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Biochemistry

低分子阻害剤スクリーニングのためのNADH結合ATPaseアッセイの半高スループット適応

doi: 10.3791/60017 Published: August 17, 2019

Summary

ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)結合ATPaseアッセイは、低分子ミオシン阻害剤の半高スループットスクリーニングに適合した。この運動アッセイは、384ウェルマイクロプレートフォーマットで実行され、総反応量はウェルあたりわずか20μLです。プラットフォームは、事実上すべてのADP産生酵素に適用可能でなければなりません。

Abstract

ATPase酵素は、アデノシン三リン酸に蓄積されたフリーエネルギーを利用して、自然に発生しない生体内生化学的プロセスの多種多様を触媒します。これらのタンパク質は、代謝、細胞分裂、環境変化や動きへの応答を含む、本質的に細胞生活のすべての側面に不可欠です。ここで提示されるプロトコルは、低分子ATPase阻害剤の半高スループットスクリーニングに適合したニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)結合ATPaseアッセイについて説明する。このアッセイは、原理の証明として、心臓および骨格筋ミオシンII、2つのアクチン系分子運動ATPasesに適用されている。ATPの加水分解は、アッセイ中の酵素反応によるNADHの酸化に結合する。まず、ATPaseによって生成されたADPは、ピルビン酸キナーゼ(PK)によってATPに再生される。PKは、リンフェノールピルビン酸(PEP)からピルビン酸への移行を並行して触媒する。続いて、ピルビン酸は乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)によって乳酸に減少し、これはNADHの酸化を並行して触媒する。したがって、ATP濃度の低下は、NADH濃度の低下と直接相関し、それに続いてNADHの本質的な蛍光への変化が続く。PEPが反応系で利用可能である限り、ADP濃度は非常に低いままで、独自の製品によるATPase酵素の阻害を回避する。さらに、ATP濃度はほぼ一定のままであり、線形時間コースを生み出します。蛍光は連続的に監視され、データの品質を容易に推定でき、潜在的なアーティファクト(例えば、化合物の沈殿や熱変化に起因する)をフィルタリングするのに役立ちます。

Introduction

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ミオシンは、真核生物1、2のアクチン細胞骨格のフィラメントに沿って方向運動を生成するためにアデノシン三リン酸(ATP)を加水分解するメカノケミカルエネルギートランスデューサである。それらは、オルガネラの輸送、筋肉収縮または細胞骨格緊張1、2の生成のような様々な細胞内機能に構造的およびキネチ的に適応している。ミオシンスーパーファミリーは、ヒトゲノム3、4における〜12個の異なるミオシンクラスに属する〜40個のミオシン遺伝子によって表される。ミオシンクラスのメンバーは、いくつかの癌、神経障害、骨格筋症、肥大型心筋症5、6などの非常に多様な疾患のセットで様々な役割を果します。これらの分子モータの生理的・病理学的機能が多いため、様々な条件7の薬剤標的としてますます認知されるようになっているのは驚くべきことではない。最近、新しいミオシン阻害剤8、9、10および活性化剤11の発見において著しい進歩がなされ、既存のものの特性を改善する12、13歳,14歳,15.

ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)結合ATPaseアッセイは、長い間、サルコプラズマ網状Ca2+ポンプATPase16、DNA修復ATPase Rad54 17、AAA+ などの様々な酵素のATPase活性を測定するために使用されてきました。ATPase p9718または微小管モーターキネシン19.アッセイはATP再生サイクルを採用しています。ATPaseによって生成されたアデノシン二リン酸(ADP)は、ピルビン酸キナーゼ(PK)によってATPに再生され、1分子のホスホエノールピルビン酸(PEP)を平行にピルビン酸に変換します。続いて、ピルビン酸は乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)によって乳酸に還元される。つまり、NADHの1分子をNADに酸化する。従って、時間の関数としてのNADH濃度の低下はATP加水分解速度に等しい。ATP再生サイクルは、PEP が使用可能である限り、ATP 濃度をほぼ一定に保ち、ADP 濃度を低くします。これは、線形時間コースで、初期反応速度を決定することが容易になり、ADP19による製品阻害を回避するのに役立ちます。NADH結合ATPaseアッセイは既に96ウェルフォーマット20に適合していますが、反応量が多い(約150μL)ため、試薬の需要が高いため比較的高価であり、多数の高速スクリーニングに対応しにくくなります。化合 物。ATPase酵素によって産生されるリン酸塩の検出に依存するマラカイトグリーンアッセイ19、21などの代替方法は、小型化およびハイスループットスクリーニング22に適っていることが証明された。,23歳,24.しかし、エンドポイントアッセイは、フルタイムのコースがない場合に未発見のままであるいくつかのアーティファクト(以下で説明)の影響を受ける可能性が高いです。

ここで、NADH結合ATPaseアッセイは、低分子阻害剤の半高スループットスクリーニング用に最適化されている。骨格および心筋ミオシンIIとミオシン阻害剤ブレビスタチン8、パラ-アミノブルビスタチン13およびパラ-軽トブルビスタチン12は、NADHに依存するアッセイの力を実証するために使用される読み出しとしての蛍光。このプロトコルは、任意のADP産生酵素に焦点を当てたプロジェクトをスクリーニングするのに適しています。

