Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Spesifikk merking av mitokondrienukleoider for tidsforløp strukturert belysningsmikroskopi

doi: 10.3791/60003 Published: June 4, 2020

Summary

Protokollen beskriver spesifikk merking av mitokondriekjerner med en kommersielt tilgjengelig DNA gel flekk, oppkjøp av tidsforløp serie av levende merkede celler ved superoppløselig strukturert belysning mikroskopi (SR-SIM), og automatisk sporing av nukleoid bevegelse.

Abstract

Mitokondriekjerner er kompakte partikler dannet av mitokondrie-DNA-molekyler belagt med proteiner. Mitokondrie-DNA koder tRNAs, rRNAs, og flere essensielle mitokondriepolypeptider. Mitokondriekjerner deler og distribuerer i det dynamiske mitokondrienettverket som gjennomgår fisjon/fusjon og andre morfologiske endringer. Høyoppløselig live fluorescensmikroskopi er en enkel teknikk for å karakterisere en nukleoids posisjon og bevegelse. For denne teknikken er nukleoider vanligvis merket gjennom fluorescerende koder for deres proteinkomponenter, nemlig transkripsjonsfaktor a (TFAM). Denne strategien trenger imidlertid overuttrykk av en fluorescerende proteinmerket konstruksjon, som kan forårsake artefakter (rapportert for TFAM), og er ikke mulig i mange tilfeller. Organiske DNA-bindende fargestoffer har ikke disse ulempene. Imidlertid viser de alltid farging av både kjernefysiske og mitokondrie-DNAer, og mangler dermed spesifisitet til mitokondriekjerner. Ved å ta hensyn til de fysikalske kjemiske egenskapene til slike fargestoffer, valgte vi en nukleinsyregelflekk (SYBR Gold) og oppnådde fortrinnsrett merking av mitokondrietalleroider i levende celler. Egenskapene til fargestoffet, spesielt den høye lysstyrken ved binding til DNA, tillater påfølgende kvantifisering av mitokondriekjernebevegelse ved hjelp av tidsserier av superoppløselige strukturerte belysningsbilder.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Sirkulære 16,5 kbp DNA-molekyler utgjør det genetiske materialet av mitokondrier, koding av 22 tRNA-er, 2 rRNA-er og 13 polypeptider som trengs for mitokondrieoksidative fosforyleringskomplekser. Mitokondrie DNA bundet til mitokondrietranskripsjonsfaktor a (TFAM) og flere andre proteiner danner mitokondriekjernene1,,2,,3,4. Mitokondriekjerner beveger seg og omfordeler mellom komponentene i mitokondrienettverket5,6 under sin morfologiske remodeling, fisjon eller fusjon avhengig av cellesyklusfase, stress og andre faktorer (gjennomgått i Pernas et al.7). I tillegg er bevegelsen av mitokondriekjerner, innblandet i systemisk lupus erythematosus sykdom8 og kan spille en rolle i andre sykdommer. Fluorescensmikroskopi er en enkel teknikk for live-celle studier av organeller, men teknikken har en oppløsning på > 200 nm, som er større enn størrelsen på mitokondriekjerner (~ 100 nm9,10,11,12). Denne grensen har blitt omgått av såkalte "superoppløsning" teknikker, for eksempel stimulert utslipp uttømming (STED) og enkelt molekyl lokalisering mikroskopi (SMLM)13,14. Så langt ble mitokondriekjerner og andre DNAer avbildet i levende celler ved direkte stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi (dSTORM)15. Fine sub-mitokondriestrukturer med posisjoner som korrelerer med mtDNA ble observert av STED i levende celler16. Imidlertid krever disse superoppløsningsteknikkene høy belysningsintensitet, noe som forårsaker fototoksiske effekter på levende celler17. Derfor er tidsforløp av mitokondriekjerner med oppløsning utover diffraksjonsgrensen utfordrende. For å løse dette brukte vi superoppløsning strukturert belysning mikroskopi (SR-SIM)18. SIM krever en mye lavere belysningseffektdose enn STED og SMLM19. Videre, i motsetning til STED og SMLM teknikker, sim tillater enkel flerfarget tredimensjonal (3D) bildebehandling, og det krever ikke spesielle fotofysiske egenskaper av fluorofore eller bildebuffer sammensetning19.

