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Biology

Etichettatura specifica dei nucleoidi mitocondriali per la microscopia dell'illuminazione strutturata time-lapse

doi: 10.3791/60003 Published: June 4, 2020

Summary

Il protocollo descrive l'etichettatura specifica dei nucleoidi mitocondriali con una macchia di gel di DNA disponibile in commercio, l'acquisizione di una serie di cellule con etichettatura live-lapse mediante microscopia di illuminazione strutturata super-risoluzione (SR-SIM) e tracciamento automatico del movimento nucleoide.

Abstract

I nucleotidi mitocondriali sono particelle compatte formate da molecole di DNA mitocondriale rivestite di proteine. Il DNA mitocondriale codifica tRNA, rRNA e diversi polipeptidi mitocondriali essenziali. I nucleoidi mitocondriali si dividono e si distribuiscono all'interno della rete mitocondriale dinamica che subisce fissione/fusione e altri cambiamenti morfologici. La microscopia a fluorescenza dal vivo ad alta risoluzione è una tecnica semplice per caratterizzare la posizione e il movimento di un nucleoide. Per questa tecnica, i nucleoidi sono comunemente etichettati attraverso tag fluorescenti dei loro componenti proteici, vale a dire il fattore di trascrizione a (TFAM). Tuttavia, questa strategia ha bisogno di sovraespressione di un costrutto fluorescente con tag proteico, che può causare artefatti (riportati per TFAM) e non è fattibile in molti casi. I coloranti organici che legano il DNA non presentano questi svantaggi. Tuttavia, mostrano sempre una colorazione dei DNA nucleari e mitocondriali, mancando quindi di specificità ai nucleoidi mitocondriali. Tenendo conto delle proprietà fisico-chimiche di tali coloranti, abbiamo selezionato una macchia di gel acido nucleico (SYBR Gold) e ottenuto l'etichettatura preferenziale dei nucleoidi mitocondriali nelle cellule vive. Le proprietà del colorante, in particolare la sua elevata luminosità dopo il legame al DNA, permettono la successiva quantificazione del movimento nucleoideto mitocondriale utilizzando serie temporali di immagini di illuminazione strutturata super-risoluzione.

Introduction

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Le molecole circolari di DNA da 16,5 kbp costituiscono il materiale genetico dei mitocondri, codificando 22 tRNA, 2 rRNA e 13 polipeptidi necessari per i complessi di fosforooostiami ossidriali mitocondriali. Il DNA mitocondriale legato al fattore trascrizione mitocondriale a (TFAM) e diverse altre proteine formano i nucleoidi mitocondriali1,2,3,4.4 I nucleoidi mitocondriali si spostano e si ridistribuiscono tra i componenti della rete mitocondriale5,6 durante il suo rimodellamento morfologico, fissione o fusione a seconda della fase del ciclo cellulare, dello stress e di altri fattori (rivisti in Pernas et al.7). Inoltre, il movimento dei nucleoidi mitocondriali, è implicato nellamalattia di 8 del lupus del lupus sistemico e può svolgere un ruolo in altre malattie. La microscopia a fluorescenza è una tecnica semplice per gli studi in cellule vive di organelli, ma la tecnica ha una risoluzione di >200 nm, che è maggiore delle dimensioni dei nucleoidi mitocondriali (100 nm9,10,11,12). Questo limite è stato aggirato con le cosiddette tecniche di "super-risoluzione", come l'esaurimento stimolato delle emissioni (STED) e la microscopia per la localizzazione a singola molecola (SMLM)13,14. Finora, i nucleoidi mitocondriali e altri DNA sono stati immagini nelle cellule vive mediante microscopia ottica stocastica diretta (dSTORM)15. Strutture sub-mitocondriali fini con posizioni correlate con mtDNA sono state osservate da STED nelle cellule vive16. Tuttavia, queste tecniche di super-risoluzione richiedono un'elevata intensità di illuminazione, che provoca effetti fototossici sulle cellule viventi17. Pertanto, l'imaging time lapse di nucleoids mitocondriali con risoluzione oltre il limite di diffrazione è impegnativo. Per risolvere questo problema, abbiamo utilizzato la microscopia di illuminazione strutturata a super-risoluzione (SR-SIM)18. SIM richiede una dose di potenza di illuminazione molto inferiore rispetto a STED e SMLM19. Inoltre, a differenza delle tecniche STED e SMLM, la SIM consente un semplice imaging tridimensionale multicolore (3D) e non richiede particolari proprietà fotofisiche dei fluorofori o della composizione del buffer di imaging19.

La strategia convenzionale per l'etichettatura dei nucleoidi mitocondriali nelle cellule vive è l'etichettatura fluorescente di una proteina nucleoide mitocondriale, come TFAM20. Tuttavia, in molti casi, questa strategia non è adatta. Inoltre, la sovraespressione del TFAM fluorescente con tag proteici produce un grave artefatto21. L'etichettatura del DNA con coloranti organici presenta vantaggi rispetto a una strategia basata su proteine fluorescenti (FP). I coloranti organici sono privi di vincoli legati all'etichettatura fp: possono essere utilizzati per qualsiasi tipo di cellule o tessuti e possono essere applicati in qualsiasi momento di un esperimento. L'imaging cellulare vivo dei nucleoidi mitocondriali è stato segnalato con diversi coloranti leganti il DNA: DAPI22, SYBR Green23, Vybrant DyeCycle24e picoGreen15,25,26.26 Un sostanziale inconveniente della maggior parte dei coloranti che legano il DNA per l'etichettatura dei nucleoidi è che macchiano tutto il DNA all'interno della cellula. Puntare un tintura esclusivamente al DNA mitocondriale è altamente auspicabile. Per raggiungere questo obiettivo, è necessaria un'attenta selezione di un colorante che possiede proprietà fisico-chimiche adeguate. I coloranti lipofilici che possiedono una carica positiva delocalizzata, come la rhodamina 123, sono noti per accumularsi nei mitocondri vivi, che conservano il loro potenziale di membrana negativa. Inoltre, un colorante ideale per l'etichettatura specifica dei nucleoidi mitocondriali dovrebbe legare il DNA con un'alta affinità ed emettere fluorescenza luminosa durante il legame del DNA. Considerando questi requisiti, alcune cianine sono promettenti (ad esempio, picoGreen), ma il DNA nucleare è abbondantemente macchiato da questi coloranti contemporaneamente con DNA mitocondriale15,25,26. Il protocollo attuale descrive l'etichettatura specifica dei nucleoidi mitocondriali nelle cellule vive con un altro colorante cianino, SYBR Gold (SG), e il monitoraggio dei nucleoidi nei video SIM a super-risoluzione time lapse. Inoltre, le cellule vive macchiate di SG possono essere immagini da qualsiasi tipo di microscopio fluorescente invertito (confocale, disco rotante, epifluorescenza, ecc.) adatto per le cellule viventi e dotato di una fonte di luce fluorescente invertita.

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Protocol

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NOT: Tutte le linee cellulari qui menzionate sono state coltivate nel mezzo dell'aquila modificata di alto glucosio (DMEM) integrato con 10% siero bovino fetale (FBS), glutammina, penicillina / streptomicina, e pyruvate. Erizza tutti i mezzi e gli integratori da utilizzare il giorno dell'etichettatura e dell'imaging riscaldandoli fino a 37 gradi centigradi in un'incubatrice impostata al 5% di CO2. Tutte le colture cellulari, compresa l'etichettatura, si svolgono in condizioni sterili sotto una cappa di flusso laminare.

