Summary
이 보고에서는, 우리는 EGFP 및 관심있는 단백질과 공동 으로 transfecting에 의해 배아 쥐 피질 뉴런에 있는 neurite outgrowth를 공부하기 위한 간단한 프로토콜을 기술합니다.
Abstract
Neurite 의 성장은 신경계 발달 중에 신경 회로형성에 근본적인 사건입니다. 가혹한 신경염성 손상 및 시냅스 역기능은 각종 신경 퇴행성 질병 및 나이 관련 변성에서 생깁니다. neurite 파생을 조절 하는 메커니즘의 조사 뿐만 아니라 뇌 발달 과정뿐만 아니라 이러한 신경 장애에 귀중 한 빛을 발산 것 이다. 낮은 형질 감염 효율로 인해, 현재 1 차 포유류 뉴런에서 신경 구이 성 성장에 특정 단백질의 효과 연구 하는 도전. 여기서, 우리는 EGFP및 관심 단백질(POI)을 이용한 1차 쥐 피질 뉴런의 공동 형질전환에 의한 뉴라이트 자생의 조사를 위한 간단한 방법을 설명한다. 이 방법은 EGFP 신호를 통해 POI 형질감염된 뉴런의 식별을 허용하고, 따라서 NEUrite 자성장에 대한 POI의 효과를 정확하게 결정할 수 있다. 이 EGFP 기반 분석법은 신경과성 자성장을 조절하는 경로의 조사를 위한 편리한 접근법을 제공한다.
Introduction
축색과 모수석을 모두 포함한 노이라이트는 신경망 의 확립에 관여하는 뉴런의 돌출부입니다. 신경 신경 발달에 필수적입니다 신경 구이염의 역동적 인 성장. 그러나, 아래 기본 규제 메커니즘 불분명 남아. 특히, 신경성 손상은 다양한 신경 퇴행성 질환과 뇌 손상 후1. 따라서, 다양한 neurite 파생 규제 경로에서 putative 분자의 역할에 대한 조사는 프로세스의 우리의 이해를 향상시킬 것입니다. 더욱이, 다양한 신경 장애에 대한 새로운 치료 표적을 밝혀낼 수 있다. 신경 세포주는 신경세포가 조작하기 쉽고 트랜스펙트2,3으로neurite 의 성장을 포함한 신경 학적 과정을 연구하기위한 귀중한 모델입니다. 그러나, 유전 드리프트는 그들의 생리적인 반응에 있는 변이로 이끌어 낼 수 있던 몇몇 일반적으로 이용되는 세포주에서 생기기 위하여 보고되었습니다4. 더욱이, 차동 단백질 발현은 신경 세포주와 1차 뉴런 사이에 나타났다. 예를 들어, PC12는, 쥐 부신에서 유래된 뉴런 세포주는 뉴라이트자생을연구하는 데 널리 사용되는2, 3,NMDA 수용체5를발현하지 않는다. 더욱이, 1차 뉴런에 비해 신경독소에 대한 마우스 신경아세포종 라인 신경-2a의 반응성이 감소된 것은 특정 막 수용체 및 이온채널(6)의발현 부족으로 인한 것으로 제안되었다. 따라서, 1차 뉴런은 신경외식 의 자생의 조사를 위한 보다 바람직하고 대표적인 모델이다. 그러나, 1 차적인 뉴런의 사용은 그들의 낮은 형질 감염 효율성7에의해 방해된다.
여기서, 우리는 관심 있는 단백질(POI) 및 EGFP를 1차 쥐 피질 뉴런에 대한 공동 형질감염과 수반하는 방법을 기술한다. EGFP는 성공적으로 형질 감염된 뉴런의 식별을 위한 형태학적 마커로서 작용하고 신경염의 측정을 허용한다. 우리는 neurite 의 성장을 조절하기 위해 보고 된 화합물 / 분자를 사용하여이 방법을 검증했습니다. 더욱이, FE65, 신경조절 단백질은 신경질성 자성장을 자극하는 것으로 나타났으며, 이러한접근법을설명하기 위해8,9를사용하였다. 이 프로토콜은 (1) 배아 18일(E18) 래트 배아로부터 1차 피질 뉴런의 분리, (2) EGFP및 POI(본 연구에서 FE65)를 이용한 뉴런의 공동 형질감염 및 (3) 이미지 처리를 이용하여 뉴런의 이미징 및 분석을 포함한다. 소프트웨어 이미지J 와 뉴런J 플러그인10,11.
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Protocol
이후 모든 절차는 홍콩 중문대학의 동물 실험 윤리 위원회의 윤리 기준에 따라 진행되었습니다.
1. 커버스립준비
- 멸균 된 18mm 원형 커버 슬립을 12 웰 조직 배양 판의 각 우물에 놓습니다.
- 커버슬립을 가습된 37°C 인큐베이터에 5 μg/mL 폴리-D-리신 용액으로 코팅하여 1시간 이상 코팅합니다.
- 조직 배양 플레이트로부터 폴리-D-리신 용액을 흡인하고 코팅된 커버슬립을 멸균수로 한 번 헹구는다.
2. 쥐 배아 신경 해부
- 자궁 경부 탈구 또는CO2 질식에 의해 18 일 (E18)의 임신 나이에 시간 임신 Sprague-Dawley 쥐를 희생.
참고: 임산부 쥐의 희생에 대해서는 현지 규정을 확인하십시오. - 해부 가위로 임신 한 쥐의 복강을 열고 자궁을 10cm 페트리 접시로 옮김하십시오.
- 작은 해부 가위로 자궁과 양수 낭을 조심스럽게 열고 작은 해부 가위를 사용하여 쥐 배아에서 태반을 제거하십시오. 포도당 (PBS-포도당, 10 mM 나트륨 인산염, 2.68 mM 염화 칼륨, 140 mM 염화 나트륨 및 3 g /L 포도당)으로 보충 된 미리 냉각 된 인산완충 식염수로 10cm 페트리 접시에 전체 배아를 옮기세요.
- 두개골의 시상 봉합사를 따라 잘라 작은 해부 가위 한 쌍으로 조심스럽게 엽니 다. 작은 평평한 주걱으로 배아 뇌를 얼음 차가운 PBS-포도당으로 10cm 페트리 접시로 옮김을 옮김.
- 해부 현미경의 밑에 2개의 #5 핀셋을 사용하여 소뇌와 두뇌 줄기에서 2개의 대뇌 반구를 분리하십시오.
참고: 쥐 뇌의 구조는 참조12를 참조하십시오. - #5 핀셋을 사용하여 수막을 제거합니다.
- 두 개의 직선 #5 핀셋으로 대뇌 반구에서 피질을 분리합니다.
- 15 mL 원심 분리기 튜브에서 얼음 차가운 PBS-포도당에 고립 된 피질을 옮김.
3. 1 차적인 피질 신경 문화
참고: 3단계와 4단계의 모든 절차는 Class II 생물안전성 캐비닛 내에서 수행됩니다.
- 5 분 동안 4 °C에서 중력에 의해 분리 된 피질을 정착하고 PBS - 포도당을 흡인.
- 분리된 피질에 0.05% 트립신-EDTA 1 mL을 추가하고 효소 소화를 허용하기 위해 37°C 수조에서 조직을 10분 동안 두드리고 배양하여 부드럽게 섞습니다. 튜브를 부드럽게 눌러 2분마다 혼합합니다.
- 조직/트립신 혼합물에 4 mL의 유지 관리 배지(예: 신경기분저 배지)를 추가합니다.
참고: 이 프로토콜에 사용되는 모든 유지 보수 매체는 페니실린 - 스트렙 토마이신과 B-27 보충13으로보충된다. - 1 mL 파이펫을 사용하여 삼조하여 조직을 부드럽게 해리하십시오.
- 200 x g에서 원심분리에 의해 해리된 세포를 5분 동안 펠렛.
- 3.5단계에서 3.7단계는 두 번 반복합니다.
- 유지 보수 배지의 1 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단하십시오.
- 혈세포계에 의한 생존 가능한 세포의 계수를 위해 10 μL의 0.4% Trypan Blue 용액을 10 μL의 세포 현탁액에 추가하십시오.
- 12웰 플레이트에서 1mL의 유지 관리 배지에서 65,000/cm2(생존 세포)의 밀도로 뉴런을 플레이트한다.
4. 세포 감염 및 고정
- 2일 체외(DIV2)에서, EGFP 구제의 트랜스펙트 0.5 μg(pEGFP-C1)을 1 μL의 트랜스펙션 시약(예를 들어, Lipofectamine 2000)을 사용하여 POI의 0.5 μg의 유무에 관계없이 뉴런에 대해 함께 한다. 제조업체의 지침을 사용하십시오.
참고: 포유류 발현 구슬은 내독소 프리 플라스미드 제제 키트를 사용하여 제조하였다. 화학 물질 /분자 (이 원고 시토 샬라신 D (Cyto D) 및 신경 성장 인자 (NGF)가 사용된 경우) 형질전환 후 6 시간에서 수행 될 수 있습니다. - 배양배지 24시간 후 형질감염세포를 37°C PBS(10 mM 인산나트륨, 염화칼륨, 염화나트륨 140m)로 1회 세척한다.
- PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드로 세포를 실온에서 어둠 속에서 10 분 동안 고정하십시오.
- 고정 된 세포를 PBS로 세 번 씻으하십시오.
- 현미경 유리 슬라이드에 최소한의 형광 장착 매체를 추가합니다. 12웰 플레이트에서 시료가 유리 슬라이드를 향하게 하여 장착 매체로 조심스럽게 커버슬립을 옮김을 옮김.
참고: 수성 마운팅 매체를 사용하는 경우 커버슬립 가장자리를 매니큐어로 밀봉합니다.
5. 노이라이트 자성장 측정
- 에피형광 현미경을 사용하여 이미지를 캡처하는 데 40x 목표를 사용합니다.
- 적어도 40 개의 손상되지 않은 뉴런에서 형상 변환 당 EGFP 신호로 이미지를 캡처합니다.
- NeuronJ 플러그인11을 사용하여 ImageJ 소프트웨어에서 캡처된 이미지를 열어 각 이미지 뉴런의 세포체에서 성장 원뿔의 끝까지 가장 긴 신경질의 길이를 측정합니다.
- 소프트웨어로 얻은 데이터를 분석하여 뉴라이트 의 외성장에 표적 화된 단백질의 효과를 결정한다.
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Representative Results
이 방법론을 시험하기 위하여는, 우리는 각각14,15,16의신경 성 자성장을 억제하고 자극하기 위하여 보인 Cyto D 및 신경 성장 인자NGF를이용했습니다. EGFP로 형질감염된 뉴런의 뉴라이트 길이는 Cyto D 또는 NGF로 치료한 후 측정되었다. 뉴런에 대한 EGFP의 형질감염 효율은 2.7%(1,068개의 뉴런 카운트)였다. 도 1A에도시된 바와 같이, Cyto D는 용량 의존적 방식으로 뉴라이트 연장을 억제하였다. 반대로, 뉴라이트 의 자성장은 NGF로 처리된 뉴런에서 강력하였다(도1B).
다음으로, 우리는 신경 적응자 FE65를 transfecting하여이 시스템의 유용성을 조사, 이는 신경 성 성장을 촉진하는 것으로 나타났다. 1차 쥐 피질 뉴런은 FE65 및 EGFP로 공동 형질감염되었다. 낮은 형질 전환 효율에도 불구하고, 면역 형광 분석은 뉴런의 80 % 이상이 EGFP 및 FE65와 성공적으로 공동 형질 감염된 것으로 나타났습니다(그림 2A). 이전 보고서8,9,FE65와 유사하여 2x(도2B)에의해 신경구의 자성장을 현저하게 자극하였다. 또한 서양 블롯 분석에 의한 서로 다른 시점에서 EGFP 및 FE65의 발현을 분석했습니다. 도 2에나타낸 바와같이,EGFP 및 FE65는 각각 6시간 및 12시간 후 형질감염이 검출되었다. 단백질의 유사한 발현 수준은 1 d 에서 7 d 후 형질감염 뉴런에서 관찰되었다. 이것은 neurite 파생의 분석이 일찍 6 h 사후 형질전환 또는 더 성숙한 뉴런에서 행해질 수 있었다는 것을 표시합니다. 함께, 이러한 데이터는 언급된 프로토콜이 고전적인 형질감염에 의해 신중성 자성장 조절 단백질의 역할을 결정하는데 적합하다는 것을 시사한다.
우리는 또한 FE65 plasmid DNA의 다른 양을 가진 1 차적인 쥐 피질 신경세포를 transfecting해서 neurite 파생에 유전자 복용량의 효력을 감시했습니다. 도 2D에나타낸 바와 같이, NEUrite 연장의 용량 의존적 증가는 FE65 플라스미드 DNA의 0-0.5 μg로부터 관찰되었다. 그러나, 플라스미드 DNA의 0.5 μg 또는 1 μg로 형질감염된 뉴런 들 사이에는 유의한 차이가없었다(도 2D).
그림 1: 노이라이트 자성장은 사이토 D 및 NGF에 의해 변조된다. E18 쥐 피질 뉴런은 EGFP 발현 벡터로 DIV2상에서 형질감염되었다. 6 h 후 형질감염, 세포를(A)0-0.5 μg/mL Cyto D 또는(B)0-100 ng/mL NGF를 24시간 동안 처리하였다. 그런 다음 뉴런을 고정하고 그에 따라 이미지화했습니다. 영상은 에피형광 현미경을 이용하여 40x 객관적으로 포획하였고, 세포체에서 성장원뿔끝까지 가장 긴 신경이염의 길이를 NeuronJ 플러그인과 함께 ImageJ를 사용하여 측정했다. 3개의 독립적인 실험이 수행되었고 적어도 40개의 뉴런이 각 그룹에서 측정되었다. 막대 차트는 평균 neurite 길이의 배 변화를 보여 주었다. 미페어링 t-검정은 통계 분석을 위해 채택되었다. * p < 0.001, **p & 0.05. 오류 막대 = S.E.M. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: FE65는 신경질성 자성장을 자극한다. E18 쥐 피질 뉴런은 EGFP 발현 벡터와 함께 빈 벡터 대조군(EV) 또는 FE65로 DIV2상에서 형질감염되었다. 세포를 고쳐 서 24 시간 후 형질 전환 하였다. (a)형질감염된 뉴런을 항FE65 항체로 반염색하였고 EGFP 또는 FE65를 단호하게 형질감염된 세포 수와 EGFP+ FE65 를 공동 형질감염시켰다. 3개의 독립적인 실험을 수행하고 각 실험에서 적어도 100개의 세포를 계수하였다. 데이터는 EGFP 및 EGFP + FE65 신호를 가진 세포의 백분율로서 발현되었다. *p< 0.001. 오차 막대 = S.D.(B)세포체로부터 성장 원뿔의 끝까지 가장 긴 신경질의 길이는 NeuronJ 플러그인과 함께 ImageJ를 사용하여 측정하였다. 대표적인 뉴런 이미지가 오른쪽 패널에 나타났다. FE65는8,17에기재된 바와 같이 염소 항FE65 항체에 의해 염색되었다. 3개의 독립적인 실험이 수행되었고 적어도 40개의 뉴런이 형질전환당 측정되었다. 막대 차트는 평균 neurite 길이의 배 변화를 보여 주었다. 데이터는 페어링되지 않은 t-test에 의해 분석되었다. *p< 0.001. 오차 막대 = S.E.M. 스케일 막대 = 10 μm.(C)지시된 바와 같이 트랜스펙션 후 시점에서 EGFP 및 FE65 의 레벨의 발현에 대한 웨스턴 블롯 분석. EGFP 및 FE65는 각각 마우스 안티-GFP 및 안티-마이크(FE65 C-말단 myc 태그)에 의해 검출되었다. (D)지시된 바와 같이 다양한 양의 FE65 플라스미드 DNA로 형질감염된 뉴런의 평균 뉴라이트 길이. 통계 분석은 본페로니 사후 시험을 이용한 단방향 ANOVA 테스트를 사용하여 수행되었습니다. * p < 0.001, **p & 0.05. 오류 표시줄 = S.E.M. 배율 표시줄 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
앞서 언급한 바와 같이, PC12 및 그 서브클론은 형질전환 효율이 우수하기 때문에 뉴라이트 확장을 연구하기 위해 널리 사용된다2,3. 대조적으로, 1 차적인 뉴런은 형질전환7에의하여 neurite 파생 조정자를 공부하기 위한 중요한 장애물인 낮은 형질감염 비율을 가시합니다. 여기서, 우리는 1 차적인 뉴런에 있는 neurite 파생을 정량화하기 위한 편리한 프로토콜을 기술합니다. 낮은 전반적인 형질 감염 효율에도 불구하고, 형질감염된 뉴런의 80% 이상이 FE65 및 EGFP(그림 2A)의두 단백질과 성공적으로 공동 형질감염되었다. 따라서, EGFP 표지된 뉴런을 분석함으로써, NEUrite 자성장에 대한 FE65의 효과를 정확하게 결정할 수있었다(도 2B).
EGFP 기반 접근법의 또 다른 장점은 면역형광 염색이 생략될 수 있다는 것이다. Tuj 1의 면역형광 염색은 뉴런 특이적 클래스 III β-tubulin로, 뉴라이트신장18,19,20,21을공부할 때 형태학적 마커로 널리 사용된다. Tuj 1 이외에, 형질감염된뉴런19,22,23의식별을 위해 POI의 염색이 요구된다. 신경질성 자성장 측정에 중요한 면역형광 염색의 일관성은 시료 제제 및 항체24를포함한 많은 요인에 의해 영향을 받는 것으로 알려져 있다. 따라서, EGFP 기반 방법의 전반적인 단순성은 분석법의 정확도를 향상시킬 수 있었다.
우리의 프로토콜에서, 뉴런은 형질전환 후 24시간 동안 뉴라이트 측정을 위해 고정된다. 따라서, 뉴런은 24 시간 동안 형질감염 시약에 노출된다. 형질감염 시약은세포(25)에독성이 있는 것으로 오랫동안 알려져 있다. NEUrite 확장에 대한 POI의 효과가 DIV3 이상으로 결정되어야 하는 경우, 신선한 배지 보충은 독성을 최소화하는 데 도움이 될 수 있다. 더욱이, 대체 유전자 전달 방법은Ca2+ 인산염 공동 침전 및 핵과 같은 고려될 수 있으며, 둘 다세포(26)에덜 독성 효과를 가지는 것으로 나타났다. 추가적으로, 우리는 neurite 파생에 FE65의 가장 높은 효력이 형질전환 시약의 1 μL를 사용하여 FE65의 0.5 μg 및 EGFP 플라스미드의 0.5 μg로 형질감염된 뉴런에서 관찰된다는 것을 여기에서 보여줍니다. 다른 POI의 경우, 단백질이 널리 다른 이직률을 가지고 있기 때문에 플라스미드 DNA 및 형질감염 시약의 최적 양을 결정해야 합니다.
유전자 전달 방법 이외에, 세포 밀도는 고려되어야 할 또 다른 중요한 파라미터이다. 뉴런 밀도가 너무 높으면 서로 겹치는 신경염의 기원을 식별하기가 어려워집니다. 저밀도에서 도금 세포가 문제를 해결할 수 있지만, 1 차 적인 뉴런의 생존은 낮은 세포 밀도27에서현저하게 감소될 것이다. 1 차적인 쥐 해 마 뉴런 사이 밀도에서 건강 하 게 성장 표시 되었습니다 40,000 받는 것 100,000/cm2 28. 이 프로토콜에서는 쥐 피질 뉴런의 65,000/cm2밀도가 사용됩니다. 그럼에도 불구 하 고, 다른 실험 조건 하에서 뉴런의 다른 유형에 대 한 적절 한 세포 밀도 결정 하는 것이 중요 하다.
쥐 1 차 적인 뉴런 (즉DIV3 뉴런)을 개발의 neurite 측정은 여기에 설명되어 있습니다. 그러나, 더 성숙한 신경 표현형은 DIV329를넘어 뉴런에서 관찰 될 수있다. 성숙한 뉴런에 있는 neurite 확장에 POIs 또는 약의 효력은 개발 신경과 다를 수 있기 때문에, 다른 단계에서 뉴런을 사용하여 조사는 더 포괄적인 관점을 제공할 것입니다. 그것은 우리가 여전히 뉴런에서 EGFP 발현을 관찰 할 수 있었다 는 것을 주목할 필요가있다 7 d 후 형질 감염. 이것은 성숙한 뉴런에 있는 neurite 파생에 POIs 또는 약의 연구 를 촉진할 수 있습니다.
인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC) 유래 뉴런은 새로운 치료 접근법의 식별에 유용한 도구입니다. 예를 들면, 이 세포에 있는 neurite 파생의 조사는 hiPSC 파생한 신경의 사용이 종 다름을 피하기 때문에 신경 재생에 있는 새로운 표적을 밝힐 수 있었습니다. 1차 설치류 뉴런과 유사하게, hiPSC 유래 뉴런은30을트랜스펙트하기 어렵고, 이는 EGFP 및 POI의 공동 형질감염 효율을 감소시킬 수 있다. 따라서, 다각형 포유류 발현 벡터의 사용은 모든 형질감염된 세포가 EGFP 및 POI를 포함하는 형질감염된 유전자의 전체 세트를 발현한다는 것을 보장할 수 있었다. 부가적으로, 전기 천공과 같은 대체 유전자 전달 방법은, 형질감염 효율을 향상시킬 수 있다. 다시, 세포 생존은 그 같은 유전자 납품 접근을 사용할 때 고려될 필요가 있는 문제점입니다.
쥐 배아 뇌 피질에는 가시 성별 뉴런, 양극성 뉴런 및 장시간 투영 뉴런31을포함한 다양한 유형의 뉴런이 포함되어 있는 것으로 알려져 있다. 여기에 명시된 이 프로토콜은 NEUrite 자성장에 대한 POI의 일반적인 효과를 나타낼 수 있지만, 동일한 POI가 다른 유형의 뉴런에서 다른 반응을 나타낼 수 있습니다. 예를 들어, 미오스타틴은 감각 축삭의 수를 증가시키지만 모터 축삭(32)의수는 증가하지 않습니다. 이러한 시나리오에서, 유세포측정에 의한 특정 유형의 뉴런의 사전 분리와 같은 프로토콜의 수정이 필요하다. 대안적으로, 특이적인 뉴런 마커 항체는 이미징 동안 필요한 유형의 뉴런의 식별을 위해 사용될 수 있다.
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Disclosures
저자는 이 문서의 내용과 이해 상충이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 연구 보조금 위원회 홍콩, 건강 및 의료 연구 기금 (홍콩), CUHK 직접 보조금 제도, 유나이티드 대학 기부 기금 및 TUYF 자선 신탁의 기금에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 tweezers | Regine | 5-COB | |
| 18 mm Circle Cover Slips | Thermo Scientific | CB00180RA | Sterilize before use |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| Cytochalasin D | Invitrogen | PHZ1063 | Dissolved in DMSO |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dissecting Scissors, 10 cm | World Precision Instruments | 14393 | |
| Dissecting Scissors, 12.5 cm | World Precision Instruments | 15922 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| Fluorescence Mounting Medium | Dako | S302380 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| NGF 2.5S Native Mouse Protein | Gibco | 13257019 | |
| Nugent Utility Forceps, 10 mm, Straight Tip | World Precision Instruments | 504489 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pEGFP-C1 | Clontech | #6084-1 | |
| pCI FE65 | Please see references 8 and 15 | ||
| PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Spatula | Sigma-Aldrich | S4147 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 |
References
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