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Protocol

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1. ストックソリューションと試薬の準備

  1. 蒸留水中の結晶性DTTを1000mMの最終濃度に溶解することにより、ジチオスレイトール(DTT)ストック溶液を調作する。1 M NaOH 溶液で pH を 7.0 に調整します。アリコットと-20 °Cで保存します。
  2. 結晶性ATPを蒸留水中に溶解してATPストック溶液を100mMの最終濃度に調出す。1 M NaOH 溶液で pH を 7.0 に調整します。アリコットと-20 °Cで保存します。
  3. 70 mM 3-(N-モルフォリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)を含む10x NADHバッファーを調製し、10mM MgCl 2、0.9mMエチレングリコールビス(β-アミノエチルエーテル)-N、N、N、N、N'-四重酢酸(EGTA)、および3mMNaMを調製する。1 M NaOH 溶液で pH を 7.0 に調整します。4 °Cで保存します。
  4. 10 mM MOPS および 0.1 mM EGTA を含む 1x ミオシン バッファーを準備します。1 M NaOH 溶液で pH を 7.0 に調整します。4 °Cで保存します。牛血清アルブミン(BSA)とDTTを最終濃度0.1%(w/v%)使用前にそれぞれ1mMです。
  5. 4 mM MOPS、0.1 mM EGTA、2 mM MgCl2、および 3 mM NaN3を含む 1x アクチン バッファを準備します。1 M NaOH 溶液で pH を 7.0 に調整します。4 °Cで保存します。BSA と DTT を最終的な濃度に 0.1% (w/v%)使用前にそれぞれ1mMです。
  6. 結晶性NADHを10倍のNADHバッファーに溶解して、5.5mMの最終濃度に溶解してNADHストック溶液を調作します。アリコットと-20 °Cで保存します。
  7. 結晶性PEPを10倍のNADHバッファーに溶解して50mMの最終濃度に溶解してPEPストック溶液を調出す。アリコットと-20 °Cで保存します。
  8. グリセロールと10倍のNADHバッファー(50%:50%)の混合物に凍結乾燥LDH粉末を溶解することにより、LDHストック溶液を調作する2000 U/mL の最終濃度に。未溶解タンパク質を除去する溶液を遠心分離する(7,197 x g、20°C、10分)。上清を清潔な遠心管に慎重に移します。アリコットと-20 °Cで保存します。
  9. グリセロールと10x NADHバッファー(50%:50%)の混合物に凍結乾燥PK粉末を溶解することにより、PKストック溶液を調作10000 U/mL の最終的な濃度に。未溶解タンパク質を除去する溶液を遠心分離する(7,197 x g、20°C、10分)。上清を清潔な遠心管に慎重に移します。アリコットと-20 °Cで保存します。
  10. 凍結乾燥した心臓および骨格筋ミオシンIIサンプルを100μL蒸留水を添加して再構成し、それぞれ〜37.9 μMおよび〜40.8 μMミオシン濃度(モノメリック)に対応する10mg/mLストック溶液を得た。詳細については、製造元の説明を参照してください。
  11. パルディーおよびスプディッチ25によって説明されるウサギの筋肉アセトン粉末からF-アクチンを調製する。

