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Biochemistry

Caracterização de agregados proteicos individuais por Nanoespectroscopia infravermelha e microscopia de força atômica

Published: September 12, 2019 doi: 10.3791/60108
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1,3
1Centre for Misfolding Diseases, Department of Chemistry, University of Cambridge, 2Institute of Biotechnology, Life Sciences Center, Vilnius University, 3Cavendish Laboratory, Department of Physics, University of Cambridge

Summary

Nós descrevemos a aplicação da nanoespectroscopia infravermelha e da microscopia de alta resolução da força atômica para visualizar o processo do self-assembly da proteína em agregados oligoméricas e em fibrilas do amilóide, que é associada pròxima com o início e o desenvolvimento de uma ampla gama de distúrbios neurodegenerativos humanos.

Abstract

O fenômeno de desdobramento de proteínas e agregação resulta na formação de agregados proteicos altamente heterogêneos, que estão associados a condições neurodegenerativas, como as doenças de Alzheimer e Parkinson. Em particular os agregados de baixo peso molecular, oligomers do amilóide, foram mostrados para possuir Propriedades citotóxica genéricas e são implicados como neurotoxinas em muitas formas de demência. Nós ilustramos o uso de métodos baseados na microscopia de força atômica (AFM) para abordar a tarefa desafiadora de caracterizar as propriedades morfológicas, estruturais e químicas desses agregados, que são difíceis de estudar usando estruturas estruturais convencionais métodos ou métodos biofísicos em massa devido à sua heterogeneidade e natureza transitória. Abordagens de microscopia de sonda de varredura agora são capazes de investigar a morfologia de agregados amilóides com resolução de subnanômetro. Mostramos aqui que a nanoespectroscopia de infravermelho (IR) (AFM-IR), que explora simultaneamente a alta resolução do AFM e o poder de reconhecimento químico da espectroscopia IR, pode ir mais longe e possibilitar a caracterização das propriedades estruturais de indivíduos agregados proteicos e, assim, oferecem insights sobre os mecanismos de agregação. Desde que a aproximação que nós descrevemos pode ser aplicada também às investigações das interações de conjuntos da proteína com moléculas e anticorpos pequenos, pode entregar a informação fundamental para desenvolver compostos terapêuticos novos para diagnosticar ou tratar distúrbios neurodegenerativos.

Introduction

Mais de 40 milhões pessoas em todo o mundo são atualmente afetadas por distúrbios neurodegenerativos, como a doença de Alzheimer (AD)1 e Parkinson (PD)2 doenças. Mais geralmente, mais de 50 patologias estão associadas a nível molecular com desdobramento de proteínas e agregação, um processo que leva à proliferação de agregados protéicos insolúveis fibrilantes, conhecidos como depósitos amilóides3, 4. as origens moleculares da neurodegeneração e suas ligações com as mudanças conformacional da proteína das proteínas que conduzem à formação do amilóide, entretanto, permanecem obscuras, na grande parte por causa do nível elevado de heterogeneidade, de natureza transiente e de nanoescala dimensões dos agregados patológicos4,5.

Investigações altamente bem-sucedidas de estruturas proteicas nas últimas décadas têm sido amplamente baseadas no uso de métodos a granel, incluindo cristalografia de raios-X, microscopia crioeletrônica e espectroscopia de ressonância magnética nuclear5, 6 anos de , 7 anos de , 8 . º , 9. dentro desta classe de técnicas, a espectroscopia infravermelha (ir) surgiu como uma ferramenta analítica sensível para desvendar as propriedades químicas dos sistemas biológicos, como as proteínas8. Os métodos do ir permitem a quantificação de mudanças estruturais secundárias e Quaternário da proteína durante seu proteínas e agregação. Além disso, a fim de decifrar mais a nível microscópico os detalhes mecanísticos envolvidos nas complexas paisagens energéticas livres de proteínas durante a sua agregação, um avanço importante tem sido o desenvolvimento de ferramentas de cinética química para estender a complexa caminhos de automontagem, incluindo formação de fibrilas amilóides5,6,7,10,11,12. No entanto, os métodos espectroscópicos em massa fornecem apenas informações médias sobre o conjunto heterogêneo de espécies presentes em solução ou envolvidas em etapas microscópicas específicas, tornando assim a investigação das propriedades biofísicas de indivíduos espécies agregadas desafiadoras no nível de nanoescala13,14.

Várias técnicas de microscopia com a capacidade de operar em escalas menores do que o limite de difração de luz emergiram nas últimas décadas. Esta classe de métodos inclui microscopia eletrônica (EM) e microscopia de força atômica (AFM). Enquanto a microscopia eletrônica de varredura (MEV) e a microscopia eletrônica de transmissão (TEM) fornecem imagens bidimensionais (2D) de um espécime, AFM emergiu nas últimas décadas como uma técnica poderosa e versátil para estudar morfologias tridimensionais (3D), como bem como as propriedades Nanomecânica de uma amostra com resolução sub-nanômetro13,14,15,16,17,18,19, 20 anos de , 21 anos de , 22 anos de , 23 anos de , 24 de cada , 25 anos de , 26 anos de , 27. a fundamentação subjacente ao estudo da agregação proteica via AFM é que essa abordagem possibilita a investigação da morfologia de espécies individuais presentes na solução13,14,16, 17,19,20,21,25,27,28,29,30, 31,32,33,34,35,36,37. Em particular, ao monitorar a amostra em função do tempo, o AFM possibilita a investigação da evolução da morfologia das espécies dentro da amostra, o que possibilita acompanhar e visualizar as vias de formação de amiloides23, 25,38,39,40,41,42. Além disso, a AFM possibilita a quantificação de parâmetros estruturais como alturas transversais e comprimentos das espécies individuais presentes na solução13,19,30,31 ,32,33,34,35,36, 37,40,43, 44 , 45 , 46 , 47 , 48. no entanto, o estudo de uma única propriedade biofísica, como a morfologia, muitas vezes não é suficiente quando se estuda sistemas biológicos heterogêneos e complexos. Os métodos de imagem AFM, SEM ou TEM sozinhos não revelam prontamente as propriedades químicas de espécies heterogêneas de agregados amilóides na nanoescala.

Um avanço importante para a análise de amostras biológicas heterogêneas nesta escala foi feito recentemente com o desenvolvimento e a aplicação ao campo da agregação da proteína da nanoespectroscopia infravermelha (AFM-ir)24,26, 38,42,49,50,51,52. Este método inovativo explora a combinação da definição espacial de AFM (~ 1 − 10 nanômetro) com o poder da análise química do IR. A técnica AFM-IR é baseada na mensuração do efeito de ressonância induzida fototermal conduzido por um laser de infravermelho, e na mensuração da expansão térmica da amostra investigação pela ponta AFM. A amostra pode ser iluminada pelo laser do ir diretamente da parte superior ou da parte inferior na reflexão interna total, similarmente como na espectroscopia infravermelha convencional24,42,52,53 . O laser do IR pode ser pulsado com freqüências típicas na ordem de centenas de kilohertz (1 − 1000 quilohertz) e ajustado sobre uma escala espectral larga, tipicamente entre 1000 − 3300 cm-1. Embora a fonte de laser cubra uma área de ~ 30 μm de diâmetro, a resolução espacial da técnica AFM-IR é determinada nominalmente pelo diâmetro da ponta AFM, que detecta a expansão térmica local do sistema. AFM-ir é poço-serido para estudar amostras biológicas porque o sinal do ir é proporcional a sua espessura até 1 − 1.5 μm, e os espectros resultantes do ir são geralmente de acordo com os espectros correspondentes da transmissão de FTIR13,54 ,55. Por esta razão, métodos de análise estabelecidos na espectroscopia podem ser prontamente aplicados, como o estudo de turnos químicos, mudança de forma de banda e de-convolução pela segunda análise de derivativos52. Globalmente, combinando a resolução espacial do AFM com o poder de reconhecimento químico da espectroscopia IR, AFM-IR permite a aquisição simultânea de uma ampla gama de propriedades morfológicas, mecânicas e químicas de uma amostra na nanoescala.

Aqui, ilustramos um protocolo para a caracterização do processo de agregação proteica que explora a combinação de ensaios de fluorescência in vitro, imagem AFM de alta resolução e AFM-IR de nanoescala. Esta abordagem combinada já se destacou no fornecimento de resultados detalhados no estudo das propriedades químicas e estruturais de microgotas individuais formadas por agregados proteicos, em estudos de separação de fase proteica líquido-líquido, e em investigando a heterogeneidade e as propriedades biofísicas de espécies agregadas individuais na nanoescala23,26,38,45,50,53, 56,57.

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Protocol

1. ensaios de agregação em leitores de placas de fluorescência

Nota: o protocolo aqui descrito é um exemplo de como estudar a agregação de qualquer proteína ou peptídeo por cinética química. Em particular, descreve um protocolo otimizado para estudar a agregação do peptídeo aβ 42, que está envolvido no início e progressão da doença de Alzheimer58,59. Um protocolo semelhante pode ser ajustado e adotado para estudar a agregação de qualquer proteína ou peptídeo.

  1. Obter uma solução monomérica altamente pura de aβ 42 por meio de técnicas de cromatografia de troca iónica e de exclusão de tamanho para distinguir as frações proteicas contendo aβ 42, e isolar a fração monomérica de outras formas agregadas de aβ 42 obtidas58 , 59.
  2. Diluir o peptídeo aβ 42 em tampão fosfato de sódio a 20 mM, 200 μM EDTA a pH 8,058 a uma concentração final desejada variando entre 1 − 5 μm, em tubos de ligação baixa de 1,5 ml. As amostras coletadas para medições de AFM não devem conter o corante fluorescente utilizado no ensaio de agregação (tioflavina T, ThT), pois pode introduzir artefactos durante a deposição da amostra para análise de AFM. Assim, prepare triplica de duas soluções idênticas: i) o primeiro que contem o aβ monoméricas 42 para seguir o processo de agregação por AFM; II) o segundo contendo o aβ 42 monomérico com adição de 20 μM ThT como traçador para monitorar a cinética de agregação.
    Nota: é importante executar as etapas 1,1 e 1,2 no gelo. Este procedimento é assegurar-se de que a solução monoméricas aβ 42 não agregue até que iniciada no leitor da placa. Ao manusear amostras, a pipetagem cuidadosa é essencial para evitar a introdução de quaisquer bolhas de ar que possam afectar a amostra de proteínas.
  3. Pipete 80 μL de cada amostra em cada poço de um 96-bem, placa de meia área de poliestireno preto com fundo claro e superfícies não vinculantes.
  4. Sele a placa com uma folha para minimizar a evaporação da amostra no decorrer da agregação.
  5. Equilibrar a temperatura do leitor de chapa a 37 ° c.
  6. Configure o protocolo de agregação para ler medições de fluorescência em intervalos fixos de ponto de tempo, em um comprimento de onda de excitação de 440 nm e um comprimento de onda de emissão de 480 nm. A agregação deve ser iniciada em condições quiescentes.
  7. Insira a chapa no leitor de chapa.
    Nota: é importante ter cuidado ao manusear a placa, para garantir que a agregação não é acionada antes de iniciar o leitor de chapa. Use as configurações de ajuste de ganho para garantir a leitura ideal da fluorescência de cada amostra.
  8. Iniciar a medição.
    Nota: o experimento de agregação é concluído quando a curva sigmoidal de fluorescência ThT atinge um patamar58.

2. preparação da amostra para medições AFM e nano-IR

  1. Cola mais alta qualidade grau v1 mica disco de alta qualidade magnética de aço inoxidável-disco usando abas adesivas ou fita dupla face.
  2. Etch mica colocando um pedaço de fita adesiva sobre a superfície mica e puxando a camada superior da mica. Este procedimento produzirá a superfície limpa, atomicamente Lisa, apropriada para o depósito da amostra.
    Nota: a superfície gravada deve ser uniforme e suave.
    Cuidado: não toque nem respire diretamente acima da mica recém-gravada, pois isso introduzirá artefatos.
  3. PAUSE/STOP a medição do leitor de chapa para recolher o ponto de tempo de interesse durante o processo de agregação da proteína.
  4. Retire a folha de vedação e colete 10 μL de alíquota das amostras sem ThT do poço em um 1,5 mL tubos de ligação baixa.
  5. Deposite os 10 μL da amostra na mica recém-gravada. Para as medições de AFM-IR, as amostras devem ser depositadas na carcaça de ouro recém-despojada.
  6. Incubar a solução na mica por 1 min para permitir a fisisorbtion.
    Nota: o tempo de incubação mais longo permitiria uma melhor absorção na superfície, mas pode induzir a autoorganização e a automontagem artificiais25. Para evitar esses efeitos, a deposição de spray pode ser explorada25.
  7. Enxague três vezes com 1 mL de água ultrapura.
  8. Seque um fluxo delicado do nitrogênio para medir a amostra no ambiente do ar.

3. imagem latente de AFM da morfologia de agregados da proteína

Nota: as medições morfológicas podem ser realizadas tanto em contato quanto em modo dinâmico, nas etapas a seguir, a última é descrita, uma vez que reduz as forças laterais para medir a morfologia 3D da amostra com alta resolução. AFM-IR medições serão executadas em modo de contato para melhorar AFM-IR sinal-ruído relação.

  1. Gire sobre o sistema de AFM pelo menos 30 minutos antes das medidas a fim permitir que o sistema alcance a estabilidade térmica. Clique em Setupe, em seguida, em Probe. Na janela de alteração da sonda , clique em Avançar para preparar Z, estágio de foco.
  2. Desligue o comutador de feixe AFM (se estiver ligado). Destrave os fechamentos da ensamblagem, desconecte a cabeça do sistema e na janela da mudança da ponta de prova estale sobre em seguida.
  3. Monte o cantilever AFM no suporte da sonda. Conecte a cabeça ao sistema e trave os fechamentos da ensamblagem.
    Nota: as cantimanhas óptimas para estudar amostras biológicas no modo dinâmico AFM têm a mola constante que varia entre 2 − 40 N m-1 e um raios do vértice que varia entre 2 − 8 nanômetro14.
  4. Gire sobre o interruptor do feixe de laser de AFM e na janela da mudança da ponta de prova estale sobre em seguida.
  5. Na janela pop-up, clique em não se o tipo cantilever não mudou. Ajuste os botões de alinhamento óptico para encontrar o cantilever. Ajuste o foco para o cantilever e clique em Next.
  6. Na janela pop-up, clique em Sim se o foco estiver no cantilever.
  7. Posicione o feixe de laser na extremidade do cantilever usando os botões que controlam a posição do laser da deteção. Maximize o sinal total medido pelo fotodiodo de quatro quadrantes a pelo menos > 1 V usando os botões controlando a posição do feixe de laser desviado no fotodiodo sensível à posição (PSPD). Na janela de alteração da sonda , clique em Avançar e depois em Fechar.
  8. Aguarde 15 minutos para que o cantilever atinja a estabilidade térmica. Reajustar a posição do feixe de laser desviado no PSPD, se necessário.
  9. Clique em NCM Sweep, escolha a amplitude desejada de oscilação, clique em fase de uso, clique em auto e sintonize o cantilever perto do máximo de sua primeira ressonância livre de oscilação, que é de aproximadamente 300 kHz para um cantilever com uma constante de mola de 40 N m-1.
    Nota: ajustando o cantilever fora do máximo de sua ressonância livre assegura uma estabilidade mais elevada das medidas14.
  10. Coloque a amostra no suporte da amostra. Escolha parâmetros de imagem adequados. A taxa de digitalização típica é de 0,3 − 1,0 Hz para uma área de digitalização de 1 x 1 μm2 a 5 x 5 μm2. A resolução típica necessária é entre 256 x 256 e 1024 x 1024 pixels. Clique na área de digitalização para escolher o tamanho da digitalização e o número do pixel.
  11. Concentre a visão óptica na amostra. Clique na abordagem para abordar a superfície da amostra. Uma vez que a aproximação é terminada estale sobre o μm do elevador 100 para levantar a ponta de afm 100 μm acima da superfície da amostra. Clique em expandir na imagem óptica da amostra. Clique na barra de estágio de foco para focar a vista na superfície da amostra.
  12. Use as setas para mover-se na região da amostra de interesse. Envolva a superfície pressionando o botão Approach . Clique no botão Scan de linha e verifique se a ponta está seguindo a superfície bem, se necessário, ajuste o Set Point.
  13. Inicie a imagem da superfície da amostra pressionando o botão Scan . Durante a imagem, para evitar a grande força de imagem e manter a consistência de dentro de amostras independentes, manter um regime constante de mudança de fase não superior a Δ20 °42.
  14. Digite o nome do arquivo e escolha o diretório base onde a imagem adquirida será salva.

4. medições de nanoespectroscopia de infravermelho de agregados proteicos

  1. Gire sobre o sistema AFM-IR e o laser infravermelho (IR)60 30 − 60 minutos antes das medidas para a estabilização térmica. Lasers típicos para instrumentos AFM-IR são osciladores de parâmetros ópticos (OPO) e lasers de cascata quântica (QCL).
  2. Abra o software incorporado para controlar o instrumento. Clique em arquivo e, em seguida, em novo para abrir um novo arquivo nanoir . Prima o botão inicializar para iniciar o sistema AFM-ir.
  3. Abra a tampa do instrumento e monte no sistema AFM-IR uma sonda revestida de ouro de silício com um raio nominal de 30 nm e uma constante de mola de 0,2 N/m para medir a amostra em modo de contato.
  4. Estale sobre a carga na ponta de prova de AFM da seção e então em seguida. Em foco na seção de sonda, clique nas setas para focar a câmera no cantilever. Na seção exemplo de movimento XY, use as setas para colocar o Cross-Air no final do cantilever.
  5. Gire os botões controlando a posição do laser de detecção para posicionar o laser no final do cantilever. Gire os botões laser para detectar e maximizar a soma medida pelo fotodiodo de quatro quadrantes a um valor ≫ 3 V. Gire o botão de deflexão para ajustar a deflexão do cantilever para-1 v e clique em Avançar. Feche a tampa do instrumento.
  6. Na seção foco na amostra use as setas para focar a câmera na amostra. Em seguida, na seção exemplo de movimento XY use as setas para mover na região de interesse da amostra e clique em abordagem e engajar.
  7. Na janela do microscópio , selecione como entradas os canais de interesse para mapear as propriedades biofísicas da amostra. Em particular, escolha a altura para a morfologia, a amplitude 2 para a absorção do ir e a freqüência de PLL para mapear a ressonância do contato da ponta-amostra.
  8. Na seção da varredura AFM da janela dos controles , use parâmetros similares como na seção 3 (isto é, taxa de varredura 0.1 − 1.0 hertz, entre 256 x 256 e 1024 x 1024 pixéis). Escolha como valor dos ganhos de acordo com a aspereza da amostra: integral I = 1 − 10 e proporcional P = 10 − 30. Em seguida, clique em Scan para adquirir um mapa de morfologia.
    Nota: a morfologia pode ser medida similarmente no modo de batida dinâmico, mas as medidas AFM-IR são executadas aqui no modo de contato para ter umas relações mais elevadas do sinal às ruído.
  9. Depois que o mapeamento da morfologia é terminado, na janela do microscópio , estale sobre o mapa da altura para posicionar a ponta de prova na parte superior de um agregado. Em seguida, na seção Nanoir da janela controles , clique em Iniciar ir para iluminar a amostra com o laser ir.
  10. Para focar o laser infravermelho no cantilever, clique em otimização. Nesta janela, escreva um wavenumber onde a amostra vai ter alta absorvância e clique em Adicionar. Para a proteína, um valor típico é 1655 cm-1. Clique em Scan para encontrar a posição do laser ir e clique em Atualizar para alinhar a sua posição com o cantilever. Feche a janela.
  11. Na seção geral da configuração de nanoir , escreva um wavenumber onde a absorvência elevada no campo relativo é esperada. Em seguida, desative a opção filtro de passe de banda e veja a leitura do medidor e a transformada rápida de Fourier (FFT) da resposta do cantilever. Na janela FFT mova o cursor verde para ler a frequência de ressonância do cantilever. Um valor típico do FFT da ressonância dos cantialavancas é em torno de 300 kHz. Escreva esse valor de frequência de ressonância na seção geral no campo freq. Centre e use uma janela freq. de 50 kHz.
    Nota: selecione um poder do laser que seja baixo bastante para não saturar a leitura do medidor e para ter a distorção na resposta do cantilever e para não superaquecer a amostra.
  12. Clique na janela de ajuste de pulso laser para usar o modo de ressonância reforçada. Escolha um centro de frequência de 300 kHz, uma faixa de sintonia de 50 kHz e um ciclo de trabalho do laser de 5%. Clique em adquirir para varrer a taxa de pulso do laser. Usando o cursor no gráfico, sintonize o pulso do laser à freqüência da resposta mecânica da expansão térmica da amostra que absorve a luz do IR. Em seguida, selecione a opção PLL para monitorar a ressonância de contato entre a amostra e a ponta. Pressione o botão zero na janela PLL e marque Enable para rastrear a ressonância de contato de ponta de amostra. Escolha um ganho integral I = 0,5 e ganho proporcional P = 10. Feche a janela.
  13. Abrir novamente a janela de optimização e encontrar a posição do laser ir para pelo menos 3 onda correspondente a grandes bandas de absorvância da amostra (Amida banda I-II-III) e para pelo menos um wavenumber para cada chip do laser.
  14. Clique em ferramentas | Calibração do fundo do ir | Novo. Na janela Selecione a região espectroscópica de interesse (1800 − 1200 cm-1 para estudar as amostras de proteínas); escolha a mesma taxa de pulso determinada na etapa 4,12 e um ciclo de dever de 5%; Estale sobre a aquisição rápida e selecione a velocidade do laser, escala típica para um laser da cascata do Quantum está entre 20 − 500 cm-1. Clique em adquirir para medir o fundo do laser ir. Este espectro do fundo será usado para a normalização de espectros localizados nanoescala medidos. Feche a janela.
    Nota: se um modo avançado de laser e ressonância avançada não estiver disponível, pule a etapa 4,12 e selecione espectros escalonados em vez de rápido em janelas de aquisição de espectros de fundo e ir. No entanto, a sensibilidade agregada única não será alcançada.
  15. Nos ajustes dos espectros do ir , escolha uma definição do espectro do ir entre 1 − 4 cm-1 e um número de co-médias pelo menos de 64x. Estale sobre adquire para medir um espectro localizado nanoescala do ir na escala da proteína (1800 − 1200 cm-1).
  16. Para adquirir um mapa químico resolvido nanoescala, selecione a opção de imagem latente do ir , escolha um wavenumber do interesse (por exemplo, 1655 cm-1 para a faixa I do Amide) e estale sobre a varredura na janela da varredura AFM .
  17. Uma vez que o mapeamento é terminado, vá ao arquivo e excepto as medidas. Para analisar os mapas adquiridos de morfologia, contato-ressonância e química, bem como os espectros localizados em escala nanométrica, use o software de processamento de imagens AFM incorporado. Espectros e imagens podem ser salvos como arquivos. csv ou. axz para uma análise mais detalhada com software comercial.

5. processamento de imagens e análise de dimensões transversais

  1. Flatten RAW images14,17,19,41,42,59 usando built-in software de processamento de imagem AFM ou software comercial.
    Nota: os agregados devem ser mascarados do cálculo para evitar artefactos de análise e subestimação da sua altura medida.
  2. Aplainar a imagem por 0 subtracção de ajuste de plano de ordem.
  3. Aplainar a imagem por plano e, em seguida, linha por linha em uma ordem de regressão de 1St , a segunda etapa é repetida até que a linha de base plana no perfil da imagem seja atingida.
  4. Se a amostra é muito lotado, contém agregados excepcionalmente altos ou artefacto arco scanner está presente, aplainar imagem usando 2ND ajuste de ordem de regressão.
  5. Meça a altura e a largura agregadas de um perfil de linha tomado perpendicularmente ao eixo fibrila14,17,19,41,42,59.
  6. Medida fibrila comprimento paralelo ao eixo fibrila14,17,19,41,42,59.

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Representative Results

Um curso de tempo representativo da agregação aβ 42, medido pelo ensaio de fluorescência ThT, é mostrado na Figura 1. O processo de agregação é comumente caracterizado por uma curva sigmoidal, onde uma fase de retardo é inicialmente observada, e é seguida por uma fase de crescimento íngreme, antes que a curva atinja um planalto quando um estado estacionário de equilíbrio é atingido6,7 , 58. é essencial garantir que um protocolo de agregação otimizado seja usado para gerar dados de alta qualidade para estudar os detalhes moleculares pertencentes aos processos de agregação58.

A alta resolução do AFM permite investigar a morfologia e a heterogeneidade das espécies agregadas em diferentes pontos temporais do processo. Durante a agregação, monitorada pelo ensaio ThT, alíquotas da amostra nas placas são preparadas para investigação agregada única por AFM e nano-IR (Figura 1). O fluxo de processo típico da preparação manual da amostra é mostrado na Figura 2. Na conclusão da medição da morfologia 3D da amostra por AFM de alta resolução e controlada por fases, os mapas são achatado para remover a não-linearidade do scanner piezoelétrico e reduzir as fontes de erro na análise pós-processamento da amostra morfologia (Figura 3). Subseqüentemente, uma análise estatística exata e sensível da molécula única pode ser executada, como mostrado na Figura 4. A partir de um mapa de morfologia 3D, é possível extrair a altura, largura e comprimento transversal do agregado (ou diâmetro em caso de partículas esferoidais), o que permite distinguir e caracterizar espécies distintas de agregados presentes durante o tempo de agregação curso23,38. Os pontos de tempo típicos de interesse para investigar o processo de agregação são a fase de retardo, a fase de crescimento e a fase de platô (Figura 1). Durante a fase de retardo, as espécies monoméricas e oligoméricas de aβ 42 estão primariamente presentes. Quando visualizado por AFM, espécies monoméricas e oligoméricas de aβ 42 tipicamente aparecem como partículas esferoidais 1 − 15 Nm de diâmetro e 0,3 − 2 nm de altura (Figura 1, parte inferior esquerda)38,39. A formação de protofilamentos alongados, protofibrilas e fibrilas é visível durante a fase de crescimento do curso de tempo de agregação aβ 42 (Figura 1, meio inferior)38,39. Tipicamente, os protofilamentos aparecem como características alongadas centenas de nanômetros de comprimento e 0,5 − 2 nm de altura, enquanto as protofibrilas aparecem como agregados lineares ou curvilíneos alongados 1 − 5 Nm de altura e centenas de nanômetros de comprimento38, 39. Durante a fase de platô, as fibrilas são as espécies dominantes de aβ 42 agregados. As fibrilas aβ 42 tipicamente aparecem como estruturas não ramificadas, tipo rosca, com um diâmetro transversal de 6 − 10 nm e comprimento na ordem se micrômetros (Figura 3, parte inferior direita)38,39. Notavelmente, essa representação esquemática das propriedades morfológicas dos agregados é uma característica geral da maioria das proteínas agregantes e peptídeos13,14.

Após a investigação da morfologia da amostra, o nano-IR pode ser usado para investigar as propriedades químicas das espécies de agregados proteicos individuais presentes durante o processo de agregação, adquirindo mapas e espectros de IR resolvidos em nanoescala tanto no ar quanto ambiente líquido nativo24,26,38,4249,50,51,52,. A Figura 5 mostra uma ilustração esquemática da configuração AFM-ir. Uma fonte do IR é usada para iluminar a amostra da parte inferior na reflexão interna total ou diretamente da parte superior como na Figura 5a. Se a luz IR é absorvida pela amostra, ele vai excitar os níveis de transição de energia vibracional molecular correspondente das espécies presentes. A energia vibracional é dissipada dentro da amostra a forma de aquecimento térmico, o que provoca a expansão térmica da amostra. Esta expansão é medida na escala nanométrica pela ponta AFM em contato com a amostra com uma resolução na ordem de 10 nm. Em cada pulso, o cantilever detecta a expansão térmica. Em particular, a expansão rápida da amostra retrocede o cantilever do contato com a amostra, e depois que o pontapé para fora os anéis do cantilever para baixo em suas freqüências naturais. A fim de aumentar a sensibilidade do AFM-IR, é possível sintonizar a frequência do pulso a laser na mesma frequência da oscilação do cantilever54. A fim trabalhar neste modo ressonância-realçado, é necessário ter as fontes do IR que podem ser pulsadas em uma escala larga das freqüências, tais como lasers da cascata do Quantum que operam tipicamente em uma escala entre 1 − 1000 quilohertz. A amplitude Peak-to-Peak e a transformada rápida de Fourier do sinal do ringdown, denominada a amplitude do IR, da deflexão crua do cantilever são proporcionais à luz do IR absorvida. Estes sinais são detectados em tempo real, medindo a deflexão de um laser vermelho focado na parte superior do cantilever. A fim adquirir mapas químicos, o wavenumber do laser é fixado em um determinado wavenumber e o sinal da amplitude do IR é coletado em cada ponto do mapa, quando, para adquirir espectros do IR, a posição do cantilever é fixada em uma posição do interesse e do laser comprimento de onda é varrido ao longo da gama espectroscópica de interesse. A resolução final do AFM-IR possibilita a mensuração das propriedades químicas de agregados proteicos com uma altura transversal de aproximadamente 5 nm, conforme representado na Figura 6.

Figure 1
Figura 1: monitorização do curso de tempo de agregação in vitro através da fluorescência ThT e AFM.
As amostras colhidas durante a fase de retardo, fase de crescimento e fase de platô do processo de agregação detectada pela fluorescência ThT foram fotografadas por AFM de alta resolução. Este número foi adaptado de Ruggeri et al.38. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: representação esquemática da preparação do substrato e deposição da amostra para medidas de AFM.
(A, B) Gravura de mica que usa a fita adesiva. (C) deposição de amostras. (D) incubação da amostra. (E) enxaguadela da amostra com água ultrapura. (F) secagem da amostra fluxo suave de nitrogênio. (G) imagem latente da amostra usando o cantilever microfabricado de AFM com ponta afiada em sua extremidade. (H) imagem processada de fibrilas amilóides. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: procedimento de processamento de imagens AFM42.
O topo de cada painel mostra uma linha de perfil da superfície da amostra (linha vermelha) ilustrada pela imagem AFM correspondente, enquanto a parte inferior mostra um histograma da altura de todos os pixels na imagem. (a) imagem AFM RAW antes do procedimento de aplaação de imagem. (b) AFM Image após o procedimento de processamento, utilizando o plano de planificação total. As estruturas fibrillar (cor rosa) foram mascaradas do procedimento de nivelamento. (c) imagem processada usando o procedimento de nivelamento line-by-line. (d) imagem final após o procedimento de processamento de imagem. Este número foi adaptado de Ruggeri et al.42.

Figure 4
Figura 4: análise estatística agregada única de imagens AFM.
(a) exemplo do traçado das alturas e comprimentos das estruturas fibrilares, indicados com 1 e 2. (b) gráfico com secções das fibrilas traçadas e a sua altura média. (c) exemplo de um histograma que mostra a altura média das estruturas fibrilares. (d) gráfico com perfil normalizado das fibrilas rastreadas 1 e 2. (e) distribuição do histograma dos pontos de altura do perfil normalizado. Este número foi adaptado de Ruggeri et al.42. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: princípio da função do método AFM-IR.
(a) a luz absorvida do ir causa a expansão térmica da amostra, excitando as ressonâncias mecânicas do cantilever de AFM no contato com a amostra. A amplitude das oscilações do cantilever é proporcional à absorção do IR. (b) os mapas da absorção do ir são obtidos que digitaliza o cantilever na amostra ao fixar o comprimento de onda do laser. (c) a ponta e a amostra em contato se comportam como um sistema de molas acopladas cuja freqüência ressonante aumenta monotonicamente com a rigidez intrínseca da amostra50. (d) os espectros localizados são obtidos varrendo o comprimento de onda do laser ao fixar a posição do cantilever de AFM. (e) espectro de ir de proteínas. (f) em síntese, o AFM-ir possibilita o estudo simultâneo de propriedades morfológicas, mecânicas e químicas na escala nanométrica26. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: nanoespectroscopia infravermelha (nano-IR) de um único agregado amilóide.
(a) mapa de morfologia AFM. (b) mapa de absorção do ir no pico da ressonância do laser em 1658 cm-1. (c) dimensões transversais da altura da fibrila. d) espectros de ir em diferentes posições da estrutura fibrilar (marcadas no painel b com círculos azuis) e o substrato (marcado no painel b com círculos verdes). O sinal líquido médio derivando da estrutura agregada (linha preta sólida) foi obtido subtraindo-se o sinal de fundo em média (linha verde sólida) a partir do sinal de fibrila (linha azul sólida). Este número foi adaptado de Ruggeri et al.42.

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Discussion

O primeiro passo crítico neste protocolo é a preparação de proteínas monoméricas, como no caso da solução aβ 42 descrita nas etapas 1,1 e 1,2. É essencial iniciar o processo de agregação a partir de uma solução monomérica altamente pura, pois a presença de espécies oligoméricas ou agregadas pode resultar em baixa reprodutibilidade da cinética de agregação58e induzir artefatos no AFM medidas (por exemplo, as espécies fibrilares serão evidentes nas fases iniciais da agregação), o que pode levar à interpretação errónea dos dados. Dados cinéticos altamente reprodutíveis da formação de amiloides com base no ensaio de fluorescência tht, emassociação com o formalismo da equação mestra da cinética química5,6,7, permitiramdefinir a agregação aβ 42 mecanismo em termos de seus eventos moleculares subjacentes. A cinética química conecta os passos microscópicos subjacentes à formação de amiloides com suas manifestações macroscópicas, considerando as diferentes formas em que novos agregados podem formar e crescer, que são, por exemplo, alongamento nas extremidades agregadas ou secundárias nucleação na superfície agregada. No entanto, a cinética química por si só não permite diretamente a visualização dos fenômenos de nucleação possíveis na nanoescala, exigindo sua combinação com métodos de molécula única.

A segunda etapa crítica neste protocolo é a preparação do substrato e os procedimentos de deposição de amostras descritos nas etapas 2,2 e 2.6 − 2.8. Para evitar artefactos, a amostra deve ser depositada numa superfície limpa e atomicamente plana. A gravura apropriada da mica é essencial para conseguir a alta resolução livre de artefatos em medições de AFM. O tempo de deposição da amostra também é extremamente importante, pois o tempo de incubação mais longo permite melhor absorção na superfície do substrato. No entanto, também pode induzir a autoorganização artificial e a automontagem25, o que pode induzir artefatos (por exemplo, espécies agregadas induzidas por superfície) que podem levar à interpretação errónea dos dados. Além, a superfície de mica é carregada negativamente, que significa que somente as moléculas positivamente carregadas absorvem facilmente nela. Se a carga líquida da amostra for negativa, a superfície da mica pode ser positivamente funcionalizada usando APTES para uma melhor fisisorção23. O depósito de pulverização microfluídico25 pode ser explorado para evitar esses efeitos e artefatos e depositar a amostra em uma única etapa e forma livre de artefatos.

A terceira etapa crítica é a configuração adequada e a escolha dos parâmetros de imagem para a imagem de amostra via AFM e AFM-IR descritos na seção 3. As pontas de AFM usadas para a imagem latente da amostra devem ser afiadas bastante (raios do vértice de 2 − 8 nanômetro) para conseguir de alta resolução e para minimizar efeitos da convolução (ampliação das características da amostra pela ponta)14, que podem induzir incertezas na imagem da amostra. A escolha do modo de imagem, contato ou dinâmica, também é importante. Para a imagem latente da amostra através do AFM convencional, o modo dinâmico é preferido sobre o modo de contato enquanto o último modo induz grandes forças laterais da fricção da ponta-amostra que podem causar o dano da amostra e introduzir artefactos nas medidas (por exemplo, redução no altura da amostra devido ao nanoindentation)14,61,62. Inversamente, o modo de contato é preferido para as medições via nano-IR para melhorar o sinal AFM-IR. Para medições em modo dinâmico, o cantilever deve ser ajustado apenas um pouco abaixo (modo de toque) ou acima (modo sem contato) o máximo de sua primeira ressonância livre de oscilação para garantir maior estabilidade das medidas14. A resolução de imagem, que depende do número do pixel e da área de digitalização, deve ser suficientemente alta para captar o menor grau de detalhe presente em uma amostra (por exemplo, 1024 x 1024 pixels para uma área de 4 x 4 μm2 )14,63. A baixa resolução de imagem pode induzir distorções e incertezas na imagem da amostra, devido à perda da informação vertical e lateral sobre a digitalização do sinal14. A taxa da varredura, usada para a imagem latente, deve ser baixa bastante para que a ponta possa seguir corretamente as características de superfície assim como para ter bastante tempo para adquirir a informação química14. Um dos parâmetros de imagem mais importantes é a força de imagem. No modo de contato, é fundamental usar uma baixa força de interação para preservar a estrutura da amostra. No modo dinâmico, a dissipação de energia nas amostras deve ser mantida constante, a fim de comparar consistentemente a morfologia de amostras distintas; a imagem latente consistente de amostras independentes pode ser obtida mantendo um regime constante de uma mudança de fase que não exceda δ20 °14,42. As grandes forças da imagem latente devem ser evitadas porque podem induzir distorções e incertezas nas imagens da amostra.

Deriva térmica causada pela expansão e contração das peças de AFM devido às flutuações térmicas pode induzir distorções e artefatos na imagem da amostra64,65. Drifts na direção vertical pode fazer com que o cantilever perder o controle da superfície, bem como para bater na superfície, enquanto drifts na direção lateral geralmente resultam em alongamento das características da superfície e distorção de imagem, o que torna difícil obter medições precisas das características da amostra. O efeito destes drifts térmicos pode ser minimizado pelo controle de temperatura exato do laboratório assim como dando bastante tempo (ao redor 30 minutos) para que o sistema torne-se estável ou realizando varreduras rápidas66,67,68 , 69 , 70.

A qualidade da imagem de nano-ir e da coleção de espectros por AFM-ir pode ser afetada por vários fatores, dos quais os mais importantes são: (i) uma divisão errada do sinal de ir na amostra pelo fundo do ir, (II) uma grande variação do contato das entre a ponta e a amostra, e (III) um aquecimento excessivo da amostra causando seu amolecimento. Para dividir corretamente o espectro de IR da amostra pelo fundo coletado, é crucial que eles são coletados na mesma potência do laser. Na verdade, a forma de linha espectral do fundo do laser IR depende do poder do laser. Então, a fim de evitar a influência das propriedades mecânicas da amostra na informação química medida, é crucial monitorar e rastrear a ressonância de contato entre a amostra e a ponta durante os espectros e a aquisição de imagens. Para a aquisição de espectros, idealmente, é suficiente para pulsar o laser em uma ressonância de contato fixo. Entretanto, se o espectro é adquirido em uma grande escala espectroscópica, os picos da intensidade elevada poderiam causar o aquecimento forte da amostra e seu amolecimento, assim mudando a ressonância da ponta-amostra do contato e reduzindo artificialmente a amplitude do pico do IR. Por esta razão, é importante rastrear a ressonância de contato durante a aquisição de espectros, a fim de verificar se o espectro não é afetado pelo aquecimento excessivo da amostra.

Em conclusão, AFM convencional e nano-ir são capazes de investigar com alta resolução as propriedades morfológicas, estruturais e químicas das espécies individuais formando durante a agregação proteica24,38. Entretanto, faltam a capacidade da cinética química de seguir sua cinética rápida da formação em circunstâncias maiorias nativas. A fim de desvendar as mudanças conformacionais que a proteína sofre durante a sua agregação e desdobramento, é necessário desenvolver e aplicar novos métodos biofísicos capazes de reunir as capacidades dos métodos biofísicos em massa com o investigação da heterogeneidade e das propriedades ultrastructural da agregação da proteína no nanoscale. Essa abordagem representa uma avenida frutífera para abordar o desafio de compreender o problema da automontagem protéica e seu papel na saúde e na doença. De fato, abordagens agregadas únicas são capazes de desvendar e elucidar os mecanismos moleculares de polimorfismo e formação de agregação proteica. Esta informação é fundamental para abordar o desafio de compreender a agregação proteica e seu papel no início e progressão das doenças humanas, bem como compreender suas propriedades biofísicas para aplicações de biotecnologia.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Os autores agradecem a Swiss National Foundation for Science (SNF) pelo apoio financeiro (Grant Number P2ELP2_162116 e P300P2_171219), o Darwin College, programa Erasmus + para o apoio financeiro (Grant Number 2018-1-LT01-KA103-046719 -15400-P3) e o investigação que conduz a estes resultados recebeu financiamento do Conselho Europeu de investigação no âmbito do sétimo programa-quadro da União Europeia (7. º PQ/2007-2013) através da subvenção do CEI PhysProt (acordo n. º 337969), da Fundação Newman (T.P.J.K.) e da Centro de Cambridge para doenças misfolding (CG, T.P.J.K.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AFM-IR system Anasys Instruments nanoIR 2 or 3 Systems to measure thermal expansion in contact and resonance mode
Corning 96-well Half Area Black/Clear Bottom Polystyrene NBS Microplate Corning 3881
Corning Microplate Aluminium Sealing Tape Corning 6570
Double Sided Adhesive Discs AGAR Scientific AGG3347N
FLUOstar Omega BMG Labtech 415-101 Platereader
Mica Disc 10mm V1 AGAR Scientific AGF7013
Park NX10 AFM system Park Systems N/A Atomic Force Microscope
Platypus Ultra-Flat Gold Chips Platypus Technologies AU.1000.SWTSG
PPP-NCHR-10 cantilevers Park Systems PPP-NCHR-10
Protein LowBind Tubes, 2.0mL Eppendorf 30108132
Silicon gold coated cantilevers Anasys Instruments PR-EX-nIR2
SPM Specimen Discs 12mm AGAR Scientific AGF7001

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Ruggeri, F. S., Šneideris, T., Chia, S., Vendruscolo, M., Knowles, T. P. J. Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (151), e60108, doi:10.3791/60108 (2019).

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