Antikor etiketleme, optik temizleme ve gelişmiş ışık mikroskobu kombinasyonu, tam yapıların veya organların üç boyutlu analizini sağlar. Burada açıklanan, kalın böbrek dilimleri immünolabeling birleştirmek için basit bir yöntemdir, etil cinnamate ile optik Temizleme, ve üç boyutlu böbrek yapıların görselleştirme ve kantifikasyon sağlayan konfoköz görüntüleme.
Optik temizleme teknikleri, sonraki üç boyutlu (3-b) görüntüleme için bir örnek boyunca refraktif indeks dengelenmiş doku şeffaf hale. Makroskopik mesafelere uzanan mikroskobik çok hücreli yapıları analiz etme potansiyeli için tüm araştırma alanlarında büyük önem aldılar. Böbrek tübülleri, damar, sinirler ve glomerüller, sadece kısmen geleneksel iki boyutlu teknikler tarafından şimdiye kadar yakalanan birçok yönde, uzatmak göz önüne alındığında, doku Temizleme de böbrek araştırma birçok yeni alanlar açtı. Optik temizleme yöntemlerinin listesi hızla büyüyor, ancak bu alandaki yeni başlayanlar için belirli bir araştırma sorusu için en iyi yöntemi seçmek zor kalır. Burada sağlanan kalın fare böbrek dilimleri antikor etiketleme birleştiren basit bir yöntemdir; ucuz, toksik olmayan ve kullanıma hazır kimyasal etil cinnamate ile optik temizleme; ve Konfokal görüntüleme. Bu protokol, böbrekler perfkullanmak ve özel ekipman gerektirmeden antikor bağlama artırmak için bir antijen alma adımı kullanın açıklamaktadır. Onun uygulama böbrek içinde görüntüleme farklı çok hücreli yapıları sunulmaktadır, ve nasıl doku içine zayıf antikor penetrasyon sorunlarını gidermek için ele alınmıştır. Ayrıca endojen fluorophores görüntüleme ve çok büyük numuneler edinme ve onları aşmak için potansiyel zorlukları tartışıyoruz. Bu basit protokol, üç boyutta doku çalışması için kolay kurulum ve kapsamlı bir araç sağlar.
Tüm organlar veya büyük çok hücreli yapıların incelenmesi artan ilgi üç boyutta şeffaf doku görüntüleme içeren optik temizleme yöntemlerinin gelişmesine yol açmıştır. Yakın zamana kadar, tüm yapıların hücre numarasını, uzunluğunu veya hacmini tahmin etmek için en iyi yöntemler stereoloji veya kapsamlı seri bölümlendirme olmuştur, bu iki boyutta sonraki analiz için doku sistemik örnekleme dayanmaktadır1, 2 , 3. ancak, bu yöntemler zaman alıcı ve eğitim ve uzmanlık yüksek düzeyde gerekir4. Optik temizleme yöntemleri, 3-b görüntüleme5,6,7için doku yarı saydam yapmak için bir örnek boyunca refraktif indeks dengelenerek bu sorunların üstesinden.
İki ana kategoriye düşen çeşitli optik temizleme yöntemleri geliştirilmiştir: solvent bazlı ve sulu bazlı Yöntemler. Sulu-tabanlı yöntemler daha basit daldırma8,9, hiperhidrasyon10,11ve hidrojel gömme12,13bölünebilir. Solvent bazlı Yöntemler dokusu susuz bırakmak, lipidleri kaldırmak ve 1,55 civarında bir değere refraktif indeksleri normalleştirmek. Çoğu solvent bazlı yöntemin sınırlamaları, GFP, solvent toksisitesi, bazı görüntüleme odalarında veya objektif lenslerde kullanılan yapıştırmaları çözünme kapasitesine sahip yaygın olarak kullanılan muhabir proteinlerinin endojen floresans ve dehidrasyon14,15,16,17,18,19,20,21. Ancak, solvent tabanlı Yöntemler, basit, zaman verimli ve farklı doku türleri bir dizi çalışabilir.
Sulu tabanlı Yöntemler, 1,38-1.52 aralığında refraktif endeksleri olan sulu çözümlerde dokusunun daldırma güveniyor8,11,12,22,23,24 . Bu yöntemler endojen floresan muhabiri protein emisyonunu korumak ve dehidrasyon kaynaklı daralma önlemek için geliştirilmiştir, ancak en sulu bazlı Temizleme yöntemlerinin sınırlamaları protokolün daha uzun bir süre içerir, doku genişleme, ve protein modifikasyon (örneğin SCALea2 gibi hiperhidrasyon protokollerinde üretan proteinleri kısmi denatürasyon)7,11,23,25. SCALe, üre kaynaklı doku genişlemesinin dehidrasyon ile dengelenmesi ve elektron mikroskobu10ile değerlendirildiği gibi doku ultrastrasyonu korunmuş olan Ürea ile Sorbitol ile birleştirerek doku genişlemesini ele aldı. Doku daralma veya genişleme yapıların mutlak boyutlarını, nesneler arasındaki mesafeleri veya hacim başına hücre yoğunluğunu etkiler; Böylece, doku temizlendiğinde boyut değişikliklerinin ölçülmesi elde edilen sonuçların yorumlanmasından7,26‘ ya yardımcı olabilir.
