Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

משופרת ירוק מבוסס חלבון פלואורסצנטית מבוססת על לימוד Neurite Outgrowth בנוירונים ראשוניים

Published: October 19, 2019 doi: 10.3791/60031
Automatic Translation
*1, *1,2, *1, 1
1School of Life Sciences, The Chinese University of Hong Kong, Hong Kong Special Administrative Region, 2Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences, Shenzhen
* These authors contributed equally

Summary

בדו ח זה, אנו מתארים פרוטוקול פשוט עבור לימוד neurite מוצלח בנוירונים הקליפת המוח העובריים על ידי שיתוף הפעולה עם egfp ואת חלבון הריבית.

Abstract

Neurite מוצלח הוא אירוע בסיסי בהקמת מעגלים עצביים במהלך פיתוח מערכת העצבים. נזק neurite חמור ותפקוד סינפטית להתרחש במחלות ניווניות שונות ניוון הקשורות לגיל. חקירת מנגנוני הווסת neurite מוצלח לא רק לשפוך אור יקר על תהליכים התפתחותיים במוח אלא גם על הפרעות נוירולוגיות כאלה. בשל יעילות ההתפתחות הנמוכה, הוא כרגע מאתגר ללמוד את ההשפעה של חלבון מסוים על neurite מוצלח בנוירונים היונקים העיקריים. כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה לחקירה של neurite מוצלח ידי שיתוף ההתפתחות של נוירונים בקליפת המוח הראשי עם egfp וחלבון של עניין (פוי). שיטה זו מאפשרת זיהוי של הנוירונים מנוכר פוי באמצעות אות egfp, ובכך את ההשפעה של פוי על neurite מוצלח ניתן לקבוע בדיוק. זה מבוסס EGFP מספק גישה נוחה לחקירה של מסלולים ויסות neurite outgrowth.

Introduction

Neurites, כולל אקסונים ו דנדריטים, הם התחזיות מפני נוירונים המעורבים בהקמת רשתות עצביות. הצמיחה הדינמית של neurites היא חיונית עבור פיתוח נוירולוגי. עם זאת, מנגנוני הרגולציה הבסיסיים שמתחת נותרים ברורים. בפרט, נזק neurite הוא נצפה לעתים קרובות במחלות ניווניות שונים ואחרי פציעות המוח1. לכן, חקירת התפקידים של מולקולות neurite מוצלח מסלולים שונים הרגולציה ישפר את הבנתנו את התהליך. יתר על כן, זה עשוי לחשוף מטרות טיפוליות הרומן עבור הפרעות נוירולוגיות שונות. קווי התאים העצביים הם מודלים יקרי ערך עבור לימוד תהליכים עצביים כולל neurite מוצלח כפי שהם קל לתמרן ו transfect2,3. עם זאת, הסחף גנטי דווח להתרחש כמה קווי התאים הנפוצים, אשר יכול להוביל וריאציות התגובות הפיסיולוגיים שלהם4. יתר על כן, ביטוי החלבון הדיפרנציאלי הוכח בין קווי התאים העצביים והנוירונים הראשוניים. למשל, PC12, קו של תא עצבי שנגזר בלוטת יותרת הכליה חולדה המשמשת רבות ללימוד neurite מוצלח2,3, אינו מבטא קולטנים NMDA5. יתר על כן, זה כבר הציע כי התגובה מופחתת של העכבר שורה נוירובלסטומה בקווים עצביים-2a כדי נוירוטוקסינים בהשוואה לנוירונים הראשי הוא בשל חוסר ביטוי של קולטני קרום מסוימים וערוצי יון6. לכן, הנוירונים העיקריים הם מודל רצוי יותר ומייצג לחקירה של neurite outgrowth. עם זאת, השימוש בנוירונים הראשי מפריע היעילות שלהם הזיהום הנמוך7.

