Protokol, mitokondriyal nükleoidlerin ticari olarak kullanılabilen DNA jeli lekesi ile özel etiketlemesini, süper çözünürlüklü yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SR-SIM) ile zaman atlamalı canlı etiketli hücrelerin zaman atlamalı serilerinin edinimini ve nükleoid hareketinin otomatik olarak izlenmesini açıklar.
Mitokondriyal nükleoidler, proteinlerle kaplanmış mitokondriyal DNA molekülleri tarafından oluşturulan kompakt parçacıklardır. Mitokondriyal DNA, tRNA’ları, rRNA’ları ve birkaç temel mitokondriyal polipeptidi kodlar. Mitokondriyal nükleoidler, fizyon/füzyon ve diğer morfolojik değişikliklerden geçen dinamik mitokondriyal ağ içinde bölünür ve dağıtır. Yüksek çözünürlüklü canlı floresan mikroskopisi bir nükleoidin konumunu ve hareketini karakterize etmek için basit bir tekniktir. Bu teknik için, nükleoidler genellikle protein bileşenlerinin floresan etiketleri ile etiketlenir, yani transkripsiyon faktörü a (TFAM). Ancak, bu strateji, eserlere (TFAM için rapor) neden olabilecek floresan protein etiketli bir yapının aşırı ifade edilmesine ihtiyaç duyar ve birçok durumda mümkün değildir. Organik DNA bağlayıcı boyalar bu dezavantajları yok. Ancak, her zaman hem nükleer hem de mitokondriyal DNA’ların boyanmasını gösterirler, böylece mitokondriyal nükleoidlere özgüllükten yoksundurlar. Bu boyaların fiziko-kimyasal özelliklerini göz önünde bulundurarak, bir nükleik asit jel lekesi (SYBR Gold) seçtik ve canlı hücrelerdeki mitokondriyal nükleoidlerin tercihli etiketlemesini sağladık. Boyanın özellikleri, özellikle DNA’ya bağlanan yüksek parlaklığı, süper çözünürlüklü yapılandırılmış aydınlatma görüntülerinin zaman serilerini kullanarak mitokondriyal nükleoid hareketinin sonraki nicelikselleştirilmesine izin verir.
Dairesel 16.5 kbp DNA molekülleri mitokondrigenetik malzemesini oluşturur, 22 tRNA, 2 rRNA ve 13 polipeptidleri kodlar? Mitokondriyal DNA mitokondriyal transkripsiyon faktörü a (TFAM) ve diğer bazı proteinler mitokondriyal nükleoidler1formu bağlı ,2,3,4. Mitokondriyal nükleoidler hareket ve mitokondriyal ağ bileşenleri arasında yeniden dağıtmak5,6 onun morfolojik remodeling sırasında, fisyon veya füzyon hücre döngüsü fazına bağlı olarak, stres, ve diğer faktörler (Pernas ve ark.7gözden). Buna ek olarak, mitokondriyal nükleoidlerin hareketi, sistemik lupus eritematozus hastalığı8 karıştığı ve diğer hastalıklarda rol oynayabilir. Floresan mikroskopisi organellerin canlı hücre çalışmaları için basit bir tekniktir, ancak bu teknik mitokondriyal nükleoidlerin boyutundan daha büyük olan >200 nm çözünürlüğe sahiptir (~100 nm9,10,11,12). Bu sınır, uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) ve tek molekül lokalizasyon mikroskobu (SMLM)13,14gibi sözde “süper çözünürlüklü” teknikler tarafından atlatılmıştır. Şimdiye kadar, mitokondriyal nükleoidler ve diğer DNA’lar canlı hücrelerde doğrudan stokhastik optik rekonstrüksiyon mikroskopisi (dSTORM)15ile görüntülenmiştir. Canlı hücrelerde STED tarafından mtDNA ile ilişkili pozisyonlara sahip ince alt mitokondriyal yapılar gözlenmiştir16. Ancak, bu süper çözünürlük teknikleri canlı hücreler üzerinde fototoksik etkilere neden olan yüksek aydınlatma yoğunluğu gerektirir17. Bu nedenle, kırınım sınırının ötesinde çözünürlüğe sahip mitokondriyal nükleoidlerin zaman atlamalı görüntülemesi zordur. Bu sorunu gidermek için süper çözünürlüklü yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SR-SIM)18kullandık. SIM STED ve SMLM19daha çok daha düşük bir aydınlatma güç dozu gerektirir. Ayrıca, STED ve SMLM teknikleri aksine, SIM basit çok renkli üç boyutlu (3D) görüntüleme izin verir, ve floroforlar veya görüntüleme tampon kompozisyon belirli fotofiziksel özellikleri gerektirmez19.
Canlı hücrelerde mitokondriyal nükleoidlerin etiketlemisiyal strateji, TFAM20gibi bir mitokondriyal nükleoid proteinin floresan etiketlemesidir. Ancak, birçok durumda, bu strateji uygun değildir. Ayrıca, floresan protein etiketli TFAM aşırı ifade ciddi bir artifakıüretir 21. DNA’nın organik boyalarla etiketlemi floresan protein (FP) tabanlı bir stratejiye göre avantajlıdır. Organik boyalar FP etiketlemeile ilgili kısıtlardan arındırılır: her türlü hücre veya doku için kullanılabilir ler ve bir deneyin herhangi bir noktasında uygulanabilirler. Mitokondriyal nükleoidlerin canlı hücre görüntüleme si birkaç DNA bağlayıcı boyalar ile bildirilmiştir: DAPI22, SYBR Yeşil23, Vybrant Boya Döngüsü24, ve picoGreen15,25,26. Nükleoid etiketleme için DNA bağlayıcı boyaların çoğunun önemli bir dezavantajı hücre içindeki tüm DNA’yı lekelemeleridir. Boyayı sadece mitokondriyal DNA’ya yönlendirmek son derece arzu edilir. Bunu başarmak için, uygun fiziko-kimyasal özelliklere sahip bir boya dikkatli seçimi gereklidir. Rhodamine 123 gibi lokalize pozitif yüke sahip lipophilic boyaların, negatif membran potansiyelini koruyan canlı mitokondride biriktiği bilinmektedir. Buna ek olarak, mitokondriyal nükleoidlerin özel etiketleme için ideal bir boya yüksek afinite sahip DNA bağlamak ve DNA bağlama üzerine parlak floresan yontmak gerekir. Bu gereksinimleri göz önünde bulundurarak, bazı siyanürler umut verici (örneğin, picoGreen), ama nükleer DNA bol miktarda mitokondriyal DNA15,,25,26ile aynı anda bu boyalar tarafından lekeli . Bu protokol, canlı hücrelerdeki mitokondriyal nükleoidlerin başka bir siyanür boyası olan SYBR Gold (SG) ile özel etiketlemesini ve zaman atlamalı süper çözünürlüklü SIM videolarında nükleoidlerin takibini açıklamaktadır. Ayrıca, SG lekeli canlı hücreler, canlı hücreler için uygun ve 488 nm ışık kaynağı ile donatılmış ters floresan mikroskop (konfokal, iplik diski, epifloresan, vb) her türlü görüntülenebilir.
Protokolün birkaç kritik bileşeni vardır: Mitokondriyal DNA’nın tercihli etiketlemesini sağlamak için, kuluçka sırasında DNA bağlayıcı boyakonsantrasyonu çok düşük tutulmalıdır (örn. tipik bir ticari stoğun 1:10.000 seyreltilmesi) ve kuluçka süresi 30 dakika olmalıdır. Kuluçka süresi asla 1 h.’yi geçmemelidir. diğer DNA bağlayıcı boyalar düşük konsantrasyonda etiketleme üzerine güçlü bir sinyal oluşturmak için yeterince parlak değildir.
Protokolümüz?…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar Asifa Akhtar ve Angelika Rambold (hem Max Planck Enstitüsü İmmünobiyoloji ve Epigenetik için) HeLa hücreleri sağlamak için kabul.
Elyra PS1 | Carl Zeiss | multi-modal super-resolution microscope containing module for super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM) | |
high glucose DMEM | GIBCO/ThermoFisher | 31966021 | |
ibidi 35-mm dish, glass bottom | Ibidi Gmbh | 81158 | |
ibidi 8-well microSlide, glass bottom | Ibidi Gmbh | 80827 | |
Imaris 8.4.1 | Bitplane/Oxford Instruments | image porcessing and visualisation software package | |
iXon 885 | Andor Technologies | EMCCD camera with back-illuminated sensor | |
LSM880 Airyscan | Carl Zeiss | laser scanning confocal microscope with array detector | |
Mitotracker CMXRos Red | ThermoFischer | M7512 | red live cell mitochondrial stain |
Mitotracker Deep Red FM | ThermoFischer | M22426 | far red live cell mitochondrial stain |
picoGreen | ThermoFischer | P7581 | cell permeant DNA stain |
Plan Apochromat 100x/1.46 Oil objective | Carl Zeiss | ||
SYBR Gold | ThermoFischer | S11494 | cell permeant DNA stain |
Zen Black 2012 software | Carl Zeiss | image acquisition and processing software |