2. 低分子阻害剤のATPase活性と阻害効果の測定

  1. 複合プレートを調べます。
    1. 高品質ジメチルスルホキシド(DMSO)に関心のある化合物を溶解する。
    2. DMSOの10 mM化合物濃度から始まる15ステップのシリアル1:2希釈を作成します。
    3. マルチチャンネルピペットを使用して、サンプルを384ウェルポリプロピレンプレート(各12.5μL)に移します。1 つのコンパウンド (3 列ではなく) に対して複合プレート上の 2 つの行を使用して、エッジ効果の影響を受ける可能性のあるウェルの数を最小限に抑えます。各化合物の 2 行目の最後の 3 つのウェルを負のコントロールとして使用します (DMSO のみ)。複合希釈には、プレート上の最初と最後の行を使用しないでください。
    4. 純粋な DMSO を最初の行のウェルに転送します(NADH キャリブレーション用に予約)。
    5. 最後の行を正のコントロールに使用します。
      注:DMSOにおける4mM濃度でのパラ-アミノブルビスタチンをここで用いた。
  2. アクチンバッファー内のアクチンストック溶液を希釈することにより、各アッセイプレート(384ウェル黒壁ポリスチレンマイクロプレート)に対して20μM希釈アクチン溶液の4500μLを調製する。5 mLピペットを使用して上下30xをピペットで完全に混合し、アクチンフィラメントを破ることによって粘度と不均一性を低減します。沈殿したタンパク質を除去する溶液を遠心分離し(7,197 x g,20°C,10分)。上清を清潔な遠心管に慎重に移します。
  3. LDHおよびPK酵素を含有するマスターミックス(「酵素ミックス」)を調製する。各アッセイプレートについて、171.4 μLのLDH溶液、171.4 μLのPK溶液、3189.3 μLまたは3252.9 μLのミオシンバッファーを組み合わせて、それぞれ15mLの円錐遠心管で心臓または骨格筋ミオシンIIを含むアッセイを行います。凝集と沈殿を避けるために、この時点でミオシンを追加しないでください。
  4. すべての基板を含むマスターミックス(「基板ミックス」)を調記します。各プレートについて、ATPの162.1 μL、PEPの162.1 μL、NADH溶液の324.1 μLを15 mLの円錐遠心管に組み合わせます。凝集と沈殿を避けるために、この時点でアクチンを追加しないでください。
  5. 250 μM から始まるキャリブレーション用の NADH の 7 ステップのシリアル 1:2 希釈を作成します。
    1. 1.5 mLマイクロ遠心管に257.7 μLのミオシンバッファーを含むNADHストック溶液の12.3 μLを混合します。
    2. アリコート135 μLのミオシンバッファーを7つの1.5 mLマイクロ遠心分離管に入れる。
    3. 第1管から溶液の135μLを第2管に移し、ピペッティングで混合します。7番目のチューブに到達するまで繰り返します。
    4. 最後のチューブを NADH コントロールなし (バッファーのみ) として使用します。
  6. 8チャンネルピペットを使用して、NADHキャリブレーションソリューションの20 μLを三つ編みのアッセイプレートの最初の行に転送します。
  7. 酵素混合物に68 μLの心臓または4.2 μLの骨格筋ミオシンIIを加える。渦は簡単に
  8. 最初の行を除き、調製されたミオシン酵素ミックスの8.4 μLを自動ディスペンサーを用いてアッセイプレートの各ウェルに分配する。
  9. 100 nLピンツールヘッドを装備した自動液体処理システムを使用して、化合物プレートから酵素ミックスを含むアッセイプレートに100 nLの溶液を移します。
  10. マイクロプレートシェーカーを使用して、室温で1分間1分間アッセイプレートを振ります。
  11. 基板ミックスに遠心アクチン溶液の4,052 μLを添加します。渦は簡単に
  12. アクチン基板の11.6 μLをアッセイプレート(第1列を除く)の各ウェルに分配し、自動ディスペンサーを使用して酵素反応を開始します。
  13. マイクロプレートシェーカーを使用して、室温で1分間1分間アッセイプレートを振ります。
  14. アッセイプレートを101 x gで30sで遠心分離します。
  15. プレートリーダーの内部温度が25°Cで安定していることを確認してください。プレートをロードし、別の30sのために振ります。この揺れステップは、各井戸で液体表面の形状を同様にするために必要であり、プレートが測定温度に達する時間を可能にします。
  16. 45秒間隔でプレートをスキャンする30分間NADH蛍光を記録します。380 nm、10 nm 帯域幅励起フィルタ、470 nm、24 nm 帯域幅発光フィルタを 425 nm カットオフダイクロイック ミラーと組み合わせて使用します。高濃度モードで測定を実行します。アッセイを実行する前に、フラッシュ、検出器ゲイン、プレート寸法、測定高さの数を最適化します。
    注:最終アッセイ条件は、300 nM心臓/20 nM骨格筋ミオシンII、10 μMアクチン、40 U/mL LDH、200 U/mL PK、220 μM NADH、1 mM PEP、1mM ATP、1mM ATP 1mM MOPSを含むバッファー内の1mM ATPです(pH = 7.0)、2MMMMg、0.15 mM EGTA、0.1 mg/mL BSA、0.5% (v/v) DMSO および 1 mM DTT.総容積は20 μL/ウェルである。最も高い最終化合物濃度は、0.5%DMSOで50 μM. 20 μMパラ-アミノーブルビスタチンであり、0.5%DMSO単独で負の対照である。すべての測定は三つ三度で行われる。

3. データの分析

  1. 観察された蛍光強度を各ウェルの時間に対してプロットします。
  2. 単純な線形回帰を実行して、各ウェルの蛍光応答の傾きと切片を決定します。勾配は ATP (NADH) 消費率に比例し、インターセプトは測定開始時の NADH 濃度に比例します(t = 0 s)。
  3. NADHの濃度に対してプレートの最初の行で得られたインターセプトをプロットすることにより、NADHのキャリブレーション曲線を構築します。インターセプトが NADH 濃度に直線的に依存していることを確認します。
    注: インターセプトは、t = 0 s で実際の蛍光強度を推定し、t ≥ 0 s で読み取る生蛍光強度の平均よりもはるかに信頼性が高くなります。
  4. 単純な線形回帰を実行して、NADH キャリブレーションラインの勾配と切片を取得します。
    注:インターセプトは蛍光バックグラウンド信号(NADHは存在しない)を記述し、傾斜は特定の実験における1M NADH溶液の外挿/理論蛍光強度に対応します。
  5. 残りのウェルで得られた蛍光応答の傾きをNADHキャリブレーションラインの傾きで除算し、蛍光変化をATP消費率に変換します。
  6. ATP 消費率を阻害剤の濃度に対してプロットします。
  7. 阻害定数を決定するには、適切な統計ソフトウェアを使用して、単純な 1 対 1 結合平衡モデルに対応する次の二次方程式に線量応答データを適合します。
    Equation 1
    ここでYはATP消費率であり、Yは阻害剤の不在の中でATP消費率であり、Ymaxは100%阻害で理論的なATP消費率であり、KIは阻害定数である。 ,,〔E〕t及び[I]tは、それぞれ酵素(ミオシン)及び阻害剤の総濃度である。