כאן, אנו מתארים שיטה המערבת שיתוף הזיהום של חלבון הריבית (פוי) ו-EGFP לנוירונים הראשי הקליפת העור הפנים. ה-EGFP משמש כסמן מורפולוגי לזיהוי נוירונים שעברו בהצלחה ומאפשר את המדידה של neurites. אנו אימות שיטה זו באמצעות תרכובות/מולקולות שדווחו לווסת neurite outgrowth. יתר על כן, FE65, חלבון מתאם עצבי כי הוכח לעורר neurite outgrowth, שימש כדי להמחיש את הגישה הזאת8,9. פרוטוקול זה כולל (1) בידוד של נוירונים בקליפת העור העיקרי מן היום העובריים 18 (E18) עוברי חולדה, (2) את שיתוף הפעולה של נוירונים עם EGFP ואת פוי (FE65 במחקר זה) ו (3) הדמיה וניתוח של הנוירונים באמצעות עיבוד תמונה ImageJ של תוכנה עם תוסף עצבי10,11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים שלאחר מכן היו בהתאם לסטנדרטים האתיים של ועדת האתיקה של הניסויים בבעלי חיים של האוניברסיטה הסינית בהונג קונג.

1. הכנת שוברי כיסוי

  1. מניחים כיסוי סטרילי מעגלי 18 מ"מ לתוך כל טוב של לוחית 12-היטב הרקמה רקמות.
  2. לחלוק את הסרבל עם 5 μg/mL פולי-D-ליזין פתרון מחולל 37 מעלות צלזיוס בחממה עבור 1 h לפחות.
  3. מנושף את התמיסה פולי-ליזין מצלחת תרבות הרקמה ולשטוף את הכיסויים מצופה פעם אחת עם מים סטריליים.

2. החולדה מתחלקים לנתיחה

  1. להקריב עכברוש מתוזמן בהריון ספראג-דאולי בגיל ההיריון של 18 ימים (E18) על ידי פריקה צוואר הרחם או שיתוף2 חנק.
    הערה: אנא בדוק את התקנות המקומיות. להקרבה של עכברושים בהריון
  2. פתח את חלל הבטן של עכברוש בהריון עם מספריים לבתר ולהעביר את הרחם על 10 ס מ צלחת פטרי.
  3. פתח את הרחם ואת שק השפיר בזהירות עם המספריים מבתר קטן ולהסיר את השליה מן העובר חולדה באמצעות מספריים מבתר קטן. להעביר את העובר כולו 10 ס מ צלחת פטרי עם מלוחים טרום מקורר פוספט באגירה בתוספת גלוקוז (PBS-גלוקוז, 10 מ"מ מלחי נתרן, 2.68 מ"מ אשלגן כלוריד, 140 mM נתרן כלוריד ו 3 g/L גלוקוז) באמצעות זוג מלקחיים קטנים.
  4. חותכים לאורך התפר המשונן של הגולגולת ופותחים אותו בזהירות עם זוג מספריים קטנים. העבר את המוח העובריים עם מרית קטנה ושטוחה לצלחת פטרי בגודל 10 ס מ עם הקרח הקר-גלוקוז.
  5. הפרידו בין שתי האונות המוחית לגזע המוח השני ובאמצעות שתי #5 פינצטה תחת מיקרוסקופ לחיתוך.
    הערה: בבקשה ראו התייחסות12 . למבנה של מוח החולדה
  6. הסר את הקרום הקרומי באמצעות ה#5 פינצטה.
  7. לבודד את קליפת המוח מהמיאונות המוחית עם שני מלקחיים #5 ישרים.
  8. העבירו את קליפת המוח הבודדת. ל-"PBS-גלוקוז" בתוך 15 מ ל

3. תרבית תא בקליפת היסוד

הערה: כל ההליכים בשלבים 3 ו-4 מבוצעים בתוך ארון מחלקה II Biosafety טיחות.

  1. ליישב את קליפת המוח הבודדת על ידי כוח הכבידה ב 4 ° c עבור 5 דקות ולאחר מכן לבשל את ה-PBS-גלוקוז.
  2. הוסיפו 1 מ ל של 0.05% טריפסין-EDTA לקליפת הקליפה הבודדת וערבבו בעדינות על ידי הקשה על הרקמה באמבט מים בגודל 37 ° c במשך 10 דקות כדי לאפשר את העיכול האנזימטי. הקש על צינור בעדינות כדי ערבוב כל 2 דקות.
  3. הוסף 4 מ ל של מדיום תחזוקה (למשל, מדיום Neurobasal סיס) לרקמה/טריפסין תערובת.
    הערה: כל המדיום תחזוקה בשימוש בפרוטוקול זה הוא שיושלם עם פניצילין-סטרפטומיצין ו B-27 תוספת13.
  4. הנתק את הרקמה בעדינות על-ידי הטריטורציה באמצעות פיפטה של 1 מ ל.
  5. גלולה את התאים הנתק על ידי צנטריפוגה ב 200 x g עבור 5 דקות. ומתה את הסופרנטאנט.
  6. חזור על שלבים 3.5 עד 3.7 פעמיים.
  7. השהה מחדש את הגלולה בתא 1 מ ל של אמצעי תחזוקה.
  8. הוסף 10 μL של 0.4% הפתרון הכחול טרימין כחול 10 μL של הבולם הסלולרי עבור ספירת תאים קיימא על-ידי הומוציטומטר.
  9. צלחת הנוירונים בצפיפות של 65000/cm2 (תאים קיימא) ב 1 מ ל של תחזוקה בינונית לכל טוב בצלחת 12-באר.

