento vorticoso mostrano una distribuzione uniforme. (A destra) Le cellule sono state pipetted direttamente nel centro del pozzo. Le immagini sono state catturate dopo la filatura a 350 x g per 5 min.

Figure 3
Figura 3: Analisi citometrica del flusso delle cellule T trasdotte. Le cellule sono state co-macchiate con PE-Cy7 coniugato anti-CD8, AF647 coniugato anti-CD3, e BV421 coniugato anti-CD28, come descritto nel passo 6.4. Vengono visualizzati i profili esaminati su singole celle vitali. (A) Cellule T CD8 parentali non macchiate. (B) Profilo PE-Cy7/GFP delle cellule trasdotte. Le celle di espressione CAR sono identificate dal reporter del GFP. (C) Le cellule tradotte colorate sono state gateed sulla doppia positività PE-Cy7/GFP. Viene visualizzato il profilo AF647/BV421. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Colorazione Tetramer di cellule CAR-T non ordinate. Le cellule sono state macchiate con tetrameri coniugati BV421 come descritto al punto 8.1. Vengono visualizzati i profili esaminati su singole celle vitali. (A) Test IAg7-insulin tetramer. (B) Controllo I-Ag7-HEL tetramer. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Secrezione citochina specifica dell'antigene da parte delle cellule T CAR. Le celle T CD8 ordinate che esprimono il test mAb287 o control mAb24.1 CAR sono state co-coltivate con celle M12C3 che esprimono cellule IAg7-B:R3, IAg7"vuote" o TFR-MBP-DTRL (il ligando per mAb24.1) come descritto nel passaggio 8.2. Dopo le 24 ore, l'IFN-eLISA fu quantificato da ELISA. È stata osservata una stimolazione specifica di entrambe le linee cellulari T. I dati rappresentano media: SD di 3 esperimenti ripetuti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

ora Preparazione dei virus Preparazione delle cellule T
GIORNO -4 (venerdì) Scongelare le cellule Phoenix (PM)
Giorno -3 (sat) Ri-piastra Phoenix
Giorno -2 (sole) vacanza
Giorno-1 (lun) Irradiare cellule Phoenix (PM) Piatto non trattato con CD3/CD28 Ab
Giorno 0 (mar) Transfecting Phoenix cellule (AM) Preparare gli splenociti e isolare le cellule T CD8.
Attivazione delle cellule T.
Giorno 1 (Wed) Modificare le celle Phoenix medio a 4 ml (AM). Cappotto RetroNectin
Giorno 2 (Thu) Raccogliere virus e ricaricare. Trasduzione, cellule T CD8
Giorno 3 (venerdì) Raccogliere il virus. Trasduzione, cellule T CD8
Giorno 4 (sat) Lavare le cellule ed espandere le cellule.
Giorno 5 (sole) Espansione delle celle, se necessario.
Giorno 6 (Lunedi) Ordinamento delle celle CAR-T.
Giorno 7 - 10 (da martedì a venerdì) Espansione delle cellule T CAR- Esperimenti.

Tabella 1: Riepilogo del protocollo di generazione CAR-T.

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Discussion

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Questo protocollo descrive un metodo efficiente per produrre cellule CD8 CAR-T specifiche dell'antigene mediante trasduzione retrovirale. L'efficienza di trasduzione del nostro protocollo è tipicamente elevata, e si osserva generalmente un'espressione robusta della RCA. Le cellule CAR T espanse mantengono le caratteristiche essenziali delle cellule T attivate dai genitori e la specificità degli anticorpi e sono adatte sia per l'uso in vitro che in vivo. Abbiamo applicato cellule T Ab-CAR CD8 nella riprogrammazione del diabete di tipo 1 nei topi NOD7.

Il nostro protocollo incorpora diverse modifiche critiche ai metodi descritti in precedenza. In primo luogo, utilizziamo un supporto ottimizzato per la coltura delle cellule T che consente un tempo di attivazione prolungato. Il mezzo completo descritto contiene livelli ottimali di diversi integratori chiave, e migliora significativamente sia la vitalità delle cellule T e l'estensione della proliferazione dopo l'attivazione. Va notato che il topo IL-2 può essere sostituito con la proteina umana con risultati equivalenti, anche se attualmente, l'IL-2 umano è più conveniente. Da notare che si ottiene un'efficienza di trasduzione significativamente più elevata utilizzando cellule T attivate per 40-48 h rispetto a quando viene utilizzato un passaggio di attivazione di 24 h.

In secondo luogo, utilizziamo una procedura di trasduzione migliorata che elimina la polibrene B (che è tossica per le cellule T) e utilizza invece la fibronectina. Questo migliora ulteriormente la vitalità cellulare. Va notato che per garantire una buona efficienza di trasduzione è fondamentale mantenere le cellule T in un mezzo ottimizzato ad una densità cellulare appropriata e utilizzare nuovi supernatanti virali ad alto tenetico piuttosto che virus precedentemente congelati. Utilizzando la nostra procedura modificata, una terza fase di trasduzione non è necessaria e in effetti è indesiderabile in quanto la vitalità in genere diminuisce se è incluso un terzo passo di infezione spin. Va anche sottolineato che è fondamentale non lasciare mai che le cellule crescano eccessivamente durante la fase di espansione. Una volta che le cellule sono incolte, tendono a perdere rapidamente il loro fenotipo e muoiono.

Oltre ai parametri sopra descritti, devono essere evitate altre due potenziali cause di bassa efficienza/viabilità della trasduzione. In primo luogo, poiché gli antibiotici non dovrebbero essere presenti durante i passaggi di trasfezione, è importante assicurarsi che i plasmidi siano preparati utilizzando un kit privo di endotossina e disciolti in acqua sterile e che venga utilizzata in ogni momento una buona tecnica sterile. In secondo luogo, deve essere evitata la presenza di alti livelli di cellule T morte o morente. Se la sospensione cellulare T parentale attivata contiene alti livelli di cellule morte o detriti cellulari, questo dovrebbe essere rimosso prima della trasduzione utilizzando kit commerciali.

Non abbiamo deliberatamente incluso un passaggio di congelamento delle cellule CAR-T in questo protocollo, poiché nella nostra esperienza una parte significativa delle cellule trasdotte muore durante la crioconservazione e lo scongelamento. Allo stesso modo, anche se le cellule CAR-T espanse possono essere ri-stimolate in vitro, hanno una maggiore tendenza a perdere l'espressione del transgene. Di conseguenza, dato l'elevato grado di proliferazione che osserviamo utilizzando cellule CAR-T appena ordinate, consigliamo vivamente che solo le cellule CAR-T appena generate vengano utilizzate per i saggi funzionali e il trasferimento adottivo.

In sintesi, il significato di questo protocollo è che descrive una procedura che fornisce un'elevata efficienza di trasduzione e genera un gran numero di cellule T CD8 specifiche dell'antigene sano per l'uso in vitro e in vivo. Il nostro protocollo fornisce quindi uno strumento utile per i ricercatori che intraprendono studi sulle cellule CAR-T in modelli murini di malattia.

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Disclosures

MAb287 e i suoi derivati sono protetti da un brevetto statunitense rilasciato nel 2014.

Acknowledgments

Questo studio è stato sostenuto da JDRF sovvenzioni 1-INO-2015-74-S-B, 2-SRA-2016-238-S-B, e SRA-2-S-2018-648-S-B, un diabete istruzione e azione Award, e il Caroline Wiess Law Fund for Research in Molecular Medicine presso Baylor College of Medicine. Lo smistamento delle cellule è stato supportato dal Cytometry and Cell Sorting Core del Baylor College of Medicine con il finanziamento del NIH (S10RR024574 e P30CA125123). Tutti i tetrameri peptide-MHC sono stati ottenuti dal NIH Tetramer Core Facility.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol (50mM) Gibco 21985-023 50 μM
5’ RACE PCR Clontech 634859
anti-mouse CD28 antibodies eBioscience 14-0281-86 final concentration at 1µg/ml
anti-mouse CD3e antibody eBioscience 145-2C11 final concentration at 1µg/ml
Biotin Rat Anti-Mouse IFN-γ BD Biosciences 554410 Working concentration at 0.5 µg/ml
BSA Sigma A7030
Endo-free Maxi-Prep kit Qiagen 12362
Gentamicin Gibco 15750-060 Final 50 µg/ml.
Heat inactivated FCS Hyclone SH30087.03 Final 10% FCS
HEPES (100X) Gibco 15630-080 1X
IAg7-CLIP tetramer-BV421 NIH tetramer Facility at Emory per approval Working concentration at 6 µg/ml
IAg7-insulin P8E tetramer-BV421 NIH tetramer Facility at Emory per approval Working concentration at 6 µg/ml
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS 100x) ThermoFisher 51500056 Final concentraion is 1x
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
MACS Separation Buffer Miltenyi Biotec 130-091-221
Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit Miletenyi Biotec Inc 130-104-075
Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit Miltenyi Biotec 130-104-075
Opti-MEM medium ThermoFisher 31985070
Penicillin-Streptomycin (5000U/ml) ThermoFisher 15070063 50 U/ml
Phoenix-ECO cells ATCC CRL-3214
Phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 10010-023
pMIG II Addgene 52107
pMSCV-IRES-GFP II Addgene 52107
Purified Rat Anti-Mouse IFN-γ BD Biosciences 551216 Working concentration at 3 µg/ml
Red cell lysis buffer Sigma R7767
RetroNectin Takara T100A Working concentration at 50 µg/ml in PBS
rhIL-2 (stock concentration 105 IU/ul) Peprotech 200-02 Final concentration at 200 IU/ml
rmIL-7 ( stock concentration 50ng/ul) R&D 407-ML-005 Final concentration at 0.5ng/ml
RPMI-1640 Gibco 11875-093
Sterile Cell Strainers Fisher Scientific 22-363-548
Tryple Gibco 12605-028

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Generazione ad alta efficienza di cellule T Topo primario specifico dell'antigene per test funzionali in un modello di diabete autoimmune
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Davidson, H. W., Cepeda, J. R., Sekhar, N. S., Han, J., Gao, L., Sosinowski, T., Zhang, L. High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model. J. Vis. Exp. (150), e59985, doi:10.3791/59985 (2019).More

Davidson, H. W., Cepeda, J. R., Sekhar, N. S., Han, J., Gao, L., Sosinowski, T., Zhang, L. High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model. J. Vis. Exp. (150), e59985, doi:10.3791/59985 (2019).

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