Den konvensjonelle strategien for merking av mitokondrietall i levende celler er fluorescerende merking av et mitokondriekjerneprotein, som TFAM20. Men i mange tilfeller er denne strategien ikke egnet. Videre produserer overuttrykk av fluorescerende protein-merket TFAM en alvorlig artefakt21. Merking av DNA med organiske fargestoffer har fordeler fremfor en fluorescerende protein (FP)-basert strategi. Organiske fargestoffer er fri for begrensninger knyttet til FP-merking: de kan brukes til alle typer celler eller vevog kan brukes når som helst i et eksperiment. Live celle avbildning av mitokondriekjerner er rapportert med flere DNA-bindende fargestoffer: DAPI22,SYBR Green23,Vybrant DyeCycle24, og picoGreen15,25,26. En betydelig ulempe med de fleste DNA-bindende fargestoffer for nukleoid merking er at de flekker alt DNA i cellen. Målretting av et fargestoff utelukkende til mitokondrie-DNA er svært ønskelig. For å oppnå det er det nødvendig med nøye valg av et fargestoff som har egnede fysikalske kjemiske egenskaper. Lipofile fargestoffer som har avlokalisert positiv ladning, som rhodamin 123, er kjent for å samle seg i levende mitokondrier, som bevarer deres negative membranpotensial. I tillegg bør et ideelt fargestoff for spesifikk merking av mitokondriekjerneoider binde DNA med høy affinitet og avgir lys fluorescens ved DNA-binding. Tatt i betraktning disse kravene, visse cyaniner er lovende (f.eks picoGreen), men kjernefysisk DNA er rikelig farget av disse fargestoffer samtidig med mitokondrie DNA15,25,26. Den nåværende protokollen beskriver spesifikk merking av mitokondriekjerneoider i levende celler med et annet cyaninefargestoff, SYBR Gold (SG), og sporing av nukleoider i tid forfaller superoppløselige SIM-videoer. Videre kan SG-fargede levende celler avbildes av alle typer inverterte fluorescerende mikroskop (confocal, spinning disk, epifluorescens, etc.) egnet for levende celler og utstyrt med en 488 nm lyskilde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

MERK: Alle cellelinjene nevnt her ble dyrket i høy glukose Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM) supplert med 10% foster storfe serum (FBS), glutamin, penicillin / streptomycin, og pyruvat. Likevekt alle medier og kosttilskudd som skal brukes på dagen for merking og bildebehandling ved å varme dem opp til 37 °C i en inkubator satt til 5% CO2. Alt cellekulturarbeid inkludert merking foregår under sterile forhold under en laminær strømning hette.

1. Etikett til levende celler

  1. En dag før merking prosedyren, kultur 4 x 105 HeLa celler i 2 ml medium i en 35 mm Petri parabolen med #1,5 glass bunn. Multi-brønn kamret lysbilder kan brukes, men volumer bør justeres proporsjonalt med volumet av brønnen. Fortynn cellesuspensjonen for å ha ca. 50 000 celler/ml og 2 ml cellesuspensjon i en petriskål på 35 mm.
  2. Forbered følgende fortynninger av SYBR Gold (SG) kommersiell lagerløsning: 1:5,000. Forbered Mitotracker Deep Red (langt rød flekk) eller Mitotracker CMXRos Rød(Table of Materials; kommersiell lager fortynnet 1:2,000) i fenol rød-fri kultur medium. Forbered de samme sett fortynninger av picoGreen som for SG.
    MERK: Løsningene som er beskrevet i trinn 1.2 er 2x-merkingsløsningene. Beskytt alle løsningene som inneholder fluorescerende fargestoffer fra lys så mye som mulig.
  3. Vask de tilhørende cellene med 2 ml PBS én gang. Tilsett 1 ml fenol rødfri kultur medium til 35 mm Petri parabolen. For et 8-brønns kamret lysbilde bruker du et volum som tilsvarer 1/2 av den totale brønnkapasiteten (f.eks. tilsett 125 μL hvis den totale brønnkapasiteten er 250 μL).
  4. Tilsett 1 mLof 2x merkingsløsningen som er klargjort i trinn 1,2 til 35 mm Petriskål. For et 8-brønns kammerglass bruker du et volum som tilsvarer 1/2 av den totale brønnkapasiteten. Inkuber cellene i 30 min ved 37 °C under 5 % CO2.
    MERK: Ikke inkuber cellene med SG-merkingsløsning i mer enn 1 time, fordi lengre inkubasjon vil føre til merking av kjernefysisk DNA.
  5. Aspirer forsiktig mediet som inneholder fluorescerende fargestoffer og vask cellene en gang med PBS.
  6. Tilsett fenol rødfri cellekultur medium og holde cellene i mørket i en CO2 inkubator ved 37 °C til bildebehandling.
  7. Bildelevende celler på et SR-SIM-mikroskop utstyrt med en inkubasjonsenhet (se nedenfor).

2. SR-SIM-bildeanskaffelse

  1. Installer en stage-top inkubator på mikroskopet scenen. Still inn ønsket temperatur og CO2-konsentrasjon (f.eks. 37 °C og 5 % for pattedyrceller) og hold den varm i minst 1 timer før bildeoppkjøp starter.
  2. Slå på alle komponentene i SR-SIM-mikroskopet, inkludert laserne, og la dem varmes opp i minst 1 timer.
  3. Velg et høyt forstørrelsespunkt, høyt tallrikt blenderåpning (NA) nedsenkingsmål (f.eks. 100 x 1,46 NA-olje) som anbefales for SR-SIM av mikroskopprodusenten.
  4. Monter et kammerglass eller 35 mm fat med merkede celler (fra trinn 1.6) på det inkuberede mikroskopstadiet.
  5. Finn interesseområdet på prøven, helst med okulære. For å oppnå den beste SR-SIM-bildekvaliteten, velg cellene som er godt festet til glasset.
  6. Bruk et baktinnet high-end elektron som multipliserer ladetilkoblet enhet (EM-CCD) kamera for å skaffe SR-SIM-bilder.
  7. Bruk programvaren for bildeinnhenting, angi en høy EM-forsterkning som anbefales for kameraet som brukes (f.eks. 300).
  8. Før du anskaffer time lapse-serien for nukleoid sporing, skaffe en to-farge SR-SIM bilde av samme synsfelt: en kanal for mitokondrie farging og en annen for SG. Sett den første fargekanalen som passer til mitokondrieflekken som brukes (f.eks. for en langt rød mitokondrieflekk, sett eksitasjonen på 633 nm eller lenger og et 650 nm longpass utslippsfilter). For SG-signalet setter du eksitasjonen på 488 nm og et utslippsfilter på 500–550 nm bandpass.
  9. Bruk programvaren til å angi den laveste lasereffekten som er mulig for både 488 nm og langt røde flekklinjer.
    MERK: En typisk innstilling er 1 % lasereffekteffekt justert av et acoustooptisk tunbart filter (AOTF).
  10. Hvis SIM-mikroskopet bare får kanaler sekvensielt (oppsett for enkeltkamera), slår du av den rødfargede flekkdeteksjonskanalen.
  11. Angi oppkjøpet av et enkelt fokalplan ved å slå av Z-stack-oppkjøpet ved å løsne Z-stakkboksen i programvaren.
  12. Still inn den korteste mulige eksponeringstiden for EM-CCD-kameraet.
  13. Angi tre rotasjoner av rutenettet i stedet for fem rotasjoner.
  14. For å øke bildefrekvensen, i Acquisition-fanen i programvaren, sett kameraet til å lese dataene bare fra det sentrale området av kamerasensoren i stedet for "Full Chip".
    MERK: Hvis du for eksempel bytter fra å lese et område på 1000 x 1000 piksler full sensor til å lese bare 256 x 256 piksler, kan du redusere eksponeringstiden for kameraet fra 50 ms til 13,4 ms og den totale rammetiden fra 1,8 s til 1,2 s. Hvis bare en sentral del av kamerasensoren leses, vil synsfeltet være svært lite for et 63x eller 100x mål som vanligvis brukes for SR-SIM. En kortere eksponeringstid vil redusere signal-til-støy-forholdet mellom bildene.
  15. Optimaliser eksponeringstid for laserkraft og kamera: innhente SR-SIM todimensjonale (2D) bilder av merkede celler ved flere lasereffektverdier (f.eks. 0,5%, 1%, 1,5%, 2%) og flere eksponeringstider (f.eks. 13,4 ms, 25 ms, 50 ms).
  16. Behandle raw SIM-datasettene (se trinn 3.1).
  17. Velg laserstrøm- og kameraeksponeringstider som gir SIM-bilder med lyse flekker i mitokondriene (dvs. nukleoidene) med små eller ingen artefakter generert av SIM-behandling. Inspiser områdene utenfor mitokondriene (f.eks. 1 % effekt av 488 nm solid state laser og 25 ms eksponering av EM-CCD-kamera).
  18. Start anskaffelsen av time lapse-serien ved hjelp av innstillingene som er optimalisert i trinn 2.15–2.17.

