Protokollen beskriver spesifikk merking av mitokondriekjerner med en kommersielt tilgjengelig DNA gel flekk, oppkjøp av tidsforløp serie av levende merkede celler ved superoppløselig strukturert belysning mikroskopi (SR-SIM), og automatisk sporing av nukleoid bevegelse.
Mitokondriekjerner er kompakte partikler dannet av mitokondrie-DNA-molekyler belagt med proteiner. Mitokondrie-DNA koder tRNAs, rRNAs, og flere essensielle mitokondriepolypeptider. Mitokondriekjerner deler og distribuerer i det dynamiske mitokondrienettverket som gjennomgår fisjon/fusjon og andre morfologiske endringer. Høyoppløselig live fluorescensmikroskopi er en enkel teknikk for å karakterisere en nukleoids posisjon og bevegelse. For denne teknikken er nukleoider vanligvis merket gjennom fluorescerende koder for deres proteinkomponenter, nemlig transkripsjonsfaktor a (TFAM). Denne strategien trenger imidlertid overuttrykk av en fluorescerende proteinmerket konstruksjon, som kan forårsake artefakter (rapportert for TFAM), og er ikke mulig i mange tilfeller. Organiske DNA-bindende fargestoffer har ikke disse ulempene. Imidlertid viser de alltid farging av både kjernefysiske og mitokondrie-DNAer, og mangler dermed spesifisitet til mitokondriekjerner. Ved å ta hensyn til de fysikalske kjemiske egenskapene til slike fargestoffer, valgte vi en nukleinsyregelflekk (SYBR Gold) og oppnådde fortrinnsrett merking av mitokondrietalleroider i levende celler. Egenskapene til fargestoffet, spesielt den høye lysstyrken ved binding til DNA, tillater påfølgende kvantifisering av mitokondriekjernebevegelse ved hjelp av tidsserier av superoppløselige strukturerte belysningsbilder.
Sirkulære 16,5 kbp DNA-molekyler utgjør det genetiske materialet av mitokondrier, koding av 22 tRNA-er, 2 rRNA-er og 13 polypeptider som trengs for mitokondrieoksidative fosforyleringskomplekser. Mitokondrie DNA bundet til mitokondrietranskripsjonsfaktor a (TFAM) og flere andre proteiner danner mitokondriekjernene1,,2,,3,4. Mitokondriekjerner beveger seg og omfordeler mellom komponentene i mitokondrienettverket5,6 under sin morfologiske remodeling, fisjon eller fusjon avhengig av cellesyklusfase, stress og andre faktorer (gjennomgått i Pernas et al.7). I tillegg er bevegelsen av mitokondriekjerner, innblandet i systemisk lupus erythematosus sykdom8 og kan spille en rolle i andre sykdommer. Fluorescensmikroskopi er en enkel teknikk for live-celle studier av organeller, men teknikken har en oppløsning på > 200 nm, som er større enn størrelsen på mitokondriekjerner (~ 100 nm9,10,11,12). Denne grensen har blitt omgått av såkalte “superoppløsning” teknikker, for eksempel stimulert utslipp uttømming (STED) og enkelt molekyl lokalisering mikroskopi (SMLM)13,14. Så langt ble mitokondriekjerner og andre DNAer avbildet i levende celler ved direkte stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi (dSTORM)15. Fine sub-mitokondriestrukturer med posisjoner som korrelerer med mtDNA ble observert av STED i levende celler16. Imidlertid krever disse superoppløsningsteknikkene høy belysningsintensitet, noe som forårsaker fototoksiske effekter på levende celler17. Derfor er tidsforløp av mitokondriekjerner med oppløsning utover diffraksjonsgrensen utfordrende. For å løse dette brukte vi superoppløsning strukturert belysning mikroskopi (SR-SIM)18. SIM krever en mye lavere belysningseffektdose enn STED og SMLM19. Videre, i motsetning til STED og SMLM teknikker, sim tillater enkel flerfarget tredimensjonal (3D) bildebehandling, og det krever ikke spesielle fotofysiske egenskaper av fluorofore eller bildebuffer sammensetning19.
Den konvensjonelle strategien for merking av mitokondrietall i levende celler er fluorescerende merking av et mitokondriekjerneprotein, som TFAM20. Men i mange tilfeller er denne strategien ikke egnet. Videre produserer overuttrykk av fluorescerende protein-merket TFAM en alvorlig artefakt21. Merking av DNA med organiske fargestoffer har fordeler fremfor en fluorescerende protein (FP)-basert strategi. Organiske fargestoffer er fri for begrensninger knyttet til FP-merking: de kan brukes til alle typer celler eller vevog kan brukes når som helst i et eksperiment. Live celle avbildning av mitokondriekjerner er rapportert med flere DNA-bindende fargestoffer: DAPI22,SYBR Green23,Vybrant DyeCycle24, og picoGreen15,25,26. En betydelig ulempe med de fleste DNA-bindende fargestoffer for nukleoid merking er at de flekker alt DNA i cellen. Målretting av et fargestoff utelukkende til mitokondrie-DNA er svært ønskelig. For å oppnå det er det nødvendig med nøye valg av et fargestoff som har egnede fysikalske kjemiske egenskaper. Lipofile fargestoffer som har avlokalisert positiv ladning, som rhodamin 123, er kjent for å samle seg i levende mitokondrier, som bevarer deres negative membranpotensial. I tillegg bør et ideelt fargestoff for spesifikk merking av mitokondriekjerneoider binde DNA med høy affinitet og avgir lys fluorescens ved DNA-binding. Tatt i betraktning disse kravene, visse cyaniner er lovende (f.eks picoGreen), men kjernefysisk DNA er rikelig farget av disse fargestoffer samtidig med mitokondrie DNA15,25,26. Den nåværende protokollen beskriver spesifikk merking av mitokondriekjerneoider i levende celler med et annet cyaninefargestoff, SYBR Gold (SG), og sporing av nukleoider i tid forfaller superoppløselige SIM-videoer. Videre kan SG-fargede levende celler avbildes av alle typer inverterte fluorescerende mikroskop (confocal, spinning disk, epifluorescens, etc.) egnet for levende celler og utstyrt med en 488 nm lyskilde.
Det er flere kritiske komponenter i protokollen: For å oppnå fortrinnsrett merking av mitokondrie DNA, konsentrasjonen av DNA bindende fargestoff under inkubasjon bør holdes svært lav (f.eks. en 1:10,000 fortynning av en typisk kommersiell lager), og inkubasjonstiden bør være 30 min. Inkubasjonstiden skal aldri overstige 1 t. SYBR Gold fargestoff bør brukes; andre DNA-bindende fargestoffer er ikke lyse nok til å generere et sterkt signal ved merking ved lav konsentrasjon.
Begrensningen…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkjenner Asifa Akhtar og Angelika Rambold (både Max Planck Institute for Immunobiology and Epigenetics) for å gi HeLa-celler.
Elyra PS1 | Carl Zeiss | multi-modal super-resolution microscope containing module for super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM) | |
high glucose DMEM | GIBCO/ThermoFisher | 31966021 | |
ibidi 35-mm dish, glass bottom | Ibidi Gmbh | 81158 | |
ibidi 8-well microSlide, glass bottom | Ibidi Gmbh | 80827 | |
Imaris 8.4.1 | Bitplane/Oxford Instruments | image porcessing and visualisation software package | |
iXon 885 | Andor Technologies | EMCCD camera with back-illuminated sensor | |
LSM880 Airyscan | Carl Zeiss | laser scanning confocal microscope with array detector | |
Mitotracker CMXRos Red | ThermoFischer | M7512 | red live cell mitochondrial stain |
Mitotracker Deep Red FM | ThermoFischer | M22426 | far red live cell mitochondrial stain |
picoGreen | ThermoFischer | P7581 | cell permeant DNA stain |
Plan Apochromat 100x/1.46 Oil objective | Carl Zeiss | ||
SYBR Gold | ThermoFischer | S11494 | cell permeant DNA stain |
Zen Black 2012 software | Carl Zeiss | image acquisition and processing software |