Summary
В этом отчете мы описываем простой протокол для изучения невритовых наростов эмбриональных крысиных корковых нейронов путем совместного перевода с EGFP и белка, интересующего.
Abstract
Невритный рост является фундаментальным событием в формировании нейронных цепей при развитии нервной системы. Тяжелые повреждения неврита и синаптической дисфункции происходят при различных нейродегенеративных заболеваниях и возрастной дегенерации. Исследование механизмов, которые регулируют невритный рост будет не только пролить ценный свет на процессы развития мозга, но и на такие неврологические расстройства. Из-за низкой эффективности трансфекции, в настоящее время сложно изучить влияние конкретного белка на нейрит нарост в первичных нейронов млекопитающих. Здесь мы описываем простой метод исследования невритовых наростов путем со-трансфекции первичных крысиных корковых нейронов с EGFP и белка, представляющих интерес (POI). Этот метод позволяет идентифицировать POI трансинфицированных нейронов через сигнал EGFP, и, таким образом, влияние POI на неврит рост может быть определена точно. Этот результат на основе EGFP обеспечивает удобный подход для исследования путей, регулирующих неврит.
Introduction
Нейриты, включая аксоны и дендриты, являются проекциями нейронов, участвующих в создании нейронных сетей. Динамический рост невритов необходим для нейроразвития. Однако основные механизмы регулирования, лежащие в основе, остаются неясными. В частности, повреждение неврита часто наблюдается при различных нейродегенеративных заболеваниях и после травм головного мозга1. Таким образом, исследование роли индикативных молекул в различных невритовых путях роста улучшило бы наше понимание процесса. Кроме того, он может выявить новые терапевтические цели для различных неврологических расстройств. Нейронные клеточные линии являются ценными моделями для изучения нейронных процессов, включая невритовый рост, поскольку они легко манипулировать и трансфекта2,3. Тем не менее, генетический дрейф, как сообщается, происходит в некоторых широко используемых клеточных линий, которые могут привести к изменениям в их физиологических реакций4. Кроме того, дифференциальная экспрессия белка была показана между нейрональными клеточными линиями и первичными нейронами. Например, PC12, нейрональной линии клеток, полученных из крыс надпочечников, которая широко используется для изучения неврит овых2,3, не выражает NMDA рецепторов5. Кроме того, было предложено, что снижение отзывчивости линии нейробластомы мыши нейробластомы нейро-2а к нейротоксинам по сравнению с первичными нейронами связано с отсутствием экспрессии определенных мембранных рецепторов и ионных каналов6. Таким образом, первичные нейроны являются более желательной и репрезентативной моделью для исследования невритовых наростов. Тем не менее, использование первичных нейронов препятствует их низкой эффективностью трансфекции7.
Здесь мы описываем метод, который включает в себя совместное трансфекцию белка, представляющих интерес (POI) и EGFP для первичных крыс корковых нейронов. EGFP действует как морфологический маркер для идентификации успешно трансинфицированных нейронов и позволяет измерять невриты. Мы подтвердили этот метод с помощью соединений / молекул, которые, как сообщается, модулировать неврит нарастания. Кроме того, FE65, нейрональный адаптер белка, который, как было показано, стимулировать неврит нарост, был использован, чтобы проиллюстрировать этот подход8,9. Этот протокол включает в себя (1) изоляцию первичных корковых нейронов от эмбриональных эмбрионов 18 (E18) крысиных эмбрионов, (2) совместное трансфекцию нейронов с EGFP и POI (FE65 в данном исследовании) и (3) визуализацию и анализ нейронов с помощью обработки изображений программное обеспечение ImageJ с плагином NeuronJ10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все последующие процедуры соответствовали этическим стандартам комитета по этике экспериментов на животных Китайского университета Гонконга.
1. Подготовка заедок
- Поместите стерильный 18-мм круговой покрывало в каждый колодец 12-хорошей пластины культуры тканей.
- Пальто coverslip с 5 мг /мл поли-D-лизин раствор в увлажненный 37 C инкубатор, по крайней мере 1 ч.
- Аспирировать поли-D-лизина раствор из ткани культуры пластины и промыть покрытием охватывает один раз со стерильной водой.
2. Крыса эмбрионального нейронов Рассечение
- Пожертвуйте приурочен-беременной крысы Sprague-Dawley в гестационном возрасте 18 дней (E18) либо вывихшей шейки матки или CO2 удушья.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, проверьте местные правила для жертвоприношения беременных крыс. - Откройте брюшную полость беременной крысы рассекающими ножницами и перенесите матку на 10 см чашку Петри.
- Откройте матку и амниотический мешок тщательно с небольшими вскрытия ножницами и удалить плаценту из эмбриона крысы с помощью небольших вскрытия ножницами. Перенесите весь эмбрион в 10-сантиметровую чашку Петри с предварительно охлажденным фосфатным солевым раствором, дополненным глюкозой (PBS-глюкоза, 10 мМ фосфатов натрия, 2,68 мм хлорид калия, 140 мМ хлорид натрия и 3 г/л глюкозы) с помощью пары небольших щипц.
- Вырежьте вдоль сагитального шва черепа и тщательно откройте его парой маленьких рассекающих ножниц. Перенесите эмбриональный мозг с помощью небольшого плоского шпателя в 10-сантиметровую чашку Петри с ледяной PBS-глюкозой.
- Отделите два полушария головного мозга от мозжечка и ствола мозга, используя два #5 пинцета под микроскопом вскрытия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, смотрите ссылку12 для структуры мозга крысы. - Удалите оленя с помощью #5 пинцетом.
- Изолировать кору из полушарий головного мозга двумя прямыми #5 пинцетом.
- Перенос изолированной коры на ледяную PBS-глюкозу в центрифуге мощностью 15 мл.
3. Первичная кортикальная культура нейронов
ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры в шагах 3 и 4 выполняются в шкафу биобезопасности класса II.
- Поселите изолированную кору под действием силы тяжести при 4 градусах по Цельсию в течение 5 минут и аспирируй PBS-глюкозу.
- Добавьте 1 мл 0,05% трипсин-ЭДТА в изолированную кору и аккуратно перемешайте, нажав и инкубировать ткани в водяной бане 37 градусов по Цельсию в течение 10 минут, чтобы обеспечить ферментативное пищеварение. Нажмите трубку осторожно, чтобы смешивания каждые 2 мин.
- Добавьте 4 мл среднего обслуживания (например, Нейробазальная среда) в ткань/трипсинную смесь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вся среда обслуживания, используемая в этом протоколе, дополняется пенициллином-стрептомицином и B-27дополнением 13. - Мягко отмежевать ткань путем тритурации с помощью 1 мл пипетки.
- Пеллети разрозненные клетки центрифугированием при 200 х г в течение 5 мин. Аспирировать супернатант.
- Повторите шаги от 3,5 до 3,7 дважды.
- Отрежь пеллетку клетки в 1 мл среды обслуживания.
- Добавьте 10 qL 0.4% Трипан Синий раствор 10 зл и суспензии клеток для подсчета жизнеспособных клеток гемоситометром.
- Плита нейронов при плотности 65000/cm2 (жизнеспособные клетки) в 1 мл поддержания среднего в хорошо в 12-хорошо пластины.
4. Трансфекция и фиксация клеток
- В течение 2 дней in vitro (DIV2) трансфект 0,5 мкг конструкции EGFP (pEGFP-C1) к нейронам вместе либо с 0,5 мкг POI с помощью 1 зЛ реагента трансфекционного реагента (например, Липофектамин 2000). Используйте инструкции производителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Mammalian выражении конструкции были подготовлены с помощью эндотоксина свободной плазмид подготовки комплекта. Лечение химическими веществами/молекулами (в этой рукописи использовались цитошалазин D (Cyto D) и фактор роста нервов (NGF) можно сделать на 6 ч после трансфекции. - Призадыхать культуры среды 24 ч после трансфекции и мыть транс-инфицированных клеток один раз с 37 КС PBS (10 мМ фосфатов натрия, 2,68 мм хлорид калия, 140 мм хлорид натрия).
- Исправить клетки с 4% параформальдегида в PBS в течение 10 минут в темноте при комнатной температуре.
- Вымойте фиксированные клетки три раза с ПОМОЩЬю PBS.