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Representative Results

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スクリーニング実験に使用される一般的なプレートレイアウトマップを図 1に示します。最初と最後の行は、NADHキャリブレーションと正の制御(20 μMパラ-アミノーブルビスタチン、0.5%DMSO)のためにそれぞれ予約されています。残りの行(BからO)は、化合物の阻害活性をテストするために使用されます。ここで、DMSO中の10mM化合物濃度から始まる15ステップの連続1:2希釈を調製し、化合物プレートからアッセイプレートに転送し、アッセイプレート上で最も高い最終化合物濃度が50μM(0.5%DMSO)であることを確認する。1つの化合物(48データポイント/化合物)の線量応答曲線を得るために2つの行が使用されます。プレート レイアウト マップは、特定のプロジェクトの特定の目的をサポートするように再設計できることに注意してください。たとえば、多数の化合物の単一点スクリーニングデータを取得する場合、1 つの 384 ウェル プレートで 112 個の化合物をテストし、同じレイアウトを使用して正の制御と NADH キャリブレーションを行うことができます(各化合物の三点数を計算します)化合物)。これらのデータポイントはエッジ効果の影響を受ける可能性があるため、1 つの化合物 (または各濃度) に対して最低 3 つのデータポイントを持ち、プレートのエッジに沿ったウェルのみを使用しないようにすることをお勧めします。エッジ効果の重要性を推定するには、常に負のコントロールを持つフル プレートを最初に実行します。

蛍光強度は、図2Aに示すようにNADHの濃度に線形依存している。線形フィットの傾きは、蛍光変化を反応速度に変換するためにデータ解析中に使用されます。なお、NADHキャリブレーションの各ウェルについて得られた生蛍光強度トレースは、まず線形回帰により分析される(化合物データについては図2B、Cに同様の分析が示されている)。これらの痕跡は、蛍光体の光漂白による時間の経過とともに指数関数的な減衰を示す見込みです。しかし、光漂白は非常に遅いため、生データは線形フィットによって分析することができます。これらの適合物の傾きおよび迎撃は、それぞれt=0sでの光漂白の初期速度および蛍光強度に対応する。これらの線形フィットの迎撃は、より多くのデータに基づいて推定されるため、関連する誤差がはるかに小さいため、NADHキャリブレーション曲線を構築するために、t = 0 で読み取られる生蛍光の平均の代わりに使用されます。

図2B、Cは、使用されるミオシンまたは阻害剤の存在にかかわらず、時間コースが測定の時間枠において線形であることを示す。ここでの最も高い(50 μM)および最低(0 μM)阻害剤濃度は、それぞれ〜100%および0%の阻害に対応する。生データの量により、1つのパネルに表示すると、実際の分析はカオスに見えることになります。したがって、これらのパネルは、プロセスをより良く視覚化するために簡素化されています。生蛍光強度読み取りの平均は、すべての並列実験(各濃度の三極化)について計算し、ここでNADH濃度に変換した。阻害剤濃度は3つだけが示されている。実際の分析では、各生蛍光強度トレース(48/化合物試験)は、最初に線形回帰によって分析され、その後、傾斜角はATP消費率に変換されます。

それぞれ、骨格および心筋ミオシンIIの図2Dおよび図2Eに示すように、反応速度が酵素濃度に比例して変化することを示すことを常に推奨する。線形適合に基づいて、酵素の最終アッセイ濃度を容易に推定することができる。たとえば、30 分の時間コースでは、~5 x 10-8 Ms-1の反応速度を推奨します。活性化剤が反応混合物(ここでアクチンなど)に使用される場合、期待される効果(活性化)が存在することを確実にするために、活性化剤の有無の両方で実験を実行することをお勧めします。条件と手順は、可能な限り最終的なプロトコルに従う必要があります。ここで、ミオシンの希釈シリーズを、まず8マイクロ遠心管中のミオシンバッファーに調製した。続いて、LDHとPK酵素の混合物を添加した。最後に、反応は、マルチチャネルピペットを使用して、各チューブに基板ミックスを並列に加えることによって開始された。反応ミックスは、直ちに三量体中のアッセイプレートの1行に転移した。アクチンが存在しない場合は、代わりにアクチンバッファーが使用された。他のパラメータは変更されませんでした(最終アッセイ条件については、プロトコルのステップ2.16の注記を参照してください)。

図2Fは、複数の負および陽性対照反応(それぞれ半プレート)について得られたATP消費率を示す。これらのデータは、高スループットアッセイの品質を推定するために広く使用されている統計パラメータであるZ値または「スクリーニングウィンドウ係数」26に基づいて比較することができる。平均値と標準偏差の両方を考慮して、正と負のコントロールを比較します。

Equation 2,

ここで、σ n、σ pおよびμn、μ pは、それぞれ負と正のコントロールの標準偏差と平均値です。Z の値が 0.5 と 1 の間にある場合、2 つの母集団は十分に分離されます。ここで得られたZ'=0.78は、アッセイが優れた26と考えることができることを示している。

アッセイが阻害定数を決定するために使用できることを実証するために、低分子ミオシン阻害剤ブレビスタチン8と2つの類似体、パラ・ニトロブルビスタチン12およびパラ・アミノブルビスタチン13は、図 3Aおよび図 3Bに示すように、ここで選択されています。ブレビスタチンは、競争力のない、アロステリックミオシン阻害剤27、28である。ブレビスタチンの1分子は、ミオシンの1つの運動ドメインに結合し、ミオシン-ADP-リン酸複合体27、28を安定化させることによってATPaseサイクルをブロックする。したがって、ブレビスタチン誘導体の阻害効果は、ここで単純な1対1の結合モデルを用いてモデル化した(プロトコルのステップ3.7参照)。ATP 消費率がミオシン濃度に線形依存性を示していない場合は、このモデルは適用できない可能性があることに注意してください (図 2D,Eを参照)。ブレビスタチン、パラ・ニトロブビスタチンおよびパラ・アミノブルビスタチンの運動性水溶性は、それぞれ426μM、3.6μMおよび9.3 μMであることが報告されている。我々の実験で報告された溶解度の下で信号の異常は観察されなかった;しかし、図4に示すように、ブレビスタチンまたはパラ・ニトロブビスタチンのいずれかが報告された溶解度値を上回って使用された場合、いくつかのアーティファクトが現れた。従って、溶解度よりも高い濃度で記録されたシグナルは、これらの場合のデータ分析から除外した。パラ-アミノベルビスタチンは、非常に可溶性であり、したがって、溶解性は、その場合の制限因子ではなかった。

最後に、任意の肯定的なヒットの阻害効果が標的ATPase酵素に特異的であるかどうかをテストすることが常にお勧めします。結合反応システムは、LDHとPKの2つの他の酵素を採用し、これらのうちの1つを阻害すると偽陽性シグナルが生じる。無関係のATPase酵素を使用してATPaseアッセイを実行すると、これらの偽陽性ヒットをフィルタリングするのに役立ちます(さらなる推奨事項については、議論を参照してください)。パラ-アミノーブルビスタチンおよびアピラーゼは、ADPおよび無機リン酸塩29を産生するATP加水分解酵素を、図5に示すように、このような対照実験を実証する例として使用した。

Figure 1
図 1:アッセイプレートレイアウト。250 μM濃度から始まるNADHの7ステップ連続1:2希釈が調製され、その後、キャリブレーション(黒から緑の色勾配)のために三極A行に分配されます。行 A の最後の 3 つのウェルには、ミオシン バッファーのみが含まれています (NADH コントロールなし、白)。最後の行(P)は、正の対照(20 μMパラ-アミノーブルビスタチン;赤)に使用されます。典型的な用量応答実験では、2行(例えば、BおよびC)が必要です。したがって、7回の線量応答実験は、単一の384ウェルプレート上で並列に実行することができます(青から白色のグラデーションで表されます)。すべてのサンプルはトリプリケートとして読み込まれます。ここで、最も高い最終化合物濃度は50 μM(0.5%DMSO)から始まります。2 行ごとに最後の 3 つのウェルが負のコントロール用に予約されます (化合物なし、0.5% DMSO のみ、シアン)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図 2: 代表的なATPaseデータ。(A)NADHの2倍希釈シリーズを調製し、各測定板の1列目に移した。蛍光強度を30分間記録し、生データを単純な線形回帰により分析した。各回帰線の迎撃はNADHの濃度に対してプロットされた。理想的な場合には、t = 0 s の蛍光強度を単にキャリブレーションラインを得るために使用することができることに注意してください。しかし、生蛍光データは非常にノイズが多い一方で、インターセプトはt= 0 sで蛍光強度の正確な推定値を与え、関連する標準誤差(誤差バーとして示される)は非常に小さい。(B,C)骨格(B)および心臓(C)筋ミオシンII ATPase反応の代表的な蛍光強度トレースは、パラ-アミノーブルビスタチンの様々なレベル(インセットを参照)の存在下で記録された。わかりやすくするために、データ ポイントと誤差余数は、それぞれ 3 つの独立した測定値の平均と関連する標準偏差を表します。単純な線形回帰(実線)を行い、反応速度を得た。なお、典型的な用量応答実験は、測定プレート上の三重化における15種類の阻害剤濃度と陰性対照で構成され(図1参照)、線形回帰は蛍光ごとに個別に行われることに注意してください。強度トレース。わかりやすくするために、ここでは 3 つの異なる濃度のみを示します。(D,E)基底(赤)およびアクチン活性化(青)ATPase率は、様々な骨格(D)および心臓(E)筋ミオシンII濃度について決定した。ATPaseレートは、ミオシン濃度に線形依存性を示す。(F)正(赤)及び負(青)対照(ハーフプレート)を384ウェルアッセイプレート上で並列に実行し、Z因子(Z')を算出し、ATPaseアッセイの品質を評価した。Z の値 0.78 は、正と負のコントロールが非常によく分離された信頼性の高いアッセイを示します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図 3: 用量応答曲線と阻害定数の分析心臓(A)および骨格(B)筋ミオシンIIは、ブレビスタチン、パラアミノビスタチンおよびパラ軽骨ビスタチンの阻害活性を試験するために使用された。ATPaseレート(青色)は、生蛍光データに単純な線形回帰を適用することによって得られた。誤差バーはフィッティングの標準誤差を表し、単純な平衡結合モデル(赤色)を表す二次方程式のフィッティング時に重み付け係数として使用されました(プロトコルのステップ3.7を参照)。上記の溶解度を得たデータは、アーティファクトの影響を受け、分析から除外されました。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図 4:溶解性関連のアーティファクト。(A)骨格筋ミオシンIIを用いたATPaseアッセイで得られたブレビスタチンに対する蛍光強度トレースは、存在する阻害剤の量に応じて直線的に減少するシグナルを示す(青色)。しかしながら、ブレビスタチンを溶解度(50μM初期ブレビスタチン濃度)以上使用した場合、シグナルの増加(赤色)が認められ、明るい蛍光ブレビスタチン結晶13の形成に起因する可能性が最も高い。(B)ブレビスタチン12の非蛍光アナログであるパラ-ニトロブビスタチンの場合、生蛍光強度トレースは正常(減少)として現れた。しかし、阻害の最高レベルは予想よりもはるかに低かった(陽性対照に基づく)。従って、データ分析には溶解度(青色)以下で得られた反応速度のみが含まれていた。上記の溶解度(赤色)以上得られた反応速度は、決定された用量応答曲線(緑色)から発散し、沈殿が溶液中に残存する阻害剤の量(濃度)を制限するようにする。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図 5: の阻害効果パラ-骨格筋ミオシンIIおよびアピラーゼATPaseアッセイにおけるアミノーブルビスタチン。パラ-アミノーブルビスタチンは、1.7μMのKIで骨格筋ミオシンIIを阻害したが、アピラーゼ29が同じ結合反応系でATPaseとして使用された場合、阻害は検出されなかった。 この実験は、パラアミノベルビスタチンがミオシンに特異的であり、PKまたはLDHを阻害しないことを明確に示し、したがって検出された阻害効果はアーティファクトではない。アピラーゼは0.5nM濃度で使用した。ミオシンまたはアクチンは存在しなかったし、反応は100 mM MOPS(pH= 7.0)、3 mM CaCl 2、2 mMMgCl 2、3 mM NaN3、1mM DTT、および0.1%BSAを含むバッファーで行った。プロトコルに対するその他の変更は行われなかった。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

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プロトコルの重要な手順

負の制御のみで複数のプレートを実行することにより、プレートレイアウトを最適化します(阻害剤を使用しないATPase反応)。反応速度のパターンについては、結果を注意深く検査してください。例えば、「非結合」プレートの親水性表面コーティングにおけるエッジ効果および/または欠陥から生じてもよい。パターンが観察される場合は、アーティファクトを最小限に抑えるためにプレートの種類やプレートのレイアウトを変更します。例えば、典型的な用量応答曲線(三重を有する16濃度、合計48点)は、384ウェルプレート上の3列または2列に配置することができる。これらの配置により、それぞれ 6 と 4 のデータ ポイントが生成され、エッジ効果の影響を受ける可能性があります。したがって、行の配置は常に優先されます。

変更とトラブルシューティング

観察された蛍光応答は、反応のフルタイムコース全体を通して線形でなければならないことに注意してください。非線形性は、熱変化のために最初の数分で、または平衡に達するために最後の数分で発生する可能性があります。非線形性が存在する場合は、反応パラメータ(例えば、ミオシンの希釈、測定温度の変化)を調整するか、単に分析をデータの線形部分に制限することができます。

ATPase酵素への阻害剤の結合が遅い(数分にわたって起こる)場合、非線形性はまた、反応の開始時に存在してもよい。この場合、酵素阻害剤複合体が蓄積するにつれて、反応は時間の経過とともに減速することが予想される。この問題を回避するために、必要に応じて基板ミックスを追加する前にアッセイプレートをインキュベートします。

アッセイ条件は、反応の線形部分が15分より長くなるように選択する必要があります。短い線形部品は、プレート全体のスキャンに約 45 秒かかるため、あまり役に立たないデータポイント (<20) に対応します。したがって、線形フィットは、はるかに高い標準的な誤差を伴う信頼性の低い勾配(反応速度)を得る。一方、運動読み取りは~120分より長く取得することはお勧めしません。このような実験は、溶媒蒸発によるタンパク質の変性または濃度変化の影響を受ける可能性があります。これらの基準は、ミオシン濃度を調整することによって最も容易に満たすことができる。

PKおよびLDHによって触媒された反応が結合反応系でレート制限されていないことを確認することが重要です。目的のATPaseなしで、または強力なATPase阻害剤の高レベルで行われる対照実験は、全く(またはほとんど)活性を示さないであろう。ただし、ADP を追加すると、LDH と PK がアクティブで正常に動作すると、信号が急激に減少します。この対照実験ではNADHの消費率が非常に高いと予想されているので、ADPの添加により反応が開始された後、できるだけ早く検出を開始することが重要です。