1. Etichettatura delle celle vive

  1. Un giorno prima della procedura di etichettatura, coltura 4 x 105 cellule HeLa in 2 mL di media in un piatto Petri 35 mm con fondo di vetro #1,5. Possono essere utilizzati vetrini multi-ben camerati, ma i volumi devono essere regolati proporzionalmente al volume del pozzo. Diluire la sospensione cellulare per avere circa 50.000 cellule / mL e seme 2 mL della sospensione cellulare in una parabola Petri 35 mm.
  2. Preparare le seguenti diluizioni della soluzione commerciale SYBR Gold (SG): 1:5.000. Preparare Mitotracker Deep Red (macchia rossa lontana) o Mitotracker CMXRos Rosso (macchia rossa) (Tabella dei materiali; stock commerciale diluito 1:2,000) in mezzo di cultura senza rosso fenolo. Preparare le stesse diluizioni set di picoGreen come per SG.
    NOT: Le soluzioni descritte nel passaggio 1.2 sono le soluzioni di etichettatura 2x. Proteggere tutte le soluzioni contenenti coloranti fluorescenti dalla luce il più possibile.
  3. Lavare le cellule aderenti con 2 mL PBS una volta. Aggiungere 1 ml di fenolo senza coltura rossa al piatto Petri da 35 mm. Per uno scivolo a 8 pozze, utilizzare un volume pari a 1/2 della capacità totale del pozzo (ad esempio, aggiungere 125 l se la capacità totale del pozzo è di 250 .
  4. Aggiungere 1 mLdella soluzione di etichettatura 2x preparata al punto 1.2-35 mm piatto Petri. Per uno scivolo a 8 camere, utilizzare un volume pari a 1/2 della capacità totale del pozzo. Incubare le cellule per 30 min a 37 s C sotto il 5% di CO2.
    NOT: Non incubare le cellule con soluzione di etichettatura SG per più di 1 h, perché l'incubazione più lunga causerà l'etichettatura del DNA nucleare.
  5. Aspirare con attenzione il mezzo contenente i coloranti fluorescenti e lavare le cellule una volta con PBS.
  6. Aggiungere il mezzo di coltura delle cellule senza macchie e mantenere le cellule al buio in un'incubatrice di CO2 a 37 gradi centigradi fino all'imaging.
  7. Cellule viventi di immagini su un microscopio SR-SIM dotato di un'unità di incubazione (vedi sotto).

2. Acquisizione di immagini SR-SIM

  1. Installare un incubatore stage-top sullo stadio del microscopio. Impostare la temperatura desiderata e la concentrazione di CO2 (ad es., 37 e 5% per le cellule dei mammiferi) e mantenere caldo per almeno 1 h prima di iniziare l'acquisizione dell'immagine.
  2. Accendere tutti i componenti del microscopio SR-SIM, compresi i laser, e lasciarli riscaldare per almeno 1 h.
  3. Scegliere un obiettivo di immersione ad alto ingrandimento, alta apertura numerica (NA) (ad esempio, 100x 1,46 NA olio) consigliato per SR-SIM dal produttore del microscopio.
  4. Installare uno scivolo a camera o un piatto da 35 mm con celle etichettate (dal punto 1.6) sullo stadio del microscopio incubato.
  5. Individuare l'area di interesse sul campione, preferibilmente con oculari. Per ottenere la migliore qualità di imaging SR-SIM, scegliere le celle che sono ben attaccate al vetro.
  6. Utilizzare una fotocamera EM-CCD (High-end Device) con tintura posteriore per acquisire immagini SR-SIM.
  7. Utilizzando il software di acquisizione delle immagini, impostare un elevato guadagno EM consigliato per la fotocamera utilizzata (ad esempio, 300).
  8. Prima di acquisire la serie time lapse per il tracciamento dei nucleoidi, acquisisci un'immagine SR-SIM a due colori dello stesso campo visivo: un canale per la colorazione mitocondriale e un altro per SG. Impostare il primo canale di colore appropriato per la macchia mitocondriale utilizzata (ad esempio, per una macchia mitocondriale di gran lunga rossa, impostare l'eccitazione a 633 nm o più a lungo e un filtro di emissione longpass di 650 nm). Per il segnale SG, impostare l'eccitazione a 488 nm e un filtro di emissione a passabanda da 500-550 nm.
  9. Utilizzando il software, impostare la potenza laser più bassa possibile sia per 488 nm e linee di macchia di gran lunga rosso.
    NOT: Un'impostazione tipica è l'1% di potenza di uscita laser regolata da un filtro regolabile acousto-ottico (AOTF).
  10. Se il microscopio SIM acquisisce i canali solo in sequenza (configurazione a telecamera singola), spegnere il canale di rilevamento delle macchie di granlungamento.
  11. Impostare l'acquisizione di un singolo piano focale disattivando l'acquisizione dello stack z deselezionando la casella di stack z nel software.
  12. Impostare il tempo di esposizione della fotocamera EM-CCD più breve possibile.
  13. Impostare tre rotazioni della griglia anziché cinque rotazioni.
  14. Per aumentare la frequenza fotogrammi, nella scheda Acquisizione del software, impostare la telecamera in modo che legga i dati solo dall'area centrale del sensore della fotocamera invece di "Full Chip".
    NOT: Ad esempio, il passaggio dalla lettura di un'area di 1.000 x 1.000 pixel di sensore completo alla lettura solo 256 x 256 pixel consente una riduzione del tempo di esposizione della fotocamera da 50 ms a 13,4 ms e il tempo totale del fotogramma da 1,8 s a 1,2 s. Se viene letta solo una parte centrale del sensore della fotocamera, il campo visivo sarà molto piccolo per un obiettivo 63x o 100x tipicamente utilizzato per SR-SIM. Un tempo di esposizione più breve ridurrà il rapporto segnale-rumore delle immagini.
  15. Ottimizzare la potenza laser e il tempo di esposizione della fotocamera: acquisire immagini bidimensionali SR-SIM (2D) di celle etichettate con diversi valori di potenza laser (ad esempio, 0,5%, 1%, 1,5%, 2%) e diversi tempi di esposizione (ad esempio, 13,4 ms, 25 ms, 50 ms).
  16. Elaborare i set di dati SIM non elaborati (vedere il passaggio 3.1).
  17. Scegli la potenza laser e i tempi di esposizione della fotocamera che producono immagini SIM con punti luminosi nei mitocondri (cioè i nucleoidi) con pochi o nessun artefatto generato dall'elaborazione della SIM. Esaminare le aree esterne ai mitocondri (ad esempio, l'1% del laser a stato solido da 488 nm e l'esposizione di 25 ms della telecamera EM-CCD).
  18. Avviare l'acquisizione della serie time lapse utilizzando le impostazioni ottimizzate nei passaggi 2.15–2.17.

