Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Karakterisera enskilda protein aggregat med infraröd Nanospektroskopi och atomkraft mikroskopi

Published: September 12, 2019 doi: 10.3791/60108
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1,3
1Centre for Misfolding Diseases, Department of Chemistry, University of Cambridge, 2Institute of Biotechnology, Life Sciences Center, Vilnius University, 3Cavendish Laboratory, Department of Physics, University of Cambridge

Summary

Vi beskriver tillämpningen av infraröd nanospektroskopi och högupplöst atomstyrkmikroskopi för att visualisera processen för självmontering av proteiner i oligomeraggregat och amyloid fibriller, som är nära förknippad med uppkomsten och utvecklingen av ett brett spektrum av mänskliga neurodegenerativa sjukdomar.

Abstract

Fenomenet med proteinförvrängning och aggregering resulterar i bildandet av mycket heterogena protein aggregat, som är förknippade med neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers och Parkinsons sjukdom. Särskilt låg molekylvikt aggregat, amyloid oligomerer, har visat sig ha generiska cytotoxiska egenskaper och är inblandade som neurotoxiner i många former av demens. Vi illustrerar användningen av metoder baserade på atomkraft mikroskopi (AFM) att ta itu med den utmanande uppgiften att karakterisera de morfologiska, strukturella och kemiska egenskaperna hos dessa aggregat, som är svåra att studera med hjälp av konventionella strukturella metoder eller bulkbiofysiska metoder på grund av deras heterogenitet och övergående natur. Scanning sond mikroskopi metoder nu kan undersöka morfologi av amyloid aggregat med sub-nanometer upplösning. Vi visar här att infraröd (IR) nanospektroskopi (AFM-IR), som samtidigt utnyttjar den höga upplösningen av AFM och den kemiska erkännande kraften i IR-spektroskopi, kan gå vidare och möjliggöra karakterisering av de strukturella egenskaperna hos enskilda protein aggregat, och därmed ge insikter i agg regeringsmekanismerna. Eftersom den metod som vi beskriver kan tillämpas även på utredningar av samspelet mellan protein sammansättningar med små molekyler och antikroppar, det kan leverera grundläggande information för att utveckla nya terapeutiska föreningar för att diagnostisera eller behandla neurodegenerativa sjukdomar.

Introduction

Över 40 000 000 människor i världen är för närvarande drabbade av neurodegenerativa sjukdomar, såsom Alzheimers (AD)1 och Parkinsons (PD)2 sjukdomar. Mer allmänt, mer än 50 patologier är associerade på molekylär nivå med protein neurodegenerativa och aggregation, en process som leder till spridningen av olösliga fibrillär protein aggregat, känd som amyloid insättningar3, 4. den molekylära ursprunget till neurodegeneration och dess kopplingar till proteinöverensstämmande förändringar av proteiner som leder till amyloid bildas, dock fortfarande oklart, till stor del på grund av den höga graden av heterogenitet, övergående natur och nanoskala dimensionerar av de patologiska aggregaten4,5.

Mycket framgångsrika undersökningar av proteinstrukturer under de senaste decennierna har i stor utsträckning baserats på användningen av bulkmetoder, inklusive röntgenkristallografi, kryoelektronmikroskopi och kärnmagnetisk resonans-spektroskopi5, 6 , 7 , 8 , 9. inom denna klass av tekniker, infraröd (IR) spektroskopi har vuxit fram som ett känsligt analytiskt verktyg för att riva upp de kemiska egenskaperna hos biologiska system såsom proteiner8. IR-metoder möjliggör kvantifiering av protein sekundära och Kvartära strukturella förändringar under deras neurodegenerativa och aggregation. Dessutom, för att ytterligare dechiffrera på mikroskopisk nivå de mekanistiska detaljerna inblandade i den komplexa fria energilandskap av protein under sin aggregering, har ett stort förskott varit utvecklingen av kemisk kinetik verktyg för att utvidga till komplexa själv monterings vägar inklusive amyloid fibriller formation5,6,7,10,11,12. Bulkspektroskopiska metoder ger dock endast genomsnittlig information om den heterogena ensemble av arter som finns i lösningen eller som medverkar i specifika mikroskopiska steg, vilket gör utredningen av de biofysiska egenskaperna hos enskilda aggregerad art som är utmanande på nanoskalan13,14.

Flera mikroskopi tekniker med förmåga att driva på skalor mindre än diffraktion gränsen för ljus har uppstått under de senaste decennierna. Denna klass av metoder omfattar elektronmikroskopi (EM) och atomkraft mikroskopi (AFM). Medan scanning elektronmikroskopi (SEM) och transmissionselektronmikroskopi (TEM) ger tvådimensionella (2D) bilder av ett prov, har AFM vuxit fram under de senaste decennierna som en kraftfull och mångsidig teknik för att studera tredimensionella (3D) morfologier, som samt nanomekaniska egenskaper hos ett prov med subnanometerupplösning13,14,15,16,17,18,19, 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. logiken bakom att studera protein aggregering via AFM är att denna metod möjliggör utredning av morfologin hos enskilda arter som finns i lösning13,14,16, 17,19,20,21,25,27,28,29,30, 31,32,33,34,35,36,37. I synnerhet genom att övervaka provet som en funktion av tiden, möjliggör AFM utredning av utvecklingen av morfologin hos de arter som ingår i provet, vilket gör det möjligt att följa och visualisera vägar för amyloid formation23, 25,38,39,40,41,42. AFM möjliggör dessutom kvantifiering av strukturella parametrar såsom tvärsnitts höjder och längder för de enskilda arter som finns i lösning13,19,30,31 ,32,33,34,35,36,37,40,43, 44 , 45 , 46 , 47 , 48studiet av en enda biofysisk egenskap, såsom morfologi, är dock ofta inte tillräckligt när man studerar heterogena och komplexa biologiska system. AFM, SEM eller TEM avbildningsmetoder ensamt inte lätt avslöja de kemiska egenskaperna hos heterogena arter av amyloid aggregat i nanoskala.

Ett stort framsteg för analysen av heterogena biologiska prover på denna skala har nyligen gjorts med utveckling och tillämpning på området för protein aggregering av infraröd nanospektroskopi (AFM-IR)24,26, 38,42,49,50,51,52. Denna innovativa metod utnyttjar kombinationen av den rumsliga upplösningen av AFM (~ 1 − 10 nm) med den kemiska analys kraften hos IR. AFM-IR-tekniken baseras på mätningen av den fototermiska inducerade resonans effekten som drivs av en IR-laser, och på mätningen av den termiska expansionen av provet under utredning av AFM-spetsen. Provet kan belysas av IR-lasern direkt från toppen eller från botten i total inre reflektion, på samma sätt som i konventionell infraröd spektroskopi24,42,52,53 . IR-lasern kan pulsas med typiska frekvenser i storleksordningen hundratals kilohertz (1 − 1000 kHz) och stämmas över ett brett spektralområde, typiskt mellan 1000 − 3300 cm-1. Även om laserkällan täcker ett område på ~ 30 μm diameter, är den rumsliga upplösningen av AFM-IR-tekniken bestäms nominellt av AFM spets diameter, som detekterar den lokala termiska expansionen av systemet. AFM-IR lämpar sig väl för att studera biologiska prover eftersom IR-signalen är proportionell mot deras tjocklek upp till 1 − 1,5 μm, och de resulterande IR-spektra är i allmänhet överens med motsvarande FTIR transmissions Spectra13,54 ,55. Av denna anledning, etablerade metoder för analys i spektroskopi kan lätt tillämpas, såsom studier av kemiska förändringar, band formförändring och de-faltning av andra derivat analys52. Sammantaget kombinerar den rumsliga upplösningen av AFM med den kemiska erkännande kraften i IR-spektroskopi, AFM-IR möjliggör samtidig förvärv av ett brett spektrum av morfologiska, mekaniska och kemiska egenskaper hos ett prov i nanoskala.

Här illustrerar vi ett protokoll för karakterisering av processen för protein aggregation som utnyttjar kombinationen av in vitro-fluorescensanalyser, högupplöst AFM-avbildning och nanoskala AFM-IR. Detta kombinerade tillvägagångssätt har redan utmärkt sig för att ge detaljerade resultat i att studera kemiska och strukturella egenskaper hos enskilda mikro-droppar som bildas av protein aggregat, i studien av flytande-flytande protein fasseparation, och i utreda heterogenitet och biofysiska egenskaper hos enskilda aggregerade arter i nanoskalan23,26,38,45,50,53, 56,57.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. aggregering analyser på fluorescens plattan läsare

Anmärkning: det protokoll som beskrivs här är ett exempel på hur man studerar aggregering av något protein eller peptid genom kemisk kinetik. I synnerhet, det beskriver ett optimerat protokoll för att studera aggregering av Aβ 42 peptid, som är involverad i uppkomsten och utvecklingen av Alzheimers sjukdom58,59. Ett liknande protokoll kan justeras och antas för att studera aggregering av något protein eller peptid.

  1. Få en mycket ren monomerlösning av Aβ 42 genom jonbytarteknik och kromatografitekniker för att särskilja protein fraktioner som innehåller Aβ 42, och för att isolera monomerfraktionen från andra aggregerade former av Aβ 42 erhållna58 , 59.
  2. Späd ut Aβ 42-peptiden i 20 mM natriumfosfatbuffert, 200 μM EDTA vid pH 8,058 till en önskad slutlig koncentration mellan 1 − 5 μm, i 1,5 ml låg bindnings rör. Prover som samlats in för AFM-mätningar bör inte innehålla det fluorescerande färgämne som används i agg regeringsanalysen (thioflavin T, ThT), eftersom det kan introducera artefakter under prov avsättning för AFM-analys. Således förbereda tre exemplar av två identiska lösningar: i) den första innehåller monomeriska Aβ 42 att följa processen för aggregering av AFM; II) den andra innehåller den Aβ 42 monomeriska med tillägg av 20 μM ThT som en spårämne för att övervaka kinetik aggregering.
    Obs: det är viktigt att utföra steg 1,1 och 1,2 på is. Detta förfarande är att se till att monomer Aβ 42 lösning inte aggregera förrän initieras i plattan läsaren. Vid hantering av prover är noggrann pipettering nödvändig för att undvika att luftbubblor införs som kan påverka protein provet.
  3. Pipettera över 80 μL av varje prov i varje brunn på en 96-brunn, halv områdes platta av svart polystyren med tydliga botten-och icke-bindande ytor.
  4. Täta plattan med en folie för att minimera avdunstning av provet under loppet av aggregeringen.
  5. Equilibrate temperaturen på plattan läsaren till 37 ° c.
  6. Ställ in agg regeringsprotokollet för att läsa fluorescensmätningar vid fasta tidsintervall, vid en exciteringvåglängd på 440 nm och en emissionsvåglängd på 480 nm. Aggregering bör initieras i quiescent villkor.
  7. Sätt in plattan i plattläsaren.
    Observera: det är viktigt att vara försiktig när du hanterar plattan, för att säkerställa att aggregeringen inte utlöses innan plattläsaren startas. Använd förstärknings justeringsinställningarna för att säkerställa optimal avläsning av fluorescensen för varje prov.
  8. Starta mätningen.
    Anmärkning: aggregering experimentet avslutas när tht fluorescens sigmodala kurvan når en platå58.

2. provberedning för AFM-och nano-IR-mätningar

  1. Limma högsta kvalitet v1 Mica-skiva till hög kvalitet magnetisk rostfrittstål skiva med hjälp av självhäftande flikar eller dubbelhäftande tejp.
  2. Etch Mica genom att placera en bit tejp på glimmer ytan och dra bort det översta lagret av glimmer. Detta förfarande kommer att producera ren, atomically platt yta, lämplig för prov deposition.
    Anmärkning: etsad yta måste vara jämn och slät.
    Varning: vidrör eller andas inte direkt över nyetsad glimmer, eftersom detta kommer att introducera artefakter.
  3. Pausa/stoppa plattan Reader mätning för att samla in tidspunkten av intresse under aggregering processen av proteinet.
  4. Ta bort tätnings folien och samla in 10 μL alikvot av proverna utan ThT från brunnen till en 1,5 mL låg bindnings rör.
  5. Sätt in 10 μL av provet på den nyetsade glimmer. För AFM-IR-mätningar skall proverna deponeras på nyrivet guld substrat.
  6. Inkubera lösningen på glimmer i 1 min för att tillåta fysisorbtion.
    Obs: längre inkubationstid skulle möjliggöra bättre absorption på ytan men kan framkalla artificiell självorganisering och självmontering25. För att undvika dessa effekter kan spraydeposition utnyttjas25.
  7. Skölj tre gånger med 1 ml ultrarent vatten.
  8. Torka under ett skonsamt kväveflöde för att mäta provet i luftmiljö.

3. AFM avbildning av morfologin av protein aggregat

Obs: morfologi mätningar kan utföras både i kontakt och dynamiskt läge, i följande steg den senare beskrivs eftersom det minskar laterala styrkor för att mäta 3D morfologi av provet med hög upplösning. AFM-IR mätningar kommer att utföras i kontakt läge för att förbättra AFM-IR signal-brus-förhållande.

  1. Slå på AFM-systemet minst 30 min före mätningarna för att systemet ska kunna uppnå termisk stabilitet. Klicka på Setup, sedan på PROBE. I sond ändra fönster Klicka på Nästa för att förbereda Z, fokus skede.
  2. Stäng av AFM beam-omkopplaren (om den är på). Lås upp passar ihop lås, koppla bort huvudet från systemet och i sond ändra fönster Klicka på Nästa.
  3. Montera AFM-cantispaken på sondhållaren. Anslut huvudet till systemet och lås passar ihop lås.
    Obs: optimala cantispakar för att studera biologiska prover i dynamiskt läge AFM har vårkonstant som sträcker sig mellan 2 − 40 N m-1 och en Apex radie mellan 2 − 8 nm14.
  4. Slå på AFM laserstrålen switch och i sond ändra fönster Klicka på Nästa.
  5. I popup-fönstret Klicka på Nej om grenställ typ inte ändras. Justera de optiska justeringsrattarna för att hitta cantilever. Justera fokus på grenställ och klicka på Nästa.
  6. I popup-fönstret klickar du på Ja om fokus ligger på cantilever.
  7. Placera laserstrålen i slutet av grenställ med hjälp av rattarna kontrollera placeringen av detekterings lasern. Maximera den totala signalen mätt med fyrkvadrant fotodiod till minst > 1 V med hjälp av rattarna styra positionen för den reflekerade laserstrålen på positionen känsliga fotodiod (PSPD). I PROBE ändra fönster Klicka på Nästa och sedan på Stäng.
  8. Vänta 15 min för grenställ att nå termisk stabilitet. Justera positionen för den reflekerade laserstrålen på PSPD om det behövs.
  9. Klicka på NCM Sweep, Välj önskad amplitud av svängning, klicka på Använd fas, klicka på Auto och justera grenställ nära den maximala av dess första fria resonans av svängning, som är av cirka 300 kHz för en grenställ med en fjäderkonstant på 40 N m-1.
    Notera: att trimma cantispaken av maximat av dess fria resonans försäkrar högre stabilitet av mätningarna14.
  10. Placera provet på provhållaren. Välj lämpliga avbildnings parametrar. Typisk skanningshastighet är 0,3 − 1,0 Hz för ett skanningsområde på 1 x 1 μm2 till 5 x 5 μm2. Typisk upplösning som behövs är mellan 256 x 256 och 1024 x 1024 pixlar. Klicka på skanningsområdet för att välja skanningsstorlek och pixel nummer.
  11. Fokusera den optiska vyn på provet. Klicka på tillvägagångssätt för att närma sig prov ytan. När tillvägagångssättet är avslutat Klicka på lyft 100 μm för att stiga AFM spetsen 100 μm över ytan av provet. Klicka på expandera på den optiska bilden av provet. Klicka på fokus stegs fältet för att fokusera vyn på provets yta.
  12. Använd pilarna för att flytta i regionen av intresse urvalet. Aktivera Surface genom att trycka på Approach -knappen. Klicka på Line Scan -knappen, och kontrollera om spetsen är efter ytan väl, om det behövs, justera den inställda punkten.
  13. Börja avbilda prov ytan genom att trycka på knappen Skanna . Vid avbildning, för att undvika stor bild kraft och hålla konsistensen inom oberoende prover, bibehålla en konstant regim av fasförändring som inte överstiger Δ20 °42.
  14. Ange filnamn och välj den baskatalog där den förvärvade bilden ska sparas.

4. infraröd nanospektroskopi mätningar av protein aggregat

  1. Slå på AFM-IR-systemet och den infraröda (IR) lasern60 30 − 60 min före mätningar för termisk stabilisering. Typiska lasrar för AFM-IR instrument är optiska parametrar oscillatorer (OPO) och Quantum Cascade lasrar (QCL).
  2. Öppna den inbyggda programvaran för att styra instrumentet. Klicka på Arkiv och sedan på ny för att öppna en ny nanoir -fil. Tryck på knappen initialisera för att starta AFM-IR-systemet.
  3. Öppna instrument luckan och montera på AFM-IR-systemet en kiselguldbelagd sond med en nominell radie på 30 Nm och en fjäderkonstant på 0,2 N/m för att mäta provet i kontakt läge.
  4. Klicka på load i avsnittet AFM sond och sedan Nästa. I fokus på sond avsnitt Klicka på pilarna för att fokusera kameran på cantilever. I avsnittet Sample XY rörelse, Använd pilarna för att placera luften i slutet av cantilever.
  5. Rotera rattarna kontrollera placeringen av detekterings lasern att placera lasern i slutet av cantilever. Rotera laser rattarna för att upptäcka och maximera summan mätt med fyrkvadrant fotodiod till ett värde ≫ 3 V. Vrid avböjningsknappen för att justera uthärdet till-1 v och klicka sedan på Nästa. Stäng locket på instrumentet.
  6. I avsnittet fokus på prov Använd pilarna för att fokusera kameran på provet. Sedan, i avsnittet Sample XY rörelse använda pilarna för att flytta i regionen av intresse av provet och klicka på tillvägagångssätt och engagera.
  7. I Mikroskop fönstret väljer du som indata de kanaler som är av intresse för att kartlägga de biofysiska egenskaperna hos provet. Välj i synnerhet höjd för morfologi, AMPLITUD 2 för IR-absorption och PLL-frekvens till kartans spets-prov kontakt resonans.
  8. I avsnittet AFM-skanning i kontroll fönstret använder du liknande parametrar som i avsnitt 3 (dvs. skanningshastighet 0,1 − 1,0 Hz, mellan 256 x 256 och 1024 x 1024 pixlar). Välj som värderar av vinsterna enligt prov ojämnhet: Integral I = 1 − 10 och proportionellt P = 10 − 30. Klicka sedan på Skanna att förvärva en morfologi karta.
    Obs: morfologin kan mätas på samma sätt i det dynamiska knacknings läget, men AFM-IR-mätningar utförs här i kontakt läget för att ha högre signal-till-brus-förhållande.
  9. Efter kartläggningen av morfologin är klar, i Mikroskop fönstret, klicka på höjden kartan för att placera sonden på toppen av en aggregat. Sedan i Nanoir delen av kontrollerna fönstret, klicka på Start IR för att belysa provet med IR-laser.
  10. För att fokusera infraröd laser på cantilever, klicka på optimering. I det här fönstret skriver du en Vågtal där provet kommer att ha hög absorbans och klicka på Lägg till. För protein är ett typiskt värde 1655 cm-1. Klicka på Skanna för att hitta IR-laserpositionen och klicka på Uppdatera för att justera positionen med cantilever. Stäng fönstret.
  11. I avsnittet Allmänt i nanoir -inställningen skriver du en Vågtal där hög absorbans i det relativa fältet förväntas. Sedan, avaktivera alternativet band pass filter och titta på mätar avläsning och vid fast Fourier Transform (FFT) av grenställ svar. I FFT fönstret flytta den gröna markören för att läsa resonansfrekvensen av cantilever. Ett typisk värderar av FFTEN av resonansen av cantispakarna är omkring 300 kHz. Skriv detta resonansfrekvens värde i avsnittet Allmänt i fältet FREQ. Centre och Använd ett freq. Window på 50 kHz.
    Obs: Välj en lasereffekt som är tillräckligt låg för att inte mätta mätar avläsning och att ha distorsion i grenställ svar och att inte överhettas provet.
  12. Klicka på laser Pulse Tune fönster för att använda resonans förstärkt läge. Välj en frekvens centrum på 300 kHz, en Tune intervall på 50 kHz och en arbetscykel av lasern på 5%. Klicka på förvärva att sopa pulsen på lasern. Genom att använda markören i grafen ställer du in laserpulsen på frekvensen av det mekaniska svaret från den termiska expansionen av provet som absorberar IR-ljuset. Välj sedan alternativet PLL för att övervaka kontakt resonans mellan provet och spetsen. Tryck på Zero -knappen i PLL fönstret och markera Aktivera för att spåra provet-spets kontakt resonans. Välj en integrerad vinst I = 0,5 och proportionell förstärkning P = 10. Stäng fönstret.
  13. Öppna igen optimerings fönstret och hitta positionen för IR-lasern i minst 3 wavenumbers motsvarande större absorbansband av provet (Amid-bandet I-II-III) och för minst en Vågtal för varje chip av lasern.
  14. Klicka på verktyg | IR-bakgrund kalibrering | Nya. I fönstret väljer du den spektroskopiska regionen av intresse (1800 − 1200 cm-1 för att studera protein prov); Välj samma pulsfrekvens som bestäms i steg 4,12 och en intermittens på 5%. Klicka på snabb anskaffning och välj laser hastighet, typiskt område för en Quantum Cascade laser är mellan 20 − 500 cm-1. Klicka på Hämta för att mäta IR-laserbakgrunden. Detta bakgrunds spektrum kommer att användas för normalisering av uppmätta nanoskala lokaliserade spektra. Stäng fönstret.
    Obs: om en snabb laser och resonans förstärkt läge inte är tillgänglig, hoppa över steg 4,12 och välj klev Spectra istället för snabbt i både bakgrunden och IR Spectra förvärv fönster. En enda aggregerad känslighet kommer dock inte att uppnås.
  15. I IR Spectra -inställningarna väljer du en IR-spektrum upplösning mellan 1 − 4 cm-1 och ett antal Co-medelvärden på minst 64x. Klicka på förvärva att mäta en nanoskala lokaliserad IR spektrum i protein området (1800 − 1200 cm-1).
  16. För att förvärva en nanoskala löst kemisk karta, Välj IR imaging alternativ, Välj en Vågtal av intresse (t. ex., 1655 cm-1 för amide band i) och klicka på Scan i AFM Scan fönster.
  17. När mappningen är klar går du till Arkiv och sparar måtten. För att analysera de förvärvade kartor av morfologi, kontakt-resonans och kemi, samt nanoskala lokaliserade spektra, använda den inbyggda AFM bildbehandling programvara. Spectra och bilder kan sparas som. csv eller. axz filer för ytterligare detaljerad analys med kommersiell programvara.

5. bildbehandling och analys av tvärsnitts mått

  1. Platta RAW-bilder14,17,19,41,42,59 med inbyggd AFM bildbehandling programvara eller kommersiell programvara.
    Observera: aggregaten ska maskeras från beräkningen för att undvika artefakter av analys och underskattning av deras uppmätta höjd.
  2. Platta till bilden med 0 order Plane Fit subtraktion.
  3. Plattar bilden med plan och sedan rad för rad vid en 1St Regressions ordning, det andra steget upprepas tills den plana baslinjen i linje profilen för bilden har uppnåtts.
  4. Om provet är mycket trångt, innehåller exceptionellt hög ballast eller scanner båge artefakt finns, platta till bilden med 2nd regression ordning Fit.
  5. Mät aggregerad höjd och bredd från en linjeprofil som är vinkelrät mot fibrillens-axeln14,17,19,41,42,59.
  6. Mät fibrilllängd parallellt med fibrillens-axeln14,17,19,41,42,59.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En representativ tidsperiod för Aβ 42-aggregation, mätt med ThT-fluorescensanalysen, visas i figur 1. Aggregations processen kännetecknas vanligen av en sigmodala kurva, där en eftersläpning fas initialt observeras, och följs av en brant tillväxtfas, innan kurvan når en platå när en jämvikt steady state uppnås6,7 , 58. det är viktigt att se till att ett optimerat agg regeringsprotokoll används för att generera högkvalitativa data för att studera molekylära detaljer som hänför sig till agg regeringsprocesser58.

Högupplöst AFM gör det möjligt att undersöka morfologi och heterogenitet av de aggregerade arterna vid olika tidpunkter i processen. Under aggregeringen, som övervakas av ThT-analysen, bereds alikvoter av provet i plattorna för en samlad undersökning av AFM och nano-IR (figur 1). Det typiska processflödet för manuell provberedning visas i figur 2. Vid slutförandet av mätningen av 3D morfologi av provet med hög upplösning och fas-kontrollerade AFM, kartorna är tillplattad för att ta bort icke-linearitet av den piezoelektriska skannern och minska källorna till fel i efter bearbetning analys av provet morfologi (figur 3). Därefter kan en noggrann och känslig statistisk analys av enstaka molekyler utföras, vilket visas i figur 4. Från en 3D-morfologi karta, är det möjligt att extrahera sammanlagda tvärsnitts höjd, bredd och längd (eller diameter i händelse av sfäriska partiklar), vilket gör att särskilja och karakterisera olika arter av aggregat som finns under aggregering tid kurs23,38. Typiska tidpunkter av intresse för att undersöka processen för aggregering är lag-fasen, tillväxtfasen och platåfasen (figur 1). Under lag-fasen är monomeriska och oligomerska arter av Aβ 42 främst närvarande. När de visualiseras av AFM, monomer och oligomerarter av Aβ 42 uppträder typiskt som sfäriska partiklar 1 − 15 nm i diameter och 0,3 − 2 nm i höjd (figur 1, nederst till vänster)38,39. Bildandet av långsträckta protofilament, protofibriller och fibriller syns under tillväxtfasen av Aβ 42 aggregation tidsförlopp (figur 1, nedre mitten)38,39. Typiskt, protofilament visas som långsträckt funktioner hundratals nanometer i längd och 0.5 − 2 nm i höjd, medan protofibriller visas som långsträckt linjär eller krökt aggregat 1 − 5 nm i höjd och hundratals nanometer i längd38, 39. Under platåfasen är fibriller den dominerande arten av Aβ 42 aggregat. Aβ 42 fibriller uppträder typiskt som ogrenade, trådliknande strukturer, med en tvärsnitts diameter på 6 − 10 nm och längd i ordningen om mikrometrar (figur 3, nedre högra)38,39. Anmärkningsvärt, denna schematiska representation av de morfologiska egenskaperna hos aggregaten är ett allmänt inslag i de flesta aggregerande proteiner och peptider13,14.

Efter undersökningen av provets morfologi kan Nano-IR användas för att undersöka de kemiska egenskaperna hos de enskilda proteinmängd arter som finns under aggregerings processen, genom förvärv av nanoskala-lösta IR-kartor och spektra både i luft och Ursprunglig vätske miljö24,26,38,4249,50,51,52,. Figur 5 visar en Schematisk illustration av AFM-IR-installationen. En IR-källa används för att belysa provet från botten i total inre reflektion eller direkt uppifrån som i figur 5a. Om IR-ljuset absorberas av provet, kommer det att excitera motsvarande molekylära vibrationsenergi övergångs nivåer av arten närvarande. Den vibrationella energin skingras inuti provet i form av termisk uppvärmning, vilket orsakar den termiska expansionen av provet. Denna expansion mäts på nanoskalan av AFM spetsen i kontakt med provet med en upplösning i storleksordningen 10 nm. Vid varje puls detekterar grenställ den termiska expansionen. I synnerhet, den snabba expansionen av provet sparkar ut grenställ från kontakt med provet, och efter sparka ut grenställ ringarna ner vid dess naturliga frekvenser. För att öka känsligheten för AFM-IR, är det möjligt att ställa in laserpuls frekvensen på samma frekvens av svängningen av grenställ54. För att kunna arbeta i detta resonans-förstärkt läge, är det nödvändigt att ha IR-källor som kan pulsas i ett brett spektrum av frekvenser, såsom Quantum Cascade lasrar som fungerar typiskt i ett intervall mellan 1 − 1000 kHz. Topp-till-topp-amplituden och den snabba Fouriertransformationen av ringdown-signalen, kallad IR-amplitud, av den råa grenställ-avböjningen är proportionell mot det IR-ljus som absorberas. Dessa signaler upptäcks i realtid genom att mäta deformationen av en röd laser fokuserad på toppen av cantilever. För att förvärva kemiska kartor, är lasern Vågtal fast vid en viss Vågtal och IR amplitud signalen samlas in vid varje punkt på kartan, medan, att förvärva IR Spectra, är positionen för grenställ fast i en position av intresse och lasern våglängd sveps längs det spektroskopiska utbudet av intresse. Den ultimata upplösningen av AFM-IR gör det möjligt att mäta de kemiska egenskaperna hos protein aggregat med en tvärsnitts höjd på ca 5 nm, som representeras i figur 6.

Figure 1
Figur 1: övervakning av Aggregations tiden kurs in vitro via ThT fluorescens och AFM.
Prover tagna under lag fasen, tillväxtfas, och platåfasen av aggregering processen som upptäcks av ThT fluorescens var avbildas via högupplöst AFM. Denna siffra har anpassats från Ruggeri et al.38. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: schematisk representation av substrat preparering och prov avsättning för AFM-mätningar.
(a, B) Glimmer etsning med tejp. C) prov deposition. D) provinkubering. E) prov sköljning med ultrarent vatten. F) prov torkning under mjukt kväveflöde. Gprov avbildning med hjälp av mikrofabricerad AFM-grenställ med skarp spets på dess ände. H) bearbetad bild av amyloida fibriller. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: AFM-bildbehandlings procedur42.
Överst på varje panel visas en profillinje i prov ytan (röd linje) som illustreras med motsvarande AFM-bild, medan den nedre delen visar ett histogram över höjden på alla pixlar i bilden. (a) rå AFM bild före bild förenklingen förfarande. (b) AFM bild efter bearbetningen med hjälp av hela planet tillplattning. Fibrillstrukturer (rosa färg) var maskerade från förenklings förfarandet. (c) bild bearbetas med rad-för-rad förenklingen förfarande. dslutlig bild efter bildbehandlings förfarandet. Denna siffra har anpassats från Ruggeri et al.42.

Figure 4
Figur 4: samlad statistisk analys av AFM-bilder.
aexempel på spårande av höjder och längder på fibrillstrukturer, indikerat med 1 och 2. b) diagram med delar av de spårade fibriller och deras genomsnittliga höjd. cexempel på ett histogram som visar den genomsnittliga höjden på fibrillers strukturer. d) kurva med normaliserad profil för de spårade fibriller 1 och 2. (e) histogramfördelningen av de normaliserade profil höjdpunkterna. Denna siffra har anpassats från Ruggeri et al.42. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: funktionsprincip för AFM-IR-metoden.
(a) absorberad IR-ljus orsakar den termiska expansionen av provet, spännande de mekaniska resonanserna i AFM grenställ i kontakt med provet. Amplituden av grenställ oscillationer är proportionell mot IR absorption. b) IR-absorptionskartor erhålls genom skanning av grenställ på provet samtidigt som laser våglängd fastställs. cspets och prov i kontakt beter sig som ett system av kopplade fjädrar vars resonansfrekvens ökar monotoniskt med den inneboende styvheten hos provet50. (d) lokaliserade spektra erhålls genom att man sveper över laservåglängden samtidigt som man fastställer AFM-cantiväxelns position. e) IR-spektrum av protein. fsammanfattnings, AFM-IR möjliggör samtidig undersökning av morfologiska, mekaniska och kemiska egenskaper i nanoskalan26. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: infraröd nanospektroskopi (nano-IR) av en enstaka amyloid-aggregerad.
aAFM morfologi karta. b) IR-absorptionskarta vid laser resonans toppen vid 1658 cm-1. c) tvärsnitts mått för fibrillhöjden. d) IR-spektra på olika positioner i fibrillstrukturen (märkt i panel b med blå cirklar) och underlaget (märkt i panel b med gröna cirklar). Den genomsnittliga netto signal som härrör från den sammanlagda strukturen (solid svart linje) erhölls genom att subtrahera den genomsnittlige bakgrunds signalen (fast grön linje) från den medelvärde fibrillens-signalen (fast blå linje). Denna siffra har anpassats från Ruggeri et al.42.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det första kritiska steget i detta protokoll är beredningen av monomerproteiner, såsom i fallet med Aβ 42 lösning som beskrivs i steg 1,1 och 1,2. Det är viktigt att initiera aggregerings processen från en mycket ren, monomerlösning, eftersom närvaron av oligomeriska eller aggregerade arter kan resultera i dålig reproducerbarhet av aggregering kinetik58, och inducera artefakter i AFM mätningar (t. ex. fibrillarter kommer att vara uppenbara i inledningsskedet av aggregeringen), vilket kan leda till felaktig tolkning av uppgifterna. Mycket reproducerbara kinetikdata för amyloid bildas baserat på THT fluorescens-analys, i samband med Master ekvation formalism av kemisk kinetik5,6,7, har tillåtit att definiera Aβ 42 aggregation mekanismen när det gäller underliggande molekylära händelser. Kemisk kinetik förbinder de mikroskopiska stegen bakomliggande amyloid formation med sina makroskopiska manifestationer genom att beakta de olika sätt på vilka nya aggregat kan bildas och växa, som är till exempel förlängning vid de sammanlagda ändarna eller sekundära kärnbildning på aggregerad yta. Emellertid, kemisk kinetik vid honom gör inte direkt möjliggöra visualiseringen av de möjliga kärnbildning fenomenen på nanoskalan som kräver deras kombination med singelmolekylen metoder.

Det andra kritiska steget i detta protokoll är substrat beredningen och prov deponerings procedurerna som beskrivs i steg 2,2 och 2.6 − 2.8. För att undvika artefakter måste provet deponeras på en ren, atomically plan yta. Korrekt etsning av glimmer är avgörande för att uppnå en artefakt, högupplöst i AFM mätningar. Prov deponerings tiden är också oerhört viktig, eftersom längre inkubationstid ger bättre absorption på substrat ytan. Det kan dock också framkalla artificiell självorganisering och självmontering25, vilket kan framkalla artefakter (t. ex. ytinducerade aggregat arter) som kan leda till felaktig tolkning av data. Dessutom är glimmer ytan negativt laddad, vilket innebär att endast positivt laddade molekyler lätt absorberar på den. Om netto laddningen av ta prov är negationen, ytbehandlar av glimmer kan vara positivt Functionalized genom att använda APTES för en bättre phisisorption23. Microfluidic spray deposition25 kan utnyttjas för att undvika dessa effekter och artefakter och deponera provet i ett enda steg och Artefact fritt sätt.

Det tredje kritiska steget är korrekt inställning och valet av avbildnings parametrar för prov avbildning via AFM och AFM-IR som beskrivs i avsnitt 3. AFM-tipsen som används för prov avbildning bör vara tillräckligt skarpa (Apex-radier på 2 − 8 nm) för att uppnå högupplöst och minimera faltningseffekter (breddning av prov funktionerna vid spetsen)14, vilket kan orsaka osäkerhet i bilden av provet. Valet av bildhanterings läge, kontakt eller dynamik är också viktigt. För prov avbildning via konventionell AFM, är det dynamiska läget att föredra framför kontakt läget eftersom det sistnämnda läget inducerar stora sido prov friktionskrafter som kan orsaka prov skador och introducera artefakter i mätningarna (t. ex. minskning av prov höjd på grund av nanoindentation)14,61,62. Omvänt är kontakt läget att föredra för mätningarna via nano-IR för att förbättra AFM-IR-signalen. För mätningar i dynamiskt läge, bör grenställ justeras strax under (Knacka läge) eller över (beröringsfria läge) maximalt av sin första fri resonans av svängning för att säkerställa högre stabilitet av mätningarna14. Bildupplösningen, som beror på pixel nummer och skanningsområde, bör vara tillräckligt hög för att fånga den minsta detaljnivå som finns i ett prov (t. ex. 1024 x 1024 pixlar för ett 4 x 4 μm2 -område)14,63. Låg bildupplösning kan framkalla snedvridningar och osäkerhet i bilden av provet på grund av förlusten av vertikal och lateral information vid digitalisering av signalen14. Skanningshastigheten, som används för avbildning, bör vara tillräckligt låg för att spetsen ska kunna följa Surface-funktioner på rätt sätt samt ha tillräckligt med tid för att inhämta kemisk information14. En av de viktigaste avbildnings parametrarna är avbildnings kraften. I kontakt läge är det grundläggande att använda en låg interaktions kraft för att bevara strukturen i provet. I dynamiskt läge bör energi spridningen på proverna hållas konstant för att konsekvent kunna jämföra morfologin med distinkta prover. konsekvent avbildning av oberoende prover kan erhållas genom bibehållande av en konstant regim med en fas ändring av högst δ20 °14,42. Stora bild krafter bör undvikas eftersom de kan framkalla snedvridningar och osäkerhet i prov bilderna.

Termisk drift orsakad av expansion och sammandragning av AFM delar på grund av termiska fluktuationer kan framkalla snedvridningar och artefakter i bilden av provet64,65. Drivor i vertikal riktning kan orsaka att grenställ att tappa spår av ytan samt att krascha in i ytan, medan drivor i sidled riktning vanligtvis resultera i förlängning av ytan funktioner och bildförvrängning, vilket gör det svårt att uppnå exakta mätningar av prov funktionerna. Effekten av dessa termiska drivor kan minimeras genom noggrann temperaturkontroll av laboratoriet samt ge tillräckligt med tid (ca 30 min) för att systemet ska bli stabilt eller genom att utföra snabba skanningar66,67,68 , 69 , 70.

Kvaliteten på nano-IR imaging och Spectra insamling av AFM-IR kan påverkas av flera faktorer, varav de viktigaste är: (i) en felaktig uppdelning av IR-signalen på provet med IR-bakgrund, (II) en stor variation av nanomekaniska kontakt mellan spets provet och (III) en överdriven upphettning av provet som orsakar dess uppmjukning. För att korrekt dela upp det INFRARÖDA spektrumet av provet med den insamlade bakgrunden är det viktigt att de samlas in med samma lasereffekt. Faktum är att den spektrala linjen formen av IR-laserbakgrund beror på kraften i lasern. Sedan, för att undvika påverkan av de mekaniska egenskaperna hos provet i den uppmätta kemiska informationen, är det viktigt att övervaka och spåra kontakt resonans mellan provet och spetsen under Spectra och bild förvärv. För Spectra förvärv, helst är det tillräckligt att pulsera lasern vid en fast kontakt resonans. Men om spektrumet förvärvas på en stor spektroskopisk räckvidd, hög intensitet toppar kan orsaka stark uppvärmning av provet och dess mjukgörande, vilket ändrar spetsen-provet kontakt resonans och artificiellt minska IR toppamplitud. Av denna anledning är det viktigt att spåra kontakt resonans under Spectra förvärv för att kontrollera att spektrumet inte påverkas av överdriven uppvärmning av provet.

Sammanfattningsvis är konventionella AFM och nano-IR kan undersöka med hög upplösning de morfologiska, strukturella och kemiska egenskaperna hos de enskilda arter som bildas under protein aggregation24,38. Emellertid, de saknar förmåga kemisk kinetik att följa deras snabba kinetik av bildandet i inhemska bulk villkor. För att riva upp de överensstämmande förändringar som proteinet genomgår under deras aggregering och fel bildning, är det nödvändigt att utveckla och tillämpa nya biofysiska metoder som kan sammanföra kapaciteten hos bulkbiopysiska metoder med undersökning av heterogenitet och ultrastrukturella egenskaper hos protein aggregering i nanoskalan. Detta tillvägagångssätt är en fruktbar väg att ta itu med utmaningen att förstå problemet med protein självmontering och dess roll i hälsa och sjukdom. Faktum är att enstaka aggregat metoder kan riva upp och belysa de molekylära mekanismerna för protein aggregation polymorfism och bildning. Denna information är central för att ta itu med utmaningen att förstå protein aggregering och dess roll i uppkomsten och utvecklingen av mänskliga sjukdomar, samt förstå deras biofysiska egenskaper för bioteknik tillämpningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Författarna tackar schweiziska National Foundation for Science (SNF) för det ekonomiska stödet (Grant Number P2ELP2_162116 och P300P2_171219), Darwin College, Erasmus + program för ekonomiskt stöd (bidrags nummer 2018-1-beteckningen LT01-KA103-046719 -15400-P3) och forskning som leder till dessa resultat har fått bidrag från Europeiska forskningsrådet inom ramen för Europeiska unionens sjunde ramprogram (FP7/2007-2013) genom ERC Grant PhysProt (avtalsnummer 337969), Newman stiftelsen (T.P.J.K.) och Cambridge centrum för Felfällbara sjukdomar (C.G., M.V., och T.P.J.K.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AFM-IR system Anasys Instruments nanoIR 2 or 3 Systems to measure thermal expansion in contact and resonance mode
Corning 96-well Half Area Black/Clear Bottom Polystyrene NBS Microplate Corning 3881
Corning Microplate Aluminium Sealing Tape Corning 6570
Double Sided Adhesive Discs AGAR Scientific AGG3347N
FLUOstar Omega BMG Labtech 415-101 Platereader
Mica Disc 10mm V1 AGAR Scientific AGF7013
Park NX10 AFM system Park Systems N/A Atomic Force Microscope
Platypus Ultra-Flat Gold Chips Platypus Technologies AU.1000.SWTSG
PPP-NCHR-10 cantilevers Park Systems PPP-NCHR-10
Protein LowBind Tubes, 2.0mL Eppendorf 30108132
Silicon gold coated cantilevers Anasys Instruments PR-EX-nIR2
SPM Specimen Discs 12mm AGAR Scientific AGF7001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease at 25 years. EMBO Molecular Medicine. 8, 595-608 (2016).
  2. Poewe, W., et al. Parkinson disease. Nature Reviews Disease Primers. 3, 1-21 (2017).
  3. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annual Review of Biochemistry. 75, 333-366 (2006).
  4. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, amyloid formation, and human disease: A summary of progress over the last decade. Annual Review of Biochemistry. 86, 27-68 (2017).
  5. Knowles, T. P. J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, 384-396 (2014).
  6. Meisl, G., et al. Molecular mechanisms of protein aggregation from global fitting of kinetic models. Nature Protocols. 11, 252-272 (2016).
  7. Knowles, T. P. J., et al. An analytical solution to the kinetics of breakable filament assembly. Science. 326, 1533-1537 (2009).
  8. Barth, A. Infrared spectroscopy of proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1767, 1073-1101 (2007).
  9. Fitzpatrick, A. W. P., et al. Atomic structure and hierarchical assembly of a cross- amyloid fibril. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 5468-5473 (2013).
  10. Cohen, S. I. A., et al. Proliferation of amyloid-β42 aggregates occurs through a secondary nucleation mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 9758-9763 (2013).
  11. Michaels, T. C. T., Lazell, H. W., Arosio, P., Knowles, T. P. J. Dynamics of protein aggregation and oligomer formation governed by secondary nucleation. Journal of Chemical Physics. 143, (2015).
  12. Šarić, A., Michaels, T. C. T., Zaccone, A., Knowles, T. P. J., Frenkel, D. Kinetics of spontaneous filament nucleation via oligomers: Insights from theory and simulation. The Journal of Chemical Physics. 145, 211926 (2016).
  13. Ruggeri, F. S., Habchi, J., Cerreta, A., Dietler, G. AFM-based single molecule techniques: Unraveling the amyloid pathogenic species. Current Pharmaceutical Design. 22, 3950-3970 (2016).
  14. Ruggeri, F. S., Šneideris, T., Vendruscolo, M., Knowles, T. P. J. Atomic force microscopy for single molecule characterisation of protein aggregation. Archives of Biochemistry and Biophysics. 664, 134-138 (2019).
  15. Iljina, M., et al. Nanobodies raised against monomeric α-synuclein inhibit fibril formation and destabilize toxic oligomeric species. BMC Biology. 15, 1-14 (2017).
  16. Schilling, C., et al. Sequence-Optimized Peptide Nanofibers as Growth Stimulators for Regeneration of Peripheral Neurons. Advanced Functional Materials. 1809112, 1-15 (2019).
  17. Chiki, A., et al. Mutant exon1 huntingtin aggregation is regulated by T3 phosphorylation-induced structural changes and crosstalk between T3 phosphorylation and acetylation at K6. Angewandte Chemie - International Edition. 56, 5202-5207 (2017).
  18. Sieste, S., et al. Water-dispersible polydopamine-coated nanofibers for stimulation of neuronal growth and adhesion. Advanced Healthcare Materials. 7, 1-11 (2018).
  19. De, S., et al. Different soluble aggregates of Aβ42 can give rise to cellular toxicity through different mechanisms. Nature Communications. 10, 1541 (2019).
  20. Chang, K. C., Chiang, Y. W., Yang, C. H., Liou, J. W. Atomic force microscopy in biology and biomedicine. Tzu Chi Medical Journal. 24, 162-169 (2012).
  21. Variola, F. Atomic force microscopy in biomaterials surface science. Physical Chemistry Chemical Physics. 17, 2950-2959 (2015).
  22. Drolle, E., Hane, F., Lee, B., Leonenko, Z. Atomic force microscopy to study molecular mechanisms of amyloid fibril formation and toxicity in Alzheimer’s disease. Drug Metabolism Reviews. 46, 207-223 (2014).
  23. Ruggeri, F. S., et al. Identification and nanomechanical characterization of the fundamental single-strand protofilaments of amyloid α-synuclein fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (28), 7230-7235 (2018).
  24. Ruggeri, F. S., et al. Infrared nanospectroscopy characterization of oligomeric and fibrillar aggregates during amyloid formation. Nature Communications. 6, 1-9 (2015).
  25. Ruggeri, F. S., et al. Microfluidic deposition for resolving single-molecule protein architecture and heterogeneity. Nature Communications. 9, (2018).
  26. Qamar, S., et al. FUS phase peparation is modulated by a molecular chaperone and methylation of arginine cation-π interactions. Cell. 173, 720-734 (2018).
  27. Habchi, J., et al. Cholesterol catalyses Aβ42 aggregation through a heterogeneous nucleation pathway in the presence of lipid membranes. Nature Chemistry. 10, 673-683 (2018).