- Добавьте минимальное количество флуоресценции монтажсреды на микроскоп стеклянной слайд. Аккуратно перенесите крышку из 12-колодца на монтажную среду с образцом, обращенным к стеклянной горке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Печать края крышки с лаком для ногтей, если aqueous монтаж среды используется.
5. Измерение нейрита
- Используйте 40-кратный объектив для захвата изображений с помощью эпифлуоресцентного микроскопа.
- Захват изображений, по крайней мере 40 нетронутых нейронов с сигналом EGFP на трансфекцию.
- Откройте захваченное изображение в программном обеспечении ImageJ с плагином NeuronJ11 для измерения длины самого длинного нейрита, от клеточного тела до кончика конуса роста, каждого изображенного нейрона.
- Проанализируйте данные, полученные с помощью программного обеспечения, чтобы определить влияние целевых белков в невритовых нарастаниях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы проверить эту методологию, мы использовали Cyto D и фактор роста нерва NGF, которые, как было показано, ингибируют и стимулируют невритный рост соответственно14,15,16. Длина неврита нейронов, трансфицированных EGFP, измерялась после лечения Сито D или NGF. Эффективность трансфекции EGFP к нейронам составила 2,7% (1068 нейронов подсчитано). Как показано на рисунке 1A, Cyto D подавлены неврит расширения в дозе зависимым образом. И наоборот, невритный рост был потенцирован в нейронах, обработанных NGF(Рисунок 1B).
Далее, мы исследовали полезность этой системы путем трансфектации нейронального адаптера FE65, который, как было показано, способствует росту неврита. Первичные крысиные корковые нейроны были совместно трансфицироваться с FE65 и EGFP. Несмотря на низкую эффективность трансфекции, иммунофлуоресценция анализ показал, что более 80% нейронов были успешно совместно трансфицировали с EGFP и FE65 (Рисунок 2A). Как и в предыдущих докладах8,9, FE65 значительно стимулировали неврит нарост в 2x(рисунок 2B). Мы также проанализировали выражение EGFP и FE65 в разных временных точках западным анализом помарки. Как показано на рисунке 2C, EGFP и FE65 были обнаружены 6 ч и 12 ч после трансфекции, соответственно. Аналогичные уровни экспрессии белков наблюдались в 1 d до 7 d после трансфекционного нейронов. Это указывает на то, что анализ невритовых наростов может быть сделан уже в 6 ч после трансфекции или в более зрелых нейронов. В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что упомянутый протокол подходит для определения роли предполагаемого неврита, насытивого роста регуляторных белков классическим трансфекцией.
Мы также отслеживали влияние дозировки генов на невритовый рост путем трансфектации первичных крыскорных нейронов с различным количеством плазмидной ДНК FE65. Как показано на рисунке 2D,дозозависимое увеличение неврита наблюдалось от 0 до 0,5 мкг плазмидной ДНК FE65. Тем не менее, не было существенной разницы между нейронами, трансфицированными либо 0,5 мкг или 1 мкг плазмидной ДНК(рисунок 2D).