3. Elaborazione e analisi dei dati

  1. Elabora set di dati SIM grezzi con il modulo di illuminazione strutturata di un software adatto (Tabella dei materiali): scegliere la casella di controllo Auto per i parametri di elaborazione della SIM. Per l'elaborazione automatica di più file, utilizzare lo strumento di elaborazione batch, deselezionare Usa corrente per Batch, fare clic su Esegui batch e selezionare più file per l'elaborazione SIM.
  2. Convertire i set di dati di serie temporali elaborati SIM in formato ims con il software Imaris file converter (cioè la versione corrispondente alla versione del software Imaris).
  3. Aprire un file convertito nel software (versione 8.4.1 o successiva) con una licenza per il modulo Lineage (o Track).
  4. Avviare la procedura guidata di creazione "Spots" facendo clic sull'icona Aggiungi nuovi spot. Verrà avviata una procedura guidata per la creazione.
  5. Scegliere la scheda Crea della procedura guidata.
  6. Nel primo passaggio della procedura guidata, fare clic su Track Spots (nel tempo) e procedere al secondo passaggio della procedura guidata.
  7. Impostare Diametro XY stimato su 0,1-0,15 m, fare clic su Sotrazione sfondo e procedere al terzo passaggio.
  8. Regolare la soglia nel filtro "Qualità" trascinando la linea verticale nell'istogramma in modo che la maggior parte dei nucleoidi venga rilevata come "punti", mentre gli artefatti non vengono rilevati (cioè, i punti rilevati sono contrassegnati come palline sovrapposte sull'immagine). Controllare se questo è il caso su ogni fotogramma e regolare la soglia, se necessario. Procedere al quarto e quindi al quinto passaggio della procedura guidata.
  9. Scegliere l'algoritmo Movimento automatico. Impostare Distanza massima su 0,5 m. Impostare Dimensione spazio massimo su 0.
  10. Guarda ogni fotogramma nelle serie temporali e controlla se vengono disegnate tracce false e se vengono introdotte delle tracce tra le tracce (le tracce create dalla procedura guidata con le impostazioni correnti sono immediatamente contrassegnate come linee sovrapposte sull'immagine). Regolare "Distanza massima", se necessario. Procedere al sesto passaggio della procedura guidata. Scegliere il filtro Durata traccia e impostare una soglia compresa tra 3 e 5 s.
  11. Se i punti o le tracce attualmente rilevati non sono ottimali, tornare ai passaggi precedenti della procedura guidata utilizzando i pulsanti di navigazione (nella parte inferiore della finestra della procedura guidata) necessari per ottimizzare qualsiasi parametro per la creazione di macchie o tracce.
  12. Quando i parametri perfezionati consentono al software di rilevare correttamente tutte le macchie e costruire le tracce, fare clic sul pulsante di navigazione freccia verde nella procedura guidata per confermare la creazione delle tracce.
  13. Estrarre le statistiche delle tracce facendo clic sulla finestra dell'icona Statistiche. Scegliere i parametri delle statistiche necessari (schedeValori dettagliati e Valori medi in Statistiche) ed esportare i valori come file csv facendo clic sull'icona Unità floppy per la quantificazione e la visualizzazione.
    NOT: La velocità massima della pista, la velocità della pista media, la lunghezza della pista e lo spostamento della pista sono esempi di parametri importanti.
  14. Se il set di dati dell'immagine deve essere presentato o pubblicato, creare istantanee e/o file video che rappresentano la serie time lapse con tracce sovrapposte facoltativamente sovrapposte utilizzando gli strumenti Istantanea o Animazione.

4. Acquisizione di immagini confocali

  1. Installare un'incubatrice stage-top sullo stadio del microscopio, impostare la temperatura desiderata e la concentrazione di CO2 (cioè 37 e 5% per le cellule dei mammiferi) e tenersi caldo per almeno 1 h prima di iniziare l'acquisizione dell'immagine.
  2. Accendere tutti i componenti di un microscopio a scansione laser confocale, compresi i laser, e lasciarli riscaldare per almeno 1 h.
  3. Scegliere l'obiettivo di ingrandimento medio-alto desiderato e il campionamento spaziale in base ai criteri Nyquist.
  4. Per il canale SG, impostare l'eccitazione su 488 nm e un intervallo di rilevamento di 500-550 nm. Per il canale di macchie mitocondriali, impostare su 561 nm e 570–630 nm per un coloranti rosso, o 633 nm eccitazione e >650 nm emissione per un coloranti lontano rosso.
  5. Impostare la potenza laser più bassa possibile (in genere 1% o meno) che consente l'acquisizione dei segnali con rilevatori PMT guadagni di 700 mV.
  6. Acquisire immagini confocali a due colori delle cellule, dove i nucleoidi mitocondriali vengono rilevati nel "canale SG" e i mitocondri vengono rilevati nel canale "rosso" o "molto rosso".

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Representative Results

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Caratterizzazione dell'etichettatura delle cellule vive con SG
In primo luogo, la distribuzione di SG nelle cellule su incubazione con il tinrito a varie diluizioni è stata caratterizzata da microscopia confocale. Dopo l'incubazione con alte concentrazioni di SG o picoGreen, entrambi i coloranti per lo più etichettavano i nuclei e hanno mostrato una colorazione puntato nel citoplasma (Figura 1), analogamente ai dati pubblicati per un altro colorante cianino caricato positivamente (cioè picoGreen)15. Tuttavia, dopo l'incubazione con SG a 1:10.000 diluizione, debole colorazione è apparso nei nuclei, mentre nel citoplasma, abbiamo osservato un modello di punti luminosi (Figura 1). D'altra parte, l'incubazione con colorante picoGreen diluito 1:10,000 ha prodotto per lo più colorazione nucleare. Il segnale SG era molto più luminoso di quello di picoGreen alla stessa concentrazione. I dati hanno mostrato che SG è più adatto per l'imaging del DNA mitocondriale rispetto ad altri coloranti simili che legano il DNA.

