Summary
Detta protokoll ger en metod för att underlätta generering av definierade heterozygot eller homozygot nukleotidförändringar med hjälp av CRISPR-CAS9 i humana pluripotenta stamceller.
Abstract
Humana pluripotenta stamceller erbjuder ett kraftfullt system för att studera genfunktion och modellspecifika mutationer relevanta för sjukdom. Generationen av exakta heterozygot genetiska modifikationer är utmanande på grund av CRISPR-CAS9 medierad indel formation i den andra allelen. Här demonstrerar vi ett protokoll för att hjälpa till att övervinna denna svårighet genom att använda två reparationsmallar där endast en uttrycker önskad sekvens förändring, medan båda mallarna innehåller tysta mutationer för att förhindra omskärning och indel formation. Denna metod är mest fördelaktig för genredigering kodnings regioner av DNA för att generera ISOGEN kontroll och muterade mänskliga stamcellslinjer för att studera mänskliga sjukdomar och biologi. Dessutom har optimering av transfektion och screeningmetoder utförts för att minska arbete och kostnader för ett genredigering experiment. Sammantaget är detta protokoll allmänt tillämpligt på många genom redigering projekt som utnyttjar den mänskliga pluripotenta stamcells modellen.
Introduction
Mänskliga embryonala stamceller (hESCs) och inducerad pluripotenta stamceller (iPSCs) är värdefulla verktyg för modellering av mänskliga sjukdomar på grund av deras förmåga till förnyelse, samtidigt som förmågan att generera celltyper av olika härstamningar1,2 ,3,4. Dessa modeller öppnar möjligheten att förhöra genfunktion, och förstå hur specifika mutationer och fenotyper är relaterade till olika sjukdomar5,6. För att förstå hur en specifik förändring är kopplad till en viss fenotyp är dock användningen av en parkopplad ISOGEN kontroll och muterade cellinjer viktig för att kontrollera linje-till-linjevariationen7,8. Transkription Activator-liknande effektor nukleaser (talens) och zink finger nukleaser har använts för att generera insättning eller radering (indels) mutationer i olika genetiska modeller, inklusive primära celler; men dessa nukleaser kan vara besvärligt att använda och dyra9,10,11,12,13,14. Upptäckten av den grupperade regelbundet interfördelade korta palindrom REPEAT (CRISPR)-CAS9 Nuclease har revolutionerat området på grund av effektivitet i indel formation i praktiskt taget alla regioner i arvsmassan, enkelhet i användning, och minskning av kostnaderna15 , 16 , 17 , 18 , 19.
En utmaning i att använda den CRISPR-CAS9 baserade genom-redigeringsteknik har varit generering eller korrigering av specifika mutationer i en allel utan att skapa en indel-mutation i den andra allelen20. Det stora målet med detta protokoll är att övervinna denna utmaning genom att använda två enkelsträngade oligonukleotid (ssODN) reparationsmallar för att minska indel formation i den andra allelen. Båda ssODNs är utformade för att innehålla tysta mutationer för att förhindra omskärning av CAS9 Nuclease, men bara en innehåller förändringen av intresse. Denna metod ökar effektiviteten av att generera en specifik heterozygot genetisk modifiering utan att inducera indel formation i den andra allelen. Med hjälp av detta protokoll, genredigering experiment i sex oberoende genomisk platser visar exakt införandet av önskad genomisk förändring i en allel utan indel formation i den andra allelen och sker med en totalverkningsgrad på ~ 10%. Det beskrivna protokollet har anpassats från Maguire et al.21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. design och konstruktion av guide RNA (gRNA)
Anmärkning: varje gRNA består av 2 60 bas par (BP) oligonukleotides som glödgas för att generera en 100 BP dubbel Stranded (DS) oligonukleotid (figur 1a-C). Tidslinjen för gRNA design, generation och testning skär verkningsgrad är cirka 2 veckor (figur 2).
- Välj DNA-regionen av intresse att genomredigera och identifiera 3-4 23 BP sekvenser som passar formatet, 5 '-G (N19) NGG-3 '. Dessa sekvenser bör placeras inom 20 BP i regionen av intresse.
Anmärkning: inriktning kan utföras på Sense eller anti-Sense strand. - Utvärdera gRNA-sekvenser för genomisk redundans och off-Target sannolikhet med hjälp av en resurs som CRISPOR (http://crispor.tefor.net).
- Införliva 20 BP-målsekvensen (exklusive protospacer angränsande motiv eller PAM) i 2 60-mer oligonukleotider som visas (sekvenserna är 5 ' till 3 ' och röda och gröna är omvända komplement som visas i figur 1C).
- Beställ 2 60 BP oligonukleotides från säljaren av Choice. När oligonukleotides har mottagits, Omsuspendera varje till en slutlig koncentration av 100 μM i ddH2O. gör en arbets lager på 10 μm.
- Anneal de två oligonukleotides och generera en 100 BP dsDNA fragment med hjälp av DNA-polymeras (tabell över material). Kombinera 5 μl av 10 μm framåt oligonukleotid och 5 μl av 10 μm omvänd oligonukleotid i en polymeras kedjereaktion (PCR) Strip Tube och inkubera vid 95 ° c i 5 min. kyl reaktionen i 10 minuter vid rumstemperatur (RT).
- Ställ in PCR enligt beskrivningen i tabell 1. Utför PCR-amplifiering i en termisk apparat med hjälp av parametrarna som beskrivs i tabell 2.
- Visualisera PCR-produkterna på en 1,5% (w/v) etidiumbromid bromid (etbr) aguppstod gel electrophoresed på 80-100 v för 40 min. punktskatter på 100 BP band (figur 3a), visualiseras på en LED-ljuskask, från gelen med hjälp av ett rakblad och renar med hjälp av en gel extraktionssats (tabell över material).
2. utformning av PCR-primers för screening
- Utföra screening av den redigerade DNA med hjälp av framåt och omvänd PCR primers som är särskilt utformade för att förstärka en 400-500 BP region av genen av intresse (tabell 2). Använd DNA isolerad från någon kontroll IPSC linje för att bekräfta en ren amplikon när du utför screening PCR.
- Visualisera PCR-produkter på en 1,5% (w/v) gel efter elektrofores vid 80-100 V för 1 h.
Sekvensering av redigerade kloner utförs med en kapslad primer som är utformad efter bekräftelse av screening primer-uppsättningen. Proverna skickas till en kommersiell källa för sekvensering.
3. beredning av gRNA_cloning Vector plasmid
- För att linearisera klonings vektorn, ta ett 1,5 mL centrifugertub och tillsätt 1-5 μg DNA från gRNA_cloning-vektorn tillsammans med 4 μL AFLII-enzymbuffert och 1,5 μl AFLII-Begränsningsenzym. Ta upp reaktionen på 24 μL ddH2O. Blanda reaktionen genom att Pipettera upp och ner. Inkubera vid 37 ° c över natten (O/N).
- Electrophorese på en 1% aguppstod gel på 80-100 V för 1 h och punktskatter band (förväntad band storlek är ~ 3519 BP).
- Extrahera och rena som i steg 1,6.
4. montering av gRNA vektor
- Ställ in reaktioner och montera DNA-fragment med hjälp av monteringssatsen (tabell över material) vid 1:5 förhållandet AFLII smält grna kloning vektor till 100 BP gel renat skär, som beskrivs i tabell 3.
- Inkubera reaktionen vid 50 ° c i 15 min. Späd reaktionen 1:3 i ddH2O och Använd 3 μl för bakterie omvandling enligt tillverkarens anvisningar (tabell över material). Plattceller på kanamycin LB/agar-plattor.
- Välj 3-5 kolonier per gRNA. Inokulera varje koloni i 4 mL LB och växa O/N vid 37 ° c i en omloppsbana skaka inkubator.
- Rena plasmid DNA med hjälp av en miniprep plasmid isolering kit, och sekvens varje gRNA med följande primers för att säkerställa en lyckad kloning: framåt: GTACAAAAAAGCAGGCTTTAAAGG; Omvänd: TGCCAACTTTGTACAAGAAAGCT.
5. test gRNA skär effektivitet
- Plattan hESCs på bestrålade murina embryonala fibroblaster (MEFs) i en 6-brunn tallrik, som tidigare beskrivits21. När cellerna når 70-80% confluency, Förbered transfection Master Mix som beskrivs i tabell 4.
- Blanda med pipettering och inkubera vid RT i 15 min. Tillsätt droppvis till cellerna och inkubera vid 37 ° c för 48 h (med en Media förändring efter 24 h).
- Skörd celler för sortering efter 48 h.
- Ta bort MEFs enzymatiskt (tabell över material) med en 3 min RT inkubation.
- Skölj cellerna 1x med hESC medium (tabell 5) och skrapa i hESC medium + 10 μm Y-27632 dihydroklorid (tabell över material).
- Pellets celler vid 300 x g för 3 min och Omsuspendera i 0,5 ml hESC-medel + 10 μm Y-27632-dihydroklorid.
- Filtrera i en 5 mL tub genom en cell-SIL Cap på 35 μm.
- Använda fluorescens aktiverad cell sortering (FACS), grind på levande celler och sortera de gröna fluorescerande protein (GFP) positiva celler.
- Överför högst 1,5 x 104 sorterade celler direkt i en 10 cm2 fat belagd med 1:3 basalmembran matris (tabell över material) och bestrålade MEFS i hESC medium (tabell 5) som innehåller Y-27632-dihydroklorid.
- Byt medium dagligen med hESC-mediet (tabell 5) utan Y-27632-dihydroklorid och plocka kloner manuellt efter 10-15 dagar, när kolonierna är ~ 1 mm i diameter.
- Med hjälp av en P200 pipett och Mikroskop, skrapa försiktigt en enda klon och dra celler i pipetten.
- Skingra cellerna genom att försiktigt Pipettera 3-4x i en 96 väl tallrik i mediet som utarbetats med kolonin.
- Fördela i PCR-bandrör för screening och pellets cellerna genom centrifugering vid 10 000 x g i 5 min. plocka 20 kolonier per grna.
6. kloning screening
- Isolera DNA genom att ruinera cell pellets i 20 μL av proteinas K-buffert (tabell 5) (1 h vid 55 ° c och 10 min vid 95 ° c) och skaka kraftigt. Centrifugera vid 10 000 x g i 5 min och samla supernatanten.
- Utför screening-PCR (avsnitt 2) i en total volym på 20 μL med en Mastermix, inklusive primers som är utformade för att förstärka den intressanta regionen och 5 μL av proteinas K Digest. Använd genomiskt DNA isolerat från den cell linje som var Gene redigerad som en kontroll.
- Utvärdera storleksändringar av PCR-produkter efter 1 h elektrofores vid 70-90 V på en 2,5% (w/V) aguppstod gel (figur 3B, C). Alla storleksskillnader är ett tecken på klyvning.
7. noggrann genom redigering i pluripotenta stamceller med hjälp av Single strand oligo DNA (ssODNs)
- Design 100 BP ssODNs centrerad kring den mest effektiva gRNA sekvens fast beslutna att ha den bästa skär effektiviteten.
- Förhindra åter klyvning av den rekombinerat ODN genom att införa tysta mutationer i grna sekvens. En enda tyst mutation i PAM-sekvensen är tillräcklig, men om inte möjligt, kommer 3-4 tysta mutationer att fungera.
Anmärkning: för att underlätta screening av riktade kloner, införandet av en begränsning plats inom ~ 20 BP i gRNA sekvens är idealisk. - Designa en ODN med önskad bas förändring (er) för att skapa mutationen av intresse och en ODN utan bas förändringen (s).
Obs: dessa förändringar bör inte vara mer än ~ 20 BP från den förutspådda CRISPR/CAS9 cut plats, som rekombination sjunker betydligt på större avstånd. - Beställ de två ssODNs från säljaren av val och Omsuspendera i vatten för att göra 1 μg/μL bestånd. Förvara lagren vid-20 ° c.
8. inställning av transfektion
- För att transfect den ssODN och CRISPR-CAS9 plasmider, tallrik målet cellinjer i en 6-väl skålen på bestrålade MEFs att nå 70-80% confluency efter en O/N inkubering.
- Ställ in den transfektionsreaktion som beskrivs i tabell 6. Blanda reaktionen genom att Pipettera och inkubera i 15 minuter vid RT. Tillsätt transfektion reaktionsblandningen droppvis till cellerna.
- Efter 48 h, Förbered cellerna för cell sortering enligt beskrivningen i avsnitt 5,3.
- Välj kolonier ~ 10 dagar efter plätering enstaka celler med en 200 μL pipett. Överför 100 μL celler till en brunn av en 24-eller 48-väl-platta som tidigare bestruket med gelatin och bestrålade MEFs i hESC-medium med Y-27632-dihydroklorid. Använd de återstående 100 μL för DNA-isolering enligt beskrivningen i avsnitt 6.
9. kontroll av mutationer i enstaka kolonier
- För att kontrollera en lyckad integration av ssODN, ta 5 μL av DNA som isolerats från varje koloni för att utföra PCR med screening primers som utformats i avsnitt 2. Rena PCR-produkter (tabell över material) och förbereda begränsningen enzym nedbrytning med hjälp av den unika enzym plats som skapats i ssODN.
Anmärkning: denna nedbrytning omfattar även restriktionsenzymbufferten och tillverkarens rekommenderade koncentration av restriktionsenzymer i en volym på 40 μL. - Blanda reaktionen genom att Pipettera och inkubera vid tillverkarens rekommenderade temperatur för 1-3 h.
- Visualisera de smälta PCR-produkterna på en 1,5% (w/v) EtBr aguppstod gel electrophoresed på 80-100 V för 40 min. Om lyckad integrering av ssODN har inträffat, sekvens specifika mutationer med hjälp av en kapslad primer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Generering av gRNAs och screening för indels
Varje gRNA kommer att klonas till en Plasmid vektor och uttrycks med hjälp av U6 promotorn. AFLII -restriktionsenzymen används för att linearisera plasmiden (addgene #41824) och ligger efter U6-arrangören. Den 100 BP band genereras efter glödgning den 2 60 BP oligos är klonade i gRNA Expression Vector med hjälp av DNA-församlingen. När grna plasmider genereras, de är transfekterade till hESCs eller iPSCs tillsammans med en Crisps-CAS9 GFP plasmid (addgene #44719). GFP +-cellerna sorteras efter 2 dagar för att berika för transfekterade celler och pläterade (se avsnitt 5). Efter 10-14 dagar, enstaka cell härledda kolonier plockas och används för att isolera DNA till skärmen för indel formation genereras för varje gRNA. En PCR-förstärkning med primers spänner över den gRNA platsen används för att visualisera indel formation med en 2,5% (w/v) aguppstod gel med EtBr, electrophoresed på 70-90 V för 1 h.
Generering av 100 BP ssODN att införa specifika mutationer
Två ssODN oligos är konstruerade runt gRNA med den mest effektiva skärning. Varje gRNA är 100 BP och innehåller tysta mutationer, företrädesvis vid PAM sekvens, för att undvika omskärning (figur 4a). En tyst mutation i PAM-sekvensen kan generera en unik begränsnings plats, vilket hjälper till att skärmen för lyckad integrering i en eller två alleler (figur 4b).
ssODN rekombination utfall
Med hjälp av detta protokoll visas frekvensen av inriktnings händelser för sex olika gener med hjälp av de två ssODN-metoden i figur 5. Genom att undersöka genomisk modifiering på grna-området i båda alleles förväntades olika utfall inklusive rekombination av vildtyp (WT) ssodn, Mutant ssodn och indel formation. De kloner där endast en allel hade genomgått rekombination, var det vanligaste resultatet indel formation i den andra allelen (10-42%). Klonerna som hade integrationen av ssodns i båda alleler ledde till tre olika utfall: 1) integration av WT ssodn i båda alleler (0-8%), 2) integration av den muterade ssodn i både alleler (0-25%), och 3) integration av både WT och Mutant ssodn WT (8-21%).
Figur 1: översikt över gRNA-generationen. (A) i regionen av intresse, utforma fyra grnas slutar i gg som inte är mer än 20 BP isär. (B) varje grna på 23 BP har en pam sekvens av NGG vid 3 ' End. C60 BP-primers består av en 40 BP-sekvens som kompletterar grna Backbone plasmid och 20 BP grna-sekvensen utan pam-sekvensen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: protokoll tidslinje för gRNA generation och kloning screening. Tidslinjen för gRNA generation och screening kloner visas. Utformning och kloning gRNA Expression plasmider tar ungefär en vecka. Cirka 48 timmar efter transfektion till mänskliga PSCs, GFP +-celler sorteras och pläteras vid begränsning av utspädning. Kolonier bör vara synliga mellan 7-10 dagar och vid ungefär dag 20, kan kloner plockas för screening, expansion och sekvens bekräftelse. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: gRNA-test för skär verkningsgrad. (A) för grna Construction är ett 100 BP-band exciserat från en 1,5% agaros gel. (B) följande cell transfektion, validering av grna skärning visualiseras med hjälp av en 2,5% aguppstod gel. En 180 BP PCR-produkt används för att kontrollera indel formation där en oklippt kontroll och olika kloner analyseras för band skiften som tyder på indel formation. (C) olika grnas kan ha olika skär effektivitetsvinster. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: generering och screening av mutationer med två ssODNs. (A) för att undvika CRISPR-CAS9 omskärning av de redigerade alleler, kan pam-sekvensen ändras med hjälp av en G till en tyst mutation. Den här ändringen lägger till en unik EcoRI begränsning webbplats som kan användas för screening. Förutom denna tysta mutation innehåller den muterade ssODN den önskade bas förändringen. (B) screening för oligonukleotidrekombination med användning av EcoRI begränsning enzym nedbrytning kan resultera i tre möjliga utfall: Ingen skärning representeras av en WT band på ~ 650 BP, rekombination i en allel representeras av en oklippt band av 650 BP och två mindre band eller införing i båda alleler representeras av endast mindre band. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: ssODN-integrationens effektivitet och resultat. Integrations effektivitet och resultat av de två ssODN-metoden bestämdes genom att analysera sex olika gener. Om endast en ssODN integreras, indel formation upptäcktes vanligtvis i den andra allelen. Om två ssODNs integrerade, tre möjliga utfall upptäcktes, som visas. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Reagens | Volym (μL) |
| dNTPs (10 mM) | 0,4 |
| Taq polymeras | 0,2 |
| PCR-buffert | 4,0 |
| Glödgad oligos (10 μM) | 10,0 |
| ddH2O | 5,4 |
Tabell 1: gRNA klonings PCR-villkor.
| PCR-program | |
| Steg 1 | 98 ° c för 30 s |
| Steg 2 | 98 ° c för 10 s |
| Steg 3 | 55 ° c för 20 s |
| Steg 4 | 72 ° c för 30 s |
| Steg 5 | Upprepa steg 2 − 4 i 30 cykler |
| Steg 6 | 72 ° c i 5 min |
| Steg 7 | Håll vid 4 ° c |
Tabell 2: parametrar för PCR-cykling.
| Reagens | Volym (μL) |
| lineariserad gRNA-vektor med AflII (dvs. 50 ng/μL) | 1,0 |
| 100 BP-DNA (dvs. 250 ng/μL) | 1,0 |
| Master Mix 2x | 10,0 |
| ddH2O | q.s. till 20 |
Tabell 3: gRNA monterings reaktions förhållanden.
| Reagens | Belopp |
| DMEM/F12 | 50,0 μL |
| pCas9_GFP vektor (addgene plasmid 44719) | 0,5 μg |
| gRNA plasmid | 0,5 μg |
| lipidtransfektion reagens | 3,0 μL |
Tabell 4: huvud blandning av cell transfektion.
| hESC medium | |
| Reagens | Slutliga koncentrationen |
| DMEM/F12 | |
| Knockout serum Replacement (KDR) | 15% (v/v) |
| Icke-essentiella aminosyror | 100 μM |
| Natriumpyruvat | 1 mM |
| Glutamin | 2 mM |
| β-merkaptoetanol | 0,1 mM |
| bFGF Human (grundläggande fibroblast tillväxtfaktor) | 10 ng/mL |
| 10X Proteinase K buffert | |
| Tris. HCl pH: 7.4 | 50 mM |
| Ammoniumsulfat pH: 9,3 | 15 mM |
| MgCl2 | 2,5 mM |
| Tween 20 | 0,1% (v/v) |
| Proteas K | 100 μg/mL |
Tabell 5: cell odlingsmedium och proteinas K rötnings buffert.
| Reagens | Belopp |
| DMEM/F12 | 50,0 μL |
| pCas9_GFP vektor (addgene plasmid 44719) | 0,5 μg |
| gRNA plasmid | 0,5 μg |
| ssODN (0,5 μg av varje ssODN) | 1,0 μg |
| lipidtransfektion reagens | 3,0 μL |
Tabell 6: ssODN cell transfektion Master blandning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta protokoll, användning av CRISPR-CAS9 tillsammans med två ssODN reparationsmallar för att generera specifika heterozygot eller homozygot genom förändringar påvisas i humana pluripotenta stamceller. Denna metod resulterade i en lyckad generering av isogena cellinjer som uttrycker heterozygot genomiska förändringar med en verkningsgrad nära 10%. Detta protokoll har optimerats för både mänskliga ESCs och iPSCs som odlas på bestrålade MEFs som stöder celltillväxt och överlevnad efter odling av celler vid låg densitet efter cell sortering. Celldöd kan minimeras genom att bibehålla celler med 10 ng/mL bFGF och Y-27632 dihydroklorid. Det är möjligt att detta protokoll kan anpassas till matar fria kultur system, men ytterligare optimering kan behövas.
Transfektionseffektiviteten kan varieras från cellinjer till cellinjer, men användningen av 3 μg DNA och 3 μL av ett lipidtransfektionsreagens gav generellt de bästa resultaten av mellan 0,5-2% transfektionseffektivitet. Om transfektionseffektiviteten är lägre kan dock optimering av mängden DNA och lipidreagens utföras. Andra transfektionsreagens kan också testas av prövaren.
Effektiviteten hos indel generation kommer att variera med olika gRNAs och kan påverkas av genomisk lokalisering. I de allra flesta fall, om fyra gRNAs är konstruerade, minst en och många gånger 2 till 3, kommer att fungera effektivt. Dessutom, innan du testar gRNAs, är optimering av PCR-strategin för att visualisera indels med en ren enbands-DNA-produkt viktig. För screening ssODN baserad genom redigering, är det bäst att lägga till en begränsning enzym plats när du introducerar en tyst mutation (s), men om det inte är möjligt, kan strykningen av en restriktion enzym plats användas också. Dessutom kräver homologi riktad reparation aktivt cykling celler så CELLTÄTHETEN av kulturer före transfektion är avgörande för att öka frekvensen av kloner repareras med den införda ssodn mall.
Några av begränsningarna i detta protokoll är relaterade till den position i genomet som kommer att redigeras. När kodning regioner ändras, ssODN bär tysta mutationer förhindra Cas9 från att re-Cutting den redigerade webbplatsen och de tysta mutationer inte förändrar protein produkten. Men redigering i reglerande eller icke-kodning regioner med denna metod blir svårare eftersom tysta mutationer är inte möjligt. Om basen som ska redigeras är en del av en PAM-sekvens, kan detta göras med framgång, men endast homozygot ändringar kan genereras effektivt.
Det protokoll som beskrivs här är användbart för att generera eller korrigera heterozygot kodning mutationer utan tillsats av oavsiktliga indels i den andra allelen. Detta protokoll kommer att underlätta användningen av mänskliga gemensamma kontaktpunkter för att studera ett brett spektrum av ämnen från utvecklingsbiologi till modellering av genetiska sjukdomar. Användningen av isogena linjer är avgörande för att definiera funktioner för en given kodnings mutation utan störande effekter på grund av olika genetiska bakgrunder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av finansiering från National Heart, lung, och blod Institute (NHLBI), National Institutes of Health genom bidrag U01HL099656 (P.G. och D.L.F.) och U01HL134696 (P.G. och D.L.F.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
| 6-well polystyrene tissue culture dishes | Corning | 353046 | |
| AflII restriction endonuclease | New England Biolabs | R0520 | |
| Agarose | VWR | N605 | |
| DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 11320033 | |
| dNTPs | Roche | 11969064001 | |
| Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus | |||
| Gel extraction kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Gibson Assembly Kit | New England Biolabs | E2611 | |
| gRNA_Cloning Vector | Addgene | 41824 | |
| LB agar plates containing 50 μg/ml kanamycin | |||
| Lipofectamine Stem Reagent | ThermoFisher | (STEM00001) | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 354230 | |
| Murine embryonic fibroblasts (MEFs) | |||
| Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Orbital shaking incubator | |||
| pCas9_GFP vector | Addgene | 44719 | |
| PCR strip tubes | USA Scientific | 1402-2900 | |
| Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5× Phusion buffer | New England Biolabs | M0530 | |
| PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K210011 | |
| Proteinase K | Qiagen | Qiagen 19133 | |
| StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells | Takara | 636763 | |
| SOC medium | New England Biolabs | B9020S | |
| TrypLE Express Enzyme | ThermoFisher | 12605036 | |
| Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi) | Tocris | 1254 |
References
- Srivastava, D., Dewitt, N. Review In Vivo Cellular Reprogramming: The Next Generation. Cell. 166 (6), 1386-1396 (2016).
- Clevers, H. Review Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of Embryonic Stem Cells to Relevant Populations: Lessons from Embryonic Development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
- Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), 1-6 (2018).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (3), 170-182 (2016).
- Tiyaboonchai, A., et al. GATA6 Plays an Important Role in the Induction of Human Definitive Endoderm, Development of the Pancreas, and Functionality of Pancreatic β Cells. Stem Cell Reports. 8 (3), 589-604 (2017).
- Guo, M., et al. Using hESCs to Probe the Interaction of the Diabetes-Associated Genes CDKAL1 and MT1E. Cell Reports. 19 (8), 1512-1521 (2017).
- Zeng, H., et al. An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery. Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).
- Wang, Y., et al. Genome editing of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells with zinc finger nucleases for cellular imaging. Circulation Research. 111, 1494-1503 (2012).
- Xue, H., Wu, J., Li, S., Rao, M. S., Liu, Y. Genetic Modification in Human Pluripotent Stem Cells by Homologous Recombination and CRISPR/Cas9 System. Methods in Molecular Biology. 1307, 173-190 (2014).
- Huang, X., et al. Production of gene-corrected adult beta globin protein in human erythrocytes differentiated from patient iPSCs after genome editing of the sickle point mutation. Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).
- Wang, X., et al. Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors. Nature Biotechnology. 33 (2), 175-178 (2015).
- Sim, X., Cardenas-Diaz, F. L., French, D. L., Gadue, P. A Doxycycline-Inducible System for Genetic Correction of iPSC Disease Models. Methods in Molecular Biology. 1353, 13-23 (2015).
- Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Review Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).
- Byrne, S. M., Mali, P., Church, G. M. Genome editing in human stem cells. Methods in Enzymology. 546, 119-138 (2014).
- Zhu, Z., González, F., Huangfu, D. The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells. Methods in Enzymology. 546, 215-250 (2014).
- Hou, Z., et al. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15644-15649 (2013).
- Cong, L., Zhang, F. Genome engineering using CRISPR-Cas9 system. Methods in Molecular Biology. 1239, Clifton, N.J. 197-217 (2015).
- Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Methods. 10 (10), 957-963 (2013).
- Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
- Maguire, J. A., Cardenas-Diaz, F. L., Gadue, P., French, D. L. Highly efficient crispr cas9-mediated genome editing in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 64 (2019).