3. Databehandling og analyse

  1. Behandle rå SIM-datasett med den strukturerte belysningsmodulen til en passende programvare (Tabell over materialer): Velg Auto-avmerkingsboksen for SIM-behandlingsparametere. For automatisk behandling av flere filer, bruk verktøyet for satsvis behandling, fjern merket for Bruk gjeldende for satsvis, klikk Kjør satsvis og velg flere filer for SIM-behandling.
  2. Konverter SIM-behandlet tidsserie datasett til ims format med Imaris filomformer programvare (dvs. versjonen som tilsvarer versjonen av Imaris programvare).
  3. Åpne en konvertert fil i programvaren (versjon 8.4.1 eller nyere) som har en lisens for lineage (eller spor)-modulen.
  4. Start"Spots"opprettelsesveiviseren ved å klikke Legg til nye flekker-ikonet. En veiviser for oppretting vil bli lansert.
  5. Velg Opprett-fanen i veiviseren.
  6. Klikk Spor flekker (over tid) i det første trinnet i veiviseren, og gå videre til det andre trinnet i veiviseren.
  7. Sett estimert XY Diameter til 0,1-0,15 μm, klikk Bakgrunnsubtraksjon og fortsett til det tredje trinnet.
  8. Juster terskelen i filteret "Kvalitet"ved å dra den vertikale linjen i histogrammet slik at flertallet av nukleoidene oppdages som "flekker", mens artefaktene ikke oppdages (dvs. de oppdagede flekkene er merket som baller overlaid på bildet). Kontroller om dette er tilfelle på hver ramme og juster om nødvendig terskelen. Fortsett til fjerde og deretter til det femte trinnet i veiviseren.
  9. Velg algoritmen Autoregressive Motion. Sett maks avstand til 0,5 μm. Sett maksimal gapstørrelse til 0.
  10. Se på hver ramme i tidsserien og kontroller om eventuelle falske spor tegnes, og om eventuelle mellomrom mellom spor introduseres (spor bygget av veiviseren med gjeldende innstillinger, merkes umiddelbart som linjer som er lagt over bildet). Juster "Maks avstand" om nødvendig. Fortsett til det sjette trinnet i veiviseren. Velg Spor varighet-filteret, og angi en terskel på 3–5 s.
  11. Hvis de oppdagede stedene eller sporene for øyeblikket ikke er optimale, går du tilbake til de foregående trinnene i veiviseren ved hjelp av navigasjonsknapper (nederst i veiviservinduet) som trengs for å finjustere en parameter for oppretting av flekker eller spor.
  12. Når de finjusterte parametrene gjør det mulig for programvaren å oppdage alle stedene og bygge spor på riktig måte, klikker du på den grønne pilnavigasjonsknappen i veiviseren for å bekrefte opprettelsen av sporene.
  13. Trekk ut statistikken over sporene ved Statistics å klikke på statistikkikonvinduet. Velg de nødvendige statistikkparameterne (Detaljerte og gjennomsnittlige verdier-kategoriene under Statistikk ) og eksporterverdiene som csv-filer ved å klikke på Diskettstasjon-ikonet for kvantifisering og visualisering.
    MERK: Maksimal sporhastighet, gjennomsnittlig sporhastighet, sporlengde og sporforskyvning er eksempler på parametere som er viktige.
  14. Hvis bildedatasettet må presenteres eller publiseres, oppretter du øyeblikksbilder og/eller videofiler som representerer tidsforløpsserien med valgfrie overlagte spor ved hjelp av verktøyene Øyeblikksbilde eller Animasjon.

4. Konfidensisk bildeanskaffelse

  1. Installer en stage-top inkubator på mikroskopet, still inn ønsket temperatur og CO2-konsentrasjon (dvs. 37 °C og 5 % for pattedyrceller) og hold varmen i minst 1 timer før bildeoppkjøp starter.
  2. Slå på alle komponentene i et konfikalt laserskanningsmikroskop, inkludert laserne, og la dem varme opp i minst 1 timer.
  3. Velg en ønsket mellom-til-høy forstørrelsesmål og romlig prøvetaking i henhold til Nyquists kriterier.
  4. For SG-kanalen setter du eksitasjonen på 488 nm og et registreringsområde på 500–550 nm. For mitokondrieflekkkanalen, satt til 561 nm og 570–630 nm utslipp for et rødt fargestoff, eller 633 nm eksitasjon og > 650 nm utslipp for et langt rødt fargestoff.
  5. Sett lavest mulig laserkraft (vanligvis 1% eller mindre) som tillater oppkjøp av signalene med PMT detektor gevinster på 700 mV.
  6. Få to-farge confocal bilder av cellene, hvor mitokondriekjerner oppdages i "SG-kanal" og mitokondrier oppdages i den "røde" eller "langt røde" kanalen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Karakterisering av etiketter i live-celler med SG
Først ble fordelingen av SG i cellene ved inkubasjon med fargestoffet ved ulike fortynninger preget av konkalibel mikroskopi. Etter inkubasjon med høye konsentrasjoner av SG eller picoGreen, begge fargestoffer for det meste merket kjernene og viste en punktat farging i cytoplasma (Figur 1), på samme måte som publiserte data for en annen positivt ladet cyanine fargestoff (dvs. picoGreen)15. Men ved inkubasjon med SG ved 1:10,000 fortynning, svak farging dukket opp i kjernene, mens i cytoplasma, observerte vi et mønster av lyse flekker (Figur 1). På den annen side, inkubasjon med picoGreen fargestoff fortynnet 1:10,000 ga det meste kjernefysisk farging. SG-signalet var mye lysere enn picoGreen i samme konsentrasjon. Dataene viste at SG er mer egnet for bildebehandling av mitokondrie-DNA enn andre lignende DNA-bindende fargestoffer.

For å bekrefte at de lyse prikkene er lokalisert i mitokondriene, farget vi levende celler samtidig med SG og langt rød mitokondrieflekk. Sistnevnte er en positivt ladet celle gjennomtrengelig organisk fargestoff som akkumuleres i mitokondriene til levende celler. Ved inkubasjon med SG ved 1:10,000 og 1:50,000 fortynninger, nesten alle SG farging forekom i mitokondrier, mens ved merking på 1:500 og 1:1,000 fortynninger, betydelig farging av kjerner og cytoplasma oppstod (Figur 2).

Videre karakteriserte vi tidsforløpet til farging av levende celler med SG etter tidsforløp mikroskopi (Figur 3). Tomtene til SG fluorescensintensitet i mitokondrier vs. tid (Figur 3B) antydet at etter 45 min var nukleoidfarging nær metning. Dermed anbefaler vi inkubasjonstider på ~ 30-60 min.

Vi testet hvordan SG intracellulær distribusjon endres ved fiksering og/eller permeabilisering av cellene. Fiksering (2% paraformaldehyd [PFA]) av de levende beisede cellene forårsaket en liten omfordeling av fargestoffet til kjernen (figur 4A,B). Permeabilisering av de faste cellene (0,1% Triton X100) eliminerte SG prikket mønster i mitokondrier, og farging av kjernene var dominerende (Figur 4C). Hvis SG ble lagt til cellene etter fiksering og permeabilisering, distribuerte den jevnt over cytoplasma og kjerner (figur 4D). Dermed kan SG-merkede celler løses om nødvendig, men fargestoffet er ikke egnet for protokoller som krever permeabilisering.

Sporing av SR-SIM og mitokondrietaller
Levende celler med SG og en langt rød mitokondrieflekk (Table of Materials) ble 3D avbildet av en superoppløsning SIM-teknikk. Som i de konfukale bildene (Figur 2), dukket mitokondriekjernoider opp som lyse flekker i mitokondriene (figur 5A). Videre kjøpte vi en tidsserie med 2D SIM-bilder og sporet posisjonene til nukleoidene med en oppløsning utover diffractiongrensen. Umiddelbart før vi startet tidsserien kjøpte vi SIM 3D-stabler i SG og mitokondrieflekkkanalene. Så kjøpte vi en tidsserie i SG-kanalen bare og sporet mitokondriekjernene for å kvantifisere sine bevegelser. Sporgjennomsnittets hastighet var 0,042 μm/s, og den maksimale øyeblikkelige hastigheten på sporet var 0,078 ± 0,012 μm/s. Flertallet av nukleoider fortrengte ikke langt fra sine opprinnelige posisjoner, men viste kortdistanse tilfeldige bevegelser som sannsynligvis var begrenset til mitokondrienettet, som et overlegg av spor på mitokondriebildene antyder (Figur 5B). Få raske retningsforskyvninger oppstod i en typisk tidsserie (Film 1).