阻害剤の溶解度を超えて得られる観察されたATPaseレートをデータ分析から除外することが常にお勧めします。溶解度は、化合物の温度、純度、および溶液の組成の違いに依存するので、実際の条件(温度、バッファーなど)と非常によく似た条件で測定することを強くお勧めします。ATPaseアッセイが行われます。可溶性以上の低分子阻害剤を使用しようとすると、結果に影響を与える可能性のある沈殿をもたらす可能性があります(図4参照)。沈殿は、溶解度に近い化合物の濃度を制限します。したがって、ATPase率は、より多くの阻害剤を添加することによってさらに低減することができない。~100%阻害を示す良好な陽性対照を使用すると、溶解性が不明であっても、シグナル中のこのような異常を同定するのに役立つ。フィッティングによって決定される最大阻害レベル(I max)に属する陽性対照の観察された反応速度と反応速度との間の大きな差は、常に問題の良好な指標である。このような場合には、分析から徐々に多くのデータを除外したり、ポジティブコントロールを使用して最大にして、フィッティングプロセス中に固定しておき、より良いフィット感が得られるまで固定しておく必要があります。阻害剤の沈殿はまた、強い光散乱をもたらす可能性があり、また、阻害剤の光学特性を変化させる可能性があり、反応の開始時に異常に高い観測信号強度および/または時間の経過とともに信号を増加させる。生データは常に慎重に検査し、影響を受ける濃度を分析から除外する必要があります。

メソッドの制限事項

低い回転数を有するATPasesの最終的なアッセイ濃度(例えば、心筋ミオシンII)は、アッセイの時間枠内で測定可能な反応速度(30−120分)を達成するために高くなければなりません。したがって、線量応答曲線の解析には二次結合モデルを使用することが重要な場合があります。他の結合モデル(双曲線、ヒル)は、通常、そのようなデータの分析には適していません。また、ATPaseの濃度は、KIが近いかそれ以下の場合に実験誤差の存在のために実際には線量応答曲線が区別できないため、測定可能な阻害定数の範囲に下限を設定する。ATPaseの濃度。

化合物ポテンシーの違いは、用量応答実験を行い、阻害定数を決定することによって常に定量化されるべきである。単一点スクリーニングデータは理論上のこれらの違いを反映していますが、応答の非線形性と実験誤差を伴って、そのような分析を行うことが非常に困難になります。単一点スクリーニング実験は、適切な阻害剤濃度と、活性と不活性を区別するために事前に定義された閾値応答レベルを選択することにより、比較的弱い阻害剤を高い信頼度で捕捉するように設計されるべきである。化合 物。

阻害定数の差が統計的に有意であることを立証することは、非線形回帰の方程式を書き直して、KIの代わりにpK I(-logK I)を決定することによって最も良い結果を出すのが最もい。KI30ではないが、正規分布している。pKIの不確実性は対称ですが、KI31では対称ではありません。信頼区間はpKIに対して計算することができ、t検定または分散の分析(ANOVA)を使用して、pKI測定値の平均が有意に異なるかどうかを判断することができます。ただし、このような統計検定を実行する場合は、同種(グループ内のデータの同じ分散)を想定して行う場合は注意が必要です。化合物の溶解性の問題のために完全な用量応答曲線が得られない場合、pKIに関連する高い分散が期待できます。この場合、等分散を想定していない他の適切な統計検定(例えば、ウェルチのt検定)を使用する必要があります。

PKまたはLDHを阻害する化合物は、NADH結合ATPaseアッセイにおいて偽陽性シグナルを与えるであろう。これらの偽陽性のいくつかは、無関係なADP産生酵素でアッセイを実行することによって同定することができる。この場合、阻害剤が両方の酵素に結合するATP類似体でない限り、実際の陽性ヒットの阻害は期待できない。このような分析を実証するために、ミオシンに関連しないATP加水分解酵素であるパラアミノブリスタチンとアピラーゼを用いたATPaseアッセイを行った(図5参照)。あるいは、目的の酵素に特異的な異なる機能アッセイ、またはPKおよびLDHを採用しない別のATPaseアッセイを実行して、実際の陽性ヒットと偽陽性ヒット(例えば、マラカイトグリーンアッセイ)を区別することができる。

すべてのウェルにおける蛍光強度の運動学の測定と分析には、プレート全体を約90−60秒未満でスキャンするのに十分な速さのプレートリーダーが必要です。

既存/代替方法に関する方法の意義

「従来の」吸光度ベースの読み出し16、17、18、19、20とは対照的に、ここで提示される改変NADH結合ATPaseアッセイはNADH蛍光に依存する。これによりアッセイがより敏感になり、励起光強度を低下させ、それによってNADHまたは阻害剤を光化学分解から保護することができます。

アッセイは一般的に多数のサンプル32を処理するのに適していないと考えられてきたが、ここで達成される小さな反応量(20 μL)は384ウェルフォーマットで、特に半高スループットスクリーニングアプリケーションに適しています。阻害定数の判定が考慮される場合。

