Summary
Die galvanische vestibuläre Stimulation beim Menschen zeigt Verbesserungen in der vestibulären Funktion. Es ist jedoch nicht bekannt, wie diese Effekte auftreten. Hier beschreiben wir, wie man sinusförmiges und stochastisches elektrisches Rauschen aufträgt und geeignete Stimulusamplituden in einzelnen medialen vestibulären Nukleusneuronen in der C57BL/6-Maus auswertet.
Abstract
Es hat sich gezeigt, dass die galvanische vestibuläre Stimulation (GVS) die Gleichgewichtsmaße bei Personen mit Gleichgewichts- oder vestibulären Beeinträchtigungen verbessert. Dies wird aufgrund des Stochastischen Resonanzphänomens (SR) vorgeschlagen, das als Anwendung eines Low-Level-/Unterschwellenreizes auf ein nichtlineares System definiert ist, um die Erkennung schwächerer Signale zu erhöhen. Es ist jedoch noch nicht bekannt, wie SR seine positiven Auswirkungen auf das menschliche Gleichgewicht zeigt. Dies ist eine der ersten Demonstrationen der Auswirkungen von sinusförmigen und stochastischen Lärm auf einzelne Neuronen. Mit Hilfe der Ganzzell-Patchklemmenelektrophysiologie können sinusförmige und stochastische Geräusche direkt auf einzelne Neuronen im medialen vestibulären Kern (MVN) von C57BL/6-Mäusen angewendet werden. Hier zeigen wir, wie die Schwelle von MVN-Neuronen zu bestimmen, um sicherzustellen, dass die sinusförmigen und stochastischen Reize unterschwellig sind und daraus die Auswirkungen bestimmen, die jede Art von Rauschen auf den neuronalen Gewinn von MVN hat. Wir zeigen, dass unterschwelliges sinusförmiges und stochastisches Rauschen die Empfindlichkeit einzelner Neuronen im MVN modulieren kann, ohne die Basalfeuerraten zu beeinflussen.
Introduction
Das vestibuläre (oder Gleichgewichts-)System steuert unseren Gleichgewichtssinn durch die Integration von auditiven, propriozeptiven, somatosensorischen und visuellen Informationen. Die Verschlechterung des vestibulären Systems hat sich als Funktion des Alters erwiesen und kann zu Gleichgewichtsdefiziten1,2führen. Therapien, die auf das Funktionieren des vestibulären Systems abzielen, sind jedoch rar.
Galvanische Vestibuläre Stimulation (GVS) hat gezeigt, dass Balance-Maßnahmen zu verbessern, autonome Funktion und andere sensorische Modalitäten beim Menschen3,4,5,6. Diese Verbesserungen sind angeblich auf das Phänomen der Stochastischen Resonanz (SR) zurückzuführen, das die Zunahme der Detektion schwächerer Signale in nichtlinearen Systemen durch die Anwendung von Unterschwellenrauschen7,8ist. Diese Studien haben Verbesserungenbei statischen 9,10 und dynamischen11,12 Balance- und vestibulären Ausgangstests wie Ocular Counter Roll (OCR)13gezeigt. Viele dieser Studien haben jedoch verschiedene Kombinationen von Stimulusparametern wie weißes Rauschen9, farbiges Rauschen13, verschiedene Stimulusfrequenzbereiche und Schwellenwerttechniken verwendet. Daher bleiben optimale Stimulusparameter unbekannt und dieses Protokoll kann bei der Bestimmung der effektivsten Parameter helfen. Neben Stimulusparametern ist die Art des Stimulus auch bei der therapeutischen und experimentellen Wirksamkeit wichtig. Die oben genannten Arbeiten beim Menschen wurden mit elektrischen Lärmreizen durchgeführt, während ein Großteil der in vivo Tierischen Arbeit mechanische14,15 oder optogenetische16 Lärmreize verwendet hat. Dieses Protokoll wird elektrisches Rauschen verwenden, um die Auswirkungen auf vestibuläre Kerne zu untersuchen.
Zuvor wurde die Anwendung von GVS zur Stimulierung der primären vestibulären Afferents in vivo bei Eichhörnchenaffen17, Chinchillas18, Hühnerembryonen15 und Meerschweinchen14durchgeführt. Allerdings untersuchten nur zwei dieser Studien die Auswirkungen von GVS auf den Gewinn von primären vestibulären Afferents14,15. Diese Experimente wurden in vivo durchgeführt, was bedeutet, dass die genauen Stimulationsmuster, die vestibulären Kernen auferlegt werden, nicht bestimmt werden können. Unserer Kenntnis nach hat nur eine andere Studie stochastisches Rauschen auf einzelne enzymatisch dissoziierte Neuronen im Zentralnervensystem angewendet19. Es wurden jedoch keine Experimente in den zentralen vestibulären Kernen durchgeführt, um geeignete Stimulusparameter und Schwellenwerttechniken zu bewerten, wodurch dieses Protokoll bei der Bestimmung der Stimuluseffekte auf einzelne Neuronen innerhalb der vestibulären Kerne.
Hier beschreiben wir, wie man sinusförmiges und stochastisches (elektrisches) Rauschen direkt auf einzelne Neuronen im medialen vestibulären Kern (MVN) aufträgt, die neuronale Schwelle bestimmt und Veränderungen der Gewinn-/Empfindlichkeit misst.
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Protocol
Alle beschriebenen Experimentellen Protokolle wurden von der Animal Ethics Committee der University of Sydney genehmigt (genehmigte Protokollnummer: 2018/1308).
1. Tiere
HINWEIS: Mäuse wurden aus dem Australian Rodent Centre (ARC; Perth, Australien) und in der Medical Foundation Building Animal Facility der University of Sydney.
- Halten Sie die Mäuse auf einem normalen 12 h Licht/Dunkel-Zyklus mit Umweltanreicherung.
- Verwenden Sie männliche und weibliche C57BL/6-Mäuse (3–5 Wochen alt) für alle Experimente.
2. Vorbereitung von Lösungen
- Bereiten Sie 1 L künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) bestehend aus 29 mM NaHCO3, 11 mM Glukose, 120 mM NaCl, 3,3 mM KCl, 1,4 mM NaH2PO4, 2,2 mM MgCl2, 2,77 mM CaCl2.
- Bereiten Sie 200 ml Saccharose-ACSF (sACSF) mit 29 mM NaHCO3, 11 mM Glukose, 241,5 mM Saccharose, 3,3 mM KCl, 1,4 mM NaH2PO4, 2,2 mM MgCl2, 2,77 mM CaCl2vor. Vor der Aufnahme von CaCl2 in die ACSF und sACSF, Gas die Lösungen mit Carbogen (95 % O2 und 5 % CO2 ), um einen pH-Wert von 7,4 zu etablieren und Kalziumfällung (Trübung) zu vermeiden.
- Bereiten K+-basierte intrazelluläre Lösung bestehend aus 70 mM Kaliumgluconat, 70 mM KCl, 2 mM NaCl, 10 mM HEPES, 4 mM EGTA, 4 mM Mg2-ATP, 0,3 mM Na3-GTP; mit einem endgültigen pH-Wert von 7,3 (angepasst mit KOH).
HINWEIS: Es wird empfohlen, intrazelluläre Lösungen mit 0,22 m Filtern zu filtern und 0,5 ml Aliquots der Lösung bei -20 °C zu speichern.
3. Vorbereitung des Brainstem
- Vor der Hirnstammextraktion den sACSF mit Carbogen ausstatten und bei -80 °C 25 min abkühlen lassen, so dass eine Eisschlämme gebildet wird.
- Anästhesisieren Sie die Maus mit Isofluran (3–5 %) sauerstoffgesättigt (3 ml/min). Sobald die Hinterpfotenreflexe fehlen, enthaupten Sie die Maus mit einer scharfen Edelstahlschere.
- Setzen Sie den Schädel aus, indem Sie einen sagittalen Schnitt in der Haut mit einer Rasierklinge (#22 abgerundet) machen.
- Mit dem spitzen Ende eines PaarStandard-Muster Schere machen einen kleinen Schnitt am Lambda und entlang der Längsspalte geschnitten.
- Reflektieren Sie vorsichtig die gepaarten parietalen Knochen und die okzipitalen Knochen mit einem Paar flach-biegsamer Pearson-Rongeurs.
HINWEIS: Während dieses gesamten Eingriffs wird das Gehirn kontinuierlich vor Ort mit der zuvor vorbereiteten eiskalten SACSF-Gülle gebadet. - Isolieren Sie den Hirnstamm aus dem Vorderhirn und seine knöcherne Ummantelung mit einer Rasierklinge (#11 gerade), um den parieto-okzipitalen Sulcus und an der kaudalen Medulla zu schneiden.
- Montieren Sie das isolierte Brainstem ventrale Ende auf einem zuvor geschnittenen trapezförmigen Polystyrolblock. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit um das sezierte Gewebe mit einem Docht aus Gewebepapier, um eine gute Gewebehaftung an der Schneidstufe zu gewährleisten.
HINWEIS: Der Polystyrolblock wird in trapezförmiger Form geschnitten, um sicherzustellen, dass das rostrale Ende des Mittelhirns in das Rückenmark passt und verjüngen. - Verwenden Sie Cyanoacrylatkleber, um den Polystyrolblock mit dem angeschlossenen Brainstem rostralen Ende bis zur Schnittstufe zu fixieren.
- Bereiten Sie mit einer Vorgeschwindigkeit von 0,16 mm/s und einer Schwingungsamplitude von 3,00 mm 200 m Querscheiben des MVN vor.
HINWEIS: Die Position des MVN wird mit dem Paxinos- und Franklin-Maus-Gehirnatlas (Abbildungen 79–89)20bestimmt. Das MVN (im Atlas als MVe aufgeführt) liegt unmittelbar ventrolateral zum 4. Ventrikel und ist der größte direkt vor der Befestigung des Kleinhirns (zwischen dem minderwertigen Colliculi und dem Obex). - Verwenden Sie eine kunststoffbeschnittene Pipette, um Scheiben vor der Aufnahme mindestens 30 min lang in einem karbogenierten ACSF bei 25 °C zu übertragen.
4. Instrumente
- Verwenden Sie ein elektrophysiologisches Standard-Setup, um ganzzellige Patchklemmen-Techniken durchzuführen21.
- Bereiten Sie Mikropipetten mit einem zweistufigen Protokoll (Wärmeschritt 1: 70; Wärmeschritt 2: 45) auf einem Mikropipette-Puller vor (siehe Materialtabelle). Mikropipetten sollten einen Endwiderstand zwischen 3 und 5 M und interner Lösung aufweisen, wenn sie in das Bad gelegt werden.
HINWEIS: Die verwendeten Einstellungen können je nach Temperatur im Raum variieren und können sich recht häufig ändern.
5. Ganzzellige Patchklemme Elektrophysiologie
- Um Ganzzell-Patchklemmenaufnahmen von einzelnen Neuronen im MVN zu erhalten, wird innerhalb der Aufnahmepipette eine K +-basierte interne Lösung verwendet.
- Übertragen Sie eine einzelne Gewebescheibe aus der Inkubationskammer in die Aufnahmekammer und sichern Sie die Scheibe mit einem Nylonfaden auf einem U-förmigen Gewicht. Kontinuierliche durchdringen die Aufnahmekammer mit Karbogenat-ACSF bei 25 °C bei einem Durchfluss von 3 ml/min.
- Nachdem Sie eine Mikropipette mit interner Lösung gefüllt haben, lokalisieren Sie den MVN mit einer low power (10x) Objektivlinse. Mit einem Hochleistungsobjektiv (40x) können einzelne Neuronen innerhalb des MVN lokalisiert werden.
HINWEIS: Die Zellqualität ist entscheidend, um die Qualität der Aufnahmen und die Haltbarkeit der Zelle zu gewährleisten, wenn sie versucht, die Ganzzellenkonfiguration zu erreichen. Eine gute Zelle zeigt sphärische Form, eine reflektierende Zellmembran und einen unsichtbaren Kern. Eine schlechte Zelle hat einen großen sichtbaren Kern (ei-like) und ein geschwollenes/geschrumpftes Aussehen. - Bevor Sie das Gewebe mit der Pipette durchbrechen, wenden Sie eine kleine Menge an positivem Druck an, um Schmutz von der Pipettenspitze wegzuschieben.
- Bewegen Sie die Pipette mit dem Mikromanipulator in Richtung des gewählten Neurons und ein kleines Dimple sollte sich auf der neuronalen Membran bilden. Lassen Sie positiven Druck los und wenden Sie eine kleine Menge an Unterdruck an.
- Sobald eine 1 G-Zoll-Dichtung erreicht ist, wenden Sie einen sanften kurzen und scharfen positiven Druck auf den Pipettenhalter durch den Sauganschluss an, um die Membran zu brechen und eine Ganzzellkonfiguration zu erstellen.
- Machen Sie Ganzzellstromklemmenaufnahmen mit Standardtechniken21,22.
6. Anwendung von sinusförmigem und stochastischem Rauschen auf einzelne mediale Vestibularnukleus Neuronen
- Wenden Sie das stochastische und sinusförmige Rauschen bei einer Reihe von Amplituden von 3 bis 24 pA an, um die neuronale Schwelle und Die Feuerrate zu bestimmen.
- Bestimmen Sie den sensorischen Schwellenwert, indem Sie niedrigere und höhere Stimulusintensitäten gruppieren, und führen Sie eine ANOVA durch, um Unterschiede zu beobachten (siehe Ergänzende Abbildung 1).
- Berechnen Sie die durchschnittliche Abschussrate über den 10 s-Zeitraum, in dem der depolarisierende Stromschritt für jede einzelne aktuelle Stufe injiziert wurde/wird (d. h. 7 Gesamtepisoden; Abbildung 1).
- Verwenden Sie die durchschnittlichen Brennrate-Werte, um eine Brennrate im Vergleich zum aktuellen Diagramm zu generieren, und führen Sie eine lineare Regressionsanalyse durch, um den Gradienten der Linie der besten Anpassung zu bestimmen. Der Gradient der Linie der besten Passung ist bezeichnend für den neuronalen Gewinn22.
Abbildung 1: Diagrammprofile von Steuerungs-, sinusförmigen und stochastischen Rauschprotokollen. (A) Kontrollprotokolle (kein Rauschen) werden auf MVN-Neuronen angewendet. (B) Sinusförmiges Rauschprotokoll mit einer Frequenz von 2 Hz. (C) Stochastische Rauschprotokolle, bei denen der größte Teil des Leistungsspektrums 2 Hz beträgt. Jedes hier vorgestellte Protokoll hat eine Amplitude von 6 pA mit einem Depolarisierungsstrom von 10 s, der um 10 pA bis zu 50 pA ansteigt. Der wahre Stimulus hat keinen depolarisierenden aktuellen Schritt und ist daher die erste Episode dieser Protokolle, um neuronale Gain-Änderungen zu bestimmen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Representative Results
Erste Aufnahmen können Informationen über die Auswirkungen liefern, die sinusförmiges und stochastisches Rauschen auf die Basalfeuerraten einzelner MVN-Neuronen haben und wie die Reize den Gewinn von Neuronen wirken. Abbildung 2 zeigt, dass weder sinusförmige noch stochastische Geräusche die Basalfeuerraten von MVN-Neuronen im Vergleich zu Kontrollaufzeichnungen (kein Rauschen) verändern. Diese Informationen sind entscheidend für die Bestimmung der Schwelle der einzelnen Neuronen. Während der Anwendung der galvanischen vestibulären Stimulation beim Menschen wird eine sensorische Schwellenaufgabe durchgeführt, um sicherzustellen, dass der Stimulus unterschwelligist 13. Der unterschwellige Stimulus ist ein wichtiger Bestandteil des stochastischen Resonanzphänomens (SR)7,8. In vitro muss diese Schwellenaufgabe anders ausgeführt werden, und die Aktivität oder Basalabschussrate von Neuronen wurde dafür gewählt. Dadurch wird sichergestellt, dass die Reize so nah wie möglich an der Unterschwelle liegen und damit mit Studien am Menschen vergleichbar sind. Abbildung 2B zeigt, dass der gewählte Rauschpegel (6 pA) unterschwellig ist, da festgestellt werden kann, dass die durchschnittliche Brennrate von 12 pA (experimentelleschwelle) zu steigen beginnt. Dieser Schwellenwert wurde objektiv durch Die Gruppierung der Stimulusniveaus über (18 und 24 pA) und darunter (3 und 6 pA) des Schwellenwerts von 12 pA bestimmt und ist in der ergänzenden Abbildung 1dargestellt.
Als nächstes wurde der neuronale Gewinn bewertet, indem Neuronen einer Reihe depolarisierender Stromschritte unterzogen wurden (0-50 pA, Erhöhung um 10 pA) mit und ohne (Kontroll-)Rauschen (Abbildung 1). Diese Ergebnisse sind entscheidend für die Bestimmung der Wirkung, die stochastisches Rauschen auf Neuronen im zentralen vestibulären System haben kann, und damit potenziell, wie GVS seine Auswirkungen auf das menschliche Gleichgewicht auslöst. Abbildung 3 zeigt, dass sinusförmiges (Abbildung 3B) und stochastisches (Abbildung 3A) Rauschen, das bei Unterschwellenamplituden von 6 pA angewendet wird, die Verstärkung von MVN-Neuronen verändern können. Diese Ergebnisse wurden bewertet, indem die Brennrate während jedes 10 s-Stromschritts gemessen und eine lineare Regressionsanalyse durchgeführt wurde, um die Verstärkung (Gradient) aus der Linie der besten Anpassung zu berechnen.
Abbildung 2: Die Wirkung von sinusförmigen und stochastischen Geräuschen auf die neuronale Brennrate von MVN. (A) Stochastische (SN; mittlere Spur) und sinusförmiges Rauschen (untere Spur) bei einer 6 pA Amplitude zeigen keinen signifikanten Einfluss auf die Basalfeuerrate eines einzelnen MVN-Neurons im Vergleich zur Kontrolle (kein Rauschen; obere Spur). (B) Brennrate von MVN-Neuronen als Reaktion auf Kontrolle (n = 53), stochastische und sinusförmige Rauschprotokolle (ohne Stromschritte) von Amplituden 3 (SN, n = 30; Sinus, n = 6), 6 (SN, n = 46; Sinus, n = 17), 12 (SN, n = 13; Sinus, n = 4), 18 (SN) , n = 5; Sinus, n = 0) und 24 (SN, n = 8; Sinus, n = 0) pA. Linien/Whisker geben die maximalen und minimalen Werte an, das Feld zeigt die 25th-75th Perzentile und die Linie innerhalb des Feldes die mittlere Brennrate (Spikes/s) an. Die gestrichelte Linie gibt den experimentellen Schwellenwert an, der durch Bündelung der mittleren Feuerraten innerhalb von 3 und 6 pA (unter 12 pA) und 18 und 24 pA (über 12 pA) in Der Zusatzabbildung 1ausgewählt wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Sinusoides und stochastisches Rauschen verändern den neuronalen Gewinn von MVN. (A) DIE neuronale Abschussrate von MVN bei jedem depolarisierenden Stromschritt und die entsprechende Verstärkungsberechnung als Reaktion auf stochastisches Rauschen. (B) Die dargestellten Daten wurden auf die gleiche Weise wie in Abbildung 3A erzeugt, jedoch während der Anwendung von sinusförmigem Rauschen. (C,D) Diagramme stellen die Gewinne dar, die aus den Linien der besten Passung von A und Bberechnet werden. Fehlerbalken geben an, dass die statistische Signifikanz durch eine lineare Regressionsanalyse bestimmt wurde, die die Gradienten der Linien vergleicht, die am besten zwischen Kontrolle und experimentellem Zustand passen. **p < 0,02; p < 0,01. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1: Objektive Bestimmung des Schwellenwerts von 12 pA. Die Feuerraten für weniger als 12 pA (3 und 6 pA) und mehr als 12 pA (18 und 24 pA) wurden gepoolt und gemittelt. Diese Mittelwerte wurden dann mit einer ANOVA und einer statistischen Signifikanz zwischen Schein und >12 pA und zwischen <12 pA und >12 pA analysiert. *p < 0,05. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Die Auswirkungen der galvanischen vestibulären Stimulation (GVS) auf das vestibuläre System wurde in vivo beim Menschen hervorgehoben3,13,23, Meerschweinchen14, Nagetiere18 und nicht-menschliche Primaten24. Jedoch, keine dieser Studien haben die direkten Auswirkungen von elektrischem Rauschen auf die Empfindlichkeit der einzelnen Neuronen im vestibulären System bewertet. Hier zeigen wir die erste In-vitro-Anwendung von stochastischem Rauschen direkt auf einzelne mediale vestibuläre Nukleus (MVN) Neuronen.
Das primäre Ziel der Anwendung von stochastischem Rauschen direkt auf einzelne MVN-Neuronen besteht darin, zu bestimmen, ob das Rauschen eine Wirkung auf die neuronale Empfindlichkeit direkt aufweist. So wird festgestellt, wie stochastische Resonanz (SR) das Gleichgewicht beim Menschen beeinflusst. Damit SR offensichtlich ist, muss der Stimulus unterschwellig sein, um sicherzustellen, dass einzelne Neuronen nicht offensichtlich aktiviert werden7 (Abbildung 2). Daher muss die in vitro neuronale Abschussrate mit Kontrollbedingungen (keine Reize) vergleichbar bleiben. Dieser Schritt ist entscheidend für das Protokoll, um das SR-Phänomen hervorzuheben, und kann sich für andere neuronale Populationen unterscheiden und daher etwas anders durchgeführt werden.
Obwohl diese Zubereitung klare Vorteile gegenüber früheren in vivo Arbeiten bei Tieren14,15,17,18, gibt es noch einige Vorbehalte. Erstens werden die Reize auf einzelne Neuronen angewendet, und daher kann die Schwellenvon stochastischem und sinusförmigem Rauschen nicht darstellen, was auf Bevölkerungsebene vorkommt. Mit diesem Protokoll sind wir jedoch in der Lage, Veränderungen auf einer einzelnen Neuronenebene zu analysieren und diese Informationen zu verwenden, um anschließend zu modellieren, was in Verhaltensstudien passieren kann. Zweitens sind diese elektrophysiologischen Aufnahmen auf Neuronen beschränkt, die spontane Aktivität oder Reaktionen auf Gleichstrominjektionen anzeigen, um natürliche Aktivität zu simulieren. Dies ist einer der Gründe für die Wahl der MVN als Ziel für die Prüfung der Auswirkungen dieser elektrischen Reize, wie es zeigt spontane neuronale Aktivität21.
Ein Vorteil der Verwendung von Ganzzell-Patchklemmenaufnahmen einzelner MVN-Neuronen besteht darin, dass die Reaktion zuverlässiger mit einer bestimmten Ausgabe des vestibulären Systems verknüpft werden kann. Verhaltensstudien sind in der Lage, solche Informationen über den otolith-okulären Signalweg durch die Messung von oular vestiular-evozierten myogenen Potentialen (OVEMPs) und okulären Gegenrollen (OCRs) auf makroebener13bereitzustellen. Durch elektrophysiologische Aufzeichnungen können Informationen über die spezifische Kernbeteiligung und damit die spezifischen Wege aufgeklärt werden. Darüber hinaus haben frühere Arbeiten zur Stimulierung der primären vestibulären Afferents in vivo wichtige Informationen darüber geliefert, wie GVS funktionieren kann, können aber nicht direkt beurteilen, wie die zentralen vestibulären Kerne reagieren14,15,17 ,18. Daher hilft die Hervorhebung der Empfindlichkeit und Präzision von Ganzzell-Patchklemmenaufnahmen bei der Aufklärung, wie GVS die vestibuläre Funktion verbessern kann.
Zukünftige Studien könnten dieses Protokoll auf andere neuronale Populationen anwenden, die spontane Aktivität zeigen. Eine Studie hat stochastisches Rauschen auf eine nicht-spontan aktive neuronale Population innerhalb der somatosensorischen und auditiven Kortiken von Rattenangewendet 19. Dies wurde jedoch in einer Zellsuspension enzymatisch dissoziierter pyramidaler Neuronen durchgeführt und nahm speziell Na+ Ströme auf, die aus postsynaptischen Zellen mittels Spannungsklemmenexperimenten entnommen werden. In diesem Protokoll wurde die spontane Aktivität von MVN-Neuronen aus einzelnen Neuronen innerhalb von Querschnitten des Hirnstamms mittels aktueller Klemmexperimente aufgezeichnet.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
SPS wurde vom postgradualen Forschungsstipendium der University of Sydney unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CaCl | Scharlau | CA01951000 | Used for ACSF and sACSF |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270 | Used for ACSF and sACSF |
| EGTA | Sigma | E0396-25G | Used for K-based intracellular solution |
| HEPES | Sigma | H3375-25G | Used for K-based intracellular solution |
| KCl | Chem-supply | PA054-500G | Used for ACSF, sACSF and intracellular solution |
| K-gluconate | Sigma | P1847-100G | Used for K-based intracellular solution |
| Mg-ATP | Sigma | A9187-500MG | Used for K-based intracellular solution |
| MgCl | Chem-supply | MA00360500 | Used for ACSF and sACSF |
| Na3-GTP | Sigma | G8877-100MG | Used for K-based intracellular solution |
| NaCl | Chem-supply | SO02270500 | Use for ACSF and intracellular solution |
| NaH2PO4•2H2O | Ajax | AJA471-500G | Used for ACSF and sACSF |
| NaHCO3 | Sigma | S5761-1KG | Used for ACSF and sACSF |
| Sucrose | Chem-supply | SA030-500G | Used for sACSF |
| Isoflurane | Henry Schein | 1169567762 | Used for anaesthetising mice |
| EQUIPMENT | |||
| Borosilicate glass capillaries | Warner instruments | GC150T-7.5 | 1.5 mm OD, 1.16 mm ID, 7.5 cm length |
| Data acquisition software | Axograph | Used for electrophysiology and analysis | |
| Friedmen-Pearson Rongeurs | World precision instruments | 14089 | Used for dissection |
| Micropipette puller | Narishige | PP-830 | Used for micropipette |
| Multiclamp amplifier | Axon instruments | 700B | Used for electrophysiology |
| pH meter | Sper scientific | 860033 | Used for internal solution |
| Standard pattern scissors | FST | 14028-10 | Used for dissection |
| Sutter micromanipulator | Sutter | MP-225/M | Used for electrophysiology |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | Used for electrophysiology |
| Vibratome | Leica | VT1200 | Used for slicing brain tissue |
References
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