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Neuroscience

विट्रो में मध्यस्थ वेस्टीबुलर न्यूक्लियस न्यूरोन संवेदनशीलता के आकलन के लिए Stochastic शोर आवेदन

Published: August 28, 2019 doi: 10.3791/60044
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 1,2
1Discipline of Physiology, Sydney Medical School, University of Sydney, 2Bosch Institute, Sydney Medical School, University of Sydney, 3The MARCS Institute, Western Sydney University, 4Department of Pharmacology, Physiology & Neuroscience, Rutgers Biomedical and Health Sciences

Summary

मानव में गैल्वेनिक वेस्टिबुलर उत्तेजना वेस्टिबुलर समारोह में सुधार दर्शाती है। हालांकि, यह अज्ञात है कि कैसे ये प्रभाव होते हैं। यहाँ, हम कैसे sinusoidal और stochastic विद्युत शोर लागू करने के लिए और अलग-अलग मध्य वेस्टिबुलर नाभिक न्यूरॉन्स में C57BL/6 माउस में उपयुक्त उत्तेजना आयाम का मूल्यांकन करने के लिए वर्णन करते हैं।

Abstract

Galvanic वेस्टिबुलर उत्तेजना (जीवीएस) संतुलन या वेस्टिबुलर हानि के साथ व्यक्तियों में संतुलन उपायों में सुधार करने के लिए दिखाया गया है। यह स्टोकेस्टिक अनुनाद (एसआर) घटना के कारण होने का प्रस्ताव है, जिसे कमजोर संकेतों का पता लगाने में वृद्धि करने के लिए एक अरैखिक प्रणाली के निम्न स्तर/उपथ्थेली प्रोत्साहन के अनुप्रयोग के रूप में परिभाषित किया गया है। हालांकि, यह अभी भी अज्ञात है कि एसआर मानव संतुलन पर इसके सकारात्मक प्रभाव को कैसे दर्शाता है। यह अलग-अलग न्यूरॉन्स पर साइनॉइडल और स्टोकेस्टिक शोर के प्रभाव के पहले प्रदर्शनों में से एक है। पूरे सेल पैच दबाना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का उपयोग करना, sinusoidal और stochastic शोर सीधे C57BL/6 चूहों के मध्यस्थ वेस्टिबुलर नाभिक (MVN) में व्यक्तिगत न्यूरॉन्स के लिए लागू किया जा सकता है. यहाँ हम कैसे sinusoidal और stochastic उत्तेजनाओं उपथ्थेलस हैं सुनिश्चित करने के लिए MVN न्यूरॉन्स की सीमा निर्धारित करने के लिए प्रदर्शन और इस से, प्रभाव है कि शोर के प्रत्येक प्रकार MVN न्यूरॉन लाभ पर है निर्धारित. हम बताते हैं कि subthreshold sinusoidal और stochastic शोर बेसल फायरिंग दरों को प्रभावित किए बिना MVN में व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की संवेदनशीलता को मॉड्युलेट कर सकते हैं.

Introduction

वेस्टिबुलर (या संतुलन) प्रणाली श्रवण, प्रोप्रियोसेप्टिव, सोमेटोसेंसरी और दृश्य जानकारी को एकीकृत करके संतुलन की हमारी भावना को नियंत्रित करती है। वेस्टिबुलर प्रणाली का अवक्रमण आयु के एक कार्य के रूप में दर्शाया गया है और इसके परिणामस्वरूप संतुलन घाटा1,2हो सकता है . तथापि, वेस्टिबुलर प्रणाली के कार्यकरण को लक्षित करने वाले उपचार दुर्लभ हैं।

Galvanic Vestibular उत्तेजना (जीवीएस) संतुलन उपायों में सुधार करने के लिए दिखाया गया है , autonomic कामकाज और अन्य संवेदी तौर तरीकों के भीतर मनुष्य के भीतर3,4,5,6. इन सुधारों को स्टोचैस्टिक अनुनाद (एसआर) घटना के कारण कहा जाता है, जो उपथ्रेशोल्ड शोर7,8के अनुप्रयोग के माध्यम से गैर रेखीय प्रणालियों में कमजोर संकेतों का पता लगाने में वृद्धि है। इन अध्ययनों से स्थिर9,10 और गतिशील11,12 शेष और वेस्टिबुलर आउटपुट परीक्षण जैसे ओकुलर काउंटर रोल (ओसीआर)13में सुधार हुआ है . हालांकि, इन अध्ययनों के कई इस तरह के सफेद शोर9के रूप में उत्तेजना मानकों के विभिन्न संयोजनों का इस्तेमाल किया है, रंग का शोर13, विभिन्न उत्तेजना आवृत्ति पर्वतमाला और दहलीज तकनीक. इसलिए, इष्टतम उत्तेजना मानकों अज्ञात रहते हैं और इस प्रोटोकॉल सबसे प्रभावी मापदंडों का निर्धारण करने के साथ सहायता कर सकते हैं. उत्तेजना मानकों के अलावा, उत्तेजना के प्रकार भी चिकित्सकीय और प्रयोगात्मक प्रभावकारिता में महत्वपूर्ण है. मनुष्य में उपरोक्त काम विद्युत शोर उत्तेजनाओं का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था, जबकि विवो पशु काम के बहुत यांत्रिक14,15 या optogenetic16 शोर उत्तेजनाओं का इस्तेमाल किया गया है. यह प्रोटोकॉल वेस्टिबुलर नाभिक पर पड़ने वाले प्रभावों की जांच करने के लिए विद्युत ीय शोर का उपयोग करेगा।

इससे पहले, प्राथमिक वेस्टिबुलर एफ़ीरेंट को प्रोत्साहित करने के लिए जीवीएस का प्रयोग गिलहरी बंदरों में विवो में किया गया था17, चिंचिलस18, चिकन भ्रूण15 और गिनी पिग14. तथापि, इनमें से केवल दो अध्ययनों से यह पता चला है कि प्राथमिक वेस्टिबुलर एफ़ीरेटर्स14,15के लाभ पर जीवीएस के प्रभाव की जांच की गई है . ये प्रयोग विवो में किए गए थे जिसका अर्थ है कि वेस्टिबुलर नाभिक पर लगाए गए उत्तेजना के सटीक पैटर्न का निर्धारण नहीं किया जा सकता है। हमारी जानकारी के लिए, केवल एक अन्य अध्ययन केंद्रीय तंत्रिका तंत्र19में व्यक्तिगत एंजाइमी रूप से असंबद्ध न्यूरॉन्स के लिए stochastic शोर लागू किया गया है। हालांकि, उचित उत्तेजना मानकों और दहलीज तकनीकों का आकलन करने के लिए केंद्रीय वेस्टिबुलर न्यूक्लिय में कोई प्रयोग नहीं किया गया है, जिससे इस प्रोटोकॉल को वेस्टिबुलर के भीतर अलग-अलग न्यूरॉन्स पर प्रोत्साहन प्रभाव ों का निर्धारण करने में अधिक सटीक बना दिया गया है। नाभिक.

यहाँ, हम कैसे sinusoidal और stochastic लागू करने के लिए (विद्युत) शोर सीधे मध्यस्थ वेस्टिबुलर नाभिक में अलग-अलग न्यूरॉन्स के लिए लागू करने के लिए (MVN), न्यूरॉन सीमा निर्धारित करने और लाभ में परिवर्तन को मापने /

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Protocol

वर्णित सभी प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल सिडनी पशु आचार समिति के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया (अनुमोदित प्रोटोकॉल संख्या: 2018/

1. पशु

नोट: चूहे ऑस्ट्रेलियाई रोडेंट सेंटर (एआरसी; पर्थ, ऑस्ट्रेलिया) और सिडनी विश्वविद्यालय में मेडिकल फाउंडेशन बिल्डिंग पशु सुविधा में आयोजित किया.

  1. पर्यावरण संवर्धन के साथ एक सामान्य 12 एच प्रकाश /अंधेरे चक्र पर चूहों को बनाए रखें।
  2. सभी प्रयोगों के लिए पुरुष और मादा C57BL/6 चूहों (3-5 सप्ताह पुराने) का प्रयोग करें।

2. समाधान की तैयारी

  1. कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (एसीएसएफ) के 1 एल तैयार 29 एमएम NaHCO3, 11 एमएम ग्लूकोज, 120 एमएम NaCl, 3.3 एमएम KCl, 1.4 mM NaH2PO4, 2.2 m MgCl2, 2.77 m CaCl2.
  2. 200 एमएल सुक्रोज-एसीएफ (एसएसीएसएफ) तैयार करें जिसमें 29 एम एम नहको3, 11 एमएम ग्लूकोज, 241.5 एमएम सुक्रोज, 3.3 एमएम केसीएल, 1.4 एमएम एनएच2पीओ4, 2.2 एमजीसीएल2, 2.77 एम एम सी एल2। ACSF और SACSF करने के लिए CaCl2 के शामिल किए जाने से पहले, 7.4 के पीएच स्थापित करने और कैल्शियम वर्षा (बादलता) से बचने के लिए कार्बोगेन (95 % O2 और 5 % CO2) के साथ समाधान गैस।
  3. तैयार K+-आधारित intracellular समाधान 70 एमएम पोटेशियम gluconate, 70 एमएम KCl, 2 एमएम NaCl, 10 mM HEPES, 4 एमएम EGTA, 4 एमएम एमजी2-ATP, 0.3 एमएम ना3-GTP से बना; 7.3 के एक अंतिम पीएच के साथ (KOH का उपयोग कर समायोजित).
    नोट: यह 0.22 डिग्री मीटर फिल्टर के साथ intracellular समाधान फिल्टर और -20 डिग्री सेल्सियस पर समाधान के 0.5 एमएल aliquots स्टोर करने के लिए सिफारिश की है।

3. ब्रेनस्टेम की तैयारी

  1. brainstem निष्कर्षण से पहले, कार्बोजन के साथ sACSF समानता और 25 मिनट के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर शांत इतना है कि एक बर्फ घोल का गठन किया है।
  2. माउस को इस्सोलुरेन के साथ एनेस्थेटाइज करें (3-5 %) ऑक्सीजन में संतृप्त (3 एमएल/मिनट)। एक बार पिछले पंजा सजगता अनुपस्थित रहे हैं, तेज स्टेनलेस स्टील कैंची के साथ माउस decapitate.
  3. एक उस्तरा ब्लेड (#22 गोल) का उपयोग कर त्वचा में एक sagittal चीरा बनाकर खोपड़ी को उजागर।
  4. मानक पैटर्न कैंची की एक जोड़ी के नुकीले अंत का उपयोग lambda पर एक छोटा सा चीरा बनाने के लिए और अनुदैर्घ्य फिशर के साथ काट दिया.
  5. उथले-पियरसन मोड़ रोंगूरों की एक जोड़ी का उपयोग करके युग्मित पार्श्विक हड्डियों और अनुकपाल हड्डियों को सावधानी पूर्वक प्रतिबिंबित करते हैं।
    नोट: इस पूरी प्रक्रिया के दौरान मस्तिष्क लगातार पहले से तैयार बर्फ ठंडा sACSF घोल का उपयोग कर situ में नहाया है.
  6. फोरब्रेन से brainstem और उसके बोनी encasing एक उस्तरा ब्लेड का उपयोग कर अलग (#11 सीधे) पैरीटो-ऑकसीपल सल्कस नीचे कटौती करने के लिए और पुच्छल मेडुला पर.
  7. एक अलग brainstem अधर एक पहले से कटौती trapezoidal polystyrene ब्लॉक पर नीचे माउंट. काटने के चरण के लिए अच्छा ऊतक आसंजन सुनिश्चित करने के लिए ऊतक कागज की एक बात के साथ विच्छेदन ऊतक के आसपास अतिरिक्त तरल पदार्थ निकालें।
    नोट: polystyrene ब्लॉक एक trapezoidal आकार में कटौती की है, midbrain फिट बैठता है और रीढ़ की हड्डी में टेपर के रोस्ट्रल अंत सुनिश्चित करने के लिए.
  8. संलग्न brainstem रोस्ट्रल अंत काटने के चरण के लिए नीचे के साथ polystyrene ब्लॉक को ठीक करने के लिए cyanoacrylate गोंद का प्रयोग करें।
  9. 3.00 मिमी के 0ण्16 मिमी तथा कंपन आयाम की अग्रिम गति का उपयोग करके एमवीएन के 200 डिग्री मीटर अनुप्रस्थ स्लाइस तैयार की।
    नोट: MVN के स्थान Paxinos और फ्रेंकलिन माउस मस्तिष्क एटलस का उपयोग कर निर्धारित किया जाता है (चित्र 79-89)20. MVN (एटलस में MVe के रूप में सूचीबद्ध) तुरंत 4वें वेंट्रिकल के लिए ventrolateral निहित है और सेरिबैलम के लगाव से पहले सबसे बड़ा सही है (अवर colliculi और obex के बीच).
  10. रिकॉर्डिंग से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर carbogenated ACSF में बैठे एक फिल्टर पेपर डिस्क पर स्लाइस हस्तांतरण करने के लिए एक प्लास्टिक-ट्रिम्ड पिपेट का उपयोग करें।