Рисунок 1: Нейритный рост модулируется Cyto D и NGF. E18 крысиных корковых нейронов были трансинфицированы на DIV2 с вектором экспрессии EGFP. 6 ч после трансфекции, клетки лечились с (A) 0-0,5 мкг/мл Cyto D или (B) 0-100 нг/мл NGF для 24 ч. Затем нейроны были зафиксированы и изображены соответствующим образом. Изображения были захвачены с 40x цели с помощью эпи-флуоресценции микроскоп и длина самого длинного нейрита из клеточного тела на кончике конуса роста был измерен с помощью ImageJ с плагином NeuronJ. Было проведено три независимых эксперимента и измерено не менее 40 нейронов в каждой группе. Диаграмма панели показала изменение складки в средней длине неврита. Для статистического анализа был принят непарный т-тест. Злт; 0,001, Злт; 0,05. Бары ошибок - S.E.M. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: FE65 стимулирует невритный рост. E18 крысиных корковых нейронов были трансфицироваться на DIV2 либо с пустым контролем переносчика (EV) или FE65 вместе с вектором экспрессии EGFP. Клетки были зафиксированы и изображены 24 ч после трансфекции. (A) Трансинфицированные нейроны были противопоставлены анти-FE65 антитела и количество клеток с EGFP или FE65 по-тели трансфицируются и EGFP FE65 совместно-транс-инфицированных были подсчитаны. Было проведено три независимых эксперимента и в каждом эксперименте было подсчитано не менее 100 клеток. Данные были выражены в процентном соотношении ячеек с сигналами EGFP и EGFP FE65. Злт; 0,001. Ошибки баров S.D. (B) Длина самого длинного неврита от тела клетки к кончику конуса роста была измерена с помощью ImageJ с плагином NeuronJ. Репрезентативные нейронные изображения были показаны в правой панели. FE65 был окрашен козы анти-FE65 антитела, как описано8,17. Было проведено три независимых эксперимента и измерено не менее 40 нейронов на трансфекцию. Диаграмма панели показала изменение складки в средней длине неврита. Данные были проанализированы непарным t-тестом. Злт; 0,001. Ошибки баров - S.E.M. Шкала бар 10 мкм. (C) Западный анализ помот выражения уровней EGFP и FE65 в пост-трансфекционных точек времени, как указано. EGFP и FE65 были обнаружены мыши анти-GFP и анти-myc (к FE65 C-терминал myc тег), соответственно. (D) Средняя длина неврита нейронов, трансфицированных с различными количествами FE65 плазмид ДНК, как указано. Статистический анализ проводился с использованием односторонних тестов ANOVA с пост-хок-тестом Bonferroni. Злт; 0,001, Злт; 0,05. Бары ошибок - S.E.M. Шкала бар 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Как указывалось ранее, PC12 и его подклоны широко используются для изучения расширения неврита, потому что они имеют отличную эффективность трансфекции2,3. В отличие от этого, первичные нейроны имеют низкий уровень трансфекции, который является основным препятствием для изучения нейрита нарастания регуляторов трансфекции7. Здесь мы описываем удобный протокол для количественной оценки невритного роста в первичных нейронах. Несмотря на низкую общую эффективность трансфекции, более 80% трансфицироновых нейронов были успешно совместно трансфицироваться с двумя белками: FE65 и EGFP (Рисунок 2A). Таким образом, путем анализа EGFP помечены нейронов, влияние FE65 на неврит нарост может быть точно определена(рисунок 2B).
Еще одним преимуществом описанного подхода на основе ЕГФПО является то, что окрашивание иммунофлуоресценции может быть опущено. Иммунофлуоресценция окрашивания Tuj 1, нейрон-специфического класса III и тубулин, широко используется в качестве морфологического маркера при изучении удлинения нейрита18,19,20,21. В дополнение к Tuj 1, окрашивание POI требуется для идентификации трансинфицированных нейронов19,22,23. Известно, что на консистенцию окрашивания иммунофлюоресценции, которая имеет решающее значение для измерения невритовых наростов, влияют многие факторы, включая подготовку образца и антитела24. Таким образом, общая простота метода, основанного на ЕГФП, может повысить точность асссе.
В нашем протоколе нейроны фиксируются для измерения неврита 24 ч после трансфекции. Таким образом, нейроны подвергаются воздействию трансфекционного реагента в течение 24 ч. Давно известно, что трансфекционные реагенты токсичны для клеток25. Если влияние POI на расширение неврита должно быть определено за пределами DIV3, свежее среднее пополнение может помочь свести к минимуму токсичность. Кроме того, альтернативные методы доставки генов могут быть рассмотрены такие, как Ca 2 "фосфатов совместного выпадения и нуклеофекции, оба из которых, как показано, имеют менее токсическое воздействие на клетки26. Кроме того, мы показываем здесь, что наивысший эффект FE65 на неврит ный рост наблюдается в нейронах трансфицируется с 0,5 мкг FE65 и 0,5 мкг плазмидов EGFP с помощью 1 Зл трансфекционного реагента. Для других POIs, оптимальное количество плазмидной ДНК и трансфекционных реагентов должны быть определены, как белки имеют широко разные показатели оборота.
В дополнение к методу доставки генов, плотность клеток является еще одним важным параметром, который необходимо учитывать. Если плотность нейронов слишком высока, становится трудно определить происхождение невритов, поскольку они будут пересекаться друг с другом. Хотя покрытие клеток при низкой плотности может решить эту проблему, выживание первичных нейронов будет значительно сокращено при низкой плотности клеток27. Первичные крысиные гиппокампальные нейроны, как было показано, растут здоровыми при плотности между 40000 до 100000/cm2 28. В этом протоколе используется плотность 65 000/см2 крысиных корковых нейронов. Тем не менее, важно определить соответствующую плотность клеток для различных типов нейронов в различных экспериментальных условиях.
Здесь описано измерение неврита развивающихся крыспервичных нейронов (т.е. div3 нейронов). Однако, более зрелые нейронные фенотипы могут наблюдаться в нейронах за пределами DIV329. Как эффекты POIs или наркотиков на расширение неврита в зрелых нейронов может отличаться от развивающихся нейронов, исследования с помощью нейронов с разных стадиях обеспечит более всеобъемлющую перспективу. Стоит отметить, что мы все еще были в состоянии наблюдать выражение EGFP в нейронах 7 d после трансфекции. Это может облегчить изучение POIs или снадобиь на росте неврита в возмужалых нейронах.
Индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (hiPSC) полученных нейронов являются ценными инструментами в выявлении новых терапевтических подходов. Например, исследование неврита в этих клетках может выявить новые цели в нейрорегенерации, как использование hiPSC полученных нейронов позволяет избежать различий видов. Подобно первичным грызунам, hiPSC полученных нейронов трудно трансфект30, которые могут снизить эффективность совместного трансфекции EGFP и POI. Таким образом, использование векторов экспрессии полицистрон млекопитающих может гарантировать, что все трансинфицированные клетки выражают весь набор трансинфицированных генов, включая EGFP и POIs. Кроме того, альтернативные методы доставки генов, такие как электропорация, могут повысить эффективность трансфекции. Опять же, жизнеспособность клеток является вопросом, который необходимо учитывать при использовании таких подходов к доставке генов.
Известно, что крыса эмбриональной коры головного мозга содержит различные типы нейронов, включая колючие нейроны stellate, биполярные нейроны и долго проектирующие нейроны31. Хотя этот протокол, изложенный здесь, может выявить общий эффект POI на невритный рост, вполне возможно, что один и тот же POI может проявлять различные реакции в различных типах нейронов. Например, миостатин увеличивает количество сенсорных аксонов, но не моторных аксонов32. В таком случае необходима модификация протокола, например, предварительная изоляция определенных типов нейронов цитометрией потока. Кроме того, специфические нейронные маркерные антитела могут быть использованы для идентификации необходимых типов нейронов во время визуализации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов с содержанием этой статьи.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана за счет средств Из Научно-исследовательского совета Гонконга, Фонда медицинских и медицинских исследований (Гонконг), схемы прямых грантов CUHK, Фонда пожертвований Объединенного колледжа и Благотворительного фонда TUYF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 tweezers | Regine | 5-COB | |
| 18 mm Circle Cover Slips | Thermo Scientific | CB00180RA | Sterilize before use |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| Cytochalasin D | Invitrogen | PHZ1063 | Dissolved in DMSO |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dissecting Scissors, 10 cm | World Precision Instruments | 14393 | |
| Dissecting Scissors, 12.5 cm | World Precision Instruments | 15922 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| Fluorescence Mounting Medium | Dako | S302380 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| NGF 2.5S Native Mouse Protein | Gibco | 13257019 | |
| Nugent Utility Forceps, 10 mm, Straight Tip | World Precision Instruments | 504489 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pEGFP-C1 | Clontech | #6084-1 | |
| pCI FE65 | Please see references 8 and 15 | ||
| PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Spatula | Sigma-Aldrich | S4147 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 |
References
- Kaplan, A., Bueno, M., Hua, L., Fournier, A. E. Maximizing functional axon repair in the injured central nervous system: Lessons from neuronal development. Developmental Dynamics. 247 (1), 18-23 (2018).
- Harrill, J. A., Mundy, W. R. Quantitative assessment of neurite outgrowth in PC12 cells. Methods in Molecular Biology. 758, 331-348 (2011).
- Yeyeodu, S. T., Witherspoon, S. M., Gilyazova, N., Ibeanu, G. C. A rapid, inexpensive high throughput screen method for neurite outgrowth. Current Chemical Genomics. 4, 74-83 (2010).
- Ben-David, U., et al. Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response. Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).
- Edwards, M. A., Loxley, R. A., Williams, A. J., Connor, M., Phillips, J. K. Lack of functional expression of NMDA receptors in PC12 cells. Neurotoxicology. 28 (4), 876-885 (2007).
- LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).
- Cheung, H. N., et al. FE65 interacts with ADP-ribosylation factor 6 to promote neurite outgrowth. The FASEB Journal. 28 (1), 337-349 (2014).
- Li, W., et al. Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1. Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).
- Swanson, L. W. Brain maps 4.0-Structure of the rat brain: An open access atlas with global nervous system nomenclature ontology and flatmaps. The Journal of Comparative Neurology. 526 (6), 935-943 (2018).
- Brewer, G. J. Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus. Journal of Neuroscience Research. 42 (5), 674-683 (1995).
- Yamada, K. M., Spooner, B. S., Wessells, N. K. Axon growth: roles of microfilaments and microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (4), 1206-1212 (1970).
- Casella, J. F., Flanagan, M. D., Lin, S. Cytochalasin D inhibits actin polymerization and induces depolymerization of actin filaments formed during platelet shape change. Nature. 293 (5830), 302-305 (1981).
- Calabrese, E. J. Enhancing and regulating neurite outgrowth. Critical Reviews in Toxicology. 38 (4), 391-418 (2008).
- Lau, K. F., et al. Dexras1 Interacts with FE65 to Regulate FE65-Amyloid Precursor Protein-dependent Transcription. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34728-34737 (2008).
- Cui, X., et al. Niacin treatment of stroke increases synaptic plasticity and axon growth in rats. Stroke. 41 (9), 2044-2049 (2010).
- Khodosevich, K., Monyer, H. Signaling involved in neurite outgrowth of postnatally born subventricular zone neurons in vitro. BMC Neuroscience. 11, 18 (2010).
- Tang, F., et al. Resveratrol Enhances Neurite Outgrowth and Synaptogenesis Via Sonic Hedgehog Signaling Following Oxygen-Glucose Deprivation/Reoxygenation Injury. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 43 (2), 852-869 (2017).
- He, W., Liu, Y., Tian, X. Rosuvastatin Improves Neurite Outgrowth of Cortical Neurons against Oxygen-Glucose Deprivation via Notch1-mediated Mitochondrial Biogenesis and Functional Improvement. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 6 (2018).
- Tesarova, P., et al. Receptor for advanced glycation end products (RAGE)--soluble form (sRAGE) and gene polymorphisms in patients with breast cancer. Cancer Investigation. 25 (8), 720-725 (2007).
- Park, S. Y., et al. Hippocalcin Promotes Neuronal Differentiation and Inhibits Astrocytic Differentiation in Neural Stem Cells. Stem Cell Reports. 8 (1), 95-111 (2017).
- Radbruch, A. Immunofluorescence: Basic Considerations. Flow Cytometry and Cell Sorting. , Springer Lab Manual Book Series. 38-52 (2000).
- Wang, T., Larcher, L. M., Ma, L., Veedu, R. N. Systematic Screening of Commonly Used Commercial Transfection Reagents towards Efficient Transfection of Single-Stranded Oligonucleotides. Molecules. 23 (10), (2018).
- Sariyer, I. K. Transfection of neuronal cultures. Methods in Molecular Biology. 1078, 133-139 (2013).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Research. 126 (3), 397-425 (1977).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Further observations on hippocampal neurons in dispersed cell culture. The Journal of Comparative Neurology. 187 (3), 469-493 (1979).
- Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study. PLoS One. 8 (12), e83899 (2013).
- Hiragi, T., et al. Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC)-Derived Neurons in Mouse Hippocampal Slice Cultures. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 143 (2017).
- Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews. Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).
- Jones, M. R., Villalon, E., Northcutt, A. J., Calcutt, N. A., Garcia, M. L. Differential effects of myostatin deficiency on motor and sensory axons. Muscle & Nerve. 56 (6), E100-E107 (2017).