4. העברה וקיבוע תאים

  1. ב 2 ימים ב מבחנה (DIV2), transfect 0.5 μg של בניית EGFP (pEGFP-C1) לנוירונים יחד עם או בלי 0.5 μg של פוי באמצעות 1 μL של העברה מגיב (g., Lipofectamine 2000). השתמש בהוראות היצרן.
    הערה: ביטויים ממיונקים הוכנו על ידי שימוש בערכת ההכנה של הפלטוקסין בחינם. טיפול עם כימיקלים/מולקולות (בכתב יד ציטוסין D (Cyto D) ואת הצמיחה העצבים גורם (NGF) שימשו) ניתן לעשות ב 6 h לאחר מעבר החצייה.
  2. מנושף את מבנה התרבות 24 שעות לאחר ההעברה ושוטף את התאים המוגברים פעם אחת עם 37 ° c PBS (10 מ"מ מלחי נתרן, 2.68 מ"מ אשלגן כלוריד, 140 מ"מ נתרן כלוריד).
  3. תקן את התאים עם 4% פאראפורמלדהיד ב-PBS במשך 10 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.
  4. שטוף את התאים הקבועים שלוש פעמים עם ה-PBS.
  5. הוסף כמות מינימלית של מדיום הרכבה פלואורסצנטית בשקופית זכוכית מיקרוסקופ. העבר בזהירות את הכיסויים של הצלחת 12-הבאר אל מדיום ההרכבה עם המדגם הפונה לשקופית זכוכית.
    הערה: לאטום את הקצה של שמיכות עם לק ציפורניים אם מדיום הרכבה מימית משמש.

5. מדידה של Neurite Outgrowth

  1. השתמש במטרה 40x עבור לכידת תמונות באמצעות מיקרוסקופ אפינפרין-פלורסנט.
  2. לכידת תמונות מ לפחות 40 נוירונים שלמים עם אות EGFP לאחר הזיהום.
  3. פתח את התמונה שנלכדה בתוכנת ImageJ עם התוסף העצבי11 כדי למדוד את אורך הneurite הארוך ביותר, מגוף התא לקצה של קונוס הצמיחה, של כל תא עצב התמונה.
  4. לנתח את הנתונים שהושגו עם התוכנה כדי לקבוע את ההשפעה של חלבונים ייעודיים ב neurite outgrowth.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי לבדוק מתודולוגיה זו, השתמשנו cyto D ואת גורם הגדילה העצבי ngf, אשר הוכחו לעכב ולעורר neurite מוצלח בהתאמה14,15,16. אורך neurite של נוירונים מנוכר עם EGFP נמדדו לאחר הטיפול עם Cyto D או NGF. היעילות של התרגום של EGFP לנוירונים הייתה 2.7% (1,068 נוירונים שנספרו). כפי שמוצג באיור 1, Cyto D דיכאneurite הארכהבצורה תלוית מינון. לעומת זאת, neurite מוצלח היה פוטנציאל בנוירונים שטופלו ngf (איור 1B).

לאחר מכן, חקרנו את כלי השירות של מערכת זו על ידי העברת מתאם עצבי FE65, אשר הוכח לקדם neurite outgrowth. הנוירונים בקליפת העצב הראשי היו שכונתיות עם FE65 ו-EGFP. למרות יעילות הזיהום הנמוך, הניתוח האימונופלואורסצנטית חשף כי למעלה מ 80% הנוירונים היו בהצלחה שכונתיות עם EGFP ו FE65 (איור 2א). בדומה לדיווחים קודמים8,9, FE65 גירוי משמעותי neurite מוצלח ידי 2x (איור 2ב). ניתחנו גם את הביטוי של EGFP ו FE65 בנקודות זמן שונות על ידי ניתוח כתמי אבן מערבית. כפי שמוצג באיור 2C, egfp ו-FE65 זוהו 6 h ו -12 שעות לאחר הניתוח, בהתאמה. ביטויים דומים רמות של החלבונים נצפו ב 1 d כדי 7 d לאחר הזיהום נוירונים. זה מצביע על כך ניתוח של neurite מוצלח יכול להיעשות מוקדם ככל 6 h לאחר ההעברה או בנוירונים בוגרים יותר. יחד, נתונים אלה מצביעים על כך שהפרוטוקול שהוזכר מתאים לקביעת התפקיד של החלבונים neurite מוצלח באמצעות ההתפתחות הקלאסית.

אנו גם פיקוח על ההשפעה של המינון הגנטי על neurite מוצלח על ידי העברה של הנוירונים הראשי חולדה בקליפת המוח עם כמויות שונות של ה-DNA FE65 פלמיד. כפי שמוצג באיור 2D, גידול תלוי במינון neurite הארכה נצפתה מ 0-0.5 μg של ה-DNA FE65 פלמיד. עם זאת, לא היה הבדל משמעותי בין נוירונים מנוכר עם או 0.5 μg או 1 μg של DNA פלמיד (איור 2ד).

Figure 1
איור 1: Neurite מוצלח מאופנן על ידי cyto D ו ngf. E18 חולדה בקליפת העור הנוירונים היו מזוהמים על DIV2 עם וקטור ביטוי EGFP. 6 h לאחר ההעברה, התאים טופלו עם (A) 0-0.5 μg/Ml Cyto D או (ב) 0-100 ng/ml ngf עבור 24 שעות. ואז הנוירונים היו מקובעים. ומתוקנים בהתאם תמונות נתפסו עם מטרה 40x באמצעות מיקרוסקופ אפינפרין-פלואורסצנטית ואורך הneurite הארוכה ביותר מגוף התא לקצה חרוט הצמיחה נמדד באמצעות ImageJ עם תוסף עצבי. שלושה ניסויים עצמאיים בוצעו לפחות 40 נוירונים נמדדו בכל קבוצה. תרשים העמודות הראה את שינוי הקיפול באורך neurite ממוצע. מבחן t שאינו משויך אומץ לניתוח הסטטיסטי. * p < 0.001, * * p < 0.05. קווי שגיאה = S.E.M. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: FE65 מעוררת neurite outgrowth. E18 חולדה בקליפת העור הנוירונים היו מזוהמים על DIV2 עם שליטה וקטורית ריק (EV) או FE65 יחד עם וקטור ביטוי EGFP. תאים תוקנו והתמונה 24 שעות לאחר הזיהום. (א) הנוירונים המזוהמים היו מוכתמים נגד הנוגדן ANTI-FE65 ואת מספר התאים עם egfp או FE65 ביחידים מזוהמים ו egfp + FE65 שכונתיות שיתוף נספרו. בוצעו שלושה ניסויים עצמאיים ולפחות 100 תאים נספרו בכל ניסוי. נתונים הוביעו כאחוז התאים עם אותות EGFP ו-EGFP + FE65. * p < 0.001. קווי שגיאה = ש גויטיין (ב) אורך הneurite הארוך ביותר מגוף התא לקצה חרוט הגידול נמדד באמצעות imagej עם התוסף העצבי. תמונות תא העצב הנציג הוצגו בלוח הימני. FE65 היה מוכתם בנוגדן עז אנטי FE65 כמתואר8,17. שלושה ניסויים עצמאיים בוצעו ולפחות 40 נוירונים נמדדו לאחר הזיהום. תרשים העמודות הראה את שינוי הקיפול באורך neurite ממוצע. הנתונים נותחו על ידי מבחן t משויך. * p < 0.001. קווי שגיאה = S.E.M. סרגל קנה מידה = 10 μm. (C) ניתוח כתמי מערבי של ביטוי של רמות egfp ו FE65 בנקודות זמן שלאחר ההעברה כפי שצוין. EGFP ו FE65 זוהו על ידי העכבר anti-GFP ו anti-myc (כדי FE65 C-טרמינל myc תג), בהתאמה. (ד) אורך הneurite הממוצע של נוירונים מנוכר עם כמויות שונות של ה-DNA FE65 פלמיד כפי שצוין. ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות בדיקות ANOVA בכיוון אחד עם מבחן בונפררוני לאחר-הוק. * p < 0.001, * * p < 0.05. קווי שגיאה = S.E.M. סרגל קנה מידה = 10 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כפי שצוין לפני, PC12 ושיבוטים שלה הם מועסקים נרחב ללמוד הארכה neurite כי יש להם יעילותמעולהמעבר 2,3. לעומת זאת, נוירונים ראשוניים יש שיעור מעבר נמוך, שהוא מכשול גדול ללמוד neurite מוצלח הרגולטורים על ידי התפתחות7. כאן, אנו מתארים פרוטוקול נוח לכמת neurite מוצלח בנוירונים הראשי. למרות היעילות הכללית הכוללת, יותר מ 80% מהנוירונים המזוהמים היו בהצלחה בשיתוף עם שני החלבונים: FE65 ו-EGFP (איור 2א). לכן, על ידי ניתוח הנוירונים המסומנת egfp, ההשפעה של FE65 על neurite מוצלח יכול להיות נחוש בדיוק (איור 2B).