Genel olarak, optik temizleme için bir protokol, ön tedavi, geçirgen, immünolabeling (gerekirse), refraktif indeksleme ve gelişmiş ışık mikroskobu ile görüntüleme (örn. iki foton, konfoköz veya Floresan mikroskopisi). Temizleme yaklaşımlarının çoğu nöronal dokusu görselleştirmek için geliştirilmiştir, ve gelişmekte olan çalışmalar diğer organlarda uygulama doğruluyor5. Bu kapsamlı araç daha önce glomerül27,28, bağışıklık infiltratlar28, damarsal28ve tübül segmentleri dahil olmak üzere böbrek yapıları, güvenilir ve verimli analiz izin göstermiştir 29, ve glomerüler fonksiyon ve sağlık ve hastalık tübül remodeling daha iyi anlayış için ideal bir yaklaşımdır.
Burada özetlenen burada böbrek tübüllerin immünostonluk birleştiren bir solvent tabanlı yöntemdir; ucuz, toksik olmayan ve kullanıma hazır kimyasal etil sinamat (ECI) ile optik temizleme; ve tam tübül görselleştirme ve quantification sağlayan Konfokal mikroskobik görüntüleme. Bu yöntem basittir, antijen-alma böbrek dilimleri ticari antikorların boyama ile birleştirir ve en laboratuvarları için erişilebilir kılan özel ekipman gerektirmez.
Optik temizleme teknikleri, 3-b görselleştirme ve çeşitli organlarda mikroanatomisinin ölçülmesi için geniş önem almıştır. Burada, solvent bazlı Temizleme Yöntemi (ECI) böbrek dilimleri içinde tüm tübüllerin 3-b görüntüleme için immünolabeling ile birleştirilir. Bu yöntem, basit, ucuz ve hızlı. Ancak, diğer araştırma soruları en iyi diğer temizleme protokolleri ile cevap olabilir5. Aynı zamanda solvent tabanlı yöntemlerin değişken derecelerde doku-küçülme …
The authors have nothing to disclose.
T. S. DFG Alman Araştırma Vakfı (332853055), Else Kröner-Fresenius-Stiftung (2015_A197) ve RWTH Aachen Tıp Fakültesi (RWTH Returner programı) gelen hibe tarafından desteklenmektedir. V. G. P. Deutsche Gesellschaft kürk Nefrologie, Alexander von Humboldt Vakfı ve Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıp Araştırma Konseyi araştırma Burslar tarafından desteklenmektedir. D. H. E, Fondation LeDucq tarafından desteklenmektedir. R. K. DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), Northrhinewestfalia (MIWF-NRW) devleti ve RWTH Aachen Üniversitesi ‘nde klinik araştırmalar için disiplinlerarası Merkezi (O3-11) ‘ den hibe tarafından desteklenmektedir.
0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-761-112 | |
15 mL conical tube | Fisher Scientific | 339650 | |
21 gauge butterfly needle | Braun | Venofix | |
3-way stopcock | Fisher Scientific | K420163-4503 | |
3D analyis software | Bitplane AG | IMARIS | |
3D analyis software | Cellprofiler | free open-source software | |
5-0 silk suture | Fine Science Tools | 18020-50 | |
50 ml plastic syringes | Fisher Scientific | 14-817-57 | |
Anti-BrdU monoclonal antibody | Roche | 11296736001 | |
Antibody diluent | Dako | S0809 | |
CD31-647 | BioLegend | 102516 | |
Citrate-based antigen retrieval solution | Vector Laboratories | H-3300 | |
curved hemostat | Fisher Scientific | 13-812-14 | |
Dako Wash Buffer | Agilent | S3006 | |
dissecting microscope | Motic | DSK-500 | |
Embedding cassettes | Carl Roth | E478.1 | |
Ethanol | Merck | 100983 | |
Ethyl cinnamate | Sigma-Aldrich | 112372 | |
Flexible film/Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | |
Goat anti-AQP2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-9882 | |
Guinea pig anti-NKCC2 | N/A | N/A | DOI: 10.1681/ASN.2012040404 |
HCl | Carl Roth | P074.1 | |
Heparin | Sagent Pharmaceuticals | 401-02 | |
hemostat | Agnthos | 312-471-140 | |
horizontal rocker | Labnet | S2035-E | |
Imaging dish | Ibidi | 81218 | |
Ketamine | MWI Animal Health | 501090 | |
Micro serrefine | Fine Science Tools | 18052-03 | |
NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
Operating scissors | Merit | 97-272 | |
Paraformaldehyde | Thermo Fischer Scientific | O4042-500 | |
Rabbit anti-phoshoThr53-NCC | PhosphoSolutions | p1311-53 | |
Silicone elastomer | World Precision Instruments Kwik-Sil | KWIK-SIL | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Tissue slicer | Zivic Instruments | HSRA001-1 | |
Triton X-100 | Acros Organics | AC215682500 | |
Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
Vibratome | Lancer | Series 1000 | |
Xylazine | MWI Animal Health | AnaSed Inj SA (Xylazine) |