Per confermare che i punti luminosi sono localizzati nei mitocondri, abbiamo macchiato le cellule viventi contemporaneamente con SG e macchie mitocondriali di gran lunga rosse. Quest'ultimo è un tincolo organico permeabile cellulare caricato positivamente che si accumula nei mitocondri delle cellule viventi. Dopo l'incubazione con SG a 1:10.000 e 1:50.000 diluizioni, quasi tutta la colorazione SG si è verificata nei mitocondri, mentre al momento dell'etichettatura a 1:500 e 1:1,000 diluizioni, si è verificata una significativa colorazione dei nuclei e del citoplasma(Figura 2).

Inoltre, abbiamo caratterizzato il corso temporale di colorazione delle cellule vive con microscopia SG by time lapse (Figura 3). Le trame dell'intensità della fluorescenza SG nei mitocondri rispetto al tempo (Figura 3B) suggerivano che dopo 45 minuti, la colorazione nucleoide fosse vicina alla saturazione. Pertanto, si consigliano tempi di incubazione di 30-60 min.

Abbiamo testato come la distribuzione intracellulare SG cambia sulla fissazione e/o sulla permeabilizzazione delle cellule. La fissazione (2% paraformaldeide [PFA]) delle cellule colorate vive ha causato una leggera ridistribuzione del colorante al nucleo (Figura 4A,B). La permeabilizzazione delle cellule fisse (0,1% Triton X100) ha eliminato il modello punteggiato SG nei mitocondri, e la colorazione dei nuclei era dominante (Figura 4C). Se l'SG è stato aggiunto alle cellule dopo fissazione e permeabilizzazione, distribuito uniformemente attraverso il citoplasma e i nuclei (Figura 4D). Così, le cellule etichettate SG possono essere fissate se necessario, ma il coloranti non è adatto per i protocolli che richiedono permeabilizzazione.

Monitoraggio dei nucleoidi SR-SIM e mitocondriali a cellule vive
Le cellule vive costate con SG e una macchia mitocondriale molto rossa (Tabella dei materiali) sono state immagini 3D da una tecnica SIM super-risoluzione. Come nelle immagini confocali (Figura 2), nucleoidi mitocondriali sono apparsi come punti luminosi all'interno dei mitocondri (Figura 5A). Inoltre, abbiamo acquisito una serie temporale di immagini SIM 2D e monitorato le posizioni dei nucleoidi ad una risoluzione oltre il limite di diffrazione. Immediatamente prima di iniziare la serie temporale abbiamo acquisito stack SIM 3D nel SG e nei canali di macchia mitocondriali. Poi abbiamo acquisito solo una serie temporale nel canale SG e tracciato i nucleoidi mitocondriali al fine di quantificare i loro movimenti. La velocità media della pista è stata di 0,042 m/s, e la velocità massima istantanea della pista è stata di 0,078 0,012 m/s. La maggior parte dei nucleoidi non si sposti lontano dalle loro posizioni originali, ma mostrava movimenti casuali a breve distanza che probabilmente erano confinati alla rete mitocondriale, come suggerisce una sovrapposizione di tracce sulle immagini mitocondriali (Figura 5B). Pochi spostamenti direzionali rapidi si sono verificati durante una tipica serie temporale (Film1).