代替方法は、通常、ATPase酵素によって産生される無機リン酸塩の検出に依存する。例えば、[γ-32P]ATPはATPaseの基質として用いることができ、その後、その放射能に基づいて無機リン酸塩を含む被空リン酸塩を測定することができる。アッセイは敏感です。しかし、それは放射性物質の取り扱いを必要とし、残りのATPは無機リン酸塩から分離されなければならない(例えば、炭上のATPの吸着によって)33。上記のマラカイトグリーンアッセイでは、リン酸塩は酸性条件下でモリブデートと反応し、得られたリンモリブデート複合体は、その吸収スペクトル19、21のシフトを引き起こすマラカイト緑色素を結合させる。 22、2324.この方法はまた、ATPase反応の消光を必要とします。したがって、主にエンドポイントアッセイとして、特に高スループット形式で使用されます。NADH結合アッセイにおけるATPase反応の連続的なモニタリングとは対照的に、エンドポイントアッセイは単に線形時間コースを想定し、非線形性につながるアーティファクトを明らかにすることはできません。マラカイトグリーンまたは複合体と相互作用する化合物はまた、アーティファクト21につながる可能性がある。また、マラカイト緑色アッセイは、リン酸汚染24に対して非常に敏感である。対照的に、NADH結合アッセイはADP汚染に敏感ではない(ATPサンプルの様々なレベルに常に存在する)反応の開始時にPKによってATPにすぐに変換される。製品の消光や分離の必要はありません。ATPaseレートの測定のための別の蛍光アッセイは、核酸リンオリラーゼ34によって触媒された反応にATP加水分解を結合することによって既に開発されている。しかし、そのアッセイはATP再生サイクルを利用しないため、初期反応速度の決定ははるかに困難な場合があります。

メソッドの将来のアプリケーションまたは方向

ATPase活性に依存する多くの酵素は、潜在的な薬物標的として探索されています。.これらには、キネシン35およびダネインファミリー36およびDNAヘリケース37に属する細胞骨格運動タンパク質が含まれ、これらは全て多様なシグナル伝達経路における末端エフェクターである。ここで説明するアッセイは、ADPが産物である反応を触媒する酵素を含む創薬および開発プロジェクトに対して容易に最適化することができる。

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Disclosures

著者は何も開示していない。

Acknowledgments

この研究は、国立神経障害研究所と脳卒中研究所と薬物乱用NS096833(CAM)国立研究所からの助成金によって支援されました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
384-well Low Flange Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate Corning 3575
ATP (Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate) Sigma A7699
Aurora FRD-IB Dispenser Aurora Discovery, Inc. 00017425
Biomek NXP Multichannel Laboratory Automation Workstation Beckman Coulter A31841
Blebbistatin AMRI N/A Custom synthesis
BSA (Bovine Serum Albumin, Protease-Free) Akron Biotech AK1391 
Centrifuge 5430 R, refrigerated, with Rotor FA-35-6-30 Eppendorf 022620663
Centrifuge 5430, non-refrigerated, with Rotor A-2-MTP Eppendorf 022620568
DMSO (Dimethyl sulfoxide)  Sigma D2650
DTT (DL-Dithiothreitol)  Sigma D5545
E1 ClipTip Multichannel Pipette; 384-format; 8-channel Thermo Scientific 4672010
E1 ClipTip Multichannel Pipette; 96-format; 8-channel Thermo Scientific 4672080
EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid)  Sigma E3889
EnVision 2104 Multilabel Plate Reader PerkinElmer 2104-0010
Glycerol  Sigma G2025
LDH (L-Lactic Dehydrogenase from rabbit muscle) Sigma L1254
MgCl2.6H2O (Magnesium chloride hexahydrate)  Sigma M2670
Microplate Shaker VWR   12620-926 
Microplate, 384 well, PP, Small Volume, Deep Well, Natural Greiner Bio-One 784201
MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid)  Sigma M1254
Myosin Motor Protein (full length) (Bovine cardiac muscle) Cytoskeleton  MY03
Myosin Motor Protein (full length) (Rabbit skeletal muscle) Cytoskeleton  MY02
NADH (β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate) Sigma N8129
NaN3 (Sodium azide)  Sigma 71289
NaOH (Sodium hydroxide)  Sigma S8045
Optical Filter CFP 470/24nm (Emission) PerkinElmer 2100-5850 Barcode 240
Optical Filter Fura2 380/10nm (Excitation) PerkinElmer 2100-5390 Barcode 112
Optical Module: Beta Lactamase PerkinElmer 2100-4270 Barcode 418
OriginPro 2017 software OriginLab N/A
para-Aminoblebbistatin AMRI N/A Custom synthesis
para-Nitroblebbistatin AMRI N/A Custom synthesis
PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monopotassium salt) Sigma P7127
PK (Pyruvate Kinase from rabbit muscle) Sigma P9136
Rabbit Muscle Acetone Powder Pel Freez Biologicals 41995-2

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低分子阻害剤スクリーニングのためのNADH結合ATPaseアッセイの半高スループット適応
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Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, J. R., Rumbaugh, G., Miller, C. A. A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors. J. Vis. Exp. (150), e60017, doi:10.3791/60017 (2019).More

Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, J. R., Rumbaugh, G., Miller, C. A. A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors. J. Vis. Exp. (150), e60017, doi:10.3791/60017 (2019).

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