Figure 1
Figur 1: Sammenligning av picoGreen og SG live cell merking. A549 celler ble inkubert med picoGreen eller SG ved indikerte fortynninger og avbildet. Representative visningsfelt for de merkede cellene i den grønne kanalen. LSM880 Airyscan FAST, 20x /air mål, Scale bar = 50 μm. Enkelt optiske seksjoner. Hvite firkanter markerer områdene som vises ved en høyere forstørrelse til høyre for hele 423 x 423 μm synsfelt. For 1:1,000 og 1:2,000 fortynninger vises de samme bildene ved to lysstyrkeinnstillinger: innstillingene for "standard" lysstyrke optimalisert for 1:10,000 fortynning, og innstillingene for "redusert lysstyrke" justert for å unngå detektormetning. Dette tallet er endret fra Jevtic et al.27. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: SG-lokalisering i levende celler ved merking ved forskjellige konsentrasjoner. HeLa-celler ble inkubert i 30 min med en blanding av 0,25 μM Mitotracker CMXRos Red og den angitte SG-fortynningen. Løsningen ble erstattet med DMEM, og bildene ble kjøpt på et LSM880 Airyscan mikroskop, 63x 1.4 olje mål, med en sekvensiell oppkjøp av fargekanaler. Enkelt optiske skiver vises Skala bar = 10 μm). Dette tallet er endret fra Jevtic et al.27. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: HeLa-celler under merking med SYBR Gold (SG). Først ble levende HeLa-celler merket med Mitotracker CMXRos Red og vasket. SG (siste fortynning 1:10,000 i DMEM) ble lagt til cellene og en tidsforløpsserie ble anskaffet. LSM880 mikroskop, 63x 1,4 Olje mål, sekvensiell oppkjøp. Z-stabler ble anskaffet på hvert tidspunkt. De maksimale intensitetsprojeksjoner vises. (A)Gjennomsnittlig intensitet av SG fluorescens over tid i flere regioner av interesse. (B) Representative synsfelt som viser interesseområdene der SG-fluorescens ble målt (fargede rektangler). (C) Et synsfelt flere ganger under inkubasjon med SG. Et kvadratisk område merket med hvit linje vises ved en høyere forstørrelse i høyre kolonne. Dette tallet er endret fra Jevtic et al.27. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Effekt av fiksering og permeabilisering på SG-lokalisering i cellene. HeLa-celler ble farget med SG (lager fortynnet 1:10,000) og Mitotracker CMXRos Red (0,25 μM) i 30 min. Enkelt optiske skiver ble kjøpt på et spinnende diskmikroskop; sekvensiell oppkjøp; skala bar = 10 μm. (A) Levende HeLa celler farget med SG. (B)Levende HeLa celler farget med SG og deretter festet med 2% PFA i PBS for 30 min. (C) Live HeLa celler farget med SG, deretter festet med 2% PFA i PBS for 30 min og permeabilisert med 0,1% Triton X100 for 15 min. På det nedre panelet vises det samme bildet, men lysstyrken i den grønne kanalen er satt høyere. (D)HeLa celler festet med 2% PFA, permeabilisert med 0,1% Triton X100 for 15 min, og deretter farget med SG og Mitotracker CMXRos Red. For å skaffe bildene vist i (D), ble EMCCD-gevinsten av kameraet for den grønne kanalen redusert med en faktor på 12 i forhold til A-C for å unngå overeksponering. Dette tallet er endret fra Jevtic et al.27. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Nucleoid sporing på live SIM-bilder. Representative bilder av et synsfelt av SG-fargede celler. Bunn: SIM-bildet med to farger tatt før oppkjøpet av time lapse-serien. Grønn = SG-kanal; magenta = mitotracker kanal. Topp: nukleoid spor fra en 50-ramme SIM tidsserie i SG-kanalen (Film 1); rammetid = 1,8 s; sporing av Imaris 8.4.1 programvare. Spor er fargekodet av maksimal sporhastighet (μm / s); Elyra PS.1, SIM-modus, 100x/1,46 Oljemål; Skala bar = 10 μm. Dette tallet er endret fra Jevtic et al.27. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Movie 1
Film 1: SIM-serien forfaller serier som viser representative SG-fargede celler. Skala bar = 5 μm. Oppdagede mitokondriekjerner er merket som hvite kuler. Sporene visualiseres som "Dragon tails" (8 rammer lengde) og fargekodet i henhold til deres maksimale instant hastigheter (fargelinjen nederst til høyre viser hastigheter i μm / s). Mitokondrie nukleoider sporing og visualisering av Imaris 8.4.1 programvare. Denne videoen er publisert i Jevtic et al.27. Vennligst klikk her for å se denne videoen (Høyreklikk for å laste ned).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Det er flere kritiske komponenter i protokollen: For å oppnå fortrinnsrett merking av mitokondrie DNA, konsentrasjonen av DNA bindende fargestoff under inkubasjon bør holdes svært lav (f.eks. en 1:10,000 fortynning av en typisk kommersiell lager), og inkubasjonstiden bør være 30 min. Inkubasjonstiden skal aldri overstige 1 t. SYBR Gold fargestoff bør brukes; andre DNA-bindende fargestoffer er ikke lyse nok til å generere et sterkt signal ved merking ved lav konsentrasjon.

Begrensningen av vår protokoll er at fargestoffet vaskes ut fra mitokondriekjernene under et permeabiliseringstrinn. Derfor er den beskrevne prosedyren ikke egnet for konvensjonelle immunfluorescensprotokoller. I dette tilfellet kan nukleoider i faste celler effektivt merkes med andre teknikker, for eksempel antistoffer mot DNA eller mitokondrietranskripsjonsfaktorer (TFAM).

Direkte merking av mitokondriekjerner med DNA-binding organisk fargestoff har fordeler over fluorescerende protein merking: enhver type celle kan merkes innenfor < 1 h, uten temporal eller andre begrensninger av forbigående eller stabilt uttrykk for fluorescerende protein-konstruksjoner. Også i gjeldende protokoller ble konvensjonell fluorescerende proteinmerking av TFAM rapportert å forårsake gjenstander. Videre flekker SG effektivt nukleoider bare hvis mitokondriemembranpotensialet er intakt. Dette forhindrer bildeoppkjøp av biologisk irrelevante "syke" og døde celler, som ikke kan unngås med FP-basert farging. Til slutt oppnådde tidligere publiserte protokoller basert på DNA-bindende fargestoffer ikke fortrinnsrett farging av mitokondrie-DNA.

Den foreslåtte protokollen er rask og enkel, og derfor antar vi at den vil bli mye brukt til levende avbildning av mitokondriekjerner av ulike fluorescensteknikker, både diffraksjon begrenset (f.eks. laserskanning confocal, TIRF, etc.) samt superoppløsning SIM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne anerkjenner Asifa Akhtar og Angelika Rambold (både Max Planck Institute for Immunobiology and Epigenetics) for å gi HeLa-celler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Elyra PS1 Carl Zeiss multi-modal super-resolution microscope containing module for super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM)
High glucose DMEM GIBCO/ThermoFisher 31966021
ibidi 35 mm dish, glass bottom Ibidi Gmbh 81158
ibidi 8-well microSlide, glass bottom Ibidi Gmbh 80827
Imaris 8.4.1 Bitplane/Oxford Instruments image porcessing and visualisation software package
iXon 885 Andor Technologies EMCCD camera with back-illuminated sensor
LSM880 Airyscan Carl Zeiss laser scanning confocal microscope with array detector
Mitotracker CMXRos Red ThermoFischer M7512 red live cell mitochondrial stain
Mitotracker Deep Red FM ThermoFischer M22426 far red live cell mitochondrial stain
picoGreen ThermoFischer P7581 cell permeant DNA stain
Plan Apochromat 100x/1.46 Oil objective Carl Zeiss
SYBR Gold ThermoFischer S11494 cell permeant DNA stain
Zen Black 2012 software Carl Zeiss image acquisition and processing software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kaufman, B. A., et al. The mitochondrial transcription factor TFAM coordinates the assembly of multiple DNA molecules into nucleoid-like structures. Molecular Biology of the Cell. 18, (9), 3225-3236 (2007).
  2. Farge, G., et al. Protein sliding and DNA denaturation are essential for DNA organization by human mitochondrial transcription factor A. Nature Communications. 3, 1013 (2012).
  3. Bogenhagen, D. F. Mitochondrial DNA nucleoid structure. Biochimica et Biophysica Acta. 1819, (9-10), 914-920 (2012).
  4. Kang, D., Kim, S. H., Hamasaki, N. Mitochondrial transcription factor A (TFAM): roles in maintenance of mtDNA and cellular functions. Mitochondrion. 7, (1-2), 39-44 (2007).
  5. Tauber, J., et al. Distribution of mitochondrial nucleoids upon mitochondrial network fragmentation and network reintegration in HEPG2 cells. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45, (3), 593-603 (2013).
  6. Garrido, N., et al. Composition and dynamics of human mitochondrial nucleoids. Molecular Biology of the Cell. 14, (4), 1583-1596 (2003).
  7. Pernas, L., Scorrano, L. Mito-Morphosis: Mitochondrial Fusion, Fission, and Cristae Remodeling as Key Mediators of Cellular Function. Annual Review of Physiology. 78, 505-531 (2016).
  8. Caielli, S., et al. Oxidized mitochondrial nucleoids released by neutrophils drive type I interferon production in human lupus. Journal of Experimental Medicine. 213, (5), 697-713 (2016).
  9. Okayama, S., Ohta, K., Higashi, R., Nakamura, K. Correlative light and electron microscopic observation of mitochondrial DNA in mammalian cells by using focused-ion beam scanning electron microscopy. Microscopy (Oxf). 63, (Suppl 1), i35 (2014).
  10. Alan, L., Spacek, T., Jezek, P. Delaunay algorithm and principal component analysis for 3D visualization of mitochondrial DNA nucleoids by Biplane FPALM/dSTORM. European Biophysics Journal. 45, (5), 443-461 (2016).
  11. Kukat, C., et al. Super-resolution microscopy reveals that mammalian mitochondrial nucleoids have a uniform size and frequently contain a single copy of mtDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, (33), 13534-13539 (2011).
  12. Kukat, C., Larsson, N. G. mtDNA makes a U-turn for the mitochondrial nucleoid. Trends in Cell Biology. 23, (9), 457-463 (2013).
  13. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, (5793), 1642-1645 (2006).
  14. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3, (10), 793-795 (2006).
  15. Benke, A., Manley, S. Live-cell dSTORM of cellular DNA based on direct DNA labeling. ChemBioChem. 13, (2), 298-301 (2012).
  16. Ishigaki, M., et al. STED super-resolution imaging of mitochondria labeled with TMRM in living cells. Mitochondrion. 28, 79-87 (2016).
  17. Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348 (2015).
  18. Gustafsson, M. G., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophysical Journal. 94, (12), 4957-4970 (2008).
  19. Hirano, Y., Matsuda, A., Hiraoka, Y. Recent advancements in structured-illumination microscopy toward live-cell imaging. Microscopy (Oxf). 64, (4), 237-249 (2015).
  20. Brown, T. A., et al. Superresolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction. Molecular and Cellular Biology. 31, (24), 4994-5010 (2011).
  21. Lewis, S. C., Uchiyama, L. F., Nunnari, J. ER-mitochondria contacts couple mtDNA synthesis with mitochondrial division in human cells. Science. 353, (6296), aaf5549 (2016).
  22. Dellinger, M., Geze, M. Detection of mitochondrial DNA in living animal cells with fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 204, (Pt 3), 196-202 (2001).
  23. Ban-Ishihara, R., Ishihara, T., Sasaki, N., Mihara, K., Ishihara, N. Dynamics of nucleoid structure regulated by mitochondrial fission contributes to cristae reformation and release of cytochrome c. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, (29), 11863-11868 (2013).
  24. Zurek-Biesiada, D., et al. Localization microscopy of DNA in situ using Vybrant((R)) DyeCycle Violet fluorescent probe: A new approach to study nuclear nanostructure at single molecule resolution. Experimental Cell Research. 343, (2), 97-106 (2016).
  25. He, J. Y., et al. The AAA(+) protein ATAD3 has displacement loop binding properties and is involved in mitochondrial nucleoid organization. Journal of Cell Biology. 176, (2), 141-146 (2007).
  26. Ashley, N., Harris, D., Poulton, J. Detection of mitochondrial DNA depletion in living human cells using PicoGreen staining. Experimental Cell Research. 303, (2), 432-446 (2005).
  27. Jevtic, V., Kindle, P., Avilov, S. V. SYBR Gold dye enables preferential labeling of mitochondrial nucleoids and their time-lapse imaging by structured illumination microscopy. PLoS One. 13, (9), e0203956 (2018).
Spesifikk merking av mitokondrienukleoider for tidsforløp strukturert belysningsmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jevtic, V., Kindle, P., Avilov, S. V. Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy. J. Vis. Exp. (160), e60003, doi:10.3791/60003 (2020).More

Jevtic, V., Kindle, P., Avilov, S. V. Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy. J. Vis. Exp. (160), e60003, doi:10.3791/60003 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter