Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

فحص قائم علي بروتين الفلورية الخضراء المعززة لدراسة نمو العصب في الخلايا العصبية الاوليه

Published: October 19, 2019 doi: 10.3791/60031
Automatic Translation
*1, *1,2, *1, 1
1School of Life Sciences, The Chinese University of Hong Kong, Hong Kong Special Administrative Region, 2Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences, Shenzhen
* These authors contributed equally

Summary

في هذا التقرير ، ونحن وصف بروتوكول بسيط لدراسة النمو العصبي في الخلايا العصبية القشرية الفئران الجنينية عن طريق المشاركة في الانتقال مع EGFP والبروتين من الفائدة.

Abstract

العصب العصبي هو حدث أساسي في تشكيل الدوائر العصبية اثناء تطوير الجهاز العصبي. تحدث الاضرار العصبية الشديدة والخلل الوظيفي المتشابك في مختلف الامراض العصبية والانحطاط المرتبط بالسن. ان التحقيق في أليات التي تنظم نمو العصب العصبي لن يؤدي فقط إلى إلقاء الضوء القيم علي العمليات التنموية للدماغ ولكن أيضا علي هذه الاضطرابات العصبية. ونظرا لكفاءة التحويل المنخفضة ، فانه من الصعب حاليا دراسة تاثير بروتين محدد علي نمو العصب العصبي في الخلايا العصبونات الاوليه. هنا ، ونحن وصف طريقه بسيطه للتحقيق في النمو العصبي من قبل المشتركة بين الخلايا العصبية القشرية الفئران الاوليه مع EGFP والبروتين من الفائدة (POI). هذا الأسلوب يسمح بتحديد الخلايا العصبية المتحولة POI من خلال اشاره EGFP ، التالي يمكن تحديد تاثير البوي علي النمو العصبي بدقه. ويوفر هذا الفحص القائم علي EGFP نهجا ملائما للتحقيق في المسارات التي تنظم نمو العصب العصبي.

Introduction

العصبية ، بما في ذلك كل من محاور و dendrites ، هي الإسقاطات من الخلايا العصبية المشاركة في إنشاء الشبكات العصبية. ان النمو الديناميكي للعصب أمر ضروري لتطوير الأعصاب. ومع ذلك ، تظل أليات التنظيمية الاساسيه في الأسفل غير واضحة. علي وجه الخصوص ، وغالبا ما يلاحظ تلف العصب في مختلف الامراض العصبية وبعد إصابات الدماغ1. ولذلك ، فان التحقيق في ادوار الجزيئات المفترضة في مختلف المسارات التنظيمية لنمو العصب العصبي من شانه ان يحسن فهمنا للعملية. وعلاوة علي ذلك ، فانه قد تكشف عن أهداف علاجيه جديده لمختلف الاضطرابات العصبية. خطوط الخلايا العصبية هي نماذج قيمه لدراسة العمليات العصبية بما في ذلك العصب العصبي لأنها سهله للتلاعب و transfect2,3. ومع ذلك ، تم الإبلاغ عن حدوث انحراف جيني في بعض خطوط الخلايا الشائعة الاستخدام ، مما قد يؤدي إلى اختلافات في الاستجابات الفسيولوجية4. وعلاوة علي ذلك ، تم عرض التعبير البروتين التفاضلي بين خطوط الخلايا العصبية والخلايا العصبية الاوليه. علي سبيل المثال, PC12, خط الخلايا العصبية المستمدة من الغدة الكظرية الفئران التي تستخدم علي نطاق واسع لدراسة العصب العصبي2,3, لا تعبر عن مستقبلات nmda5. وعلاوة علي ذلك ، فقد اقترح ان انخفاض الاستجابة للخط العصبي العصبي الماوس خط عصبيه-2a إلى السموم العصبية بالمقارنة مع الخلايا العصبية الاوليه ويرجع ذلك إلى عدم التعبير عن مستقبلات غشاء معينه وقناات أيون6. لذلك ، الخلايا العصبية الاوليه هي نموذج أكثر من المرغوب فيه وتمثيليه للتحقيق في النمو العصبي. ومع ذلك ، فان استخدام الخلايا العصبية الاوليه يعوقه الكفاءة المنخفضة للتحويل7.

هنا ، ونحن وصف الطريقة التي تنطوي علي الانتقال المشترك للبروتين من الفائدة (POI) و EGFP إلى الخلايا العصبية القشرية الفئران الاوليه. وتعمل EGFP كعلامة مورفولوجية لتحديد الخلايا العصبية المتحولة بنجاح وتسمح بقياس العصب. نحن التحقق من صحة هذه الطريقة باستخدام المركبات/الجزيئات التي تم الإبلاغ عنها لتعدل العصب العصبي. وعلاوة علي ذلك ، تم استخدام FE65 ، وهو بروتين محول الخلايا العصبية التي ثبت لتحفيز النمو العصبي ، لتوضيح هذا النهج8،9. هذا البروتوكول ينطوي علي (1) عزل الخلايا العصبية القشرية الاوليه من الجنينية اليوم 18 (E18) أجنه الفئران ، (2) المشترك بين الخلايا العصبية مع EGFP و POI (FE65 في هذه الدراسة) و (3) التصوير وتحليل الخلايا العصبية باستخدام معالجه الصور البرمجيات ImageJ مع البرنامج المساعد نيونونج10,11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وكانت جميع الإجراءات المتبعة متفقه مع المعايير الاخلاقيه للجنة أخلاقيات التجارب الحيوانية التابعة لجامعه هونغ كونغ الصينية.

1. اعداد الشفاه المختلطة

  1. ضعي الضمادة الدائرية المعقمة بحجم 18 ملم في كل بئر من لوحه ثقافة الانسجه التي تبلغ 12 بئرا.
  2. معطف كوفيرسليب مع 5 ميكروغرام/مل محلول بولي دي يسين في ترطيب 37 درجه مئوية حاضنه لمده لا تقل عن 1 ساعة.
  3. يستنشق محلول بولي دي يسين من لوحه ثقافة الانسجه وشطف الشفتين المغلفة مره واحده مع الماء المعقم.

2. الفئران الجنينية تشريح الخلايا العصبية

  1. قم بالتضحية بالفئران الموقوتة-الحامل في سن الحمل الذي يبلغ 18 يوما (E18) اما عن طريق خلع عنق الرحم أو خنق CO2 .
    ملاحظه: يرجى التحقق من اللوائح المحلية للتضحية من الفئران الحوامل.
  2. فتح تجويف البطن من الفئران الحامل مع تشريح مقص ونقل الرحم إلى صحن بيتري 10 سم.
  3. فتح الرحم والكيس السلوى بعناية مع مقص تشريح الصغيرة وأزاله المشيمة من جنين الفئران باستخدام مقص تشريح الصغيرة. نقل الجنين كله إلى طبق بيتري 10 سم مع الفوسفات قبل المبردة المالحة مخزنه تستكمل مع الجلوكوز (تلفزيوني-الجلوكوز ، 10 مم الفوسفات الصوديوم ، 2.68 mM كلوريد البوتاسيوم ، 140 mM كلوريد الصوديوم و 3 غرام/لتر الجلوكوز) باستخدام زوج من ملقط صغير.
  4. قطع علي طول خياطه السهمي من الجمجمة وفتحه بعناية مع زوج من مقص تشريح الصغيرة. نقل الدماغ الجنينية مع ملعقة صغيره مسطحه إلى صحن بيتري 10 سم مع الجليد الباردة تلفزيوني-الجلوكوز.
  5. افصل نصفي الدماغ عن المخيخ وجذع المخ باستخدام ملقطين #5ين تحت مجهر التشريح.
    ملاحظه: يرجى الاطلاع علي المرجع12 لهيكل الدماغ الفئران.
  6. أزاله السحايا باستخدام ملاقط ال#5.
  7. عزل القشرة من نصفي الدماغ مع اثنين من ملاقط ال#5 علي التوالي.
  8. نقل القشرة معزولة إلى الجليد الباردة تلفزيوني-الجلوكوز في أنبوب الطرد المركزي 15 مل.

3. ثقافة الخلايا العصبية القشرية الاوليه

ملاحظه: يتم تنفيذ جميع الإجراءات الموجودة في الخطوتين 3 و 4 داخل مجلس الوزراء للسلامة البيولوجية من الدرجة الثانية.

  1. تسويه القشرة المعزولة بالجاذبية في 4 درجه مئوية لمده 5 دقائق ويستنشق الجلوكوز.
  2. أضافه 1 مل من 0.05 ٪ التريبسين-أدتا إلى القشرة المعزولة وتخلط بلطف عن طريق التنصت واحتضان الانسجه في 37 درجه مئوية حمام المياه لمده 10 دقيقه للسماح الهضم الانزيمي. اضغط علي الأنبوب برفق للخلط كل 2 دقيقه.
  3. أضافه 4 مل من متوسط الصيانة (علي سبيل المثال ، المتوسطة العصبية) إلى خليط الانسجه/التريبسين.
    ملاحظه: وتستكمل جميع المتوسطة الصيانة المستخدمة في هذا البروتوكول مع البنسلين-ستربتوميسين و ب-27 الملحق13.
  4. قومي بفك النسيج برفق باستخدام ماصه بمقدار 1 مل.
  5. بيليه الخلايا المنفصلة عن طريق طرد في 200 x g لمده 5 دقيقه. يستنشق سوبرناتانت.
  6. كرر الخطوات 3.5 إلى 3.7 مرتين.
  7. أعاده تعليق بيليه الخلية في 1 مل من متوسط الصيانة.
  8. أضافه 10 μL من 0.4% الحل الأزرق التريان إلى 10 μL من تعليق الخلية لعد الخلايا القابلة للحياة من قبل مقياس الكريات الدموية.
  9. لوحه الخلايا العصبية في كثافة من 65000/سم2 (خليه قابله للحياة) في 1 مل من متوسط الصيانة لبئر في لوحه 12 بئر.

4. خليه النقل والتثبيت

  1. في 2 أيام في المختبر (DIV2) ، transfect 0.5 ميكروغرام من البناء EGFP (pEGFP-C1) إلى الخلايا العصبية معا اما مع أو بدون من 0.5 ميكروغرام من POI باستخدام 1 μL من كاشف العدوى (علي سبيل المثال ، ليبوفيكتامين 2000). استخدم إرشادات الشركة المصنعة.
    ملاحظه: وقد أعدت بني التعبير الثدييات باستخدام السمية المعوية الحرة مجموعه اعداد البلازميد. العلاج مع المواد الكيميائية/جزيئات (في هذه المخطوطة الخلوية D (Cyto) وعامل نمو العصب (NGF) وقد استخدمت) يمكن القيام به في 6 ح بعد الحقن.
  2. يستنشق الوسط الثقافي 24 ساعة بعد التحويل ويغسل الخلايا المقسمة مره واحده مع 37 درجه مئوية (10 ملم فوسفات الصوديوم ، 2.68 مم كلوريد البوتاسيوم ، 140 مم كلوريد الصوديوم).
  3. إصلاح الخلايا مع 4 ٪ بارافورمالدهيد في الخدمات التلفزيونية لمده 10 دقيقه في الظلام في درجه حرارة الغرفة.
  4. غسل الخلايا الثابتة ثلاث مرات مع تلفزيوني.
  5. أضافه كميه الحد الأدنى من المتوسطة تركيب الفلورية علي الشريحة الزجاجية المجهر. انقل المشبك بعناية من اللوحة المكونة من 12 بئر إلى الوسط المتصاعد مع العينة التي تواجه الشريحة الزجاجية.
    ملاحظه: ختم حافه المشبك مع طلاء الأظافر إذا تم استخدام متوسط تركيب مائي.

5. قياس النمو العصبي

  1. استخدام هدف 40x للتقاط الصور باستخدام المجهر الضوئي-الفلورسنت.
  2. التقاط الصور من ما لا يقل عن 40 الخلايا العصبية سليمه مع اشاره EGFP لكل النقل.
  3. فتح الصورة الملتقطة في ImageJ البرمجيات مع البرنامج المساعد نيونوج11 لقياس طول أطول العصب ، من جسم الخلية إلى غيض من مخروط النمو ، من كل الخلايا العصبية الذين يعانون من العمر.
  4. تحليل البيانات التي تم الحصول عليها مع البرنامج لتحديد تاثير البروتينات المستهدفة في النمو العصبي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لاختبار هذه المنهجية ، استخدمنا cyto وعامل نمو العصب ngf ، والتي تبين ان تمنع وتحفز العصبية النمو علي التوالي14،15،16. تم قياس طول العصب من الخلايا العصبية مع EGFP بعد العلاج مع Cyto أو NGF. وكانت كفاءه التحويل من EGFP إلى الخلايا العصبية 2.7 ٪ (1,068 الخلايا العصبية تحسب). كما هو مبين في الشكل 1ا، سيالي D قمعت العصبية التمديد بطريقه تعتمد علي الجرعة. وعلي العكس من ذلك ، تم تحفيز العصب العصبي في الخلايا العصبية المعالجة مع NGF (الشكل 1ب).

بعد ذلك ، قمنا بالتحقيق في فائده هذا النظام عن طريق تحويل محول الخلايا العصبية FE65 ، والتي ثبت انها تعزز نمو العصب العصبي. وكانت الخلايا العصبية القشرية الفئران الاوليه مشتركه مع FE65 و EGFP. وعلي الرغم من الكفاءة المنخفضة للتحويل ، كشف التحليل المناعي-الفلوري ان أكثر من 80% من الخلايا العصبية كانت ناجحه بنجاح مع EGFP و FE65 (الشكل 2ا). علي غرار التقارير السابقة8،9، FE65 حفزت بشكل كبير العصب العصبي من قبل 2x (الشكل 2ب). وحللنا أيضا التعبير عن EGFP و FE65 في نقاط زمنيه مختلفه بواسطة تحليل لطخه الغربية. كما هو مبين في الشكل 2ج، تم الكشف عن egfp و FE65 6 ساعة و 12 ساعة بعد التحويل ، علي التوالي. ولوحظت مستويات التعبير مماثله من البروتينات في 1 د إلى 7 د الخلايا العصبية بعد ترانسفيكشن. وهذا يدل علي ان تحليل النمو العصبي يمكن القيام به في وقت مبكر من 6 ح بعد التحويل أو في الخلايا العصبية أكثر نضجا. معا ، تشير هذه البيانات إلى ان البروتوكول المذكور مناسب لتحديد دور البروتينات التنظيمية العصبية المفترضة بواسطة التحوير الكلاسيكي.

ونحن أيضا رصد تاثير الجرعة الجينية علي العصب العصبي عن طريق تحويل الخلايا العصبية القشرية الفئران الاوليه مع كميات مختلفه من FE65 البلازميد الحمض النووي. كما هو مبين في الشكل 2د، لوحظت زيادة تعتمد علي الجرعة في التمديد العصبي من 0-0.5 ميكروغرام من الحمض النووي FE65 بلازميد. ومع ذلك ، لم يكن هناك فرق كبير بين الخلايا العصبية التي نقلت مع اما 0.5 ميكروغرام أو 1 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد (الشكل 2د).

Figure 1
الشكل 1: يتم تضمين العصب العصبي بواسطة Cyto و NGF. E18 الفئران الخلايا العصبية القشرية تم نقلها علي DIV2 مع ناقل التعبير EGFP. 6 ح بعد النقل ، عولجت الخلايا مع (ا) 0-0.5 ميكروغرام/مل cyto أو (B) 0-100 ng/ml ngf لمده 24 ساعة. ثم كانت ثابته الخلايا العصبية والذين هم علي هذا النحو. تم القبض علي الصور مع 40x الهدف باستخدام المجهر الموسع-الفلورية وتم قياس طول أطول عصب من جسم الخلية إلى غيض من مخروط النمو باستخدام ImageJ مع المساعد نيونوج. أجريت ثلاث تجارب مستقله وتم قياس ما لا يقل عن 40 الخلايا العصبية في كل مجموعه. واظهر الرسم البياني شريط التغيير اضعاف في متوسط طول العصب. واعتمد اختبار غير مقترن للتحليل الإحصائي. * p < 0.001 ، * * p < 0.05. أشرطه الخطا = s.e.m. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: FE65 يحفز نمو العصب العصبي. E18 الفئران الخلايا العصبية القشرية تم نقلها علي DIV2 اما مع التحكم في ناقلات فارغه (EV) أو FE65 مع ناقل التعبير EGFP. وكانت الخلايا ثابته وغير البالغة 24 ساعة بعد الحقن. (ا) كانت الخلايا العصبية المقسمة ملطخه بالأجسام المضادة لFE65 وعدد الزنزانات التي بها egfp أو FE65 منفردة و egfp + FE65 المشتركة بين الناقلات تم احتسابها. وأجريت ثلاث تجارب مستقله واحصي ما لا يقل عن 100 زنزانة في كل تجربه. وتم التعبير عن البيانات باعتبارها النسبة المئوية للخلايا التي بها إشارات EGFP و EGFP + FE65. * p < 0.001. أشرطه الخطا = ذاكره (B) تم قياس طول أطول العصب من جسم الخلية إلى غيض من مخروط النمو باستخدام imagej مع المساعد نيونوج. وعرضت صور الخلايا العصبية التمثيلية في اللوحة اليمني. FE65 كان ملطخا بمضاد لFE65 الماعز كما هو موصوف8,17. أجريت ثلاث تجارب مستقله وتم قياس ما لا يقل عن 40 الخلايا العصبية لكل عمليه نقل. واظهر الرسم البياني شريط التغيير اضعاف في متوسط طول العصب. تم تحليل البيانات بواسطة اختبار t غير المقترن. * p < 0.001. أشرطه الخطا = شريط مقياس S.E.M. = 10 μm. (ج) التحليل الغربي للطخه التعبير عن مستويات EGFP و FE65 في النقاط الزمنيه التالية للتحويل علي النحو المبين. تم الكشف عن EGFP و FE65 بواسطة الماوس المضادة GFP ومكافحه myc (إلى FE65 C-الطرفية myc العلامة) ، علي التوالي. (د) متوسط طول العصب من الخلايا العصبية المتحولة مع كميات مختلفه من الحمض النووي FE65 البلازميد كما هو مبين. وأجريت تحليلات احصائيه باستخدام اختبارات ANOVA ذات اتجاه واحد مع اختبار بونفيرروني المخصص لمرحله ما بعد الدراسة. * p < 0.001 ، * * p < 0.05. أشرطه الخطا = شريط مقياس S.E.M. = 10 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

كما ذكر من قبل ، وتستخدم علي نطاق واسع PC12 والمستنسخات لها لدراسة تمديد نيوريت لان لديهم كفاءه ممتازة ترانسكشن2،3. في المقابل ، الخلايا العصبية الاوليه لديها معدل التحويل منخفضه ، والتي هي عقبه رئيسيه لدراسة المنظمين العصب العصبي من قبل الانتقال7. هنا ، ونحن وصف بروتوكول مناسب لقياس النمو العصبي في الخلايا العصبية الاوليه. وعلي الرغم من انخفاض كفاءه التحويل الكلي ، فان أكثر من 80% من الخلايا العصبية المحولة كانت ناجحه بنجاح مع البروتينين: FE65 و EGFP (الشكل 2ا). ولذلك ، من خلال تحليل الخلايا العصبية الموسومة EGFP ، يمكن تحديد تاثير FE65 علي نمو العصب العصبي بدقه (الشكل 2ب).

ميزه أخرى للنهج القائم علي EGFP الموصوفة هو ان تلطيخ المناعي يمكن حذفها. تلطيخ المناعية من tuj 1 ، وهي فئة الخلايا العصبية الخاصة الثالثة β-الأنابيب ، ويستخدم علي نطاق واسع كعلامة المورفولوجية عند دراسة استطاله العصب18،19،20،21. بالاضافه إلى tuj 1 ، تلطيخ من البوي مطلوب لتحديد الخلايا العصبية المتحولة19،22،23. ومن المعروف ان اتساق تلطيخ المناعي ، وهو أمر بالغ الاهميه لقياس العصب العصبي ، يتاثر بالعديد من العوامل بما في ذلك اعداد العينة والأجسام المضادة24. التالي ، فان البساطة العامة للأسلوب القائم علي EGFP يمكن ان يحسن من دقه الفحص.

في البروتوكول الخاص بنا ، يتم إصلاح الخلايا العصبية لقياس العصب 24 ساعة بعد النقل العابر. وهكذا ، تتعرض الخلايا العصبية لكاشف ترانسفيكشن ل 24 ساعة. ومن المعروف منذ فتره طويلة ان الكواشف ترانسكشن هي سامه للخلايا25. إذا كان تاثير البوي علي التمديد العصبي يحتاج إلى تحديد ما بعد DIV3 ، فان التجديد المتوسط الطازج قد يساعد علي تقليل السمية. وعلاوة علي ذلك ، يمكن النظر في طرق بديله لتقديم الجينات مثل Ca2 + الفوسفات المشارك في هطول الامطار والانكسار ، وكلاهما يظهر ان له تاثير اقل سميه علي الخلايا26. بالاضافه إلى ذلك ، نعرض هنا ان اعلي تاثير FE65 علي العصب العصبي لوحظ في الخلايا العصبية التي تم نقلها مع ان 0.5 ميكروغرام من FE65 و 0.5 ميكروغرام من EGFP البلازميدات باستخدام 1 μL من كاشف التحويل. بالنسبة لغيرها من pois ، يجب تحديد الكميات المثلي من الحمض النووي البلازميد والكاشفات ترانسفيكشن كما البروتينات لها معدلات دوران مختلفه علي نطاق واسع.

بالاضافه إلى طريقه الولادة الجينية ، فان كثافة الخلايا هي معلمه هامه أخرى يجب مراعاتها. إذا كانت كثافة الخلايا العصبية مرتفعه جدا ، يصبح من الصعب التعرف علي أصول العصب كما انها تتداخل مع بعضها البعض. علي الرغم من ان الخلايا الطلاء في كثافة منخفضه قد حل هذه المسالة ، فان بقاء من الخلايا العصبية الاوليه سيتم تخفيض كبير في كثافة خليه منخفضه27. وقد أظهرت الخلايا العصبية هيبوكامبال الفئران الاوليه تنمو بشكل صحي في الكثافة بين 40,000 إلى 100000/سم2 28. في هذا البروتوكول ، يتم استخدام كثافة 65000/سم2 من الخلايا العصبية القشرية الفئران. ومع ذلك ، من المهم تحديد كثافة الخلايا المناسبة لأنواع مختلفه من الخلايا العصبية تحت ظروف تجريبية مختلفه.

يتم وصف قياس العصب من الخلايا العصبية الرئيسية الفئران النامية (اي DIV3 الخلايا العصبية) هنا. ومع ذلك ، يمكن ملاحظه الظواهر العصبية أكثر نضجا في الخلايا العصبية وراء DIV329. كما اثار POIs أو المخدرات علي تمديد نيوريت في الخلايا العصبية الناضجة قد تكون مختلفه عن الخلايا العصبية النامية, التحقيق باستخدام الخلايا العصبية من مراحل مختلفه من شانه ان يوفر منظور أكثر شمولا. ومن الجدير بالذكر اننا كنا لا نزال قادرين علي مراقبه التعبير EGFP في الخلايا العصبية 7 د بعد ترانسكشن. وهذا قد يسهل دراسة POIs أو المخدرات علي نمو عصبي في الخلايا العصبية ناضجه.

الخلايا الجذعية مستحث البشرية (hiPSC) المستمدة من الإنسان هي أدوات قيمه في تحديد النهج العلاجية الجديدة. علي سبيل المثال, التحقيق في النمو العصبي في هذه الخلايا يمكن ان تكشف عن أهداف جديده في التجدد العصبي كما ان استخدام الخلايا العصبية المستمدة hiPSC يتجنب الاختلافات الأنواع. علي غرار الخلايا العصبية القوارض الاوليه ، والخلايا العصبية المشتقة hiPSC من الصعب transfect30، والتي قد تقلل من كفاءه النقل المشترك لل EGFP و POI. التالي ، فان استخدام ناقلات التعبير الثديية متعددة الخلايا يمكن ان يضمن ان جميع الخليات المقسمة تعبر عن مجموعه كامله من الجينات المقسمة بما في ذلك EGFP و POIs. الاضافه إلى ذلك ، فان الطرق البديلة لتقديم الجينات ، مثل الكهرباء ، قد تحسن كفاءه التحويل. ومره أخرى ، فان بقاء الخلية مساله تحتاج إلى النظر فيها عند استخدام نهج إيصال الجينات هذه.

ومن المعروف ان قشره الدماغ الجنينية الفئران يحتوي علي أنواع مختلفه من الخلايا العصبية بما في ذلك الخلايا العصبية النجميه شائك, الخلايا العصبية ثنائيه القطب والخلايا العصبية إسقاط طويلة31. في حين ان هذا البروتوكول المذكور هنا يمكن ان تكشف عن التاثير العام لل POIs علي النمو العصبي ، فمن الممكن ان نفس POI قد تظهر ردود مختلفه في أنواع مختلفه من الخلايا العصبية. علي سبيل المثال ، myostatin يزيد من عدد محاور الحسية ولكن ليس من السيارات محاور32. في مثل هذا السيناريو ، من الضروري تعديل البروتوكول ، مثل العزل المسبق لأنواع معينه من الخلايا العصبية عن طريق قياس التدفق الخلوي. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام الأجسام المضادة محدده علامة الخلايا العصبية لتحديد الأنواع المطلوبة من الخلايا العصبية اثناء التصوير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ انه ليس لديهم تضارب في المصالح مع محتويات هذه المادة.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل بأموال من مجلس المنح البحثية في هونغ كونغ ، وصندوق البحوث الصحية والطبية (هونغ كونغ) ، وخطه المنح المباشرة للمجلس ، وصندوق الهبات التابع للكلية المتحدة ، ومؤسسه تويلاتش الخيرية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#5 tweezers Regine 5-COB
18 mm Circle Cover Slips Thermo Scientific CB00180RA Sterilize before use
B27 Supplement Gibco 17504044
Cytochalasin D Invitrogen PHZ1063 Dissolved in DMSO
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich D2650
Dissecting Scissors, 10 cm World Precision Instruments 14393
Dissecting Scissors, 12.5 cm World Precision Instruments 15922
EndoFree Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12362
Fluorescence Mounting Medium Dako S302380
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Invitrogen 11668019
Neurobasal Medium Gibco 21103049
NGF 2.5S Native Mouse Protein Gibco 13257019
Nugent Utility Forceps, 10 mm, Straight Tip World Precision Instruments 504489
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
pEGFP-C1 Clontech #6084-1
pCI FE65 Please see references 8 and 15
PBS Tablets Gibco 18912014
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich P7280
Spatula Sigma-Aldrich S4147
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300062
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kaplan, A., Bueno, M., Hua, L., Fournier, A. E. Maximizing functional axon repair in the injured central nervous system: Lessons from neuronal development. Developmental Dynamics. 247 (1), 18-23 (2018).
  2. Harrill, J. A., Mundy, W. R. Quantitative assessment of neurite outgrowth in PC12 cells. Methods in Molecular Biology. 758, 331-348 (2011).
  3. Yeyeodu, S. T., Witherspoon, S. M., Gilyazova, N., Ibeanu, G. C. A rapid, inexpensive high throughput screen method for neurite outgrowth. Current Chemical Genomics. 4, 74-83 (2010).
  4. Ben-David, U., et al. Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response. Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).
  5. Edwards, M. A., Loxley, R. A., Williams, A. J., Connor, M., Phillips, J. K. Lack of functional expression of NMDA receptors in PC12 cells. Neurotoxicology. 28 (4), 876-885 (2007).
  6. LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
  7. Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).
  8. Cheung, H. N., et al. FE65 interacts with ADP-ribosylation factor 6 to promote neurite outgrowth. The FASEB Journal. 28 (1), 337-349 (2014).
  9. Li, W., et al. Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1. Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).
  10. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  11. Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).
  12. Swanson, L. W. Brain maps 4.0-Structure of the rat brain: An open access atlas with global nervous system nomenclature ontology and flatmaps. The Journal of Comparative Neurology. 526 (6), 935-943 (2018).
  13. Brewer, G. J. Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus. Journal of Neuroscience Research. 42 (5), 674-683 (1995).
  14. Yamada, K. M., Spooner, B. S., Wessells, N. K. Axon growth: roles of microfilaments and microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (4), 1206-1212 (1970).
  15. Casella, J. F., Flanagan, M. D., Lin, S. Cytochalasin D inhibits actin polymerization and induces depolymerization of actin filaments formed during platelet shape change. Nature. 293 (5830), 302-305 (1981).
  16. Calabrese, E. J. Enhancing and regulating neurite outgrowth. Critical Reviews in Toxicology. 38 (4), 391-418 (2008).
  17. Lau, K. F., et al. Dexras1 Interacts with FE65 to Regulate FE65-Amyloid Precursor Protein-dependent Transcription. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34728-34737 (2008).
  18. Cui, X., et al. Niacin treatment of stroke increases synaptic plasticity and axon growth in rats. Stroke. 41 (9), 2044-2049 (2010).
  19. Khodosevich, K., Monyer, H. Signaling involved in neurite outgrowth of postnatally born subventricular zone neurons in vitro. BMC Neuroscience. 11, 18 (2010).
  20. Tang, F., et al. Resveratrol Enhances Neurite Outgrowth and Synaptogenesis Via Sonic Hedgehog Signaling Following Oxygen-Glucose Deprivation/Reoxygenation Injury. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 43 (2), 852-869 (2017).
  21. He, W., Liu, Y., Tian, X. Rosuvastatin Improves Neurite Outgrowth of Cortical Neurons against Oxygen-Glucose Deprivation via Notch1-mediated Mitochondrial Biogenesis and Functional Improvement. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 6 (2018).
  22. Tesarova, P., et al. Receptor for advanced glycation end products (RAGE)--soluble form (sRAGE) and gene polymorphisms in patients with breast cancer. Cancer Investigation. 25 (8), 720-725 (2007).
  23. Park, S. Y., et al. Hippocalcin Promotes Neuronal Differentiation and Inhibits Astrocytic Differentiation in Neural Stem Cells. Stem Cell Reports. 8 (1), 95-111 (2017).
  24. Radbruch, A. Immunofluorescence: Basic Considerations. Flow Cytometry and Cell Sorting. , Springer Lab Manual Book Series. 38-52 (2000).
  25. Wang, T., Larcher, L. M., Ma, L., Veedu, R. N. Systematic Screening of Commonly Used Commercial Transfection Reagents towards Efficient Transfection of Single-Stranded Oligonucleotides. Molecules. 23 (10), (2018).
  26. Sariyer, I. K. Transfection of neuronal cultures. Methods in Molecular Biology. 1078, 133-139 (2013).
  27. Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Research. 126 (3), 397-425 (1977).
  28. Banker, G. A., Cowan, W. M. Further observations on hippocampal neurons in dispersed cell culture. The Journal of Comparative Neurology. 187 (3), 469-493 (1979).
  29. Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study. PLoS One. 8 (12), e83899 (2013).
  30. Hiragi, T., et al. Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC)-Derived Neurons in Mouse Hippocampal Slice Cultures. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 143 (2017).
  31. Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews. Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).
  32. Jones, M. R., Villalon, E., Northcutt, A. J., Calcutt, N. A., Garcia, M. L. Differential effects of myostatin deficiency on motor and sensory axons. Muscle & Nerve. 56 (6), E100-E107 (2017).

Tags

البيولوجيا التنموية ، العدد 152 ، البروتين الفلوري الأخضر المعزز ، ImageJ ، المجهر ، نمو العصب العصبي ، الخلايا العصبية الاوليه ، التحويل
فحص قائم علي بروتين الفلورية الخضراء المعززة لدراسة نمو العصب في الخلايا العصبية الاوليه
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chan, W. W. R., Li, W., Chau, D. L.… More

Chan, W. W. R., Li, W., Chau, D. L. D., Lau, K. F. An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons. J. Vis. Exp. (152), e60031, doi:10.3791/60031 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter