Isolering af intakt øjeæblet for at opnå integreret okulær overflade væv til histologisk undersøgelse og immun histokemi
Summary
Denne protokol beskriver en metode til isolering af muse øjeæblet med øjenlåg, okulær overflade, forreste og bageste segmenter i relativt intakt position.
Abstract
Okulær overflade (os) består af et epitel blad med tre forbundne dele: øjenspalten conjunctiva, bulbar conjunctiva og cornea epithelium. Forstyrrelse af OS ville føre til keratitis, konjunktivitis eller begge dele (keratoconjunctivitis). I eksperimentelle dyremodeller med visse genetiske modifikationer eller kunstige operationer er det nyttigt at undersøge alle dele af OS epitel arket for at evaluere relative patogengenetiske ændringer af hver del parallelt. Men, dissektion af OS væv som helhed uden forvrængning eller skade har været udfordrende, primært på grund af blødhed og tyndhed af OS fastgjort til fysisk adskilte endnu bevægelige øjenlåg og øjeæblet. Desuden er den dybe øjen sokkel dannet af den hårde kraniet/orbital knogler er fuldt besat af øjeæblet forlader begrænset plads til drift dissektioner. Som et resultat, direkte dissektion af øjeæblet med tilhørende os væv fra ansigtet side ville ofte føre til vævsskader, især øjenspalten og bulbar conjunctiva. I denne protokol, vi beskrev en metode til at fjerne kraniet og orbital knogler sekventielt fra en bisected muse hoved, forlader øjenlåg, okulær overflade, linse og nethinden helt i ét stykke. Integriteten af OS-arket var velbevaret og kunne undersøges ved histologi eller immun farvning i et enkelt afsnit.
Introduction
Den okulære overflade består af et kontinuerligt ark regionaliseret Epitelet, herunder øjenspalten conjunctiva, bulbar conjunctiva og cornea1. Mange glandulære strukturer er forbundet med den okulære overflade epitel og sammen generere et lag af tåre film beskytter hornhinden overflade fra tørring og miljømæssige invasioner2. Forstyrrelse af OS ville føre til keratitis, konjunktivitis eller begge dele (keratoconjunctivitis). Både genetiske faktorer og miljø irritanter eller deres interaktioner bidrager til patologiske ændringer af os3,4. Derfor er en række genetisk fremstillede og fysisk eller kemisk inducerede dyremodeller blevet brugt til at studere sygdomsprocesser i det menneskelige OS.
Strukturen og funktionen af musen OS er magen til den af mennesker på mange måder. De tåre film komponenter udskilles af de okulære kirtler er også ens mellem mus og mennesker. Et væld af undersøgelser er blevet udført ved hjælp af musemodeller til belyse mekanismer af menneskelige os sygdomme5,6,7. I mange tilfælde er det afgørende at analysere globale i stedet for lokale molekylære ændringer af OS for at få omfattende information under den samme eksperimentelle behandling. Derfor er prøveforberedelse med god integritet nødvendig for at sikre, at hver del af operativsystemet analyseres samtidigt.
Musen OS stramt associerer med øjeæblet, der var indlejret i øjet socket/kredsløb (en Bony Cup lavet af flere forskellige kraniet knogler) og forbinder til det gennem tynde bindevæv. Der findes enorme udfordringer for dissekting hele okulær overflade uden at beskadige øjenspalten eller bulbar conjunctiva. Disse udfordringer kommer ned fra: (i) OS er bløde og tynde og anbringes på fysisk adskilte, men bevægelige øjenlåg og Eyeball, derfor sårbar for forvrængning og beskadigelse; og (II) den begrænsede plads mellem de orbital knogler og øjeæblet begrænser dissektions operationer. Udfordringerne er meget større for voksne mus. I embryonale mus, den orbital knogle ossifikation er ikke komplet og omgivende væv er relativ løs8. Hovedet kan fjernes og bisected, og derefter direkte udsat for PARAFORMALDEHYD (PFA) fiksering og indlejring9. I modsætning hertil er de postnatal og voksne mus orbital knogler fuldt ossificeret med tykke omgivende væv, hvilket gør penetration af fikater mindre effektiv. Desuden er orbital/kraniet knogler hårde og skøre, let brudt, når skære dem i de bløde indlejring forbindelser såsom paraffin. De brudte stykker af knogler vil enstemmigt rive de nærliggende væv resulterer i ringere væv morfologi.
Mange offentliggjorte undersøgelser viste ofte delvis okulær overflade, hvilket kan være tilstrækkeligt til deres særlige forskningsformål10,11. En grov undersøgelse af litteraturer fandt kun få undersøgelser viser hele intakt okulær overflade, der påvises uden detaljeret beskrivelse af dissektion protokoller12,13. I denne protokol, vi detaljeret en dissektion metode til at opnå en integreret postnatal okulær overflade, hvor orbital og kraniet knogler blev ordnet fjernet, forlader uberørt okulær overflade sammen med øjeæblet og øjenlåg, minimere de fysiske skader. Vi undersøgte yderligere OS histologi og udførte immun histokemi ved hjælp af vævs sektioner udarbejdet med denne protokol.
Protocol
Representative Results
Discussion
En kritisk påmindelse til forberedelse af den intakte øjeæblet er, at alle orbital knogler skal fjernes helt, især har og lacrimal knogler, som er små og placeret nær bunden af øjet socket. Eventuelle venstre-over knogler kan komplicere den efterfølgende histologi. Hvis et lille stykke knogle ikke var helt fjernet fra dissektion ved et uheld, kan det blive plukket ud fra indlejring paraffin blok ved hjælp af et par skarp pincet. Hullet efterladt skal fyldes med smeltet paraffin.
Der b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takke Prof. Rong Ju for kritisk læsning af manuskriptet, og alle Lab medlemmer for teknisk assistance. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation i Kina (NSFC: 31571077; Beijing, Kina), den Guangzhou City Sciences and Technologies innovation Project (201707020009; Guangzhou, Guangdong-provinsen, Kina), “100 People plan” fra Sun Yat-sen Universitet (8300-18821104; Guangzhou, Guangdong-provinsen, Kina), og forskning finansiering fra State Key laboratorium af Ophthalmology på Zhongshan Ophthalmic Center (303060202400339; Guangzhou, Guangdong-provinsen, Kina).
Materials
| 1× Phosphate buffered saline (PBS) | Transgen Biotech | FG701-01 | |
| 50ml centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| Adhesive microscope slides | Various | ||
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | Suggested concentration 1:500 – 1,000 |
| Alexa Fluor 568 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12380 | Suggested concentration 1:500 – 1,000 |
| Anti-K12 antibody | Abcam | ab124975 | Suggested concentration 1:1,000 |
| Anti-K14 antibody | Abcam | ab7800 | Suggested concentration 1:800 |
| Citric acid | Various | ||
| Cover slide | Various | ||
| Curved forceps | World Precision Instruments | 14127 | |
| Dissecting microscope. | Olmpus | SZ61 | |
| Ethyl alcohol | Various | ||
| Fluorescent Microscope | Zeiss | AxioImager.Z2 | |
| Fluoromount-G Mounting media | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Micro dissecting scissors-straight blade | World Precision Instruments | 503242 | |
| Microwave ovens | Galanz | P70D20TL-D4 | |
| Mouse strains | C57/BL6 and Sv129 mixed | ||
| No.4 straight forceps | World Precision Instruments | 501978-6 | |
| Normal Goat Serum | Various | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Various | Prepare a 4% solution in 1× PBS and filter with 0.45μm filter membrane | |
| Tissue culture dish | Various | ||
| Trisodium citrate | Various | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | SLBW6818 |
References
- Swamynathan, S. K. Ocular surface development and gene expression. Journal of Ophthalmology. 2013, (2013).
- Arita, R., Fukuoka, S., Morishige, N. Functional Morphology of the Lipid Layer of the Tear Film. Cornea. 36 Suppl 1, S60-S66 (2017).
- Guo, D., et al. Ocular surface pathogenesis associated with precocious eyelid opening and necrotic autologous tissue in mouse with disruption of Prickle 1 gene. Experimental Eye Research. 180, 208-225 (2018).
- Knop, E., Knop, N. Anatomy and immunology of the ocular surface. Chemical Immunology and Allergy. 92, 36-49 (2007).
- Mizoguchi, S., et al. Ocular surface alkali injury damages meibomian glands in mice. The Ocular Surface. 15 (4), 713-722 (2017).
- Gipson, I. K. Goblet cells of the conjunctiva: A review of recent findings. Progress in Retinal and Eye Research. 54, 49-63 (2016).
- Nowell, C. S., et al. Chronic inflammation imposes aberrant cell fate in regenerating epithelia through mechanotransduction. Nature Cell Biology. 18 (2), 168-180 (2016).
- Nagata, M., Ohashi, Y., Ozawa, H. A histochemical study of the development of premaxilla and maxilla during secondary palate formation in the mouse embryo. Archives of Histology and Cytology. 54 (3), 267-278 (1991).
- Zhang, L., et al. A role for MEK kinase 1 in TGF-beta/activin-induced epithelium movement and embryonic eyelid closure. The Embo Journal. 22 (17), 4443-4454 (2003).
- Sharov, A. A., et al. Noggin overexpression inhibits eyelid opening by altering epidermal apoptosis and differentiation. The Embo Journal. 22 (12), 2992-3003 (2003).
- Setala, N. L., Metso, J., Jauhiainen, M., Sajantila, A., Holopainen, J. M. Dry eye symptoms are increased in mice deficient in phospholipid transfer protein (PLTP). The American Journal of Pathology. 178 (5), 2058-2065 (2011).
- Zhang, Y., et al. Mastermind-like transcriptional co-activator-mediated Notch signaling is indispensable for maintaining conjunctival epithelial identity. Development. 140 (3), 594-605 (2013).
- McCauley, H. A., et al. TGFbeta signaling inhibits goblet cell differentiation via SPDEF in conjunctival epithelium. Development. 141 (23), 4628-4639 (2014).
- Guo, D., et al. Ocular surface pathogenesis associated with precocious eyelid opening and necrotic autologous tissue in mouse with disruption of Prickle 1 gene. Experimental Eye Research. 180, 208-225 (2019).
