Summary
हम लगातार चूहों में मजबूत अवरोही वक्ष महाधमनी aurysms प्रेरित करने के लिए एक शल्य प्रोटोकॉल का वर्णन. प्रक्रिया छोड़ दिया thoracotomy शामिल है, थोरैसिक महाधमनी जोखिम, और एक स्पंज की नियुक्ति porcin अग्नाशय elastase में महाधमनी दीवार पर भिगो.
Abstract
रोग नियंत्रण के लिए केंद्र के अनुसार, महाधमनी aneurysms (एएएस) 1999-2016 से सभी जातियों और दोनों लिंगों में मौत का एक प्रमुख कारण माना जाता था. एक anureysm प्रगतिशील कमजोर और aorta के अंतिम फैलाव का एक परिणाम के रूप में रूपों, जो टूटना या आंसू एक बार यह एक महत्वपूर्ण व्यास तक पहुँच सकता है. छाती में उतरते महाधमनी के aneurysms, अवरोही वक्ष महाधमनी aurysms (dTAA) कहा जाता है, संयुक्त राज्य अमेरिका में aurysm मामलों का एक बड़ा अनुपात बनाते हैं. Unintained डीटीएए टूटना लगभग सार्वभौमिक घातक है, और वैकल्पिक मरम्मत रुग्णता और मृत्यु दर की एक उच्च दर है। हमारे मॉडल का उद्देश्य विशेष रूप से डीटीएए का अध्ययन करना, डीटीएए के पैथोफिजियोलॉजी को स्पष्ट करना और विकास को रोकने या डीटीएए के आकार को कम करने के लिए आणविक लक्ष्यों की खोज करना है। वक्ष विकृति का ठीक अध्ययन करने के लिए एक murine मॉडल होने से, लक्षित चिकित्सा विशेष रूप से डीटीएए का परीक्षण करने के लिए विकसित किया जा सकता है। विधि शल्य जोखिम के बाद बाहरी murine महाधमनी दीवार पर सीधे porcin अग्नाशय elastase (PPE) की नियुक्ति पर आधारित है. यह एक विनाशकारी और भड़काऊ प्रतिक्रिया पैदा करता है, जो महाधमनी दीवार को कमजोर करता है और महीनों के लिए सप्ताह में anureysm गठन के लिए अनुमति देता है। हालांकि murine मॉडल सीमाओं के अधिकारी, हमारे dTAA मॉडल उम्मीद के मुताबिक आकार के मजबूत anureysms पैदा करता है. इसके अलावा, इस मॉडल को आनुवंशिक और दवा लक्ष्य है जो डीटीएए विकास को गिरफ्तार या टूटना रोकने के परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. मानव रोगियों में, इस तरह के हस्तक्षेप aneurysm टूटना से बचने में मदद कर सकता है, और मुश्किल शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप.
Introduction
इस विधि का उद्देश्य महाधमनी धमनी निर्माण के दौरान मूत्र अवरोही वक्ष महाधमनी में विकास, पैथोफिजियोलॉजी, और संरचनात्मक परिवर्तन का अध्ययन करना है। हमारे मॉडल चूहों में वक्ष महाधमनी aurysms (dTAA) प्रेरित करने के लिए एक reproduible और लगातार विधि प्रदान करता है जिससे विभिन्न आनुवंशिक और फार्माकोलॉजिक inhibitors के परीक्षण के लिए अनुमति देता है. यह काम दवाओं और जीन-चिकित्सा ओंठ की पहचान करने में मदद कर सकता है, जिनका अनुवाद डीटीएए बीमारी वाले मनुष्यों के लिए एक व्यवहार्य उपचार रणनीति में किया जा सकता है।
dTAAs फार्म जब वक्ष महाधमनी की दीवार कमजोर हो जाता है और समय के साथ फैला जब तक एक महत्वपूर्ण व्यास तक पहुँचने जब फाड़ या टूटना हो सकता है. चिकित्सकीय, dTAA मौन में प्रगति कर सकते हैं, आकार में वृद्धि जब तक महाधमनी दीवार की संरचना इतनी विकृत है कि यह अंततः विफल रहता है, भयावह परिणामों के साथ. चिंता की बात है, लक्षण आम तौर पर केवल जब anureysm एक खतरनाक आकार (100-150% फैलाव) तक पहुँच गया है और विच्छेदन या टूटना1,2के लिए उच्च जोखिम में है विकसित . डीटीएए टूटना लगभग सार्वभौमिक रूप से घातक3है , और वैकल्पिक शल्य चिकित्सा मरम्मत महत्वपूर्ण रुग्णता4,5वहन करती है . इसके अलावा, अधिकांश रोगियों को शल्य चिकित्सा मरम्मत से पहले लगभग 5 साल के लिए एक महाधमनी एन्युरिज्म का निदान ले6,7. इस खिड़की गैर शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप करने के लिए एक उपयुक्त समय का प्रतिनिधित्व करता है. इस प्रकार, चिकित्सा उपचार के इलाज या dTAA की धीमी प्रगति की जरूरत है और anureysm अनुसंधान के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण प्रगति का प्रतिनिधित्व करेंगे. वर्तमान में डीटीएए के लिए कोई चिकित्सा उपचार उपलब्ध नहीं है, ज्यादातर डीटीएए रोगजनन की अधूरी समझ के कारण।
पिछले 20 वर्षों में, कई dTAA पशु मॉडल विकसित किया गया है, लेकिन इन मॉडलों में से प्रत्येक हमारे अपने से अलग थे और मजबूत anureysms का उत्पादन नहीं किया. एक murine dTAA मॉडल हमारे लिए सबसे समान Ikonomidis एट अल द्वारा विकसित किया गया था8, जो caCl2 के प्रत्यक्ष आवेदन aorta के adventitia के लिए भी शामिल है. हालांकि हमारे मॉडल Ikonomidis द्वारा निर्धारित तकनीकों के कई से अनुकूलित किया गया था, हमारे मॉडल तीन अलग अलग तरीकों से अद्वितीय है. सबसे पहले, हमारे मॉडल में aorta 3-5 मिनट के लिए सामयिक elastase को उजागर किया है, CaCl2 जोखिम के 15 मिनट की तुलना में. दूसरा, महाधमनी फैलाव 2 सप्ताह में होता है, CaCl2 मॉडल में 16 सप्ताह की तुलना में. पिछले, हमारे मॉडल लगातार लगभग 100% फैलाव के anureysms का उत्पादन, CaCl द्वारा उत्पादित 20-30% के महाधमनी फैलाव की तुलना में2 आवेदन (जो वास्तव में aneurysms नहीं माना जा सकता के रूप में वे महाधमनी में वृद्धि के रूप में परिभाषित कर रहे हैं व्यास और 50%). एन्युरिज्म गठन के अन्य गैर सर्जिकल murine मॉडल हैं, जैसे एपो ई नॉकआउट माउस, जो एंजियोटेन्सिन द्वितीय के अर्क के साथ मजबूत anureysms फार्म. तथापि, इन चूहों का विकास सुप्रा-रेनल या आरोही वक्षीय महाधमनी धमनीसंम ों का विकास होता है, न कि विशेष रूप से अवरोही वक्ष महाधमनी9,10में एन्युरिज्म के स्थान पर .
इस प्रोटोकॉल के लिए तर्कसंगत के लिए एक सरल, सस्ती है, और समय के लिए एक murine मॉडल में dTAA अध्ययन उपयुक्त तरीका है. माउस मॉडल कई आनुवंशिक और सेल विशेष knockouts कि अन्य संवहनी रोगों में प्रभावशाली होना पाया गया है का उपयोग करने के लिए एक अनूठा अवसर प्रदान करता है. हमारे विशिष्ट टीएए मॉडल का उपयोग अच्छी तरह से प्राप्त हुआ है और इसका उपयोग करते हुए प्रयोग उच्च प्रभाव पत्रिकाओं11,12में प्रकाशित किए गए हैं . इस बिंदु के लिए, मॉडल संभव आनुवंशिक और pharmacologic उपचार है कि पेट महाधमनी aurysm (एएए) murine मॉडल में एक महत्वपूर्ण प्रभाव था की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है; हालांकि, के रूप में हमारी प्रयोगशाला dTAA मॉडल के उपयोग का विस्तार किया गया है, हम लक्ष्य डीटीएए गठन जो मनुष्यों में लक्षित चिकित्सा के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता करने के लिए अद्वितीय पा रहे हैं.
इस मॉडल प्रयोगशालाओं है कि murine माइक्रो सर्जिकल क्षमताओं के लिए सबसे उपयुक्त है. हालांकि यह तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है, यह लगातार भी कोई पूर्व शल्य चिकित्सा अनुभव के साथ शोधकर्ताओं द्वारा मार डाला जा सकता है. कोई murine शल्य चिकित्सा अनुभव के साथ एक शोधकर्ता के लिए मॉडल लगभग में महारत हासिल किया जा सकता है 20 ऑपरेटिव सत्र (या लगभग 50 चूहों). पूर्व शल्य चिकित्सा अनुभव के साथ शोधकर्ता के लिए, मॉडल में महारत हासिल किया जा सकता 5 ऑपरेटिव सत्र (लगभग 20 चूहों). हम एक उच्च गुणवत्ता वाले वीडियो के साथ विश्वास करते हैं, महारत के लिए समय आगे कम किया जा सकता है. प्रवीणता हासिल करने के बाद, प्रक्रिया सर्जरी के लिए 35 मिनट में पूरा किया जा सकता है, और टर्मिनल फसल के लिए 20 मिनट। हमारी प्रयोगशाला में सर्जन 5-10% की एक ऑपरेटिव मृत्यु दर के साथ, प्रति दिन 10-12 पूर्ण सर्जरी को पूरा कर सकते हैं। मृत्यु का सबसे आम कारण छाती में प्रवेश पर फेफड़ों की चोट है, संवेदनाहारी विषाक्तता, या विच्छेदन के दौरान महाधमनी के आंसू. डीटीएए अनुसंधान के अलावा, इस मॉडल को भी छाती में अन्य हस्तक्षेप का अध्ययन शोधकर्ताओं के लिए वक्ष आरोटा और फेफड़ों के हिलम के लिए सुरक्षित और आसान पहुँच के लिए एक गाइड के रूप में कार्य करता है।
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Protocol
पशु प्रोटोकॉल वर्जीनिया संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (सं. 3634) के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया.
1. संज्ञाहरण और intubation का प्रेरण
- एक 8-10 सप्ताह पुराने पुरुष C57BL/6 माउस एक बंद कक्ष में 5% isoflurane और 5 मिनट के लिए ऑक्सीजन मिश्रण के निरंतर प्रवाह के साथ प्लेस, जब तक श्वसन visibly धीमा कर रहे हैं.
नोट: विभिन्न उपभेदों, लिंग और चूहों की उम्र प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के आधार पर इस्तेमाल किया जा सकता है. मादा चूहों को छोटे आकार और इस तरह छोटे airway की वजह से intubate करने के लिए और अधिक कठिन हो सकता है. - वैनिवोर्ट एट अल 13 द्वारा वर्णितके रूप में माउस intubate .
नोट: intubation कदम दोनों जानने के लिए और प्रदर्शन करने के लिए इस मॉडल का सबसे कठिन भाग है। ऊपर संदर्भित लेखक ों को अपने वीडियो में कदम समझा एक उत्कृष्ट काम करते हैं.
2. शल्य चिकित्सा बोर्ड के लिए माउस को सुरक्षित
- एंडोट्रेकल (ईटी) ट्यूब कनेक्ट करें, छाती वृद्धि की पुष्टि करें, और सही पार्श्व decubitus स्थिति में माउस रखना। लगभग 3% करने के लिए isoflurane बारी और दोनों आंखों के लिए स्नेहन लागू होते हैं। वेंटीलेटर को प्रति मिनट लगभग 200 सांस और ज्वारीय मात्रा का 225 डिग्री सेल्सियस प्रदान करने के लिए सेट किया जाना चाहिए।
नोट: विषाक्तता तेजी से है अगर isoflurane 5% पर छोड़ दिया जाता है. हालांकि, आइसोफ्लुरेन की प्रतिक्रिया चर है इसलिए संवेदनाहारी प्रवाह दर को इस तरह टिके जाने चाहिए कि सहज डायाफ्रामिक संकुचन लगभग हर 10-20 एस होते हैं और श्लेष्म झिल्ली और उजागर ऊतक के निरीक्षण पर ऑक्सीजन पर्याप्त दिखाई देता है। - टेप के साथ बोर्ड के लिए एट ट्यूब सुरक्षित. सामने पंजा नाक के साथ लाइन में है और यह टेप के साथ सुरक्षित है तो सही हाथ rostrally का विस्तार।
- दाहिने हाथ और पूंछ के बीच तनाव की एक लाइन बनाने के लिए, रीढ़ की हड्डी के विस्तार का उत्पादन करने के लिए पूंछ caudally खींचो।
नोट: दोनों पूंछ और लाइन में सही पंजा सुरक्षित निवेश या एट ट्यूब के dislodgement पर रोकता है. - अपनी प्राकृतिक स्थिति में बाएं पैर टेप करें। बाएं हाथ को लुढ़का हुआ धुंध और टेप नीचे पर निकालें।
3. सर्जरी के लिए तैयारी
- माउस के बाएं पार्श्व को बाएं कंधे से बाएं पेट तक बिजली के क्लिपर के साथ दाढ़ी करें।
- शल्य चिकित्सा स्थल पर betadine समाधान ब्रश करने के लिए एक कपास टिप applicator का प्रयोग करें. शल्य साइट पर 70% इथेनॉल समाधान ब्रश करने के लिए एक नया कपास टिप applicator का प्रयोग करें। सूखने दें। एक बाँझ कपड़ा रखें.
- चेतावनी: सुनिश्चित करें कि सभी इथेनॉल पूरी तरह से आगे बढ़ने से पहले सूख गया है के रूप में electrocautery प्रयोग किया जाता है और इथेनॉल प्रज्वलित कर सकते हैं.
4. वक्ष में प्रवेश
- शल्य कैंची का उपयोग कर हेमीथोरैक्स के मध्य बिंदु पर एक 1 सेमी पार्श्व चीरा बनाओ। पसलियों दिखाई दे रहे हैं जब तक मांसपेशियों की परतों को विभाजित करने के लिए हाथ में electrocautery का प्रयोग करें।
- सीधे रिब के एक 2 मिमी भाग cauterize.
नोट: रिब पर इलेक्ट्रोकाउटरी का उपयोग करते समय, सहज श्वास आवृत्ति का पालन करें। यदि चूहे में क्यूटरी के दौरान डायाफ्रामिक संकुचन होता है, तो टिप छाती में प्रवेश कर सकता है और फेफड़ों को पंचर कर सकता है, जो आमतौर पर इस मॉडल में घातक होता है। - काटे हुए हिस्से से बेहतर रिब अंतरिक्ष में एक गीला, ठीक कपास-टिप ेड ऐप्लीकेटर का उपयोग करना, फुफ्फुस अंतरिक्ष में तोड़ने के लिए ऊतक पर टिप को घुमाएं। फेफड़ों के पतन में मदद करने के लिए छाती में 3 मिमी x 2 मिमी स्पंज गीला रखें।
नोट: केवल नरम, गीला, स्पंज फेफड़ों से संपर्क करें क्योंकि यह बेहद नाजुक है। - कैथराइज़्ड रिब के शीर्ष पहलू के साथ कटौती करने के लिए कैंची का उपयोग करें, जब तक डायाफ्राम दिखाई नहीं देता है।
5. महाधमनी जोखिम
- रिब retractors प्लेस और उन्हें thoracotomy चीरा खोलने के लिए उपयोग करें. ध्यान से फेफड़ों की सतह से स्पंज निकालें।
- जगह गीला 6 मिमी x 4 मिमी स्पंज इतना है कि यह फेफड़ों को कवर देता है, के साथ समाप्त होता है rostrally और caudally ओर इशारा करते हुए. स्पंज पर (व्यापक फ्लैट) फेफड़ों के आकुंचक रखें और धीरे से आकुंचक ventrally स्लाइड जब तक उतरते वक्ष aorta उजागर है.
- एक लगभग 5 मिमी अनुभाग के लिए aorta बंद संयोजी ऊतक और वसा विच्छेदन करने के लिए #7 संदंश का प्रयोग करें.
नोट: छोटी नसों aorta भर में अनुप्रस्थ चल सकता है; विच्छेदन के दौरान उन्हें फाड़ से बचने (कम से कम 14x आवर्धन का उपयोग कर इस जटिलता से बचने में मदद कर सकते हैं).
6. इलैस्टेस एक्सपोजर
- संतृप्त 0.5 मिमी x 1 मिमी स्पंज के साथ 12 $L porcin अग्नाशय elastase के और यह महाधमनी के उजागर सतह पर जगह है.
नोट: स्पंज contralateral फेफड़ों को छूने मत देना। - पूर्व निर्धारित समय (आमतौर पर 3-5 मिनट) के बाद, #7 संदंश के साथ elastase स्पंज को हटा दें। फेफड़ों के रिट्रैक्टर निकालें. छाती गुहा को 1 एमएल बाँझ नमकीन के साथ उत्तेजित करें।
नोट: नमकीन के साथ सिंचाई से पहले फेफड़ों के आकुंचक निकालें क्योंकि यह फेफड़ों के स्पंज को संतृप्त और नरम बनने की अनुमति देगा, जिससे फेफड़ों की सतह से निकालना आसान हो जाएगा। - शेष लवण सिंचाई को अवशोषित करने के लिए लुढ़का हुआ 2 " x 2" धुंध का उपयोग करें। बारी isoflurane 2% करने के लिए नीचे है.
7. छाती का बंद होना
- फेफड़ों के स्पंज निकालें. पुच्छ फेफड़ों के आकुंचक को निकालें। रोस्ट्रल फेफड़ों के रिट्रैक्टर को निकालें।
- पसलियों का विरोध करने के लिए 3 बाधित 6-0 गैर अवशोषित टांके, प्रत्येक में एक ढीली गाँठ टाई लेकिन नीचे टाई नहीं है। सीवन सुई के साथ फेफड़ों को स्पर्श नहीं करने के लिए महान ध्यान रखें।
- वेंटीलेटर पर बहिर्वाह ट्यूब को रोककर या 3 रास्ता बंद मुर्गा का उपयोग करके एट ट्यूब के माध्यम से हवा के 0.5-1.0 एमएल उड़ाने से फेफड़ों को फिर से भरना।
नोट: बारोट्रामा से बचने के लिए, हवा से भरे सिरिंज के अत्यधिक उपयोग से बचें, और 1.0 एमएल से अधिक हवा का उपयोग करें। - गैर अवशोषित टांके टाई. एक चल 5-0 अवशोषित multifilament सीवन के साथ मांसपेशियों परतों reapproximate. बारी isoflurane 1% करने के लिए नीचे है.
- 7-10 बाधित 5-0 गैर अवशोषित टांके के साथ बंद त्वचा. 0% करने के लिए isoflurane बारी.
8. वसूली
- buprenorphine subcutaneously के एक 0.3 mg/mL निलंबन के 6 $g (0.02 एमएल) प्रशासन। दाएँ पैर, पूंछ, और बाएं हाथ से टेप निकालें दाएँ हाथ टेप द्वारा पीछा किया.
- जब माउस extremities ले जाता है, यह अपनी पूंछ से खींच कर ET ट्यूब बंद स्लाइड करने के लिए extubate. सुपाच्य स्थिति में उच्च ऑक्सीजन सामग्री गर्म कक्ष में रखें।
नोट: यह पिंजरे में ऑक्सीजन चैम्बर से माउस को स्थानांतरित करने के लिए सुरक्षित है जब यह खुद को सामान्य खड़े स्थिति में बदल सकते हैं. इसके अलावा, चूहों दर्द के लक्षण के लिए निगरानी की जानी चाहिए, संकट, या विफलता सर्जरी के बाद पहले 24-48 घंटे के लिए अक्सर कामयाब और अतिरिक्त analgesia या नरम भोजन के रूप में संकेत दिया प्रदान की.
9. महाधमनी धमनी का एक्सपोजर (टर्मिनल फसल प्रक्रिया)
नोट: सामान्य तौर पर, ऊतक फसल 14 दिनों में किया जाता है, क्योंकि यह अधिक से अधिक फैलाव की अवधि का प्रतिनिधित्व करता है। हालांकि, प्रयोग के आधार पर, उपयोग के आधार पर, फसल प्रक्रिया समय 3 दिनों और 4+ सप्ताह के बीच किसी भी समय किया जा सकता है, प्रयोग के आधार पर।
- ऊपर वर्णित के रूप में ऑपरेटिव क्षेत्र के लिए Intubate और सुरक्षित माउस (अनुभाग 1-3). त्वचा को बाएं पार्श्व से केंद्रीय पेट तक छेदने के लिए कैंची का उपयोग करें ताकि पेरिटोनम में प्रवेश न किया जा सके।
- पृष्ठीय बाईं ओर से त्वचा को बाएं कंधे के स्तर तक उत्तेजित करें। फिर अक्षिका के माध्यम से स्टर्नम के लिए एक 90 डिग्री कोण पर छेद.
नोट: यह चीरा पूरी तरह से मूल त्वचा चीरा घेर लेना चाहिए. - कॉटरी का उपयोग करना, माउस के अधर पहलू की ओर त्वचा फ्लैप विच्छेदन, बाएं हेमीथोरैक्स को उजागर. पेट में प्रवेश करने के लिए कैंची का उपयोग करें और बाएं कॉसल मार्जिन के साथ अधर से पृष्ठीय तक झुकाव के साथ बाएं डायाफ्राम के नीचे को बेनकाब करने के लिए। डायाफ्राम के पार्श्व सबसे किनारे जो वांछित है खोल सकते हैं.
- यदि पूर्व चरण के साथ नहीं बनाया गया है, तो इसके सबसे पार्श्व किनारे पर डायाफ्राम को इंकाकरें। इस छेद में कॉटरी की टिप रखें और जाइफोइड प्रक्रिया के लिए कॉस्टल मार्जिन से डायाफ्राम को cauterize। एक नम ठीक टिप कपास-टिप applicator का उपयोग करना, धीरे छाती की दीवार के लिए आसंजन से फेफड़ों को मुक्त करने और फेफड़ों medialy धक्का.
नोट: यदि आसंजन आसानी से छाती की दीवार से नहीं आते हैं, तो उन्हें हटाने के लिए कॉटरी का उपयोग करें; ऐसा करने से फेफड़ों को फाड़ने से बचने में मदद मिलती है जो भारी रक्तस्राव का कारण बन सकता है। - छाती की दीवार के अंदर रिब एक से लागत मार्जिन, मध्य कक्षीय रेखा के लिए पृष्ठीय लेकिन कम से कम 2 मिमी से aorta के लिए cauterize. कॉटरीकृत लाइन के साथ छाती की दीवार काटें।
नोट: यह तकनीक इंटरकोस्टल धमनियों से रक्तस्राव से बचाती है। - रिब के बेहतर मार्जिन के साथ कट एक और फिर स्टर्नम के पार्श्व किनारे के साथ caudally, बाएं रिब पिंजरे को हटाने। फेफड़ों पर आकुंचक रखें और मीडिया को खींचें। डायाफ्राम पर आकुंचक रखें और संभव के रूप में ज्यादा aorta के रूप में बेनकाब करने के लिए caudally आकर्षित।
- महाधमनी धमनी और एक अप्रभावित दूरस्थ खंड से आसंजन को दूर करने के लिए एक सूखी कपास-टिप एप्लिकेटर का उपयोग करें। अप्रभावित नियंत्रण खंड के व्यास और elastase इलाज aneurysm के व्यापक भाग को मापने के वीडियो micrometry का उपयोग कर.
नोट: वीडियो micrometry माप समीकरण 1 के साथ एक नियंत्रण खंड की तुलना में aneurysmal खंड के प्रतिशत फैलाव की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है। एक नियंत्रण खंड है कि 0.5 मिमी aneurysmal खंड 1 के लिए distal है चुना गया है.
समीकरण 1
- Harms forceps के साथ Grasp aorta, बस इलाज खंड के लिए distal. कैंची का प्रयोग करने के लिए बल के लिए distal कटौती, तो रीढ़ की हड्डी स्तंभ से aorta विच्छेदन. इलाज खंड के लिए आसन्न aorta कट और aneurysmal aorta को दूर.
- एक ट्यूबरकुलिन सिरिंज और सुई का उपयोग करना, इच्छा के रूप में नमकीन और प्रक्रिया ऊतक के साथ महाधमनी लुमेन धोएं।
समीकरण 1Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
हमारे प्रोटोकॉल के आवेदन नमकीन नियंत्रण की तुलना में चूहों में मजबूत dTAA में परिणाम. विकसित किए गए TAAs आकार में fusiform होते हैं और केवल aorta के इलाज किए गए भाग में होते हैं (चित्र 1 और चित्र 2)11. चित्र 2 ऊतक फसल पर एक वीडियो micrometry माप का एक उदाहरण से पता चलता है. समीकरण 1 का उपयोग कर, महाधमनी फैलाव इस उदाहरण में 130% है।
जॉन्स्टन एट अल11 द्वारा मूल अध्ययन मॉडल का वर्णन जंगली प्रकार elastase इलाज चूहों में महाधमनी फैलाव में महत्वपूर्ण वृद्धि से पता चला (WT TAA) पर 3, 7, 14, और 21 दिन जंगली प्रकार चूहों में नियंत्रण की तुलना में (WT नियंत्रण). मैक्सिमल महाधमनी फैलाव दिन 14 में हुई (WT TAA: 99.6 ] 24.7% बनाम WT नियंत्रण: 14.4 ] 8.2%; p;lt; 0.0001) (चित्र 3)11. पोप एट अल12 द्वारा एक अलग प्रयोग 14 दिनों में इसी तरह के फैलाव से पता चलता है.
ऊतक विज्ञान की जांच करते समय, WT TAAs elastin फाइबर है कि पतला और खंडित कर रहे हैं. वहाँ भी कम चिकनी मांसपेशी सेल (SM$A) धुंधला है, जबकि मैक्रोफेज (Mac2) और interleukin-1 $ (आईएल-1 $) अभिव्यक्ति बढ़ रहे हैं (चित्र 4).
चित्र 1 : वक्ष महाधमनी aurysm (TAA) मॉडल और उपकरण सेटअपके नमूना तस्वीरें. बाएं से दाएं, (1) एक बाएं थोरेकोटोमी के माध्यम से थोरैसिक वारोटा का प्रारंभिक जोखिम, (2) फुफ्फुस का विच्छेदन, (3) एक इलैस्टेज से लथपथ स्पंज का अनुप्रयोग, और (4) स्पंज हटाने। महाधमनी फसल (5) के लिए, थोरैकोटोमी को फिर से खोला गया था, और थोरैसिक महाधमनी को मुक्त और मापा गया था। (6) सही करने के लिए चित्रण घेघा, फेफड़े, और हेमियाजीगो नस के साथ महारा के रिश्तेदार संघ को दर्शाता है। यह आंकड़ा जॉन्स्टन एट अल11से अनुकूलित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2 : TAA का नमूना वीडियो micrometry माप. C ] unexposed नियंत्रण खंड, A ] elastase इलाज aneurysmal खंड, आर एल - दाएँ फेफड़े, ई ] घेघा, टी ] पूंछ, एच ] सिर. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3 : TAA गठन के दौरान समय के साथ महाधमनी व्यास. WT चूहों में मतलब महाधमनी व्यास (मिमी जेड एसडी) elastase के संपर्क में (WT TAA, ग्रे) या समय के साथ नमकीन (WT नियंत्रण, हरे रंग) के संपर्कमें. तारक (p-lt; 0.05) के साथ चिह्नित सभी समय बिंदुओं पर WT TAA और WT नियंत्रण के बीच महत्वपूर्ण अंतर उत्पन्न हुआ। अधिकतम महाधमनी फैलाव 14 दिन में होता है (WT TAA: 99.6 ] 24.7% बनाम WT नियंत्रण: 14.4 - 8.2%; p;lt; 0.0001). त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं. यह आंकड़ा जॉन्स्टन एट अल11से अनुकूलित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4 : WT elastase TAA और WT लवण नियंत्रण ऊतक की हिस्टोलॉजिकल परीक्षा. 14 दिन पर डब्ल्यूटी नियंत्रण (सेलीन स्पंज) और डब्ल्यूटी टीएएएस (एलास्टेस स्पंज) के नमूना महाधमनी पार वर्गों। elastin के लिए दाग, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (SM [A), मैक्रोफेज (Mac2), और interleukin-1] (आईएल-1]. स्केल बार $ 50 डिग्री मी. यह आंकड़ा जॉन्स्टन एट अल11से अनुकूलित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 5 : व्यक्तिगत elastase बोतल की खुराक प्रतिक्रिया परीक्षा. बिंदुओं का प्रत्येक समूह एक पूर्व-निर्दिष्ट समय का प्रतिनिधित्व करता है जब इलैस्टेस से लथपथ स्पंज को रहने की अनुमति दी जाती है। इन आंकड़ों का उपयोग 100-130% फैलाव के लिए आदर्श पाचन समय का अनुमान लगाने के लिए किया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
वक्षीय और उदरीय वाता कोशिकीय और भ्रूणात्मक रूप से भिन्न होते हैं , जो एन्युरस्मल रोग14,15,16से संबंधित होते हैं . इसलिए, TAA का अध्ययन करने के लिए एक विशिष्ट पशु मॉडल की जरूरत है. हालांकि अन्य murine dTAA मॉडल प्रकाशित किया गया है8, हमारा केवल मॉडल अवरोही वक्ष महाधमनी फैलाव जो वास्तव में aneurysmal माना जा सकता है बनाने के लिए है (50% से अधिक फैलाव). इसके अलावा, हमारे मॉडल अपेक्षाकृत निष्पादित करने के लिए जल्दी है और CaCl2 मॉडल8में 16 सप्ताह के लिए विरोध के रूप में 14 दिनों में अधिक से अधिक फैलाव में परिणाम है. इस दक्षता ने विशिष्ट भेषजविज्ञान संबंधी हस्तक्षेपों के अध्ययन में मदद की है जो मानव परीक्षणों11,12में संभावित रूप से अनुवाद कर सकते हैं . हालांकि, इस प्रोटोकॉल कई चुनौतीपूर्ण पहलुओं और सीमाओं है.
हमारे मॉडल शुद्ध porcin अग्नाशय elastase, जो कई पिछले एएए मॉडल में इस्तेमाल किया गया है का इस्तेमाल करता है. कार्रवाई के तंत्र को माओटा के मीडिया में इलैस्टिन के टूटने और एक मजबूत भड़काऊ प्रतिक्रिया के निर्माण के लिए माना जाता है, जिससे कम अनुरूप और अंततः कमजोर दीवार होती है। इलैस्टेस का पाचन प्रभाव बोतल से बोतल तक भिन्न होता है। एक सुसंगत पाचन प्रभाव सुनिश्चित करने के लिए, एक खुराक प्रतिक्रिया वक्र elastase की प्रत्येक नई बोतल के लिए किया जाना चाहिए. खुराक उस समय से मेल खाती है जिसके दौरान इलैस्टेस से लथपथ धुंध को रहने की अनुमति है। ऐसे वक्र का एक उदाहरण चित्र 5में दर्शाया गया है। विशिष्ट elastase स्पंज जोखिम बार एक जोखिम अवधि है जो 14 दिनों में 100-130% फैलाव के aneurysms बनाता है खोजने के लक्ष्य के साथ जांच कर रहे हैं. इस उदाहरण वक्र में, एक 4 मिनट पाचन समय elastase की इस बोतल के लिए नामित किया गया है (ध्यान दें की, elastase की सबसे छोटी मात्रा उपलब्ध 10 एमएल में है, जो लगभग 830 व्यक्तिगत चूहों के लिए पर्याप्त है). अत्यधिक इलैस्टेज पाचन इंट्राऑपरेटिव रक्तस्राव या समय से पहले टूटना और अपर्याप्त जोखिम पर्याप्त पाचन और aneurysmal फैलाव पैदा करने के लिए असफल हो सकता है।
क्योंकि इस मॉडल में वक्ष गुहा को खोलना शामिल है, सकारात्मक दबाव वेंटिलेशन का उपयोग अनिवार्य है। शुरू में हम प्रत्यक्ष दृष्टि के तहत एक पूर्वकाल गर्दन विच्छेदन और orotracheal intubation का उपयोग किया, लेकिन इस विधि समय लेने के रूप में यह एक अतिरिक्त चीरा और बंद करने की आवश्यकता थी. अब हम एक प्रत्यक्ष orotracheal intubation का उपयोग के रूप में Vandivort एट अल13द्वारा विस्तृत . जब इस मॉडल पर नए सर्जन प्रशिक्षण, हम बड़े पैमाने पर यह वास्तविक सर्जरी पर जाने से पहले मास्टर करने के लिए intubation तकनीक का अभ्यास करने की सलाह देते हैं। एक बार माउस सफलतापूर्वक intubated है, महान देखभाल के लिए ट्यूब उखाड़ना नहीं लिया जाना चाहिए के रूप में edema प्रत्येक intubation प्रयास के साथ बढ़ जाती है, लगातार सफलता की संभावना कम और एक घातक airway चोट की संभावना बढ़ रही है. सर्जरी के दौरान एक्सटबेशन के जोखिम को कम करने के लिए भी महान देखभाल की जानी चाहिए क्योंकि पुनर्नत के लिए आवश्यक समय लगभग हमेशा घातक होता है। हमारे प्रोटोकॉल में विस्तृत के रूप में, तनाव की एक छोटी राशि के तहत सही हाथ और पूंछ हासिल करने से सर्जरी के दौरान रोस्ट्रल या कारण स्थानांतरण को रोकने और इसलिए extubation के जोखिम को कम करेगा.
संज्ञाहरण का नियंत्रण इस मॉडल में महत्वपूर्ण है. के रूप में Vandivort एट अल13 intubation पर अपने अध्ययन में चर्चा की, sedation के एक गहरे स्तर पर आवश्यक है. यदि माउस intubation प्रक्रिया के दौरान होश में है, एट ट्यूब प्रविष्टि के लिए प्रतिरोध श्वासनली चोट और esophageal intubation पैदा कर सकता है. isoflurane विषाक्तता के जोखिम को कम करने के लिए, एक बार एट ट्यूब के श्वासनली स्थान की पुष्टि की गई है, isoflurane के प्रतिशत मिश्रण लगभग आधा है कि प्रेरण के लिए इस्तेमाल किया द्वारा कम किया जाना चाहिए. isoflurane के आदर्श प्रतिशत को प्राप्त करने के लिए, माउस एक सहज डायाफ्रामिक संकुचन हर 10-20 सेकंड होना चाहिए. सर्जरी की प्रगति के रूप में, isoflurane उत्तरोत्तर कम किया जाना चाहिए और पूरी तरह से बंद कर दिया के बाद पिछले त्वचा बंद सिलाई रखा गया है. टेप संयम हटा दिया जाना चाहिए, जबकि माउस अभी भी हटाने के रूप में संज्ञाहरण से ठीक हो रहा है, जबकि माउस जाग रहा है दर्दनाक हो सकता है. अवशिष्ट isoflurane के वसूली और अपव्यय के साथ सहायता करने के लिए हम हाल ही में प्रक्रिया इस तरह है कि माउस एक उच्च ऑक्सीजन वार्मिंग वातावरण में तुरंत extubation के बाद बरामद किया जाता है संशोधित.
माउस फेफड़े बहुत नाजुक और पंचर से चोट है, अनुचित हैंडलिंग, या elastase जोखिम लगभग हमेशा मौत में परिणाम. फेफड़ों की चोट का सबसे आम बिंदु फुफ्फुस में प्रारंभिक प्रवेश है। पसलियों पर कॉटरी का उपयोग करते समय (चरण 4.2), हम सहज श्वास आवृत्ति पर करीब ध्यान देने की सलाह देते हैं और केवल एक सांस के तुरंत बाद कुछ सेकंड के लिए कॉटरी को सक्रिय करते हैं। यह रिबकेज के अप्रत्याशित विस्तार को रोकने में मदद करता है जो छाती की दीवार के माध्यम से और फेफड़ों में कॉटरी टिप ड्राइव कर सकता है। धीरे ऊतकों को तोड़ने के लिए अगले कदम में गीला कपास tipped applicator का उपयोग और फुफ्फुस झिल्ली भी फेफड़ों की चोट की हमारी दर को कम करने में मदद के बाद से तेज उपकरणों फेफड़ों की सतह को पूरा नहीं कर रहे हैं. अंत में, अगर elastase-लथपथ स्पंज संपर्क या तो सीधे फेफड़ों, गंभीर नुकसान हो सकता है. यह महाधमनी विच्छेदन के दौरान contralateral फुफ्फुस अंतरिक्ष में प्रवेश नहीं करके और स्पंज तैयार इतना है कि यह थोड़ा repositioning के साथ महाधमनी पर सीधे रखा जा सकता है द्वारा बचा जा सकता है. सर्जरी के अंत में, बाएं फेफड़े को फिर से फुलाने का प्रयास वेंटीलेटर के बहिर्वाह ट्यूब को बंद करके किया जाना चाहिए। यदि यह असफल है, तो 3-तरफा स्टॉपकॉक के माध्यम से 0.5 से 1.0 एमएल हवा का प्रत्यक्ष इंजेक्शन फेफड़ों को फिर से विस्तृत कर सकता है। यदि उन तरीकों के दोनों काम नहीं करते हैं, बंद सामान्य रूप में आगे बढ़ना चाहिए. हमने पाया है कि अगर कोई प्रमुख फेफड़ों की चोट मौजूद है, चूहों एक आंशिक रूप से फुलाया फेफड़ों अपेक्षाकृत अच्छी तरह से सहन और फेफड़ों लगभग हमेशा ऊतक फसल पर फुलाया है.
इस मॉडल की कई सीमाएँ हैं. प्रायोगिक मॉडल पूरी तरह से मानव महाधमनी रोग मॉडल नहीं है. dTAA हमारे मॉडल में elastase के एक आवेदन के बाद 14 दिनों में होता है, जबकि मानव TAA गठन multifactoral है और नहीं तो दशकों से होता है. हालांकि, एक माउस मॉडल है कि महीने के लिए साल लेता है aneurysms विकसित करने के लिए एक खोजी क्षमता में उपयोगी नहीं है. मानव रोग के विपरीत, elastase प्रेरित aneurysms हमारे मॉडल में आकार में कमी करने के लिए जब वे दो सप्ताह के बाद ऑपरेटिव पर अधिक से अधिक फैलाव तक पहुँचने के लिए शुरू करते हैं. इस प्रतिगमन को माउस के आहार में पश्चात पूरक $-एमिनोप्रोपिओनिट्रिल (BAPN) के उपयोग के साथ दूर किया जा सकता है। जब elastase जोखिम मॉडल के साथ संयुक्त, BAPN पूरकता निरंतर विकास और अंततः टूटना की अनुमति देता है, बेहतर मानव रोग की पुरानीता नकल. हमारी प्रयोगशाला पहले एएए17 में BAPN का अध्ययन किया है और हम वर्तमान में यह डीटीएए मॉडल में उपयोग कर रहे हैं आगे हमारे प्रोटोकॉल को परिष्कृत. डीटीएए मॉडल के साथ प्राथमिक प्रयोगों ने 28 दिनों में लगभग 30% की टूटना दरों का प्रदर्शन किया है।
भविष्य में, हम इस मॉडल का उपयोग करने के लिए अन्य आनुवंशिक और औषधीय उपचार है कि मनुष्यों में anureysm उपचार के लिए अनुवाद किया जा सकता है का मूल्यांकन करने की योजना है. क्योंकि इस प्रोटोकॉल वक्ष aorta का उपयोग करने के लिए एक आसान और सुरक्षित तरीका का वर्णन करता है, यह अन्य प्रयोगशालाओं कि वक्ष aorta पर हस्तक्षेप का परीक्षण करना चाहते द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता है.
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Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
यह काम AHA वैज्ञानिक विकास अनुदान 14SDG18730000 (M.S.), NIH K08 HL098560 (G.A.) और RO1 HL081629 (G.R.U.) अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। इस परियोजना के अनुसंधान और शिक्षा के लिए थोरैसिक सर्जरी फाउंडेशन (TSFRE) अनुसंधान अनुदान (पीआई: जी Ailawadi) द्वारा समर्थित किया गया था. सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी NHLBI या TSFRE के विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है. हम अपने ज्ञान और तकनीकी विशेषज्ञता के लिए एंथनी हेरिंग और सिंडी Dodson धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Angiocatheter (22G) | Used for ET Tube | ||
| Dumont Tweezers; Pattern #7 x2 | Roboz | RS-4982 | |
| Graefe Tissue Forceps | Roboz | RS-5158 | |
| Harms Forceps x2 | Roboz | RS-5097 | |
| Intracardiac Needle Holder; Extra Delicate; Carbide Jaws; 7" Length | Roboz | RS-7800 | |
| KL 1500 LED Light Source | Leica | 150-400 | |
| M205A Dissction Microscope | Leica | CH 94-35 | |
| Iris Scissors, 11cm, Tungsten Carbide | World Precision Instruments | 500216-G | |
| Metal Clip board | Use with the Mouse Retractor Set | ||
| Mouse Retractor Set | Kent | SURGI-5001 | Need 2 short and 1 tall fixators |
| Mouse Ventilator MiniVent Type 845, 115 V, Power Supply with US Connector | Harvard Apparatus | 73-0043 | MiniVent Ventilator for Mice (Model 845), Single Animal, Volume Controlled |
| Sigma Aldrich | Elastase from porcine pancreas | E0258-50MG | Can be purchased in various size bottles |
| Small Vessel Cauterizer Kit | Fine Science Tools | 18000-00 | Recommend using rechargable AA batteries |
| Spring Scissors, 10.5cm | World Precision Instruments | 14127 | |
| Steril Swabs (Sponges) | Sugi | 31603 | Can be cut to size |
| Surgi Suite Surgical Platform | Kent | Attach to clip board | |
| Tech IV Isoflurane Vap | Jorgensen Laboratories | J0561A | Anesthesia vaporizer |
References
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