Summary
Vi beskriver en kirurgisk protokoll som konsekvent induserer robuste, nedadgående bryst aorta aneurismer hos mus. Prosedyren innebærer venstre toraktomi, bryst aorta eksponering, og plassering av en svamp dynket i svin bukspyttkjertelen elastase på aorta veggen.
Abstract
I henhold til senter for sykdomskontroll ble aorta aneurismer (AAs) betraktet som en ledende dødsårsak i alle raser og begge kjønn fra 1999-2016. En form for blødning som følge av progressiv svekkelse og eventuell utvidelse av aorta, som kan sprekke eller rive når den når en kritisk diameter. Aneurismer av den synkende aorta i brystet, kalt synkende bryst aorta aneurismer (dTAA), utgjør en stor andel av blødning tilfeller i USA. Uncontained dTAA brudd er nesten universelt dødelig, og valgfag reparasjon har en høy grad av sykelighet og dødelighet. Hensikten med vår modell er å studere dTAA spesielt, å belyse patofysiologi av dTAA og å søke etter molekylære mål å stanse veksten eller redusere størrelsen på dTAA. Ved å ha en murine modell for å studere bryst patologi presist, kan målrettede terapier utvikles til spesielt teste dTAA. Metoden er basert på plassering av svin bukspyttkjertel elastase (PPE) direkte på den ytre murine aorta veggen etter kirurgisk eksponering. Dette skaper en destruktiv og inflammatorisk reaksjon, som svekker aorta veggen og gir mulighet for blødning dannelse over uker til måneder. Selv om murine modeller har begrensninger, produserer vår dTAA-modell en robust aneurismer av forutsigbar størrelse. Videre kan denne modellen brukes til å teste genetiske og farmasøytiske mål som kan arrestere dTAA vekst eller hindre brudd. I menneskelige pasienter, intervensjoner som disse kan bidra til å unngå blødning brudd, og vanskelig kirurgisk inngrep.
Introduction
Formålet med denne metoden er å studere utviklingen, patofysiologi, og strukturelle endringer i murine synkende bryst aorta under dannelse av aorta-blødning. Vår modell tilbyr en reproduserbar og konsistent metode for å indusere bryst aorta aneurismer (dTAA) i mus og dermed muliggjør testing av ulike genetiske og Pharmacologic hemmere. Dette arbeidet kan bidra til å identifisere medikamenter og gen-terapier som kan oversettes til en levedyktig behandlings strategi for mennesker med dTAA sykdom.
dTAAs form når veggen av bryst aorta blir svekket og utvider over tid til å nå en kritisk diameter når rive eller brudd kan da forekomme. Klinisk, dTAA kan utvikle seg i stillhet, øker i størrelse til strukturen av aorta veggen er så forvrengt at det til slutt svikter, med katastrofale konsekvenser. Concerningly, symptomene utvikler seg vanligvis bare når det har nådd en farlig størrelse (100-150% utvidelse) og har høy risiko for disseksjon eller brudd1,2. dTAA brudd er nesten universelt dødelig3, og valgfag kirurgisk reparasjon bærer betydelig sykelighet4,5. Videre bærer de fleste pasientene diagnosen aorta-blødning i ca. 5 år før kirurgisk reparasjon6,7. Dette vinduet representerer en beleilig tid til å gripe inn ikke-kirurgisk. Således, medisinsk behandling for å behandle eller langsom progresjon av dTAA er nødvendig og vil representere en betydelig fremgang til feltet av blødning forskning. Det er for tiden ingen medisinske behandlinger for dTAA tilgjengelig, hovedsakelig på grunn av en ufullstendig forståelse av dTAA patogenesen.
I løpet av de siste 20 årene har flere dTAA dyremodeller blitt utviklet, men hver av disse modellene var adskilt fra vår egen og produserte ikke robuste aneurismer. En murine dTAA-modell som er mest lik vår, ble utviklet av Ikonomidis et al.8, som inkluderer direkte anvendelse av CaCl2 til adventitia av aorta. Selv om vår modell var tilpasset fra mange av teknikkene som er fremsatt av Ikonomidis, er vår modell unik på tre forskjellige måter. Først i vår modell aorta er eksponert for aktuell elastase i 3-5 minutter, sammenlignet med 15 minutter av CaCl2 eksponering. For det andre oppstår aorta-utvidelse i 2 uker, sammenlignet med 16 uker i CaCl2 -modellen. Sist, vår modell konsekvent produserer aneurismer på ca 100% dilatasjon, sammenlignet med aorta dilatations av 20-30% produsert av CaCl2 søknad (som ikke kan virkelig betraktes aneurismer som de er definert som en økning i aorta diameter > 50%). Det er andre ikke-kirurgiske murine modeller av blødning, slik som Apo E knockout mus, som danner robuste aneurismer med infusjon av angiotensin II. Men disse musene utvikle Supra-nyre eller stigende bryst aorta aneurismer snarere enn aneurismer spesielt i synkende bryst aorta9,10.
Den rasjonelle for denne protokollen er å ha en enkel, billig og tid egnet måte å studere dTAA i en murine modell. Musa modellen gir en unik mulighet til å utnytte mange genetiske og celle-spesifikke Knockouts som har blitt funnet å være slagkraftige i andre vaskulære sykdommer. Bruken av vår spesifikke TAA-modell har blitt godt mottatt og eksperimenter som bruker den har blitt publisert i High Impact tidsskrifter11,12. Til dette punktet, har modellen blitt brukt til å undersøke mulige genetiske og Pharmacologic behandlinger som hadde en betydelig effekt i abdominal aorta (AAA) murine modeller; som vår Lab har utvidet bruken av dTAA-modellen, finner vi imidlertid mål som er unike for dTAA-formasjonen, som kan brukes som målrettede terapier hos mennesker.
Denne modellen er mest hensiktsmessig for laboratorier som har murine mikro-kirurgiske evner. Selv om det er teknisk utfordrende, kan det utføres konsekvent selv av forskere uten tidligere kirurgisk erfaring. For en forsker uten murine kirurgisk erfaring modellen kan bli mastret i ca 20 operative sesjoner (eller ca 50 mus). For forskeren med tidligere kirurgisk erfaring, kan modellen bli mastret i 5 operative sesjoner (ca 20 mus). Vi tror med en høy kvalitet video, kan tiden for å mestre bli ytterligere redusert. Etter at ferdigheter er oppnådd, kan prosedyren være ferdig i 35 minutter for kirurgi, og 20 minutter for terminalen innhøsting. Kirurger i laboratoriet vårt kan fullføre 10-12 fulle operasjoner per dag, med en operativ dødelighet på 5-10%. Den vanligste årsaken til dødelighet er lungeskade ved innreise til brystet, bedøvelse toksisitet, eller tåre av aorta under disseksjon. I tillegg til dTAA forskning, fungerer denne modellen også som en guide for sikker og enkel tilgang til bryst aorta og lunge hilum for forskere som studerer andre intervensjoner i brystet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Animal protokoller ble godkjent av University of Virginia institusjonelle Animal Care og use Committee (nr. 3634).
1. induksjon av anestesi og intubering
- Plasser en 8-10-uke gammel mannlig C57BL/6-mus i et lukket kammer med kontinuerlig strøm av 5% isoflurane og oksygen blanding i 5 minutter, til respirations er synlig redusert.
Merk: ulike stammer, kjønn og alder av mus kan brukes avhengig av eksperimentell protokollen. Kvinnelige mus kan være vanskeligere å intubere på grunn av mindre størrelse og dermed mindre luftveier. - Intubere musa som beskrevet av Vandivort et al.13.
Merk: intubering trinnet er den vanskeligste delen av denne modellen til å både lære og utføre. Ovennevnte refererte forfatterne gjør en utmerket jobb som forklarer trinnene i videoen deres.
2. sikring av musen til kirurgisk bord
- Koble endotrakeal (ET) tube, bekrefte brystet stige, og legge musen i høyre lateral liggeposisjon. Drei isoflurane til ca. 3% og påfør smøring på begge øynene. Ventilatoren bør stilles inn for å gi ca. 200 pust per minutt og 225 μL av tidevanns volum.
Merk: toksisitet er rask hvis isoflurane er igjen ved 5%. Men, respons på isoflurane er variabel slik bedøvelse strømningshastighet bør være titrert slik at spontan diafragma sammentrekninger forekomme omtrent hver 10-20 s og oksygenering vises tilstrekkelig på inspeksjon av slimhinner og eksponert vev. - Fest ET rør til styret med tape. Utvid høyre arm rostrally slik at fronten labben er i tråd med nesen og fest den med tape.
- Trekk halen caudally for å skape en linje av spenning mellom høyre arm og hale, produserer forlengelse av ryggraden.
Merk: sikring av både halen og høyre labb i linje hindrer over innsetting eller koagulater av ET rør. - Tape venstre ben i sin naturlige posisjon. Tegn venstre arm ventrally over rullet gasbind og tape ned.
3. forberedelse til kirurgi
- Barbering venstre flanke av musen med elektrisk Clippers fra venstre skulder til venstre magen.
- Bruk en bomulls spiss applikator for å børste Betadine oppløsning over operasjonsstedet. Bruk en ny bomulls spiss applikator for å børste 70% etanol løsning over operasjonsstedet. La det tørke. Plasser en steril gardin.
- FORSIKTIG: Sørg for at alle etanol er helt tørket før du fortsetter som elektrokautering brukes og kan tenne etanol.
4. inntreden i thorax
- Lag en 1 cm lateral snitt på midtpunktet av hemithorax ved hjelp av kirurgiske saks. Bruk håndholdt elektrokautering å dele muskel lag til ribbeina er synlige.
- Direkte cauterize en 2 mm del av vrborden.
Merk: Når du bruker elektrokautering på vrborden, skal du observere den spontane pustefrekvensen. Hvis musen har en diafragma sammentrekning under cauterization, kan spissen gå inn i thorax og punktering av lungene, som vanligvis er dødelig i denne modellen. - Ved hjelp av en fuktet, fin bomull-tippet applikator i rib rommet overlegen til den cauterized delen, rotere spissen på vevet for å bryte inn i pleural plass. Plasser fuktet 3 mm x 2 mm svamp inn i thorax for å bidra til å skjule lungene.
Merk: bare la myke, våte, svamper kontakte lungene som det er svært delikat. - Bruk saks til å skjære langs toppen aspekt av cauterized ribben, til membranen er synlig.
5. aorta eksponering
- Plasser rib sårhaker og bruke dem til å åpne toraktomi snitt. Forsiktig fjerne svamp fra overflaten av lungene.
- Plasser fuktet 6 mm x 4 mm svamp slik at den ligger som dekker lungene, med endene som peker rostrally og caudally. Plasser (Wide flat) lunge retractor på svamp og skyv forsiktig retractor ventrally til den synkende bryst aorta er eksponert.
- Bruk #7 tang til å analysere bindevev og fett av aorta for en ca 5 mm delen.
Merk: små årer kan kjøre tvers over aorta; unngå å rive dem under disseksjon (bruker minst 14x forstørrelse kan bidra til å unngå denne komplikasjon).
6. Elastase eksponering
- Mette 0,5 mm x 1 mm svamp med 12 μL av svin bukspyttkjertel elastase og plasser den på den eksponerte overflaten av aorta.
Merk: ikke la svamp berøre kontralateral lunge. - Etter forhåndsbestemt tid (vanligvis 3-5 min), fjerne elastase svamp med #7 tang. Fjern lunge retractor. Skyll bryst hulrommet med 1 mL sterilt saltvann.
Merk: Fjern lunge retractor før vanning med saltvann som det vil tillate lunge svamp til å bli mettet og myk, noe som gjør det enklere å fjerne fra overflaten av lungene. - Bruk rullet 2 "x 2" gasbind å absorbere de resterende saltvann vanning. Drei isoflurane ned til 2%.
7. lukking av brystet
- Fjern lunge svamp. Fjern caudal lunge retractor. Fjern rostral lunge retractor.
- Plass 3 avbrutt 6-0 ikke-absorberbare sting å motsette ribbeina, knytte en løs knute i hver, men ikke tie ned. Vær svært forsiktig med å ikke berøre lungene med Sutur nålen.
- Re-blåse opp lungene ved å okkluderer strøm røret på ventilatoren eller ved raskt å blåse 0,5-1,0 mL luft gjennom ET rør ved å benytte 3-veis stopp kuk.
Merk: for å unngå barotrauma, unngå overdreven bruk av den luftfylte sprøyten, og bruk ikke mer enn 1,0 mL luft. - Tie ikke-absorberbare sting. Reapproximate muskelen lag med en kjørende 5-0 absorberbare multifilament Sutur. Snu isoflurane ned til 1%.
- Lukk huden med 7-10 avbrutt 5-0 ikke-absorberbare sting. Slå isoflurane til 0%.
8. gjenvinning
- Administrer 6 μg (0,02 mL av en 0,3 mg/mL suspensjon) av buprenorfin subkutant. Fjern tapen fra høyre fot, hale, og venstre arm etterfulgt av høyre arm tape.
- Når musen beveger ekstremiteter, ekstubere ved å trekke den ved halen for å skyve av ET rør. Plasser i det høye oksygeninnholdet varmere kammer i liggende posisjon.
Merk: det er trygt å flytte musen fra oksygen kammer i buret når det kan slå seg over til normal stående posisjon. Videre bør mus overvåkes for tegn på smerte, nød eller manglende evne til å trives ofte i de første 24-48 timene etter operasjonen og gitt ekstra analgesi eller myk mat som indikert.
9. eksponering av aorta-blødning (Terminal Harvest prosedyre)
Merk: Generelt er vev innhøsting utført på 14 dager, da dette representerer den perioden av maksimal dilatasjon. Men, avhengig av eksperimentet, kan innhøstingen prosedyren timing utføres når som helst mellom 3 dager og 4 + uker, avhengig av eksperimentet.
- Intubere og sikker mus til operative feltet som beskrevet ovenfor (seksjoner 1-3). Bruk saks til å incise huden anteriort fra venstre flanke til sentrale abdomen ta vare å ikke gå inn i peritoneum.
- Incise huden fra rygg venstre flanke rostrally til nivået på venstre skulder. Deretter incise på en 90 ° vinkel gjennom axilla til brystbenet.
Merk: Dette snittet bør helt omslutter den opprinnelige huden snitt. - Benytter cauterization, analysere hud klaff mot det ventrale aspektet av musa, utsette det igjen hemithorax. Bruk saks for å komme inn i buken og incise langs venstre Costal margin fra ventrale til rygg for å avdekke undersiden av venstre membran. Den laterale mest kanten av membranen kan åpne som er ønsket.
- Hvis ikke opprettet med det tidligere trinnet, incise membranen på sitt mest laterale kanten. Plasser tuppen av cauterization i dette hullet og cauterize membranen av Costal margen til xyphoid prosessen. Ved hjelp av en fuktig, fin tippet bomulls spiss applikator, forsiktig frigjør lungene fra adhesjon til brystveggen og skyv lunge anteriort.
Merk: Hvis adhesjon ikke lett kommer ut av brystveggen, bruk cauterization for å fjerne dem; Dette bidrar til å unngå å rive lungene som kan forårsake kraftig blødning. - Cauterize innsiden av brystveggen fra vrbord en til Costal margin, rygg til midten aksillær linje, men minst 2 mm fra aorta. Skjær brystveggen langs cauterized linjen.
Merk: denne teknikken unngår blødning fra interkostalrom arterier. - Skjær langs overlegen margin på rib en og deretter caudally langs den laterale kanten av brystbenet, fjerne venstre rib bur. Plasser sårhaker på lungene og trekk anteriort. Plasser retractor på membranen og trekk caudally for å avdekke så mye aorta som mulig.
- Bruk et tørr bomulls spiss applikator for å fjerne adhesjon fra aorta og et uberørt, Fjern segment. Mål diameteren på det upåvirket kontroll segmentet og den bredeste delen av elastase som ble behandlet med video micrometry.
Merk: video micrometry målingene brukes til å beregne prosent utvidelse av aneurisme segmentet sammenlignet med et kontroll segment med formel 1. Et kontroll segment som er 0,5 mm til aneurisme segment 1 er valgt.
Ligning 1
- Grip aorta med skader tang, bare til det behandlede segmentet. Bruk saks til å kutte opp-ned til pinsett, og deretter analysere aorta av ryggsøylen. Skjær aorta proksimale til behandlet segmentet og fjerne aneurisme aorta.
- Ved hjelp av en tuberkulin sprøyte og nål, vask aorta lumen med saltvann og prosess vev som ønsket.
Ligning 1Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anvendelsen av vår protokoll resulterer i robuste dTAA i mus sammenlignet med saltvann kontroller. TAAs utviklet er fusiform i form og forekommer bare i den behandlede delen av aorta (figur 1 og figur 2)11. Figur 2 viser et eksempel på en video micrometry måling ved vev innhøsting. Ved hjelp av ligning 1 er aorta-utvidelse 130% i dette eksempelet.
Den opprinnelige studien av Johnston et al.11 som beskriver modellen viste signifikant økning i aorta-utvidelse i vill type elastase behandlede mus (WT TAA) ved 3, 7, 14 og 21 dager sammenlignet med kontroller i ville type mus (WT kontroller). Maksimal aorta utvidelse oppstod på dag 14 (WT TAA: 99,6 ± 24,7% versus WT kontroll: 14,4 ± 8,2%; p < 0,0001) (Figur 3)11. Et eget eksperiment av pave et al.12 viser tilsvarende utvidelse på 14 dager.
Når man undersøker histologi, har WT TAAs elastin fiber som er tynnet og fragmentert. Det er også mindre glatt muskel celle (SMαA) farging, mens makrofager (Mac2) og interleukin-1β (IL-1β) uttrykket er økt (Figur 4).
Figur 1 : Eksempel fotografier av bryst aorta (TAA) modell og utstyrsoppsett. Fra venstre til høyre, (1) første eksponering av bryst aorta gjennom en venstre toraktomi, (2) Disseksjon av pleura, (3) anvendelse av en elastase-gjennomvåt svamp, og (4) svamp fjerning. For aorta innhøsting (5) ble toraktomi gjenåpnet, og bryst aorta ble dissekert fri og målt. (6) illustrasjon til høyre demonstrerer relativ sammenslutning av aorta med spiserør, lunge og hemiazygos vene. Dette tallet er tilpasset fra Johnston et al.11. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Eksempel video micrometry måling av TAA. C = ueksponerte kontroll segment, A = elastase behandlet aneurisme segment, RL = høyre lunge, E = spiserør, T = hale, H = hode. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Aorta diameter over tid under TAA formasjon. Gjennomsnittlig aorta diameter (mm ± SD) i WT mus eksponert for elastase (WT TAA, grå) eller utsettes for saltvann (WT kontroll, grønn) over tid. Det oppstod betydelige forskjeller mellom WT TAA og WT kontroll på alle tidspunkt punktmerket med stjerne (p < 0,05). Maksimal aorta-utvidelse oppstår på dag 14 (WT TAA: 99,6 ± 24,7% versus WT kontroll: 14,4 ± 8,2%; p < 0,0001). Feilfelt representerer standardavvik. Dette tallet er tilpasset fra Johnston et al.11. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Histologiske undersøkelse av WT ELASTASE TAA og WT saltvann kontroll vev. Eksempel på aorta-tverrsnitt av WT-kontroll (saltvann svamp) og WT TAAs (elastase svamp) på dag 14. Farging for elastin, glatte muskelceller (SMαA), makrofager (Mac2), og interleukin-1β (IL-1β). Scale bar = 50 μm. Dette tallet er tilpasset fra Johnston et al.11. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Dose-respons undersøkelse av individuell elastase flaske. Hver gruppe av poeng representerer en pre-spesifisert tid når elastase-gjennomvåt svamp har lov til å dvele. Disse dataene brukes til å anslå den ideelle fordøyelsen tid for 100-130% utvidelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bryst og abdominal aorta er cellularly og embryologically distinkte, som er relevant for aneurisme sykdom14,15,16. Derfor er en bestemt dyr modell for å studere TAA nødvendig. Selv om andre murine dTAA modeller har blitt publisert8, er vår den eneste modellen for å skape synkende bryst aorta dilatasjon som kan betraktes som virkelig aneurisme (over 50% utvidelse). Videre er vår modell relativt rask å kjøre og resulterer i maksimal utvidelse på 14 dager i motsetning til 16 uker i CaCl2 Model8. Denne effektiviteten har gjort det lettere å studere konkrete Pharmacologic intervensjoner som potensielt kan være oversettbare for menneskelige studier på11,12. Denne protokollen har imidlertid flere utfordrende aspekter og begrensninger.
Vår modell benytter renset svin bukspyttkjertel elastase, som har vært brukt i flere tidligere AAA-modeller. Virkningsmekanismen antas å være nedbryting av elastin i Media av aorta og etablering av en robust inflammatorisk respons, fører til en mindre kompatibel og til slutt svakere vegg. Fordøyelses effekten av elastase varierer fra flaske til flaske. For å sikre en konsistent fordøyelses effekt, bør en dose respons kurve foretas for hver nye flaske elastase. Dosen tilsvarer tiden der elastase-gjennomvåt gasbind har lov til å dvele. Et eksempel på en slik kurve vises i figur 5. Spesifikk elastase svamp avsøring timene er undersøkt med det målet å finner en avsøring varigheten hvilke skaper aneurismer av 100-130% utvidelse for 14 dager. I dette eksempelet kurve, en 4-minutters fordøyelse tid er utpekt for denne flasken av elastase (av notatet, den minste mengden av elastase tilgjengelig er i 10 mL, som er nok for ca 830 individuelle mus). Overdreven elastase fordøyelse kan forårsake intraoperativ blødning eller for tidlig brudd og utilstrekkelig eksponering kan ikke forårsake tilstrekkelig fordøyelse og aneurisme utvidelse.
Fordi denne modellen innebærer åpning av bryst hulrom, er bruken av positivt trykk ventilasjon obligatorisk. Opprinnelige vi benyttet en fremre nakke disseksjon og orotracheal intubering under direkte visjon, men denne metoden var tidkrevende som det kreves en ekstra snitt og nedleggelse. Vi benytter nå en direkte orotracheal intubering som beskrevet av Vandivort et al.13. Når du trener nye kirurger på denne modellen, anbefaler vi å praktisere intubering teknikken mye å mestre det før du går videre til selve operasjonen. Når musen er vellykket intubert, bør stor forsiktighet tas ikke å løsne røret som ødem øker med hver intubering forsøk, suksessivt reduseres sjansene for suksess og øke sjansene for en dødelig luftveis skade. Stor forsiktighet bør også tas for å minimere risikoen for ekstubering under operasjonen siden den tiden som kreves for reintubasjon er nesten alltid dødelig. Som beskrevet i vår protokoll, sikring av høyre arm og hale under en liten mengde spenning vil hindre rostral eller caudal skiftende under operasjonen og dermed minimere risikoen for ekstubering.
Kontroll av anestesi er viktig i denne modellen. Som Vandivort et al.13 diskutert i sine studier på intubering, et dypt nivå av sedasjon er nødvendig. Hvis musen er bevisst under intubering prosedyren, motstand mot ET tube innsetting kan forårsake tracheal Kader og esophageal intubering. For å redusere risikoen for isoflurane toksisitet, en gang tracheal plassering av ET rør har blitt bekreftet, prosent blanding av isoflurane bør reduseres med omtrent halvparten som brukes til induksjon. For å oppnå den ideelle prosentandelen av isoflurane, bør musen har en spontan diafragma sammentrekning hvert 10-20 sekunder. Etter hvert som operasjonen utvikler seg, bør isoflurane gradvis senkes og slås helt av etter at den siste hud lukke masken er plassert. Tapen begrensninger bør fjernes mens musen er fortsatt utvinne fra anestesi som fjerning mens musen er våken kan være traumatisk. For å bistå med utvinning og spredning av resterende isoflurane vi nylig endret prosedyren slik at musen er gjenopprettet i en høy oksygen varmende miljø umiddelbart etter ekstubering.
Musa lungen er ytterst delikat og skaden fra punktering, upassende handling, eller elastase avsøring nært alltid resultater inne død. Det vanligste punktet for lungeskade er den første inntreden i pleura. Når du bruker cauterization på ribbeina (trinn 4,2), anbefaler vi oppmerksom på spontan pustefrekvens og bare aktivere cauterization i noen sekunder umiddelbart etter en pust. Dette bidrar til å hindre en uventet utvidelse av brystkasse som kan drive cauterization spissen gjennom brystveggen og inn i lungene. Bruken av den fuktet bomulls spiss applikator i neste trinn for å forsiktig bryte vevet og pleural membranen bidro også til å minimere vår hastighet på lungeskade siden skarpe instrumenter ikke møter lunge overflaten. Til slutt, hvis elastase-gjennomvåt svamp kontakter enten lunge direkte, alvorlig skade kan oppstå. Dette kan unngås ved å ikke gå inn i kontralateral pleural plass under aorta disseksjon og klargjøring svamp slik at den kan plasseres direkte på aorta med liten omplassering. På slutten av operasjonen, et forsøk på å re-blåse venstre lunge bør gjøres ved okkluderer utløpet tube av ventilatoren. Hvis det er mislykket, direkte injeksjon av 0,5 til 1,0 mL luft gjennom 3-veis stopcock kan re-utvide lungene. Hvis begge disse metodene ikke fungerer, bør nedleggelse fortsette som normalt. Vi har funnet at hvis ingen stor lungeskade er til stede, mus tolerere en delvis oppblåst lunge relativt godt og lungene er nesten alltid oppblåst ved vev innhøsting.
Denne modellen har flere begrensninger. Eksperimentelle modeller ikke fullt ut modellen menneskelige aorta sykdom. dTAA oppstår i 14 dager etter en anvendelse av elastase i vår modell, mens menneskelige TAA formasjon er multifaktoriell og oppstår over år om ikke ti år. Men en musemodell som tar måneder til år å utvikle aneurismer er ikke nyttig i en undersøkende kapasitet. I motsetning til menneskelig sykdom, elastase indusert aneurismer i vår modell begynner å avta i størrelse når de når maksimal dilatasjon på to uker etter operativt. Denne regresjon kan overvinnes med bruk av β-aminopropionitrile (BAPN) supplert i musen kosthold postoperativt. Når kombinert med elastase eksponering modellen, BAPN tilskudd tillater kontinuerlig vekst og til slutt brudd, bedre etterligne kronisitet av menneskelig sykdom. Vår Lab har tidligere studert BAPN i AAA17 og vi er for tiden bruker den i dTAA modellen for ytterligere å avgrense vår protokoll. Primær eksperimenter med dTAA-modellen har vist brudd rater på omtrent 30% på 28 dager.
I fremtiden planlegger vi å bruke denne modellen til å evaluere andre genetiske og farmakologiske behandlinger som kan være oversettbare for behandling av mennesker. Fordi denne protokollen beskriver en enkel og sikker måte å få tilgang til bryst aorta, kan den brukes av andre laboratorier som ønsker å teste intervensjoner på bryst aorta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av AHA forsker Development Grant 14SDG18730000 (M.S.), NIH K08 HL098560 (G.A.) og RO1 HL081629 (G.R.U.) tilskudd. Dette prosjektet ble støttet av bryst Surgery Foundation for Research and Education (TSFRE) Research Grant (PI: G. Ailawadi). Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis synspunktene til NHLBI eller TSFRE. Vi takker Anthony sild og Cindy Dodson for deres kunnskap og teknisk ekspertise.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Angiocatheter (22G) | Used for ET Tube | ||
| Dumont Tweezers; Pattern #7 x2 | Roboz | RS-4982 | |
| Graefe Tissue Forceps | Roboz | RS-5158 | |
| Harms Forceps x2 | Roboz | RS-5097 | |
| Intracardiac Needle Holder; Extra Delicate; Carbide Jaws; 7" Length | Roboz | RS-7800 | |
| KL 1500 LED Light Source | Leica | 150-400 | |
| M205A Dissction Microscope | Leica | CH 94-35 | |
| Iris Scissors, 11cm, Tungsten Carbide | World Precision Instruments | 500216-G | |
| Metal Clip board | Use with the Mouse Retractor Set | ||
| Mouse Retractor Set | Kent | SURGI-5001 | Need 2 short and 1 tall fixators |
| Mouse Ventilator MiniVent Type 845, 115 V, Power Supply with US Connector | Harvard Apparatus | 73-0043 | MiniVent Ventilator for Mice (Model 845), Single Animal, Volume Controlled |
| Sigma Aldrich | Elastase from porcine pancreas | E0258-50MG | Can be purchased in various size bottles |
| Small Vessel Cauterizer Kit | Fine Science Tools | 18000-00 | Recommend using rechargable AA batteries |
| Spring Scissors, 10.5cm | World Precision Instruments | 14127 | |
| Steril Swabs (Sponges) | Sugi | 31603 | Can be cut to size |
| Surgi Suite Surgical Platform | Kent | Attach to clip board | |
| Tech IV Isoflurane Vap | Jorgensen Laboratories | J0561A | Anesthesia vaporizer |
References
- Coady, M. A., et al. What is the appropriate size criterion for resection of thoracic aortic aneurysms. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 113 (3), 489-491 (1997).
- Aggarwal, S., Qamar, A., Sharma, V., Sharma, A. Abdominal aortic aneurysm: A comprehensive review. Experimental and Clinical Cardiology. 16 (1), 11-15 (2011).
- Bickerstaff, L. K., et al. Thoracic aortic aneurysms: a population-based study. Surgery. 92 (6), 1103-1108 (1982).
- Cheng, D., et al. Endovascular aortic repair versus open surgical repair for descending thoracic aortic disease a systematic review and meta-analysis of comparative studies. Journal of the American College of Cardiology. 55 (10), 986-1001 (2010).
- Walsh, S. R., et al. Endovascular stenting versus open surgery for thoracic aortic disease: systematic review and meta-analysis of perioperative results. Journal of Vascular Surgery. 47 (5), 1094-1098 (2008).
- Absi, T. S., et al. Altered patterns of gene expression distinguishing ascending aortic aneurysms from abdominal aortic aneurysms: complementary DNA expression profiling in the molecular characterization of aortic disease. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 126 (2), 344-357 (2003).
- Ailawadi, G., Eliason, J. L., Upchurch, G. R. Current concepts in the pathogenesis of abdominal aortic aneurysm. Journal of Vascular Surgery. 38 (3), 584-588 (2003).
- Ikonomidis, J. S., et al. A murine model of thoracic aortic aneurysms. Journal of Surgical Research. 115 (1), 157-163 (2003).
- Daugherty, A., Manning, M. W., Cassis, L. A. Angiotensin II promotes atherosclerotic lesions and aneurysms in apolipoprotein E-deficient mice. Journal of Clinical Investigation. 105 (11), 1605-1612 (2000).
- Trachet, B., et al. Ascending Aortic Aneurysm in Angiotensin II-Infused Mice: Formation, Progression, and the Role of Focal Dissections. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (4), 673-681 (2016).
- Johnston, W. F., et al. Inhibition of interleukin-1beta decreases aneurysm formation and progression in a novel model of thoracic aortic aneurysms. Circulation. 130 (11), Suppl 1 51-59 (2014).
- Pope, N. H., et al. Interleukin-6 Receptor Inhibition Prevents Descending Thoracic Aortic Aneurysm Formation. Annals of Thoracic Surgery. 100 (5), 1620-1626 (2015).
- Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), e53771 (2016).
- Ailawadi, G., et al. A nonintrinsic regional basis for increased infrarenal aortic MMP-9 expression and activity. Journal of Vascular Surgery. 37 (5), 1059-1066 (2003).
- Ruddy, J. M., Jones, J. A., Spinale, F. G., Ikonomidis, J. S. Regional heterogeneity within the aorta: relevance to aneurysm disease. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 136 (5), 1123-1130 (2008).
- Trigueros-Motos, L., et al. Embryological-origin-dependent differences in homeobox expression in adult aorta: role in regional phenotypic variability and regulation of NF-kappaB activity. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (6), 1248-1256 (2013).
- Lu, G. S. G., Davis, J. P., Schaheen, B., Downs, E., Roy, R. J., Ailawadi, G., Upchurch, G. R. A novel chronic advanced staged abdominal aortic aneurysm murine model. Journal of Vascular Surgery. 66 (1), 232-242 (2017).