Figure 1
Figura 1: Confronto tra l'etichettatura delle cellule vive picoGreen e SG. Le cellule A549 sono state incubate con picoGreen o SG a diluizioni indicate e immagini. Campi rappresentativi della vista delle celle etichettate nel canale verde. LSM880 Airyscan FAST, obiettivo 20x/air, barra di scala - 50 m. Singole sezioni ottiche. I quadrati bianchi indicano le aree mostrate con un ingrandimento più alto a destra dell'intero campo visivo di 423 x 423 m. Per le diluizioni 1:1,000 e 1:2.000, le stesse immagini vengono visualizzate con due impostazioni di luminosità: le impostazioni di luminosità "predefinite" ottimizzate per la diluizione 1:10,000 e le impostazioni di "luminosità ridotta" regolate per evitare la saturazione del rilevatore. Questa cifra è stata modificata da Jevtic et al.27. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: localizzazione SG in cellule vive su etichettatura a diverse concentrazioni. Le cellule di HeLa sono state incubate per 30 min con una miscela di 0,25 M Mitotracker CMXRos Red e la diluizione SG indicata. La soluzione è stata sostituita con DMEM, e le immagini sono state acquisite su un microscopio LSM880 Airyscan, obiettivo dell'olio 63x 1.4, con un'acquisizione sequenziale di canali di colore. Vengono visualizzate singole sezioni ottiche con una barra di scala di 10 m. Questa cifra è stata modificata da Jevtic et al.27. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: cellule HeLa durante l'etichettatura con SYBR Gold (SG). In primo luogo, le cellule HeLa dal vivo sono state etichettate con Mitotracker CMXRos Red e lavate. SG (diluizione finale 1:10,000 in DMEM) è stato aggiunto alle celle ed è stata acquisita una serie time lapse. LSM880 microscopio, 63x 1.4 obiettivo olio, acquisizione sequenziale. In ogni momento sono stati acquisiti gli stack z. Vengono visualizzate le proiezioni di intensità massima. (A) Intensità mediche della fluorescenza SG nel tempo in diverse regioni di interesse. (B) Campi di vista rappresentativi che mostrano le regioni di interesse in cui è stata misurata la fluorescenza SG (rettangoli colorati). (C) Un campo visivo in diversi momenti durante l'incubazione con SG. Un'area quadrata contrassegnata con una linea bianca viene visualizzata con un ingrandimento più alto nella colonna di destra. Questa cifra è stata modificata da Jevtic et al.27. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Effetto della fissazione e della permeabilizzazione sulla localizzazione SG nelle cellule. Le cellule di HeLa sono state macchiate con SG (stock diluito 1:10,000) e Mitotracker CMXRos Red (0,25 min) per 30 min. Le fette ottiche singole sono state acquisite al microscopio a disco rotante; acquisizione sequenziale; barra della scala - 10 cellule HeLa dal vivo macchiate con SG.A (B) Cellule HeLa vive macchiate con SG e poi fissate con il 2% di PFA in PBS per 30 min. (C) Cellule HeLa vive macchiate con SG, quindi fissate con il 2% di PFA in PBS per 30 min e permeati con 0,1% Triton X100 per 15 min. Nel pannello inferiore viene visualizzata la stessa immagine, ma la luminosità del canale verde è impostata su un valore superiore. (D) Cellule HeLa fissate con 2% PFA, permeabilizzate con 0,1% Triton X100 per 15 min, e poi macchiate con SG e Mitotracker CMXRos Red. Per acquisire le immagini mostrate in (D), il guadagno EMCCD della fotocamera per il canale verde è stato ridotto di un fattore 12 rispetto ad A-C per evitare la sovraesposizione. Questa cifra è stata modificata da Jevtic et al.27. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: monitoraggio dei nucleoid sulle immagini SIM in tempo reale. Immagini rappresentative di un campo visivo delle cellule macchiate SG. In basso: l'immagine SIM a due colori scattata prima dell'acquisizione della serie time lapse. Verde : canale SG; magenta - canale mitotracker. In alto: tracce nucleoide di una serie temporale SIM di 50 fotogrammi nel canale SG (Film 1); tempo di inquadratura: 1,8 s; tracciamento da parte del software Imaris 8.4.1. Le tracce sono codificate a colori in base alla massima velocità della pista (m/s); Elyra PS.1, modalità SIM, obiettivo Olio 100x/1.46; Barra della scala: 10 m. Questa cifra è stata modificata da Jevtic et al.27. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Movie 1
Filmato 1: serie di time lapse SIM che mostra le cellule sing SG rappresentative. Barra della scala - 5 nucleoids mitocondriali rilevati sono contrassegnati come sfere bianche. Le tracce sono visualizzate come "Dragon tails" (lunghezza 8 fotogrammi) e codificate a colori in base alla loro massima velocità istantanea (barra dei colori in basso a destra mostra le velocità in m /s). Monitoraggio e visualizzazione dei nucleoidi mitocondriali da parte del software Imaris 8.4.1. Questo video è stato pubblicato su Jevtic etal. Fare clic qui per visualizzare questo video (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).

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Discussion

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Ci sono diversi componenti critici per il protocollo: per ottenere un'etichettatura preferenziale del DNA mitocondriale, la concentrazione del tinaccio di legame del DNA durante l'incubazione dovrebbe essere mantenuta molto bassa (ad esempio, una diluizione di 1:10.000 di un tipico stock commerciale), e il tempo di incubazione dovrebbe essere di 30 min. Il tempo di incubazione non deve mai essere superiore a 1 h. si deve usare un tinrio d'oro SYBR; altri coloranti che legano il DNA non sono abbastanza luminosi da generare un segnale forte dopo l'etichettatura a bassa concentrazione.

La limitazione del nostro protocollo è che il coloranti viene lavato fuori dai nucleoidi mitocondriali durante una fase di permeabilizzazione. Pertanto, la procedura descritta non è adatta per i protocolli di immunofluorescenza convenzionali. In questo caso, i nucleoidi nelle cellule fisse possono essere etichettati in modo efficiente con altre tecniche, come anticorpi contro il DNA o i fattori di trascrizione mitocondriale (TFAM).

L'etichettatura diretta dei nucleoidi mitocondriali con il colorante organico che lega il DNA ha dei vantaggi rispetto all'etichettatura delle proteine fluorescenti: qualsiasi tipo di cellula può essere etichettata all'interno di <1 h, senza vincoli temporali o di altri vincoli di espressione transitoria o stabile di costrutti fluorescenti con etichettatura proteica. Inoltre, nei protocolli attuali, è stato segnalato che l'etichettatura proteina fluorescente convenzionale di TFAM è stata segnalata per causare artefatti. Inoltre, SG macchia in modo efficiente i nucleoidi solo se il potenziale della membrana mitocondriale è intatto. Ciò impedisce l'acquisizione di immagini di cellule "malate" e morte biologicamente irrilevanti, che non possono essere evitate con la colorazione basata su FP. Infine, i protocolli precedentemente pubblicati basati su coloranti di legame del DNA non hanno raggiunto la colorazione preferenziale del DNA mitocondriale.

Il protocollo proposto è veloce e semplice, quindi presumiamo che sarà ampiamente utilizzato per l'imaging dal vivo di nucleoidi mitocondriali da varie tecniche di fluorescenza, sia diffrazione limitata (ad esempio, laser scansione confocale, TIRF, ecc.) così come SIM super-risoluzione.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Gli autori riconoscono Asifa Akhtar e Angelika Rambold (sia Max Planck Institute for Immunobiology and Epigenetics) per la fornitura di cellule HeLa.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Elyra PS1 Carl Zeiss multi-modal super-resolution microscope containing module for super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM)
High glucose DMEM GIBCO/ThermoFisher 31966021
ibidi 35 mm dish, glass bottom Ibidi Gmbh 81158
ibidi 8-well microSlide, glass bottom Ibidi Gmbh 80827
Imaris 8.4.1 Bitplane/Oxford Instruments image porcessing and visualisation software package
iXon 885 Andor Technologies EMCCD camera with back-illuminated sensor
LSM880 Airyscan Carl Zeiss laser scanning confocal microscope with array detector
Mitotracker CMXRos Red ThermoFischer M7512 red live cell mitochondrial stain
Mitotracker Deep Red FM ThermoFischer M22426 far red live cell mitochondrial stain
picoGreen ThermoFischer P7581 cell permeant DNA stain
Plan Apochromat 100x/1.46 Oil objective Carl Zeiss
SYBR Gold ThermoFischer S11494 cell permeant DNA stain
Zen Black 2012 software Carl Zeiss image acquisition and processing software

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References

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Etichettatura specifica dei nucleoidi mitocondriali per la microscopia dell'illuminazione strutturata time-lapse
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Jevtic, V., Kindle, P., Avilov, S. V. Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy. J. Vis. Exp. (160), e60003, doi:10.3791/60003 (2020).More

Jevtic, V., Kindle, P., Avilov, S. V. Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy. J. Vis. Exp. (160), e60003, doi:10.3791/60003 (2020).

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