I denna rapport beskriver vi ett enkelt protokoll för att studera påverkar utväxt i embryonala råtta kortikala neuroner genom Co-transfecting med egfp och proteinet av intresse.
Neurite utväxt är en grundläggande händelse i bildandet av neurala kretsar under nervsystemets utveckling. Svår neurit skador och synaptisk dysfunktion förekommer i olika neurodegenerativa sjukdomar och åldersrelaterade degeneration. Utredning av de mekanismer som reglerar påverkar utväxt skulle inte bara kasta värdefullt ljus över hjärnans utvecklingsprocesser utan också på sådana neurologiska sjukdomar. På grund av den låga transfektion effektivitet, det är för närvarande utmanande att studera effekten av ett specifikt protein på neurit utväxt i primära däggdjurs nervceller. Här beskriver vi en enkel metod för utredning av påverkar utväxt av co-transfektion av primära råtta kortikala neuroner med egfp och ett protein av intresse (POI). Denna metod gör det möjligt att identifiera POI transfekterade nervceller genom egfp signalen, och därmed effekten av POI på påverkar utväxt kan bestämmas exakt. Denna egfp-baserade analysen ger en bekväm metod för utredning av vägar som reglerar påverkar utväxt.
Neuriter, inklusive både axoner och dendriter, är projektionerna från nervceller inblandade i inrättandet av neurala nätverk. Den dynamiska utväxten av neuriter är avgörande för neuroutveckling. De bakomliggande regleringsmekanismerna under förblir dock oklara. I synnerhet, neurit skador observeras ofta i olika neurodegenerativa sjukdomar och efter hjärnskador1. Därför, utredning av roller av förmodade molekyler i olika påverkar utväxt reglerings vägar skulle förbättra vår förståelse av processen. Dessutom kan det avslöja nya terapeutiska mål för olika neurologiska sjukdomar. Neuronala cellinjer är värdefulla modeller för att studera neuronala processer inklusive påverkar utväxt eftersom de är lätta att manipulera och transfect2,3. Emellertid, genetisk drift har rapporterats förekomma i vissa vanligen använda cellinjer, vilket kan leda till variationer i deras fysiologiska svar4. Dessutom, Differentiellt proteinuttryck har visats mellan neuronala cellinjer och primära nervceller. Till exempel, PC12, en neuronala cellinjer härrör från råtta binjurar som ofta används för att studera neurit utväxt2,3, inte uttrycker NMDA-receptorer5. Dessutom har det föreslagits att den minskade lyhördhet mus neuroblastom linje neuro-2A till neurotoxiner i jämförelse med primära nervceller beror på avsaknaden av uttryck för vissa membran receptorer och jonkanaler6. Därför, primära nervceller är en mer önskvärd och representativ modell för utredning av neurit utväxt. Emellertid, användningen av primära nervceller hindras av deras låga transfektion effektivitet7.
Här beskriver vi en metod som involverar Co-transfektion av proteinet av intresse (POI) och EGFP till primär råtta kortikala neuroner. Egfp fungerar som en morfologisk markör för identifiering av framgångsrikt transfekterade nervceller och tillåter mätning av neuriter. Vi validerade denna metod genom att använda föreningar/molekyler som har rapporterats att modulera påverkar utväxt. Dessutom, FE65, en neuronala adapter protein som har visat sig stimulera påverkar utväxt, användes för att illustrera detta tillvägagångssätt8,9. Detta protokoll innebär (1) isolering av primära kortikala neuroner från embryonala dag 18 (E18) råtta embryon, (2) Co-transfektion av nervceller med EGFP och POI (FE65 i denna studie) och (3) avbildning och analys av nervceller med hjälp av bildbehandling programvara ImageJ med NeuronJ plugin10,11.
Som nämnts tidigare, PC12 och dess subkloner är allmänt anställda för att studera påverkar förlängning eftersom de har utmärkta transfektion effektivitet2,3. I motsats, primära nervceller har en låg transfektion hastighet, vilket är ett stort hinder för att studera påverkar utväxt regulatorer genom transfektion7. Här beskriver vi ett bekvämt protokoll för att kvantifiera påverkar utväxt i primära nervceller. Trots den …
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av medel från forskningsstipendier rådet Hong Kong, hälso-och sjukvårds forskningsfonden (Hongkong), CUHK direkt bidragssystem, United College donationsfond och TUYF välgörenhets förtroende.
#5 tweezers | Regine | 5-COB | |
18 mm Circle Cover Slips | Thermo Scientific | CB00180RA | Sterilize before use. |
B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
Cytochalasin D | Invitrogen | PHZ1063 | Dissolved in DMSO. |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
Dissecting Scissors, 10 cm | World Precision Instruments | 14393 | |
Dissecting Scissors, 12.5 cm | World Precision Instruments | 15922 | |
EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
Fluorescence Mounting Medium | Dako | S302380 | |
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
NGF 2.5S Native Mouse Protein | Gibco | 13257019 | |
Nugent Utility Forceps, 10mm, Straight Tip | World Precision Instruments | 504489 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
pEGFP-C1 | Clontech | #6084-1 | |
pCI FE65 | Please see references 8 and 15 | ||
PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7280 | |
Spatula | Sigma-Aldrich | S4147 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 |