Geração de alta eficiência de células T Cytotoxic do rato preliminar antígeno-específico para o teste funcional em um modelo auto-imune do diabetes
Summary
Este artigo descreve um protocolo para a geração de pilhas CD8 T antígeno-específicas, e sua expansão in vitro, com o objetivo de render números elevados de pilhas de T funcionais para o uso in vitro e in vivo.
Abstract
O diabetes tipo 1 (T1D) é caracterizado por autoimunidade específica de Islet, levando à destruição de células beta e perda absoluta da produção de insulina. No modelo espontâneo do rato do diabetes não-obeso (nod), o insulin é o alvo preliminar, e a manipulação genética destes animais para remover um único epítopo mapeado chave da insulina impede a doença. Assim, a eliminação seletiva de pilhas de apresentação do antígeno profissional (APCs) que carregam este epítopo patogénico é uma aproximação para inibir as respostas auto-imunes insulin-específicas indesejadas, e tem provavelmente o maior potencial translacional.
Os receptores de antígeno Quimérico (CARs) podem redirecionar as células T para segmentar seletivamente antígenos causadores de doenças. Esta técnica é fundamental para tentativas recentes de usar a engenharia celular para terapia celular adotiva para tratar vários cânceres. Neste protocolo, nós descrevemos uma transdução aperfeiçoada do retrovírus de célula T (RV) e o protocolo in vitro da expansão que gera números elevados de pilhas CD8 antígeno-específicas funcionais do Car-T que partem de um baixo número de pilhas ingênuas. Os protocolos previamente múltiplos da pilha de CAR-T foram descritos, mas tipicamente com eficiência relativamente baixa da transdução e viabilidade da pilha depois da transdução. Em contrapartida, nosso protocolo fornece até 90% de eficiência de transdução, e as células geradas podem sobreviver mais de duas semanas in vivo e atrasar significativamente o início da doença após uma única infusão. Nós fornecemos uma descrição detalhada do protocolo da manutenção e da transdução da pilha, de modo que as etapas críticas possam facilmente ser seguidas. Todo o procedimento do isolamento da célula primária para a expressão CAR pode ser realizado dentro de 14 dias. O método geral pode ser aplicado a qualquer modelo de doença do mouse no qual o alvo é conhecido. Da mesma forma, a aplicação específica (visando um complexo de peptídeo patogênico/MHC classe II) é aplicável a qualquer outro modelo de doença auto-imune para o qual um complexo-chave foi identificado.
Introduction
Dado o provável risco reduzido de efeitos indesejados fora do alvo, as terapias imunes antígeno-específicas (ASI) são tratamentos prometedores para doenças auto-imunes tais como T1D. Evidências acumulantes sugerem que as respostas imunes à insulina (prepro) podem ser particularmente importantes na T1D1. Na última década, estudos de vários grupos, incluindo os nossos, sugerem fortemente que a apresentação de um epítopo contendo aminoácidos de cadeia de insulina B 9 a 23 por moléculas específicas de classe II de MHC (B: 9-23/MHCII), desempenha um papel importante no desenvolvimento de T1D em camundongos e humanos2,3,4,5. Para segmentar seletivamente o complexo B: 9-23/MHCII, geramos um anticorpo monoclonal, denominado mAb287, que não tem reatividade cruzada para a insulina hormonal ou complexos contendo outros peptídeos6. MAb287 bloqueia a apresentação do antígeno in vitro, e a administração semanal de mAb287 a camundongos NOD pré-diabéticos atrasou o desenvolvimento de T1D em 35% dos camundongos tratados6. Para obstruir a apresentação do antígeno in vivo, as injeções freqüentes são exigidas tipicamente a fim manter uma concentração de circulação elevada. Nós supor que nós poderíamos superar esta dificuldade tirando proveito da especificidade elevada de Ab287 para reprogramar pilhas de T, assim fornecendo uma terapia antígeno-específica melhorada da pilha de T para T1D7.