4. उपकरण

  1. पूरे सेल पैच दबाना तकनीक21प्रदर्शन करने के लिए एक मानक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल सेटअप का प्रयोग करें।
  2. एक माइक्रोपिपेट पुलर पर एक द्वि-चरणीय प्रोटोकॉल (गर्मी चरण 1: 70; ऊष्मा चरण 2: 45) का उपयोग करके माइक्रोपाइपेट तैयार करें (सामग्री की सारणीदेखें)। माइक्रोपाइपेट में स्नान में रखे जाने पर आंतरिक विलयन के साथ 3-5 दम् तक अंतिम प्रतिरोध होना चाहिए।
    नोट: इस्तेमाल किया सेटिंग्स कमरे के भीतर तापमान के आधार पर भिन्न हो सकते हैं और काफी बार बदल सकते हैं.

5. पूरे सेल पैच दबाना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी

  1. MVN में अलग-अलग न्यूरॉन्स से पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए, एक कश्मीर+आधारित आंतरिक समाधान रिकॉर्डिंग पिपेट के भीतर प्रयोग किया जाता है।
  2. रिकॉर्डिंग कक्ष में ऊष्मायन कक्ष से एक एकल ऊतक टुकड़ा स्थानांतरण और एक यू के आकार का वजन पर एक नायलॉन धागे का उपयोग कर टुकड़ा सुरक्षित. 3 एमएल/मिनट की प्रवाह दर पर 25 डिग्री सेल्सियस पर कार्बोजेनित-एसीएसएफ के साथ रिकॉर्डिंग चैम्बर को लगातार उपयोग करना।
  3. आंतरिक समाधान के साथ एक micropipette भरने के बाद, एक कम शक्ति (10x) उद्देश्य लेंस का उपयोग कर MVN का पता लगाने. एक उच्च शक्ति (40x) उद्देश्य का उपयोग करना, MVN के भीतर अलग-अलग न्यूरॉन्स स्थित किया जा सकता है.
    नोट: सेल की गुणवत्ता गुणवत्ता रिकॉर्डिंग और सेल के स्थायित्व सुनिश्चित करने में आवश्यक है जब पूरे सेल विन्यास को प्राप्त करने का प्रयास. एक अच्छी कोशिका गोलाकार आकृति, चिंतनशील कोशिका झिल्ली और एक अदृश्य नाभिक प्रदर्शित करेगी। एक बुरा सेल एक बड़े दिखाई नाभिक (एग की तरह) और एक सूजन /
  4. पिपेट के साथ ऊतक का उल्लंघन करने से पहले, पाइपेट टिप से मलबे को दूर पुश करने के लिए सकारात्मक दबाव की एक छोटी राशि लागू करें।
  5. चुने हुए न्यूरॉन की ओर micromanipulator का उपयोग कर pippette ले जाएँ और एक छोटे डिंपल न्यूरॉन झिल्ली पर फार्म चाहिए. सकारात्मक दबाव रिलीज और नकारात्मक दबाव की एक छोटी राशि लागू होते हैं।
  6. एक बार एक 1 जी जेड सील हासिल की है, झिल्ली टूटना और एक पूरे सेल विन्यास बनाने के लिए चूषण बंदरगाह के माध्यम से पिपेट धारक के लिए कोमल कम और तेज सकारात्मक दबाव लागू होते हैं।
  7. मानक तकनीक21,22का उपयोग कर पूरे सेल वर्तमान क्लैम्प रिकॉर्डिंग बनाओ.

6. व्यक्तिगत मध्यस्थ वेस्टिबुलर न्यूक्लियस न्यूरोन्स को साइनसॉइडऔरल और स्टोकस्टिक शोर लागू करना

  1. न्यूरॉन सीमा और फायरिंग दर निर्धारित करने के लिए 3 से 24 pA से आयाम की एक सीमा पर stochastic और sinusoidal शोर लागू करें.
  2. निम्न तथा उच्च उद्दीपक तीव्रता ओंटों को समूहित करके संवेदी सीमा निर्धारित करके एनोवा किसी भी अंतर का प्रेक्षण करने के लिए एनोवा का कार्य करें (जैसा कि अनुपूरक चित्र 1में दर्शाया गया है)।
  3. 10 की अवधि में औसत फायरिंग दर की गणना जहां depolarizing वर्तमान कदम था / प्रत्येक व्यक्ति वर्तमान स्तर के लिए इंजेक्शन दिया जाएगा (यानी, 7 कुल एपिसोड; चित्र 1) .
  4. वर्तमान आलेख बनाम एक फायरिंग दर जनरेट करें और सबसे अच्छा फिट की रेखा की ढाल निर्धारित करने के लिए एक रेखीय प्रतिगमन विश्लेषण करने के लिए औसत फायरिंग दर मान का उपयोग करें। उत्तम फिट की रेखा की प्रवणता तंत्रिका लाभ22का सूचक है।

Figure 1
चित्र 1: नियंत्रण के आरेखीय प्रोफाइल, साइनॉइडी और स्टोकस्टिक शोर प्रोटोकॉल। (ए) नियंत्रण (कोई शोर) प्रोटोकॉल MVN न्यूरॉन्स के लिए लागू किया. (ठ) सिनसॉइडी रव प्रोटोकॉल में 2 भ्भ् की आवृत्ति के साथ (ग ) स्टोकेस्टिक रव प्रोटोकॉल जहाँ अधिकांश शक्ति स्पेक्ट्रम का अधिकांश अंशांक 2 भ्रष् टा. यहाँ प्रस्तुत प्रत्येक प्रोटोकॉल एक 10 s depolarizing वर्तमान 10 pA अप करने के लिए 50 pA द्वारा बढ़ रही के साथ $ 6 pA का एक आयाम है. सच उत्तेजना एक depolarizing वर्तमान कदम नहीं है और इसलिए इन प्रोटोकॉल के पहले प्रकरण न्यूरॉन लाभ परिवर्तन निर्धारित करने के लिए है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Representative Results

प्रारंभिक रिकॉर्डिंग प्रभाव है कि sinusoidal और stochastic शोर व्यक्तिगत MVN न्यूरॉन्स के बेसल फायरिंग दरों पर है और कैसे उत्तेजनाओं प्रभाव न्यूरॉन्स के लाभ के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं. चित्रा 2 से पता चलता है कि न तो sinusoidal और न ही stochastic शोर परिवर्तन MVN न्यूरॉन्स के बेसल फायरिंग दर जब नियंत्रण की तुलना में (कोई शोर) रिकॉर्डिंग. यह जानकारी व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की सीमा निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है. मनुष्यों को गैल्वेनिक वेस्टिबुलर उत्तेजना के अनुप्रयोग के दौरान यह सुनिश्चितकरने के लिए एक संवेदी दहलीज कार्य किया जाता है कि उद्दीपक अवथ्ली 13 है। उपथ्रेशोल्ड उद्दीपक स्टोचैस्टिक अनुनाद (एसआर) परिघटना7,8का एक महत्वपूर्ण घटक है। इन विट्रो में, इस दहलीज कार्य को अलग ढंग से किया जाना चाहिए और न्यूरॉन्स की गतिविधि या बेसल फायरिंग दर को इसके लिए चुना गया है। यह सुनिश्चित करता है कि उत्तेजनाओं के रूप में संभव के रूप में subthreshold के करीब हैं और इसलिए मानव अध्ययन के लिए तुलनीय. चित्र 2B पर प्रकाश डाला गया है कि चयनित शोर स्तर (6 pA) subthreshold है, के रूप में यह देखा जा सकता है कि औसत फायरिंग दर 12 pA (प्रयोगात्मक सीमा) से वृद्धि शुरू होता है. यह सीमा उद्देश्यपूर्ण रूप से (18 और 24 pA) से ऊपर और नीचे (3 और 6 pA) 12 pA थ्रेशोल्ड के ऊपर और पूरक चित्र 1में दर्शाया गया है।

अगले, न्यूरॉन लाभ वर्तमान कदम depolarizing के एक सूट करने के लिए न्यूरॉन्स विषय द्वारा मूल्यांकन किया गया था (0-50 pA, द्वारा बढ़ रही है 10 pA) के साथ और बिना (नियंत्रण) शोर (चित्र 1). ये परिणाम प्रभाव है कि stochastic शोर केंद्रीय वेस्टिबुलर प्रणाली में न्यूरॉन्स पर हो सकता है और इस प्रकार, संभवतः कैसे GVS मानव संतुलन पर इसके प्रभाव प्रकाश में लाना है निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं. चित्र 3 से पता चलता है कि साइनसॉइडी (चित्र 3ठ) और स्टोचैस्टिक (चित्र 3क) 6 चए के उपथ्रेशोल्ड आयाम पर अनुप्रयुक्त रव MVN न्यूरॉन्स के लाभ को बदल सकता है। इन परिणामों को प्रत्येक 10 s वर्तमान चरण के दौरान फायरिंग दर को मापने और सबसे अच्छा फिट की लाइन से लाभ (ग्रेडिएंट) की गणना करने के लिए एक रेखीय प्रतिगमन विश्लेषण प्रदर्शन द्वारा मूल्यांकन किया गया.

Figure 2
चित्र2: MVN न्यूरोनल फायरिंग दर पर साइनॉइडी और स्टोस्टिक शोर का प्रभाव। (ए) स्टोचैस्टिक (एसएन; मध्य ट्रेस) और साइनॉइडी शोर (नीचे ट्रेस) एक 6 पी ए आयाम पर नियंत्रण की तुलना में एक व्यक्ति MVN न्यूरॉन के बेसल फायरिंग दर पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं दिखा (कोई शोर; शीर्ष ट्रेस). (बी) नियंत्रण के प्रत्युत्तर में एमवीएन न्यूरॉन्स की फायरिंग दर (एन जेड 53), स्टोकास्टिक और साइनॉइडी शोर प्रोटोकॉल (कोई वर्तमान चरणों के साथ) आयाम 3 (एसएन, एन ] 30; ज्या, n ] 6), 6 (SN, n ] 46; ज्या n , 13 ( n, n , n , n ) , n ] 5; ज्या, द र् 0) तथा 24 (SN, n ] 8; ज्या, द र् 0) च। रेखाएँ/whiskers अधिकतम और न्यूनतम मान इंगित करते हैं, बॉक्स 25वें-75वें शतमक इंगित करता है और बॉक्स के भीतर की रेखा माध्य फायरिंग दर (स्पाइक्स/ डैश्ड रेखा प्रायोगिक सीमा को इंगित करती है, जैसा कि अनुपूरक चित्र 1में दर्शाए गए 3 और 6 pA (12 pA से कम) और 18 और 24 pA (12 pA से ऊपर) के भीतर माध्य फायरिंग दरों को पूल करके चुना गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: साइनसॉइडी और स्टोकेस्टिक शोर एमवीएन न्यूरोनल लाभ को बदल देता है। (ए) MVN न्यूरोनल फायरिंग दर प्रत्येक depolarizing वर्तमान कदम पर और इसी लाभ गणना stochastic शोर के जवाब में. (ख) प्रस्तुत आंकड़े 3क में उसी प्रकार उत्पन्न किए गए थे, परंतु साइनॉइडी रव के अनुप्रयोग के दौरान। (सी, डी) रेखांकन ए और बीके सर्वश्रेष्ठ फिट की तर्ज से गणना किए गए लाभों का प्रतिनिधित्व करते हैं . त्रुटि पट्टियाँ इंगित करती हैं कि S.D. सांख्यिकीय महत्व नियंत्रण और प्रयोगात्मक स्थिति के बीच सर्वश्रेष्ठ फ़िट की रेखाओं की प्रवणता की तुलना रेखीय प्रतिगमन विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया गया था. * *पी एंड एलटी; 0.02; पी और 0.01. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्र 1: 12 pA थ्रेशोल्ड का उद्देश्य निर्धारण। कम से कम 12 pA (3 और 6 pA) और अधिक से अधिक 12 pA (18 और 24 पीए) के लिए फायरिंग दरों जमा और औसत थे. ये औसत तो एक ANOVA और sham के बीच सांख्यिकीय महत्व का उपयोग कर विश्लेषण किया गया और gt; 12 pA और के बीच [lt;12 pA और gt;12 pA. * पी एंड एलटी; 0.05. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

वेस्टिबुलर प्रणाली पर जस्तवेनी वेस्टिबुलर उत्तेजना (जीवीएस ) के प्रभाव कोमनुष्योंमें विवो में 3 ,13,23, गिनी पिग14, कृन्तकों18 और गैर -मानव प्राइमेट24में उजागर किया गया है . हालांकि, इन अध्ययनों में से कोई भी वेस्टिबुलर प्रणाली में व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की संवेदनशीलता पर बिजली के शोर के प्रत्यक्ष प्रभाव का मूल्यांकन किया है. यहाँ हम सीधे व्यक्तिगत मध्यस्थ वेस्टिबुलर नाभिक (MVN) न्यूरॉन्स के लिए stochastic शोर के पहले इन विट्रो आवेदन प्रदर्शित करते हैं.

व्यक्तिगत MVN न्यूरॉन्स के लिए सीधे stochastic शोर लागू करने का प्राथमिक उद्देश्य, शोर सीधे न्यूरॉन संवेदनशीलता पर एक प्रभाव का प्रदर्शन है कि क्या यह निर्धारित करने के लिए है. इस प्रकार, स्थापित कैसे Stochastic अनुनाद (एसआर) मनुष्यों में संतुलन को प्रभावित करता है. एसआर के लिए स्पष्ट करने के लिए, यह सुनिश्चित करने के लिए कि अलग-अलग न्यूरॉन्स को स्पष्ट रूप से सक्रिय नहीं किया जा रहा है, उत्तेजना को उप-थ्रेशोल्ड की आवश्यकता है( चित्र2)। इसलिए, इन विट्रो न्यूरोनल फायरिंग दर को नियंत्रित करने के लिए तुलनीय रहना चाहिए (कोई उत्तेजना) शर्तों. यह चरण एसआर घटना को उजागर करने के लिए प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण है, और अन्य न्यूरॉन आबादी के लिए अलग हो सकता है और इसलिए थोड़ा अलग प्रदर्शन किया.

हालांकि इस तैयारी जानवरों में विवो काम में पिछले पर स्पष्ट लाभ प्रदान करता है14,15,17,18, वहाँ अभी भी कुछ चेतावनी हैं. सबसे पहले, उत्तेजनाओं व्यक्तिगत न्यूरॉन्स के लिए लागू कर रहे हैं और इसलिए stochastic और sinusoidal शोर की दहलीज प्रतिनिधित्व नहीं कर सकते हैं क्या एक जनसंख्या के स्तर पर हो रहा है. हालांकि, इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर हम एक न्यूरॉन स्तर पर परिवर्तन का विश्लेषण और बाद में मॉडल क्या व्यवहार अध्ययन में हो सकता है इस जानकारी का उपयोग करने में सक्षम हैं. दूसरा, इन electrophysiological रिकॉर्डिंग न्यूरॉन्स कि सहज गतिविधि या प्रतिक्रियाओं को प्रदर्शित करने के लिए वर्तमान इंजेक्शन प्रत्यक्ष प्राकृतिक गतिविधि अनुकरण करने के लिए सीमित कर रहे हैं. यह इन विद्युत उत्तेजनाओं के प्रभाव के परीक्षण के लिए एक लक्ष्य के रूप में MVN को चुनने के लिए कारणों में से एक है, के रूप में यह सहज न्यूरॉन गतिविधि21दर्शाती है.

व्यक्तिगत MVN न्यूरॉन्स की पूरी सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग का उपयोग करने का एक लाभ यह है कि प्रतिक्रिया और अधिक मज़बूती से वेस्टिबुलर प्रणाली के एक विशिष्ट उत्पादन से जोड़ा जा सकता है. व्यवहार अध्ययन एक अधिक स्थूल स्तर13पर नेत्र वेस्टिबुलर-evoked myogenic क्षमता (oVEMPs) और नेत्र काउंटर रोल (OCRs) की माप के माध्यम से ओटोलिथ-ओकुलर मार्ग के बारे में ऐसी जानकारी प्रदान करने में सक्षम हैं। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के माध्यम से, विशिष्ट नाभिक ोंवंज के बारे में जानकारी और इस प्रकार, इसमें शामिल विशिष्ट रास्ते स्पष्ट किए जा सकते हैं। इसके अलावा, विवो में प्राथमिक वेस्टिबुलर एफ़लेंटकोटर्स को उत्तेजित करने में पिछले काम ने महत्वपूर्णजानकारी प्रदान की है कि कैसे GVS काम कर सकते हैं, लेकिन सीधे आकलन नहीं कर सकते कि केंद्रीय वेस्टिबुलर नाभिक 14 ,15,17 ,18. इसलिए, संवेदनशीलता और पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग की परिशुद्धता पर प्रकाश डाला कैसे GVS वेस्टिबुलर कामकाज में सुधार हो सकता है स्पष्ट करने में मदद करता है.

भविष्य के अध्ययन सहज गतिविधि प्रदर्शित अन्य न्यूरॉन आबादी के लिए इस प्रोटोकॉल लागू कर सकते हैं. एक अध्ययन में चूहों की सोमातोसेनेरी और श्रवण कॉर्टिस के भीतर एक गैर-स्वत: सक्रिय तंत्रिका कोशिका पर स्टोकेस्टिक शोर लागू किया गयाहै। हालांकि, यह enzymatically अलग पिरामिड न्यूरॉन्स के एक सेल निलंबन में किया गया था और विशेष रूप से ना+ धाराओं रिकॉर्डिंग था, जो voltage clamp प्रयोगों का उपयोग कर postsynaptic कोशिकाओं से लिया जाता है. इस प्रोटोकॉल में MVN न्यूरॉन्स की सहज गतिविधि वर्तमान दबाना प्रयोगों का उपयोग brainstem के अनुप्रस्थ स्लाइस के भीतर व्यक्तिगत न्यूरॉन्स से दर्ज की गई थी.

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

एसपीएस सिडनी स्नातकोत्तर अनुसंधान छात्रवृत्ति के विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CaCl Scharlau CA01951000 Used for ACSF and sACSF
D-(+)-Glucose Sigma G8270 Used for ACSF and sACSF
EGTA Sigma E0396-25G Used for K-based intracellular solution
HEPES Sigma H3375-25G Used for K-based intracellular solution
KCl Chem-supply PA054-500G Used for ACSF, sACSF and intracellular solution
K-gluconate Sigma P1847-100G Used for K-based intracellular solution
Mg-ATP Sigma A9187-500MG Used for K-based intracellular solution
MgCl Chem-supply MA00360500 Used for ACSF and sACSF
Na3-GTP Sigma G8877-100MG Used for K-based intracellular solution
NaCl Chem-supply SO02270500 Use for ACSF and intracellular solution
NaH2PO4•2H2O Ajax AJA471-500G Used for ACSF and sACSF
NaHCO3 Sigma S5761-1KG Used for ACSF and sACSF
Sucrose Chem-supply SA030-500G Used for sACSF
Isoflurane Henry Schein 1169567762 Used for anaesthetising mice
EQUIPMENT
Borosilicate glass capillaries Warner instruments GC150T-7.5 1.5 mm OD, 1.16 mm ID, 7.5 cm length
Data acquisition software Axograph Used for electrophysiology and analysis
Friedmen-Pearson Rongeurs World precision instruments 14089 Used for dissection
Micropipette puller Narishige PP-830 Used for micropipette
Multiclamp amplifier Axon instruments 700B Used for electrophysiology
pH meter Sper scientific 860033 Used for internal solution
Standard pattern scissors FST 14028-10 Used for dissection
Sutter micromanipulator Sutter MP-225/M Used for electrophysiology
Upright microscope Olympus BX51WI Used for electrophysiology
Vibratome Leica VT1200 Used for slicing brain tissue

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 150 Stochastic अनुनाद stochastic शोर साइनसॉइडी शोर वेस्टिबुलर प्रणाली मध्य वेस्टिबुलर नाभिक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी
विट्रो में मध्यस्थ वेस्टीबुलर न्यूक्लियस न्यूरोन संवेदनशीलता के आकलन के लिए Stochastic शोर आवेदन
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Stefani, S. P., Breen, P. P., Serrador, J. M., Camp, A. J. Stochastic Noise Application for the Assessment of Medial Vestibular Nucleus Neuron Sensitivity In Vitro. J. Vis. Exp. (150), e60044, doi:10.3791/60044 (2019).

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