Summary
タウは、細胞質に存在する神経タンパク質であり、そこで微小管を結合し、核の中で、アルツハイマー病関連遺伝子の変調を含む非伝統的な機能を発揮する。ここでは、細胞質タウからの干渉を排除しながら核タウの機能を調べる方法について述べる。
Abstract
タウは、ニューロンで発現される微小管結合タンパク質であり、その主な既知の機能は、細胞骨格安定性の維持に関連している。しかし、最近の証拠は、タウがDNA保護に関与する核を含む他の細胞内コンパートメントにも存在することを示し、rRNA転写において、レトロトランスポゾンの移動性および構造組織において核小体。我々は最近、核タウがVGluT1遺伝子の発現に関与していることを実証し、アルツハイマー病の初期段階におけるグルタミン酸放出の病理学的増加を説明できる分子機構を示唆している。最近まで、標的遺伝子の発現を調節する核タウの関与は、細胞質タウの寄与または他の効果の排除を妨げた技術的な制限のために比較的不確実であいまいであった核タウとは関係のない下流要因この不確実性を克服するために、核タウタンパク質によって特異的に変調された標的遺伝子の発現を研究する方法を開発しました。我々は、局在シグナルと細胞下分画の使用を結合するプロトコルを採用し、細胞質タウ分子からの干渉を排除することを可能にした。最も顕著なのは、プロトコルは簡単であり、他の細胞型および細胞状態におけるタウの核機能を研究するために広く適用可能である古典的で信頼できる方法で構成されている。
Introduction
核内のタウタンパク質の機能は、核酸1、2、3、4、5、6と密接に関連していることが示されているように、近年大きな関心を集めている。実際、最近のゲノムワイド研究では、タウが生体内7で原性およびインタージェニックDNA配列に結合することを実証した。ヌクレオラー組織における役割は、8、9、10、11が示唆されている。さらに、タウは酸化および高熱ストレス5、10、12、13からのDNA保護に関与することが提案されているのに対し、変異タウは染色体不安定性およびアヌプロイディ14、15、16に関連している。
これまで、核区画におけるタウの機能を研究する上での課題は、細胞質タウの寄与から核タウの具体的な寄与を解剖する難しさのためにほとんど未解決のままでした。さらに、核区画内のタウ分子に起因する機能は、これまで、核タウタンパク質の直接的な関与の明確な実証を欠いているため、相関に過ぎない。実際、レトロトランスポゾンの移動性またはrRNA転写またはDNA保護11、12、17、18、19におけるタウの関与は、細胞質タウの寄与または核タウに関連しない他の下流因子の影響によっても説明され得る。
ここでは、核局在化(NLS)または核輸出信号(NES)でタグ付けされたタウコンストラクト0N4Rの使用と組み合わせて核コンパートメントを分離する古典的な手順を利用して、この問題を解決する方法を提供します。このアプローチは、細胞質コンパートメントからのタウ分子の波及による可能なアーティファクトに関連する複雑な問題を排除します。さらに、タウNLSおよびタウファミコン構築物は、それぞれ核コンパートメントからのタウ分子の濃縮または排除を誘導し、特定の機能における核タウ分子の関与に対する正および負の制御を提供する。このプロトコルは技術的に容易であり、タウ発現20、21を再活性化する癌細胞などの他の細胞型におけるタウの核機能を研究するために広く適用可能な古典的で信頼性の高い方法で構成されている。さらに、異なる区画に関連する生物学的機能を解剖するために、細胞質と核の両方に存在する他のタンパク質にも適用され得る。
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Protocol
1. 細胞培養
- 培養SH-SY5Y細胞(ヒト神経芽細胞腫細胞株、CRL-2266)を完全培地(ダルベッコの改変イーグル培地:栄養混合物F12[DMEM/F-12]10%胎児ウシ血清[FBS]、2mM L-グルタミン、100U/mLペニシリンおよび100μ細胞を37°Cおよび5%CO2でインキュベーターで維持する。10cmプレートで細胞を成長させ、コンフルエントになると分割します。
2. 細胞分化
- SH-SY5Y細胞を分化するには、めっき翌日に、10μMレチノイン酸(RA)を加えて培地を5日間完成させる。
- 6日目は、培地を分化培地に置き換える:DMEM/F-12は50 ng/mL BDNF、2 mM Lグルタミンを添加した。FBS や抗生物質を追加しないでください。
- 分化培地で細胞を3日間増殖させる。
3. キメラコンストラクトクローニング
- タウシーケンス0N4R(383aa)の3'末端のフレーム内の制限酵素消化によるクローニングによりタウNLSコンストラクトを生成する3xNLS(SV40NLS):5'-CCAAAAAAAAAAGGAAAAAAAAAAAAGaAGaAAAAAAGaA
注:タウの3'終端の3xNLSは、マルチクローニングサイト(MCS)にXhoIおよびBamHI制限部位を利用する哺乳動物発現のためのpCMV-タウプラスミドに複製される。 - タウ配列0N4R(383aa)の3'末端のフレーム内の制限酵素消化によるクローニングによりタウファネス構築物を生成する: 5'-AGTGAGCTGCAGAACTCTGAGGAGTGTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTACAAA-3'。
注:タウの3'終端のファミコンは、エコリおよびBamHI制限部位をMCSに利用する哺乳動物発現のためにpCMV-タウプラスミドにクローニングされる。 - DH5α大腸菌株をステップ3.1または3.2のDNA100ngで変換し、LB-寒天プレート上のプレート細胞を100mg/mLアンピシリンで変換します。37°Cで一晩栽培しましょう。
- 単一のコロニーを選択し、アンピシリンでLBの5 mLに細胞をスパイク。細胞を一晩攪拌中に37°Cで増殖させる。
- DNAミニプレップ(材料テーブル)でプラスミドを抽出し、配列して構成を検証します。
- DH5α大腸菌株を、LB-寒天プレート上の配列検証された構造およびプレート細胞をアンピシリンで変換します。37°Cで一晩栽培しましょう。
- 単一のコロニーを選択し、アンピシリンでLBの5 mLに細胞をスパイク。細胞を攪拌中に37°Cで2時間増殖させる。
- ステップ3.7の細胞をアンピシリンで200 mLのLBに入れます。37°Cで一晩栽培しましょう。
- 細胞を3,500 x gで4°Cで10分間ペレットします。
- DNAマキシプレップ(材料表)でプラスミドを抽出します。
4. 細胞トランスフェクション
- ステップ1.1から種子400,000細胞を6ウェルプレートに、または8ウェルチャンバースライドで20,000細胞。プレート4サンプル:空ベクターでトランスフェクトされるコントロール細胞、タグなしタウでトランスフェクトされる細胞、タウNLSでトランスフェクトされる細胞およびタウファミコンでトランスフェクトされる細胞。
- 製造業者の指示に従って、6ウェルプレートまたは200ngのDNAを使用して、各ウェルに対して400ngのDNAを播種した翌日。
- DNAとカチオン性脂質を250μL(6ウェルプレートの場合)または25μL(8ウェルチャンバースライドの場合)で、RTで5分間還元血清培地をインキュベートします。次に、それらを組み合わせてDNA脂質複合体を生成し、20分間インキュベートします。
- 培養培地を2mL(6ウェルプレートの場合)または250°L(8ウェルチャンバースライドの場合)に交換します。細胞にDNA脂質複合体を加え、一晩で37°Cでインキュベートする。
- あるいは、カチオ系試薬ポリエチレニミン(PEI)を用したトランスフェクトDNA。
- 2μgのDNAと6μLのPEIを完全培養培地(6ウェルプレートのウェルそれぞれに)、または100μLの完全培養培地を用いた1μgのDNAと3μLのPEIを混合します(8ウェルチャンバースライドの各ウェルに対して)、渦とRTで10分間インキュベートします。
- 細胞にミックスを追加し、めっき量に達するために8ウェルチャンバースライドでウェルあたり6ウェルプレートまたは150°Lの完全培養培地あたり1.8 mLの完全培養培地を追加します。
- トランスフェクションの翌日に培地を変更し、ステップ2.2の説明に従って分化媒体を追加します。
5. 免疫蛍光
- 培養培地を取り出し、1x PBSで細胞をすすす。100%氷冷メタノールで細胞を3分間振とわずに固定します。固定液を取り外し、1x PBSで短時間洗浄します。
- 室温(RT)で5分間1x PBSで0.1%非イオン性界面活性剤で透過する。簡単に、1x PBSで3回洗浄します。
- ブロッキングバッファー(PBSでは0.1%トゥイーン20および1%BSA)を有する細胞を軌道シェーカーのRTで30分間インキュベートする。
- 適切な一次抗体(例えば、マウスモノクローナル抗タウ13抗体)でインキュベートし、眼窩シェーカー上の4°Cで一晩ブロッキング緩衝液中で1:500希釈した。抗体溶液を取り出し、1x PBSで簡単に洗浄します。
- フルオロフォアに共役した二次抗体(例えば、アレクサ・フルオ633に共役したヤギ抗マウス抗体)をRTで1時間ブロッキング緩衝液で希釈し、抗体溶液を1x PBSで短時間洗浄する。
- 核を染色するには、DAPIで1:20,000を希釈して10分間ブロッキング緩衝液でインキュベートし、RTで10分間洗浄し、1x PBSで3回洗浄する。アンチフェード取り付け媒体を使用してスライドにカバースリップを取り付けます。
6. ウェスタンブロット
- ステップ4.4から細胞ペレットを回収するには、培地を取り出し、PBSで細胞を洗浄する。37°Cで4分間、500 μLのトリプシンをインキュベートします。完全なメディアと再サスペンドセルの等量を追加します。
- チューブ内の細胞を収集し、5分間500 x gで遠心分離機を行います。遠心分離の終わりに慎重に上清を削除します。1 mL の PBS を追加し、5 分間 500 x gで遠心分離し、上清を慎重に取り除く。細胞ペレットを氷の上に保管してすぐに使用するか、-80°Cで凍結して長期保存します。
- 総タンパク質抽出物の場合、細胞ペレットをリシスバッファー内の氷上で30分間インキュベートし(20 mM Tris-HCl pH 8、20 mM NaCl、10%グリセロール、1%オクチルフェノキシポリ(エチレンオキシ)エタノール、分岐(材料表)、10mM EDTAを添加した。ペレットの豊富さに応じて、50 μLから100°Lのリシスバッファーを使用してください。
- 16,000 x gで抽出物を15分間遠心分離します。20μgのタンパク質を4x Laemmli緩衝液の5μLと混合してSDS-PAGE用のタンパク質サンプルを調製し、合計20μLの総体積で100°Cで5分間沸騰させます。
注:試料は-20°Cで保存することができる。
- 16,000 x gで抽出物を15分間遠心分離します。20μgのタンパク質を4x Laemmli緩衝液の5μLと混合してSDS-PAGE用のタンパク質サンプルを調製し、合計20μLの総体積で100°Cで5分間沸騰させます。
- 細胞内分画の場合、ステップ6.2の細胞を完全な培地で再サスペンドし、各サンプルにつき1x 106細胞を収集する。500xgで10分間遠心分離機を行い、以下の工程で細胞ペレットを得た。
- 細胞内コンパートメントを分離するには、キット仕様に従って分画します。各画分を単離するには、ステップ6.4から細胞ペレットを対応する緩衝液でインキュベートし、遠心分離機を採取し、6.4.1.1-6.4.1.5で説明されているように次の緩衝液をペレットに添加する。細胞質抽出バッファー、膜抽出バッファー、核抽出バッファー、核抽出バッファーを5 mM CaCl2および3 U/μLマイクロコッカルヌクレアーゼおよびサイト骨格抽出バッファーで補完します。
注:すべてのバッファーは、プロテアーゼ阻害剤で補う必要があります。.セルペレットの体積に応じてバッファーの体積をスケールします。- 細胞質画分を単離するには、プロテアーゼ阻害剤を4°Cで補充した氷冷細胞質抽出バッファーを100μLでインキュベートし、4分間500×gで500xgで500×500gで5分間穏やかに混合し、上清を予冷チューブに移す。
- ステップ6.4.1.1からプロテアーゼ阻害剤を補充した100μLの氷冷膜抽出バッファーをペレットに加え、4°Cで10分間穏やかな混合でインキュベートし、4分間4分間、上清を集めます。
- 可溶性核分率については、ステップ6.4.1.2からペレットにプロテアーゼ阻害剤を補充した核抽出バッファーを50μL添加し、渦を加える。4°Cで30分間インキュベートし、5分間4°Cで5,000 x gで遠心分離し、上清を回収する。
- 不溶性核分率の場合は、プロテアーゼ阻害剤を添加した核抽出バッファー50μLを、CaCl2およびマイクロコッカルヌクレアーゼをステップ6.4.1.3からペレットに添加し、ボルテックスを添加する。37°Cで5分間インキュベートし、再び渦を入れ直します。RTで16,000 x gで遠心分離し、上清を集める。
- 細胞骨格分率については、ステップ6.4.1.4からペレットにプロテアーゼ阻害剤を補充した50μLの細胞骨格抽出バッファーを添加し、渦を踏む。RTで10分間インキュベートし、16,000 x gでチューブを5分間インキュベートし、上清を回収してペレットを廃棄します。
注:キット プロトコルに示されているように、セルの体積に応じてバッファーボリュームをスケーリングします。インキュベーションおよび遠心分離時間および温度22、23、24、25、26、27、28、29の詳細については、キットプロトコルを参照してください。あるいは、洗剤を用いて、イオン強度と遠心分離速度を上げることによって、細胞異性、膜結合、細胞骨格および核画分を分離する任意の標準的な方法30を使用する。標準的な核抽出バッファーを利用して、可溶性核分率と不溶性核分率を分離します。試料は-20°Cで保存することができる。
- SDS-PAGEの場合は、ステップ6.4.1.1-6.4.1.5から得られた細胞内分率の20°Lに4x Laemmliバッファーの7μLを追加し、5分間100°Cで沸騰させます。
- 細胞内コンパートメントを分離するには、キット仕様に従って分画します。各画分を単離するには、ステップ6.4から細胞ペレットを対応する緩衝液でインキュベートし、遠心分離機を採取し、6.4.1.1-6.4.1.5で説明されているように次の緩衝液をペレットに添加する。細胞質抽出バッファー、膜抽出バッファー、核抽出バッファー、核抽出バッファーを5 mM CaCl2および3 U/μLマイクロコッカルヌクレアーゼおよびサイト骨格抽出バッファーで補完します。
- アクリルアミドゲルにサンプルをロードし、120Vの定電圧で電気泳動を行い、250mAで250mAでタンパク質を90分間転写します。
- 適切なタンパク質ゲル電気泳動をチェックし、ポンソー染色溶液で膜を5分間インキュベートして、正常なブロッティングを行います。背景がきれいになるまで蒸留水で膜を洗いす。Tween 20(TBST)でトリス緩衝生理線をシェイカーで10分間洗い続けて汚れを取り除きます。
- シェーカーのRTで1時間、ブロッキング溶液(TBSTで5%ミルク)で膜をインキュベートします。TBSTで3回5分間洗浄します。
- ブロッキング溶液中の一次抗体(TBSTでは1%ミルク)で膜を4°Cで一晩ハイブリダイズする。TBSTで3回5分間洗浄します。
- HRP共役二次抗体をHRP共役二次抗体と共役化し、RTで1時間のブロッキング溶液を行い、TBSTで5分間3回洗浄する。
- 化学発光を用いてタンパク質バンドを検出します。ImageJ によってウェスタン ブロット バンドの強度を定量化します。ハウスキーピング遺伝子の産物にタンパク質発現を正規化する:核可溶性および不溶性画分のためのヒストンH2B、細胞質分率および総抽出物のためのGAPDH。
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Representative Results
細胞質タウタンパク質の寄与を避ける遺伝子発現における核タウの影響を解剖するために用いられる戦略を図1に示した。簡単に言えば、NLSまたはNESでタグ付けされたタウタンパク質は、それぞれ核コンパートメントに蓄積されるか、または核コンパートメントから除外されます。このアンバランスの機能効果は、VGluT1遺伝子の産物として測定される遺伝子発現の変化である。
プロトコルの説明に続いて、SH-SY5Y細胞をRAで5日間処理し、次いでBDNFで3日間処理し、有糸分裂後ニューロン様細胞を得た(図2)。RAおよびBDNFがない場合、未分化SH-SY5Y細胞は、ラウンダー形態を仮定し、細胞塊を形成する。予想通り、分化プロトコルを開始し、塊が巻き戻され、細胞は神経突起を広げます。分化の終わりに、細胞は分岐した神経突起のネットワークを介して均一に分布し、相互接続される。
播種の翌日、細胞はカチオン性脂質でタウNLSまたはタウファミズプラスミド(セクション4.2)でトランスフェクトされています。タウNLSまたはタウファミコン構築物を発現する細胞の場合、タウ細胞内局在は抗タウ抗体による免疫蛍光によって検出することができる。トランスフェクションの効率に応じて、細胞は、それぞれタウNLSまたはタウファミコンで正常にトランスフェクトされた場合、DAPIシグナルと結合する強力な核染色または空の核との細胞質染色を表示する(図3)。これらの特定の信号の欠如は非効率的なトランスフェクションを示す。
異なる細胞内コンパートメントで濃縮されたタンパク質を分析するために、細胞を採取し、サンプル当たり等量の細胞を処理するためにカウントした。洗剤とイオン強度の増加と遠心分離速度の向上を利用する任意の標準的な分画法は、細胞コンパートメントを互いに分離し、したがって、細胞細胞、膜結合、細胞骨格を分離するために使用することができますそして核の分数。
核が単離されると、核可溶性画分とクロマチン結合画分を、マイクロコッカルヌクレアーゼと5mMCaCl2の3U/μLを添加して分離した。
ウェスタンブロット分析では、細胞質および膜画分の等量および他の画分の半分の体積が勾配プレキャストアクリルアミドゲルにロードされ、各ステップで添加される異なる量の緩衝液を補正する。
異なる画分の効率的な分離を検証するために、以下の抗体を利用するウェスタンブロットが行われました:抗GADPH(細胞骨格を除くすべての画分に存在し、特に細胞質画分に富む)。抗アクチン(特に細胞骨格分率に富む);抗チューブリン (特に細胞質および細胞骨格分率に富む);反H2B(核分画で濃縮)(図4)。
異なる細胞内分画におけるこれらのマーカーの濃縮は、分画が適切に行われないことを示す。細胞内分画のための任意のプロトコルは、分画間の汚染の10〜15%を提示することができることに留意する必要があります。
サンプルの分画が成功したことを確認したら、ウェスタンブロットを行い、核コンパートメント内のタウの信号と総抽出物中のVGluT1信号を確認した(図5)。タグなし Tau はすべての分数で検出可能ですが、Tau-NLS は核区画内で強く濃縮されており、細胞質分率では検出力が低いです。それどころか、タウファミコンは細胞質分率に富み、核分画では検出力が低い。可溶性核分率への少量のタウファミコンの存在は、内因性タウと同様に核に移り変容し、核破壊室に一度入り込むと核輸出信号が細胞質への転位を可能にするので、期待されなければならない。これら2つの融合タンパク質に対する異なる濃縮の検出は、トランスフェクションの効率、または構築物のクローニングまたは分画における問題を示している可能性があります。
ウエスタンブロットの定量分析はImageJを用いて行うことができる。値は、各分数に特異的なハウスキーピング遺伝子に対して正規化される(細胞質分画のGAPDH、可溶性核およびクロマチン結合画分のヒストンH2B)。
図5Bのグラフは、可溶性核分率と細胞質分率におけるタウの比率を報告し、タウNLSが可溶性核分率(SNF)に高く富み、タウファミコンが減少していることを強調している。さらに、タウNLSは細胞質分率(CF)に対してクロマチン結合画分(CBF)に富み、タウファミコンは減少します。SNF/CF = 1 および CBF/CF = 1 は、制御セル内のタウ比に対応します。内因性タウは、期待どおりにすべての分数で弱く検出可能です。図5Cのグラフは、異なる量の核タウを発現するサンプルの総抽出物におけるVGluT1発現の定量を報告する。タウファミコンを発現する細胞において、VGluT1発現は対照細胞におけるベースライン発現に匹敵する。逆に、タグなしTauまたはTau-NLSを発現する細胞では、VGluT1の発現は2倍以上である。
図1:タウの核または細胞質蓄積を可能にするために使用される戦略のグラフィカルな表現。タウNLSは核コンパートメントに蓄積され、タウファミコンは除外されます。実験的読み出しは、VGluT1式の変調である。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:代表的な未分化および分化細胞培養。未分化SH-SY5Y(左)の画像は、RA(中央)により分化した細胞とRAとBDNF(右)により分化した細胞である。スケール バー = 100 μm.ここをクリックすると、この図の大きなバージョンが表示されます。
図3:免疫蛍光によるタウ細胞内濃縮の代表的な画像。タグなしのタウ、タウファミ、またはタウNLSコンストラクトをトランスフェクトまたは発現する細胞の画像。タウシグナルは免疫蛍光(赤色)により得られており、DAPI染色(青色)により核信号が得られており、結合画像が報告されている。スケール バー = 10 μm.ここをクリックすると、この図の大きなバージョンが表示されます。
図4:ウェスタンブロットによる細胞下分画に富んだタンパク質の代表的な検出。SH-SY5Y細胞からの細胞下分画のウェスタンブロット。CF = 細胞質分率;MF = 膜分率;SNF = 可溶性核分率;CBF = クロマチン結合画分;CKF = 細胞骨格分率。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:核タウおよびVGluT1タンパク質の代表的な検出(A)核および細胞質画分で検出されたタウタンパク質のウェスタンブロット。(B) グラフは、核画分と細胞質分率におけるタウの比率を報告する。値は内因性タウで正規化されています。SNF/CF = 1 および CBF/CF = 1 は、対照セル内の内因性タウ比に対応します。(C)VGluT1タンパク質のウェスタンブロット。(D) グラフは、異なる量の核タウを発現するサンプルの総抽出物におけるVGluT1発現の定量を報告する。クラスカル・ウォリス・アノヴァとマン・ホイットニー検定;p < 0.001, **** p < 0.0001, n.s. p > 0.05.すべての結果は、少なくとも3つの独立した実験から平均±SEMとして示される。この代表的な図は、Sianoら31から改変された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
核タウタンパク質が遺伝子発現に及ぼす影響を測定する方法について述べたい。このプロトコルを使用すると、細胞質タウの寄与は強く制限される。このプロトコルの重要なステップは、ヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞の分化、細胞内分画および核コンパートメントにおけるタウタンパク質の局在化である。
まず、代表結果セクションに示すように、RAおよびBDNFを添加することによりSH-SY5Y細胞の分化は、培養中のニューロン様細胞の良好な調製を得るために重要である。種子化された細胞の密度は、密度が低いほど細胞増殖に影響を与える可能性があるため、特に重要である。さらに、細胞分画やウェスタンブロットのような多数の細胞を必要とする実験では、BDNF分化工程が末端分化を可能にする細胞増殖をブロックし、培養中の細胞数を制限することに注意することが重要である。代替差別化プロトコルは、BDNF の代わりに RA または NGF のみを使用します。しかしながら、RA後にBDNFを添加すると、より良い形態学的分化32、33に到達することを可能にするが、NGFはSH-SY5Y細胞34において弱い神経突起増殖を誘導する。さらに、RAとBDNFの組み合わせにより、神経マーカーの発現と増殖の減少を伴う均質なニューロン集団を得ることができることが広く実証されている。このため、ここで利用される差別化プロトコルは RA と BDNF を組み合わせたものです。
しかしながら、異なる細胞内コンパートメントにおけるタウの役割を解剖すると報告された手順は、未分化細胞または異なる細胞型にも使用することができる。
細胞内分画は非常に重要なステップであり、十分な開始材料を持つことは非常に重要です:商用キットは1 x 106細胞しか必要とせず、他の手順ははるかに高い開始量を必要とする場合があります。さらに、標準的な緩衝剤およびステップが付いたキットの使用は避けられない、そして不可欠である実験の再現性を保証する。しかし、バッファーの組成はしばしば独自のものであるため、目的のタンパク質の機能を変化させる可能性のある洗剤が含まれている可能性があり、画分の分離を最適化することは困難な場合があります。さらに、最良の状態であっても、分画間の汚染の10〜15%があるかもしれません。各画分からの収率が悪い場合は、特定の画分の抽出バッファー内のインキュベーション時間を増やすことで克服できます。
近年、核タウの機能が大きな関心を集めているため、異なる細胞区画におけるタウの機能を解剖する信頼性の高い方法を提供することが特に重要です。細胞内分画を結合し、特に核から向けられたか、または核から除外されたタウ構築物の発現と共に、異なるコンパートメント内のタウの量を微調整することを可能にする。
プロトコルのこの部分の重要なステップは、核局在化信号または核輸出信号でタグ付けされたタウのクローニングです。NLSの効率は、SV40ウイルスからの3XNLSコンセンサス配列の存在によって保証される。タンパク質の核転位は免疫蛍光によって容易に検査することができ、核へのシグナルの欠如は、誤ったクローニングまたは非効率的なトランスフェクションに起因する可能性があります。それどころか、核輸出はNESコンセンサスシーケンスによって保証されます。この場合、免疫蛍光は、核からのタウの輸出のチェックを可能にする。しかし、タウファミコンタンパク質が核内に入り、NES配列のために、細胞質に輸出されるため、弱い核シグナルは除外されません。
これまで、核タウの機能は、直接的な関与を保証しない相関的アプローチによってのみ研究されてきた。ここで説明するプロトコルは、タウの特定の機能を核区画に明確に区別することを可能にする最初のアプローチを提供する。前に示したように、内因性Tauは、このプロトコルによって得られた結果に影響を与えません。実際、内因性タウを発現しない非ニューロン細胞で行われたのと同じ実験は、VGluT1の変化した発現につながる。このプロトコルを適用して疾患関連遺伝子31の発現を研究した。とにかく、DNA損傷への関与、核補因子との相互作用、クロマチンとの相互作用など、他の核タウ機能を調査するためにも利用される可能性があります。
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Disclosures
著者たちは何も開示する必要はない。
Acknowledgments
この作品は、スクオラ・ノーマル・スペリオーレ(SNS14_B_DIPRIMIO;)からの助成金によって支えられた。SNS16_B_DIPRIMIO)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 633 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21050 | IF 1:500 |
| anti Actin Antibody | BETHYL LABORATORIE | A300-485A | anti-rabbit WB 1:10,000 |
| anti GAPDH Antibody | Fitzgerald Industries International | 10R-G109a | anti-mouse WB 1:10,000 |
| anti H2B Antibody | Abcam | ab1790 | anti-rabbit WB 1:15,000 |
| anti Tau-13 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-21796 | anti-mouse WB 1:1,000; IF 1:500 |
| anti Tubulin alpha Antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-16891 | anti-mouse WB 1:5,000 |
| anti VGluT1 Antibody | Sigma-Aldrich | AMAb91041 | anti-mouse WB 1:500 |
| BCA Protein Assay Kit | Euroclone | EMPO14500 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | |
| Blotting-Grade Blocker | Biorad | 1706404 | Non-fat dry milk |
| BOVIN SERUM ALBUMIN | Sigma-Aldrich | A4503-50g | |
| cOmplete Mini | Roche | 11836170001 | protease inhibitor |
| Criterion TGX 4-20% Stain Free, 10 well | Biorad | 5678093 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| DMEM/F-12 | GIBCO | 21331-020 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose | Euroclone | ECM0060L | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 0390-100ml | pH = 8, 0.5 M |
| Foetal Bovine Serum | Euroclone | EC50182L | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ml | |
| Goat anti-mouse IgG-HPR | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | WB 1:1,000 |
| Goat anti-rabbit IgG-HPR | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | WB 1:1,000 |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896-50ml | Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol |
| Immobilon Western | MERCK | WBKLS0500 | |
| Lab-Tech Chamber slide 8 well glass slide | nunc | 177402 | |
| L-glutamine | Euroclone | ECB3000D | 100X |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher Scientific | 12566014 | cationic lipid |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-6X1L | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-1kg | |
| Opti-MEM reduced serum medium | Gibco | 31985070 | |
| PEI | Sigma-Aldrich | 40,872-7 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL, 100 mL |
| Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) | OXOID | BR0014G | |
| PhosStop | Roche | 4906837001 | phosphatase inhibitor |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | Step 3.10 |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-100mg | |
| Subcellular Protein Fractionation Kit for cultured cells | Thermo Fisher Scientific | 78840 | |
| Supported Nitrocellulose membrane | Biorad | 1620097 | |
| TC-Plate 6well | SARSTEDT | 833,920 | |
| TCS SP2 laser scanning confocal microscope | Leica | N/A | |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | Non-ionic surfactant |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | 0.50% |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ml | |
| VECTASHIELD antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systems | Promega | A1330 | Step 3.5 |
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