יתרון נוסף של הגישה המבוססת על EGFP המתואר הוא שניתן להשמיט כתמים מאימונוofor,. Immunofluorescence כתמים של tuj 1, תא העצב הספציפי III β-טובולין, מועסק נרחב כסמן מורפולוגית כאשר לומד neurite אלונגציה18,19,20,21. בנוסף tuj 1, כתמים של פוי נדרש עבור זיהוי של נוירונים מתובל19,22,23. ידוע כי העקביות של מכתים אימונוofor, אשר חיוני למדידת neurite מוצלח, מושפע גורמים רבים כולל הכנה לדוגמא ונוגדנים24. מכאן, הפשטות הכללית של השיטה המבוססת על EGFP יכולה לשפר את הדיוק של התיקון.

בפרוטוקול שלנו, נוירונים הם קבועים למדידה neurite 24 h לאחר ההעברה. לפיכך, נוירונים חשופים לזיהום מגיב עבור 24 שעות. זה ידוע מאוד כי ריאגנטים החצייה רעילים לתאים25. אם ההשפעה של פוי על הסיומת neurite צריך להיקבע מעבר DIV3, חידוש בינוני טרי עשוי לסייע למזער את הרעילות. יתר על כן, שיטות חלופיות משלוח גנים עשויים להיחשב כגון Ca2 + פוספט שיתוף משקעים ונוקלאופלוט, שניהם מוצגים אפקט רעיל פחות תאים26. בנוסף, אנו מראים כאן כי ההשפעה הגבוהה ביותר של FE65 על neurite מוצלח הוא נצפה הנוירונים מנוכר עם כי 0.5 μg של FE65 ו 0.5 μg של הפלמידים egfp באמצעות 1 μl של התפתחות מגיב. עבור POIs אחרים, את הכמויות האופטימליות של ה-DNA והזיהום הפלסטי יש לקבוע כמו חלבונים יש שיעורי מחזור שונים באופן נרחב.

בנוסף לשיטת המסירה הגנטית, צפיפות התא היא פרמטר קריטי אחר שיש לשקול. אם צפיפות תא העצב גבוהה מדי, קשה לזהות את מקורותיה של neurites כפי שהם חופפים זה לזה. למרות התאים ציפוי בצפיפות נמוכה עשוי לפתור את הבעיה, הישרדות הנוירונים הראשי יהיה מופחת באופן משמעותי בצפיפות תא נמוך27. מעצב ראשי היפוקאמאל הנוירונים הוכחו לגדול באופן בסדר בצפיפות בין 40,000 ל-100,000/cm2 28. בפרוטוקול זה, צפיפות של 65000/cm2 של נוירונים חולדה הקליפת העצב משמש. עם זאת, חשוב לקבוע את צפיפות התא המתאים עבור סוגים שונים של נוירונים בתנאים ניסיוניים שונים.

המדידה הneurite של פיתוח נוירונים הראשי עכברוש (כלומר DIV3 נוירונים) מתואר כאן. עם זאת, פנוטיפים עצביים בוגרים יותר ניתן לצפות בנוירונים מעבר DIV329. כמו ההשפעות של POIs או תרופות על הרחבה neurite בנוירונים בוגרים עשוי להיות שונה מן הנוירונים המתפתח, החקירה באמצעות נוירונים משלבים שונים יספק פרספקטיבה מקיפה יותר. ראוי לציין כי עדיין היינו מסוגלים לצפות ביטוי EGFP בנוירונים 7 d לאחר הזיהום. זה עשוי להקל על המחקר של pois או תרופות על neurite מוצלח בנוירונים בוגרים.

תא גזע בהשפעת האדם (היפנוטית)-הנוירונים הנגזרים הם כלים יקרי ערך לזיהוי גישות טיפוליות הרומן. למשל, חקירה של neurite מוצלח בתאים אלה יכול לחשוף מטרות הרומן בדור העצבי כמו השימוש של הנוירונים הנגזרים מונע את ההבדלים המינים. בדומה נוירונים מכרסמים העיקרי, הנוירונים הנגזרים הנגזרות קשה transfect30, אשר עשוי להפחית את היעילות שיתוף החצייה של egfp ו פוי. מכאן, השימוש בווקטורים בעלי ביטוי polycistronic יכול להבטיח כי כל התאים המנוכר לבטא את הקבוצה כולה של גנים מזוהמים כולל EGFP ו POIs. בנוסף, השיטות החלופיות לאספקת גנים, כגון אלקטרופורציה, עשויות לשפר את יעילות התרגום. שוב, הכדאיות של התא היא בעיה שצריכה להיחשב בעת שימוש בגישות משלוח גנים כאלה.

ידוע כי בקליפת המוח מתחלקים החולדה מכיל סוגים שונים של נוירונים כולל נוירונים stellate הקוצני, נוירונים דו-קוטבית ו מקרין הנוירונים ארוך31. בעוד פרוטוקול זה הצהיר כאן יכול לחשוף את ההשפעה הכללית של POIs על neurite outgrowth, ייתכן כי פוי יכול להפגין תגובות שונות בסוגים שונים של נוירונים. לדוגמה, מיוסטטין מגדיל את מספר האקטונים הסנסוריים, אך לא את זה של אקסונים מוטוריים32. בתרחיש כזה, השינוי של הפרוטוקול הוא הכרחי, כגון בידוד מוקדם של סוגים ספציפיים של נוירונים באמצעות הזרימה cy, try. לחילופין, ניתן להשתמש בנוגדנים ספציפיים לסמן העצבי במהלך הדמיה של סוגי הנוירונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניין בתוכן של מאמר זה.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי כספים מן המועצה מענקים מחקר הונג קונג, בריאות ומחקר רפואי הקרן (הונג קונג), CUHK מענק הערכה, קרן הנאמנות של המכללה המאוחדת ו TUYF נאמנות צדקה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#5 tweezers Regine 5-COB
18 mm Circle Cover Slips Thermo Scientific CB00180RA Sterilize before use
B27 Supplement Gibco 17504044
Cytochalasin D Invitrogen PHZ1063 Dissolved in DMSO
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich D2650
Dissecting Scissors, 10 cm World Precision Instruments 14393
Dissecting Scissors, 12.5 cm World Precision Instruments 15922
EndoFree Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12362
Fluorescence Mounting Medium Dako S302380
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Invitrogen 11668019
Neurobasal Medium Gibco 21103049
NGF 2.5S Native Mouse Protein Gibco 13257019
Nugent Utility Forceps, 10 mm, Straight Tip World Precision Instruments 504489
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
pEGFP-C1 Clontech #6084-1
pCI FE65 Please see references 8 and 15
PBS Tablets Gibco 18912014
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich P7280
Spatula Sigma-Aldrich S4147
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300062
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kaplan, A., Bueno, M., Hua, L., Fournier, A. E. Maximizing functional axon repair in the injured central nervous system: Lessons from neuronal development. Developmental Dynamics. 247 (1), 18-23 (2018).
  2. Harrill, J. A., Mundy, W. R. Quantitative assessment of neurite outgrowth in PC12 cells. Methods in Molecular Biology. 758, 331-348 (2011).
  3. Yeyeodu, S. T., Witherspoon, S. M., Gilyazova, N., Ibeanu, G. C. A rapid, inexpensive high throughput screen method for neurite outgrowth. Current Chemical Genomics. 4, 74-83 (2010).
  4. Ben-David, U., et al. Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response. Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).
  5. Edwards, M. A., Loxley, R. A., Williams, A. J., Connor, M., Phillips, J. K. Lack of functional expression of NMDA receptors in PC12 cells. Neurotoxicology. 28 (4), 876-885 (2007).
  6. LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
  7. Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).
  8. Cheung, H. N., et al. FE65 interacts with ADP-ribosylation factor 6 to promote neurite outgrowth. The FASEB Journal. 28 (1), 337-349 (2014).
  9. Li, W., et al. Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1. Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).
  10. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  11. Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).
  12. Swanson, L. W. Brain maps 4.0-Structure of the rat brain: An open access atlas with global nervous system nomenclature ontology and flatmaps. The Journal of Comparative Neurology. 526 (6), 935-943 (2018).
  13. Brewer, G. J. Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus. Journal of Neuroscience Research. 42 (5), 674-683 (1995).
  14. Yamada, K. M., Spooner, B. S., Wessells, N. K. Axon growth: roles of microfilaments and microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (4), 1206-1212 (1970).
  15. Casella, J. F., Flanagan, M. D., Lin, S. Cytochalasin D inhibits actin polymerization and induces depolymerization of actin filaments formed during platelet shape change. Nature. 293 (5830), 302-305 (1981).
  16. Calabrese, E. J. Enhancing and regulating neurite outgrowth. Critical Reviews in Toxicology. 38 (4), 391-418 (2008).
  17. Lau, K. F., et al. Dexras1 Interacts with FE65 to Regulate FE65-Amyloid Precursor Protein-dependent Transcription. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34728-34737 (2008).
  18. Cui, X., et al. Niacin treatment of stroke increases synaptic plasticity and axon growth in rats. Stroke. 41 (9), 2044-2049 (2010).
  19. Khodosevich, K., Monyer, H. Signaling involved in neurite outgrowth of postnatally born subventricular zone neurons in vitro. BMC Neuroscience. 11, 18 (2010).
  20. Tang, F., et al. Resveratrol Enhances Neurite Outgrowth and Synaptogenesis Via Sonic Hedgehog Signaling Following Oxygen-Glucose Deprivation/Reoxygenation Injury. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 43 (2), 852-869 (2017).
  21. He, W., Liu, Y., Tian, X. Rosuvastatin Improves Neurite Outgrowth of Cortical Neurons against Oxygen-Glucose Deprivation via Notch1-mediated Mitochondrial Biogenesis and Functional Improvement. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 6 (2018).
  22. Tesarova, P., et al. Receptor for advanced glycation end products (RAGE)--soluble form (sRAGE) and gene polymorphisms in patients with breast cancer. Cancer Investigation. 25 (8), 720-725 (2007).
  23. Park, S. Y., et al. Hippocalcin Promotes Neuronal Differentiation and Inhibits Astrocytic Differentiation in Neural Stem Cells. Stem Cell Reports. 8 (1), 95-111 (2017).
  24. Radbruch, A. Immunofluorescence: Basic Considerations. Flow Cytometry and Cell Sorting. , Springer Lab Manual Book Series. 38-52 (2000).
  25. Wang, T., Larcher, L. M., Ma, L., Veedu, R. N. Systematic Screening of Commonly Used Commercial Transfection Reagents towards Efficient Transfection of Single-Stranded Oligonucleotides. Molecules. 23 (10), (2018).
  26. Sariyer, I. K. Transfection of neuronal cultures. Methods in Molecular Biology. 1078, 133-139 (2013).
  27. Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Research. 126 (3), 397-425 (1977).
  28. Banker, G. A., Cowan, W. M. Further observations on hippocampal neurons in dispersed cell culture. The Journal of Comparative Neurology. 187 (3), 469-493 (1979).
  29. Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study. PLoS One. 8 (12), e83899 (2013).
  30. Hiragi, T., et al. Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC)-Derived Neurons in Mouse Hippocampal Slice Cultures. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 143 (2017).
  31. Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews. Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).
  32. Jones, M. R., Villalon, E., Northcutt, A. J., Calcutt, N. A., Garcia, M. L. Differential effects of myostatin deficiency on motor and sensory axons. Muscle & Nerve. 56 (6), E100-E107 (2017).

Tags

ביולוגיה התפתחותית סוגיה 152 חלבון פלורסנט ירוק משופר ImageJ מיקרוסקופיה neurite outgrowth נוירונים ראשוניים העברה
משופרת ירוק מבוסס חלבון פלואורסצנטית מבוססת על לימוד Neurite Outgrowth בנוירונים ראשוניים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chan, W. W. R., Li, W., Chau, D. L.… More

Chan, W. W. R., Li, W., Chau, D. L. D., Lau, K. F. An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons. J. Vis. Exp. (152), e60031, doi:10.3791/60031 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter