Summary
In diesem Bericht beschreiben wir ein einfaches Protokoll zur Untersuchung des Neuritenauswüchss in embryonalen kortikalen Neuronen von Ratten durch Co-Transfecting mit EGFP und dem Protein von Interesse.
Abstract
Neuritenwachstum ist ein grundlegendes Ereignis bei der Bildung der neuronalen Schaltkreise während der Entwicklung des Nervensystems. Schwere Neuritenschäden und synaptische Dysfunktion treten bei verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen und altersbedingten Degeneration nen auf. Die Untersuchung der Mechanismen, die das Neuritenwachstum regulieren, würde nicht nur wertvolles Licht auf die Entwicklungsprozesse des Gehirns werfen, sondern auch auf solche neurologischen Störungen. Aufgrund der geringen Transfektionseffizienz ist es derzeit schwierig, die Wirkung eines bestimmten Proteins auf das Neuritenwachstum in primären Säugetierneuronen zu untersuchen. Hier beschreiben wir eine einfache Methode zur Untersuchung des Neuritenauswuchses durch die Kotransfektion von primären kortikalen Neuronen der Ersten Ratte mit EGFP und einem Protein von Interesse (POI). Diese Methode ermöglicht die Identifizierung von POI transfizierten Neuronen über das EGFP-Signal, und so kann die Wirkung des POI auf das Neuritenwachstum genau bestimmt werden. Dieser EGFP-basierte Assay bietet einen bequemen Ansatz für die Untersuchung von Wegen zur Regulierung des Neuritenwachstums.
Introduction
Neurite, einschließlich Axone und Dendriten, sind die Projektionen von Neuronen, die an der Etablierung der neuronalen Netze beteiligt sind. Das dynamische Wachstum von Neuriten ist für die Neuroentwicklung unerlässlich. Die zugrunde liegenden Regulierungsmechanismen bleiben jedoch unklar. Insbesondere neuritäre Schäden werden oft bei verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen und nach Hirnverletzungen beobachtet1. Daher würde die Untersuchung der Rolle vermeintlicher Moleküle in verschiedenen neuriteren Auswuchs-Regulierungswegen unser Verständnis des Prozesses verbessern. Darüber hinaus kann es neue therapeutische Ziele für verschiedene neurologische Störungen offenbaren. Neuronale Zelllinien sind wertvolle Modelle für die Untersuchung neuronaler Prozesse einschließlich Neuritenwachstum, da sie leicht zu manipulieren und transfektsind 2,3. Es wurde jedoch berichtet, dass genetische Drift in einigen häufig verwendeten Zelllinien auftritt, was zu Variationen ihrer physiologischen Reaktionen führen könnte4. Darüber hinaus wurde eine differenzielle Proteinexpression zwischen neuronalen Zelllinien und primären Neuronen gezeigt. Zum Beispiel, PC12, eine neuronale Zelllinie aus Derbe rinder Nebennieren, die weit verbreitet für die Untersuchung von Neuritenauswachsen verwendet wird2,3, nicht ausdrücken NMDA-Rezeptoren5. Darüber hinaus wurde vorgeschlagen, dass die reduzierte Reaktionsfähigkeit der Maus Neuroblastom Linie Neuro-2a zu Neurotoxinen im Vergleich zu primären Neuronen ist aufgrund der mangelnden Expression bestimmter Membranrezeptoren und Ionenkanäle6. Daher sind primäre Neuronen ein wünschenswerteres und repräsentativeres Modell für die Untersuchung des Neuritenwachstums. Jedoch, die Verwendung von primären Neuronen wird durch ihre geringe Transfektion Effizienz behindert7.
Hier beschreiben wir eine Methode, die die Kotransfektion des Proteins von Interesse (POI) und EGFP in primäre kortikale Neuronen der Ratte beinhaltet. Das EGFP dient als morphologischer Marker zur Identifizierung erfolgreich transfizierter Neuronen und ermöglicht die Messung von Neuriten. Wir validierten diese Methode, indem wir Verbindungen/Moleküle verwendet haben, von denen berichtet wurde, dass sie das Neuritenwachstum modulieren. Darüber hinaus wurde FE65, ein neuronales Adapterprotein, das nachweislich das Neuritenwachstum stimuliert, verwendet, um diesen Ansatz zu veranschaulichen8,9. Dieses Protokoll beinhaltet (1) die Isolierung von primären kortikalen Neuronen von embryonalen Tag 18 (E18) Rattenembryonen, (2) die Kotransfektion von Neuronen mit EGFP und dem POI (FE65 in dieser Studie) und (3) die Bildgebung und Analyse der Neuronen mit Hilfe der Bildverarbeitung Software ImageJ mit dem NeuronJ Plugin10,11.
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Protocol
Alle verfahren entsprachen den ethischen Standards der Ethikkommission für Tierversuche der Chinesischen Universität Hongkong.
1. Herstellung von Coverlips
- Legen Sie einen sterilen 18 mm runden Abdeckungsslip in jeden Brunnen einer 12-Well-Gewebekulturplatte.
- Beschichten Sie den Deckelschlupf mit 5 g/ml Poly-D-Lysin-Lösung in einem befeuchteten 37 °C-Inkubator für mindestens 1 h.
- Die Poly-D-Lysin-Lösung von der Gewebekulturplatte absaugen und die beschichteten Abdeckungen einmal mit sterilem Wasser abspülen.
2. Ratte Embryonale Neuronensektion
- Opfern Sie eine zeitschwangere Sprague-Dawley-Ratte im Schwangerschaftsalter von 18 Tagen (E18) entweder durch Zervixdislokation oder CO2-Erstickung.
HINWEIS: Bitte überprüfen Sie die örtlichen Vorschriften für das Opfer von trächtigen Ratten. - Öffnen Sie die Bauchhöhle der schwangeren Ratte mit einer Sezierschere und übertragen Sie die Gebärmutter auf eine 10 cm Petrischale.
- Öffnen Sie die Gebärmutter und den Fruchtwassersack vorsichtig mit einer kleinen Sezierenderin und entfernen Sie die Plazenta aus dem Rattenembryon mit einer kleinen Sezierenderin. Übertragen Sie den gesamten Embryo in eine 10 cm Petrischale mit vorgekühlter Phosphat-gepufferter Saline, ergänzt mit Glucose (PBS-Glucose, 10 mM Natriumphosphate, 2,68 mM Kaliumchlorid, 140 mM Natriumchlorid und 3 g/L Glukose) mit einem Paar kleiner Zangen.
- Schneiden Sie entlang der sagittalen Naht des Schädels und öffnen Sie es vorsichtig mit einem Paar kleiner Sezieren Schere. Übertragen Sie das embryonale Gehirn mit einem kleinen flachen Spachtel auf eine 10 cm Petrischale mit eiskaltem PBS-Glucose.
- Trennen Sie die beiden zerebralen Hemisphären vom Kleinhirn und Hirnstamm mit zwei #5 Pinzette unter einem Zerlegungsmikroskop.
HINWEIS: Siehe Referenz12 für die Struktur des Rattenhirns. - Entfernen Sie die Meninges mit der #5 Pinzette.
- Isolieren Sie den Kortex von den Großhirnhälften mit zwei geraden #5 Pinzette.
- Übertragen Sie den isolierten Kortex in eine 15 ml Zentrifugenröhre in eiskalte PBS-Glucose.
3. Primäre kortikale Neuronenkultur
HINWEIS: Alle Verfahren in den Schritten 3 und 4 werden in einem Biosicherheitsschrank der Klasse II durchgeführt.
- Den isolierten Kortex bei 4 °C 5 min durch Schwerkraft absetzen und die PBS-Glukose ansaugen.
- Fügen Sie 1 ml 0,05% Trypsin-EDTA in den isolierten Kortex und mischen Sie sanft durch Tippen und Inkubieren des Gewebes in einem 37 °C Wasserbad für 10 min, um eine enzymatische Verdauung zu ermöglichen. Tippen Sie vorsichtig auf das Rohr, um alle 2 min zu mischen.
- 4 ml Pflegemedium (z.B. Neurobasal Medium) in das Gewebe/Trypsin-Gemisch geben.
HINWEIS: Alle Wartungsmedium in diesem Protokoll verwendet wird mit Penicillin-Streptomycin und B-27 Ergänzung13ergänzt. - Dissoziieren Sie das Gewebe sanft durch Triturierung mit einer 1 ml Pipette.
- Pellet die dissoziierten Zellen durch Zentrifugation bei 200 x g für 5 min. Aspirieren Sie den Überstand.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.5 bis 3.7 zweimal.
- Das Zellpellet in 1 ml Wartungsmedium wieder aufsetzen.
- Fügen Sie 10 L von 0,4% Trypan Blue-Lösung zu 10 l Zellsuspension für die Zählung lebensfähiger Zellen durch ein Hämozytometer hinzu.
- Die Neuronen mit einer Dichte von 65.000/cm2 (lebensfähige Zellen) in 1 ml Pflegemedium pro Brunnen in einer 12-Well-Platte verkleben.
4. Zelltransfektion und Fixierung
- Nach 2 Tagen in vitro (DIV2) transfekt man 0,5 g EGFP-Konstrukt (pEGFP-C1) zusammen mit oder ohne 0,5 g POI in Neuronen unter Verwendung von 1 l Transfektionsreagenz (z. B. Lipofectamin 2000). Verwenden Sie die Anweisungen des Herstellers.
HINWEIS: Säugetierexpressionskonstrukte wurden mit einem Endotoxin-freien Plasmid-Präparat-Kit hergestellt. Die Behandlung mit Chemikalien/Molekülen (in diesem Manuskript wurden Cytochalasin D (Cyto D) und Nervenwachstumsfaktor (NGF) verwendet) kann bei 6 h nach der Transfektion erfolgen. - Das Kulturmedium 24 h nach der Transfektion ansaugen und die transfizierten Zellen einmal mit 37 °C PBS (10 mM Natriumphosphate, 2,68 mM Kaliumchlorid, 140 mM Natriumchlorid) waschen.
- Fixieren Sie die Zellen mit 4% Paraformaldehyd in PBS für 10 min im Dunkeln bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie die festen Zellen dreimal mit PBS.
- Fügen Sie eine minimale Menge an Fluoreszenz-Montagemedium auf einem Mikroskop-Glasschlitten hinzu. Übertragen Sie den Deckelrutsch von der 12-Well-Platte vorsichtig auf das Montagemedium mit der Probe zur Glasrutsche.
HINWEIS: Versiegeln Sie den Rand des Deckels mit Nagellack, wenn ein wässriges Montagemedium verwendet wird.
5. Messung des Neuritenauswüchses
- Verwenden Sie ein 40-faches Objektiv, um Bilder mit einem Epifluoreszenzmikroskop zu erfassen.
- Erfassen Sie Bilder von mindestens 40 intakten Neuronen mit EGFP-Signal pro Transfektion.
- Öffnen Sie das aufgenommene Bild in der ImageJ-Software mit dem NeuronJ-Plugin11, um die Länge des längsten Neurites vom Zellkörper bis zur Spitze des Wachstumskegels jedes abgebildeten Neurons zu messen.
- Analysieren Sie die mit der Software erhaltenen Daten, um die Wirkung der gezielten Proteine im Neuritenwachstum zu bestimmen.
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Representative Results
Um diese Methode zu testen, verwendeten wir Cyto D und den Nervenwachstumsfaktor NGF, die nachweislich das Neuritenwachstum bzw.14,15,16hemmen und stimulieren. Die Neuritenlänge der mit EGFP transfizierten Neuronen wurde nach der Behandlung mit Cyto D oder NGF gemessen. Die Transfektionseffizienz von EGFP auf die Neuronen betrug 2,7% (1.068 Neuronen gezählt). Wie in Abbildung 1Adargestellt, unterdrückte Cyto D die Neuritenverlängerung dosisabhängig. Umgekehrt wurde das Neuritenwachstum in den mit NGF behandelten Neuronen potenziert (Abbildung 1B).
Als nächstes untersuchten wir den Nutzen dieses Systems, indem wir den neuronalen Adapter FE65 transfizieren, der nachweislich das Neuritenwachstum fördert. Primäre kortikale Neuronen der Ratte wurden mit FE65 und EGFP kotransfiziert. Trotz der geringen Transfektionseffizienz ergab die Immunfluoreszenzanalyse, dass über 80 % der Neuronen erfolgreich mit EGFP und FE65 kotransfiziert wurden (Abbildung 2A). Ähnlich wie in früheren Berichten8,9stimulierte FE65 das Neuritenwachstum signifikant um das 2x (Abbildung 2B). Wir analysierten auch die Expression von EGFP und FE65 zu verschiedenen Zeitpunkten durch Western Blot-Analyse. Wie in Abbildung 2Cdargestellt, wurden EGFP und FE65 6 h bzw. 12 h nach der Transfektion nachgewiesen. Ähnliche Expressionsniveaus der Proteine wurden in 1 d bis 7 d Posttransfektionsneuronen beobachtet. Dies deutet darauf hin, dass die Analyse des Neuritenauswüchses bereits 6 h nach der Transfektion oder in reiferen Neuronen durchgeführt werden könnte. Zusammen deuten diese Daten darauf hin, dass das erwähnte Protokoll geeignet ist, die Rolle von vermeintlichen Neuriten-Auswuchs-Regulierungsproteinen durch klassische Transfektion zu bestimmen.
Wir überwachten auch die Wirkung der Gendosis auf das Neuritenwachstum, indem wir primäre kortikale Neuronen der Ratte mit unterschiedlichen Mengen an FE65-Plasmid-DNA transfizieren. Wie in Abbildung 2Ddargestellt, wurde eine dosisabhängige Erhöhung der Neuritenerweiterung von 0 - 0,5 g FE65-Plasmid-DNA beobachtet. Es gab jedoch keinen signifikanten Unterschied zwischen Neuronen, die entweder mit 0,5 g oder 1 g Plasmid-DNA transfiziert wurden (Abbildung 2D).
Abbildung 1: Das Neuritenwachstum wird durch Cyto D und NGF moduliert. E18 kortikale Neuronen von Ratten wurden auf DIV2 mit einem EGFP-Expressionsvektor transfiziert. 6 h nach der Transfektion wurden die Zellen 24 h lang mit (A) 0-0,5 g/ml Cyto D oder (B) 0-100 ng/mL NGF behandelt. Dann wurden die Neuronen fixiert und entsprechend abgebildet. Die Bilder wurden mit einem 40-fachen Objektiv mit einem Epifluoreszenzmikroskop aufgenommen und die Länge des längsten Neurititen vom Zellkörper bis zur Spitze des Wachstumskegels wurde mit ImageJ mit dem NeuronJ-Plugin gemessen. Es wurden drei unabhängige Experimente durchgeführt und mindestens 40 Neuronen in jeder Gruppe gemessen. Das Balkendiagramm zeigte die Faltenänderung in der mittleren Neuritenlänge. Für die statistische Analyse wurde ein ungepaarter t-Test angenommen. *p < 0.001, **p < 0.05. Fehlerbalken = S.E.M. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: FE65 stimuliert das Neuritenwachstum. E18 kortikale Neuronen von Ratten wurden auf DIV2 mit entweder leerer Vektorsteuerung (EV) oder FE65 zusammen mit einem EGFP-Expressionsvektor transfiziert. Die Zellen wurden 24 h nach der Transfektion fixiert und abgebildet. (A) Die transfizierten Neuronen wurden mit Anti-FE65-Antikörpern gegenstainiert und die Anzahl der Zellen mit EGFP oder FE65 singly transfiziert und EGFP + FE65 kotransfiziert wurden gezählt. Es wurden drei unabhängige Experimente durchgeführt und mindestens 100 Zellen in jedem Experiment gezählt. Die Daten wurden als Prozentsatz der Zellen mit EGFP- und EGFP + FE65-Signalen ausgedrückt. *p < 0.001. Fehlerbalken = S.D. (B) Die Länge des längsten Neurititen vom Zellkörper bis zur Spitze des Wachstumskegels wurde mit ImageJ mit dem NeuronJ-Plugin gemessen. Repräsentative Neuronenbilder wurden im rechten Bereich gezeigt. FE65 wurde von einem Ziegenanti-FE65-Antikörper wie beschrieben8,17gebeizt. Es wurden drei unabhängige Experimente durchgeführt und mindestens 40 Neuronen pro Transfektion gemessen. Das Balkendiagramm zeigte die Faltenänderung in der mittleren Neuritenlänge. Die Daten wurden durch einen ungepaarten t-Test analysiert. *p < 0.001. Fehlerbalken = S.E.M. Scale bar = 10 m. (C) Western Blot Analyse der Expression von EGFP und FE65 an den nachdertransfektionszeitpunkten angegebenen Zeitpunkten. EGFP und FE65 wurden von Maus-Anti-GFP und Anti-Myc (zu FE65 C-terminal myc-Tag) erkannt. (D) Die durchschnittliche Neuritenlänge von Neuronen, die mit verschiedenen Mengen von FE65-Plasmid-DNA transfiziert wurden, wie angegeben. Statistische Analysen wurden mit einseitigen ANOVA-Tests mit Bonferroni-Post-hoc-Tests durchgeführt. *p < 0.001, **p < 0.05. Fehlerbalken = S.E.M. Scale bar = 10 'm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Wie bereits erwähnt, PC12 und seine Subklonen sind weit verbreitet für das Studium der Neuritenerweiterung verwendet, weil sie ausgezeichnete Transfektionseffizienz2,3haben. Im Gegensatz dazu haben primäre Neuronen eine niedrige Transfektionsrate, was ein großes Hindernis für die Untersuchung von Neuriten-Auswuchsregulatoren durch Transfektion7darstellt. Hier beschreiben wir ein praktisches Protokoll zur Quantifizierung des Neuritenwachstums in primären Neuronen. Trotz der geringen Gesamttransfektionseffizienz wurden mehr als 80% der transfizierten Neuronen erfolgreich mit den beiden Proteinen FE65 und EGFP kotransfiziert (Abbildung 2A). Daher konnte durch die Analyse der EGFP-markierten Neuronen die Wirkung von FE65 auf das Neuritenwachstum genau bestimmt werden (Abbildung 2B).
Ein weiterer Vorteil des beschriebenen EGFP-basierten Ansatzes besteht darin, dass die Immunfluoreszenzfärbung entfallen kann. Die Immunfluoreszenzfärbung von Tuj 1, einer neuronspezifischen Klasse III- und Tubulin, wird bei der Untersuchung der Neuritendehnung18,19,20,21als morphologischer Marker weit verbreitet. Zusätzlich zu Tuj 1 ist die Färbung des POI für die Identifizierung transfizierter Neuronen19,22,23erforderlich. Es ist bekannt, dass die Konsistenz der Immunfluoreszenzfärbung, die für die Neuritenauswuchsmessung entscheidend ist, durch viele Faktoren beeinflusst wird, einschließlich Probenvorbereitung und Antikörper24. Daher könnte die allgemeine Einfachheit der EGFP-basierten Methode die Genauigkeit des Assays verbessern.
In unserem Protokoll sind Neuronen für die Neuritenmessung 24 h nach der Transfektion fixiert. So sind Neuronen dem Transfektionsreagenz für 24 h ausgesetzt. Es ist seit langem bekannt, dass Transfektionsreagenzien für die Zellen25giftig sind. Wenn die Wirkung des POI auf die Neuritenverlängerung über DIV3 hinaus bestimmt werden muss, kann eine frische mittlere Auffüllung dazu beitragen, die Toxizität zu minimieren. Darüber hinaus können alternative Genabgabemethoden wie Ca 2+-Phosphat-Ko-Fällung und Nukleofektion in Betracht gezogen werden, die beide nachweislich eine weniger toxische Wirkung auf die Zellen26haben. Darüber hinaus zeigen wir hier, dass die höchste Wirkung von FE65 auf das Neuritenwachstum in den Neuronen beobachtet wird, die mit den 0,5 g FE65 und 0,5 g EGFP-Plasmiden transfikiert wurden, indem 1 l Transfektionsreagenz verwendet werden. Bei anderen POIs sollten die optimalen Mengen an Plasmid-DNA und Transfektionsreagenzien bestimmt werden, da Proteine sehr unterschiedliche Fluktuationsraten aufweisen.
Neben der Genabgabemethode ist die Zelldichte ein weiterer kritischer Parameter, der berücksichtigt werden muss. Wenn die Neuronendichte zu hoch ist, wird es schwierig, die Ursprünge von Neuriten zu identifizieren, da sie sich überlappen würden. Obwohl die Beschichtung von Zellen mit geringer Dichte das Problem lösen kann, würde das Überleben der primären Neuronen bei einer niedrigen Zelldichte signifikant reduziert27. Primäre Ratten-Hippocampus-Neuronen haben gezeigt, dass gesund mit der Dichte zwischen 40.000 bis 100.000/cm2 28wachsen. In diesem Protokoll wird eine Dichte von 65.000/cm2 von kortikalen Neuronen der Ratte verwendet. Dennoch ist es wichtig, die geeignete Zelldichte für verschiedene Arten von Neuronen unter verschiedenen experimentellen Bedingungen zu bestimmen.
Die Neuritenmessung der entwicklungden primären Neuronen der Ratte (d.h. DIV3-Neuronen) wird hier beschrieben. Jedoch, reifere neuronale Phänotypen können in Neuronen über DIV329beobachtet werden. Da die Auswirkungen von POIs oder Medikamenten auf die Neuritenerweiterung in reifen Neuronen von den sich entwickelnden Neuronen abweichen können, würde die Untersuchung durch die Verwendung von Neuronen aus verschiedenen Stadien eine umfassendere Perspektive bieten. Es ist erwähnenswert, dass wir immer noch in der Lage waren, DIE EGFP-Expression in den Neuronen 7 d nach der Transfektion zu beobachten. Dies kann die Untersuchung von POIs oder Medikamenten auf Neuritenwachstum in reifen Neuronen erleichtern.
Humaninduzierte pluripotente Stammzell (hiPSC)-abgeleitete Neuronen sind wertvolle Werkzeuge zur Identifizierung neuartiger therapeutischer Ansätze. Zum Beispiel könnte die Untersuchung des Neuritenwachstums in diesen Zellen neue Ziele in der Neuroregeneration aufdecken, da die Verwendung von hiPSC-abgeleiteten Neuronen die Artenunterschiede vermeidet. Ähnlich wie primäre Nagetierneuronen, hiPSC-abgeleitete Neuronen sind schwierig zu transfetieren30, die die Co-Transfektion Effizienz von EGFP und poI reduzieren kann. Daher könnte die Verwendung polycistronischer Säugetierexpressionsvektoren sicherstellen, dass alle transfizierten Zellen den gesamten Satz transfizierter Gene, einschließlich EGFP und POIs, ausdrücken. Darüber hinaus können alternative Genabgabemethoden, wie Elektroporation, die Transfektionseffizienz verbessern. Auch hier ist die Zelllebensfähigkeit ein Problem, das bei der Verwendung solcher Genabgabeansätze berücksichtigt werden muss.
Es ist bekannt, dass die Ratte embryonale Gehirn Kortex enthält verschiedene Arten von Neuronen einschließlich spiny stellate Neuronen, bipolare Neuronen und lang-projizierte Neuronen31. Während dieses hier angegebene Protokoll die allgemeine Wirkung von POIs auf das Neuritenwachstum aufzeigen kann, ist es möglich, dass die gleiche POI unterschiedliche Reaktionen in verschiedenen Arten von Neuronen aufweisen kann. Zum Beispiel erhöht Myostatin die Anzahl der sensorischen Axone, aber nicht die von Motoraxons32. In einem solchen Szenario ist eine Änderung des Protokolls erforderlich, z. B. vorherige Isolierung bestimmter Arten von Neuronen durch Durchflusszytometrie. Alternativ können spezifische neuronale Marker-Antikörper zur Identifizierung der erforderlichen Neuronentypen während der Bildgebung verwendet werden.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte mit dem Inhalt dieses Artikels haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Mittel des Research Grants Council Hong Kong, health and Medical Research Fund (Hong Kong), CUHK Direct Grant Scheme, des United College Endowment Fund und des TUYF Charitable Trust unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 tweezers | Regine | 5-COB | |
| 18 mm Circle Cover Slips | Thermo Scientific | CB00180RA | Sterilize before use |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| Cytochalasin D | Invitrogen | PHZ1063 | Dissolved in DMSO |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dissecting Scissors, 10 cm | World Precision Instruments | 14393 | |
| Dissecting Scissors, 12.5 cm | World Precision Instruments | 15922 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| Fluorescence Mounting Medium | Dako | S302380 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| NGF 2.5S Native Mouse Protein | Gibco | 13257019 | |
| Nugent Utility Forceps, 10 mm, Straight Tip | World Precision Instruments | 504489 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pEGFP-C1 | Clontech | #6084-1 | |
| pCI FE65 | Please see references 8 and 15 | ||
| PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Spatula | Sigma-Aldrich | S4147 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 |
References
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