As células T citotóxicas são relatadas para serem capazes de matar seu alvo se até mesmo uma única cópia de seu ligante cognato é expressa8,9,10. Assim, B: as pilhas CD8 T específicas de 9-23/MHCII são esperadas ter uma eficiência mais elevada em eliminar a apresentação indesejada do antígeno do que o anticorpo do pai, que precisará provavelmente de ligar aos complexos múltiplos no mesmo APC para exercer seu efeito. As pilhas de T do carro foram usadas tratando cancros humanos múltiplos11,12,13, e podem igualmente ser eficaz na autoimunidade14. No entanto, as células CAR-T com especificidade para complexos peptídeos-MHC patogênicos ainda não foram utilizadas para modificar a progressão da T1D. Ao usar a técnica de transdução de células T CD8 otimizada descrita abaixo, demonstramos recentemente uma prova de princípio de que isso representa, de fato, uma abordagem viável7.
Neste protocolo, nós esboçamos um método eficiente e aerodinamizado da transdução e da expansão. Nosso protocolo é aplicável a outros estudos que exigem a geração de pilhas CD8 do carro T do rato com eficiência elevada.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve um método eficiente para produzir pilhas CD8 antígeno-específicas do CAR-T pela transdução retroviral. A eficiência de transdução do nosso protocolo é tipicamente alta, e a expressão robusta do CAR é geralmente observada. As pilhas de T do carro expandido mantêm as características essenciais das pilhas de T pai-ativadas, e da especificidade do anticorpo, e são apropriadas para in vitro e in vivo uso. Nós aplicamos pilhas do AB-carro CD8 T em reprogramação tipo-1 diabetes em ratos …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado por JDRF Grants 1-INO-2015-74-S-B, 2-SRA-2016-238-S-B, e SRA-2-S-2018-648-S-B, um prêmio de educação e ação de diabetes, e o fundo de lei Caroline Wiess para pesquisa em medicina molecular na Baylor College of Medicine. O Cell-Sorting foi apoiado pelo núcleo da citometria e da classificação da pilha na faculdade de medicina de Baylor com o financiamento do NIH (S10RR024574 e P30CA125123). Todos os tetrâmeros do peptide-MHC foram obtidos da facilidade do núcleo de tetramer de NIH.
Materials
| 2-Mercaptoethanol (50mM) | Gibco | 21985-023 | 50 uM |
| 5’ RACE PCR | Clontech | 634859 | |
| anti-mouse CD28 antibodies | eBioscience | 14-0281-86 | final concentration at 1µg/ml |
| anti-mouse CD3e antibody | eBioscience | 145-2C11 | final concentration at 1µg/ml |
| Biotin Rat Anti-Mouse IFN-γ | BD Biosciences | 554410 | Working concentration at 0.5 µg/ml |
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Endo-free Maxi-Prep kit | Qiagen | 12362 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | Final 50 µg/ml. |
| Heat inactivated FCS | Hyclone | SH30087.03 | Final 10% FCS |
| HEPES (100X) | Gibco | 15630-080 | 1X |
| IAg7-CLIP tetramer-BV421 | NIH tetramer Facility at Emory | per approval | Working concentration at 6 µg/ml |
| IAg7-insulin P8E tetramer-BV421 | NIH tetramer Facility at Emory | per approval | Working concentration at 6 µg/ml |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS 100x) | ThermoFisher | 51500056 | Final concentraion is 1x |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Separation Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit | Miletenyi Biotec Inc | 130-104-075 | |
| Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit | Miltenyi Biotec | 130-104-075 | |
| Opti-MEM medium | ThermoFisher | 31985070 | |
| Penicillin-Streptomycin (5000U/ml) | ThermoFisher | 15070063 | 50 U/ml |
| Phoenix-ECO cells | ATCC | CRL-3214 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| pMIG II | Addgene | 52107 | |
| pMSCV-IRES-GFP II | Addgene | 52107 | |
| Purified Rat Anti-Mouse IFN-γ | BD Biosciences | 551216 | Working concentration at 3 µg/ml |
| Red cell lysis buffer | Sigma | R7767 | |
| RetroNectin | Takara | T100A | Working concentration at 50 µg/ml in PBS |
| rhIL-2 (stock concentration 105 IU/ul) | Peprotech | 200-02 | Final concentration at 200 IU/ml |
| rmIL-7 ( stock concentration 50ng/ul) | R&D | 407-ML-005 | Final concentration at 0.5ng/ml |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Sterile Cell Strainers | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Tryple | Gibco | 12605-028 |
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