  28. Sweers, K. K. M., Stöckl, M., Bennink, M. L., Subramaniam, V. Characterizing nanoscale morphologic and mechanical properties of α-Synuclein amyloid fibrils with atomic force microscopy. Bio-nanoimaging: Protein Misfolding & Aggregation. Uversky, V. N., Lyubchenko, Y. L. , London, UK. 309-322 (2014).
  29. Goldsbury, C., et al. Amyloid structure and assembly Insights from scanning transmission electron microscopy. Journal of Structural Biology. 173, 1-13 (2011).
  30. Knowles, T. P. J., Smith, J. F., Devlin, G. L., Dobson, C. M., Welland, M. E. Analysis of structural order in amyloid fibrils. Nanotechnology. 18, (2007).
  31. Knowles, T. P. J., Mezzenga, R. Amyloid fibrils as building blocks for natural and artificial functional materials. Advanced Materials. , 6546-6561 (2016).
  32. Knowles, T. P. J., Oppenheim, T. W., Buell, A. K., Chirgadze, D. Y., Welland, M. E. Nanostructured films from hierarchical self-assembly of amyloidogenic proteins. Nature Nanotechnology. 5, 204-207 (2010).
  33. Knowles, T. P. J., Smith, J. F., Craig, A., Dobson, C. M., Welland, M. E. Spatial persistence of angular correlations in amyloid fibrils. Physical Review Letters. 96, 1-4 (2006).
  34. Knowles, T. P. J., et al. Twisting transition between crystalline and fibrillar phases of aggregated peptides. Physical Review Letters. 109, 158101 (2012).
  35. Knowles, T. P., et al. Role of intermolecular forces in defining material properties of protein nanofibrils. Science. 318, 1900-1903 (2007).
  36. Smith, J. F., Knowles, T. P. J., Dobson, C. M., MacPhee, C. E., Welland, M. E. Characterization of the nanoscale properties of individual amyloid fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 15806-15811 (2006).
  37. Sokolov, D. V. Atomic force microscopy for protein nanotechnology. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 300, 323-367 (2013).
  38. Ruggeri, F. S., et al. Influence of the β-sheet content on the mechanical properties of aggregates during amyloid fibrillization. Angewandte Chemie - International Edition. 54, 2462-2466 (2015).
  39. Jeong, J. S., Ansaloni, A., Mezzenga, R., Lashuel, H. A., Dietler, G. Novel mechanistic insight into the molecular basis of amyloid polymorphism and secondary nucleation during amyloid formation. Journal of Molecular Biology. 425, 1765-1781 (2013).
  40. Adamcik, J., Mezzenga, R. Study of amyloid fibrils via atomic force microscopy. Current Opinion in Colloid and Interface Science. 17, 369-376 (2012).
  41. Deguire, S. M., et al. N-terminal huntingtin (Htt) phosphorylation is a molecular switch regulating Htt aggregation, helical conformation, internalization, and nuclear targeting. Journal of Biological Chemistry. , (2018).
  42. Ruggeri, F. S., et al. Nanoscale studies link amyloid maturity with polyglutamine diseases onset. Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).
  43. Adamcik, J., et al. Understanding amyloid aggregation by statistical analysis of atomic force microscopy images. Nature Nanotechnology. 5, 423-428 (2010).
  44. Lin, Y. C., Komatsu, H., Ma, J., Axelsen, P. H., Fakhraai, Z. Quantitative analysis of amyloid polymorphism using height histograms to correct for tip convolution effects in atomic force microscopy imaging. RSC Advances. 6, 114286-114295 (2016).
  45. Mannini, B., et al. Stabilization and characterization of cytotoxic Aβ40 oligomers isolated from an aggregation reaction in the presence of zinc ions. ACS Chemical Neuroscience. , (2018).
  46. Medalsy, I., Hensen, U., Muller, D. J. Imaging and quantifying chemical and physical properties of native proteins at molecular resolution by force-volume AFM. Angewandte Chemie - International Edition. 50, 12103-12108 (2011).
  47. Dufrêne, Y. F., Martínez-Martín, D., Medalsy, I., Alsteens, D., Müller, D. J. Multiparametric imaging of biological systems by force-distance curve–based AFM. Nature Methods. 10, 847-854 (2013).
  48. Takai, E., et al. Scanning electron microscope imaging of amyloid fibrils. American Journal of Biochemistry and Biotechnology. 10, 31-39 (2014).
  49. Dazzi, A., et al. AFM-IR: Combining atomic force microscopy and infrared spectroscopy for nanoscale chemical characterization. Applied Spectroscopy. 66, 1365-1384 (2012).
  50. Volpatti, L. R., et al. Micro- and nanoscale hierarchical structure of core-shell protein microgels. Journal of Materials Chemistry B. 4, 7989-7999 (2016).
  51. Galante, D., et al. A critical concentration of N-terminal pyroglutamylated amyloid beta drives the misfolding of Ab1-42 into more toxic aggregates. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 79, 261-270 (2016).
  52. Ruggeri, F. S., et al. Identification of oxidative stress in red blood cells with nanoscale chemical resolution by infrared nanospectroscopy. International Journal of Molecular Sciences. 19, 1-14 (2018).
  53. Ramer, G., Ruggeri, F. S., Levin, A., Knowles, T. P. J., Centrone, A. Determination of polypeptide conformation with nanoscale resolution in water. ACS Nano. 12 (7), 6612-6619 (2018).
  54. Dazzi, A., Prater, C. B. AFM-IR: Technology and applications in nanoscale infrared spectroscopy and chemical imaging. Chemical Reviews. 117, 5146-5173 (2017).
  55. Lahiri, B., Holland, G., Centrone, A. Chemical imaging beyond the diffraction limit: experimental validation of the PTIR technique. Small. 9 (3), 439-445 (2013).
  56. Ansaloni, A., et al. One-pot semisynthesis of exon 1 of the huntingtin protein: New tools for elucidating the role of posttranslational modifications in the pathogenesis of Huntington’s disease. Angewandte Chemie - International Edition. 53 (7), 1928-1933 (2014).
  57. Khalaf, O., et al. The H50Q mutation enhances α-synuclein aggregation, secretion, and toxicity. Journal of Biological Chemistry. 289, 21856-21876 (2014).
  58. Hellstrand, E., Boland, B., Walsh, D. M., Linse, S. Amyloid β-protein aggregation produces highly reproducible kinetic data and occurs by a two-phase process. ACS Chemical Neuroscience. 1, 13-18 (2010).
  59. Limbocker, R., et al. Trodusquemine enhances Aβ42 aggregation but suppresses its toxicity by displacing oligomers from cell membranes. Nature Communications. 10 (1), 225 (2019).
  60. Lu, F., Belkin, M. A. Infrared absorption nano-spectroscopy using sample photoexpansion induced by tunable quantum cascade lasers. Optics Express. 19, 1902-1904 (2011).
  61. Jiao, Y., Schäffer, T. E. Accurate height and volume measurements on soft samples with the atomic force microscope. Langmuir. 20, 10038-10045 (2004).
  62. Müller, D. J., Engel, A. The height of biomolecules measured with the atomic force microscope depends on electrostatic interactions. Biophysical Journal. 73, 1633-1644 (1997).
  63. Heymann, J. B., Moller, C., Muller, D. J. Sampling effects influence heights measured with atomic force microscopy. Journal Of Microscopy-Oxford. 207, 43-51 (2002).
  64. Marinello, F., Balcon, M., Schiavuta, P., Carmignato, S., Savio, E. Thermal drift study on different commercial scanning probe microscopes during the initial warming-up phase. Measurement Science and Technology. 22, 9 (2011).
  65. Marinello, F., Bariani, P., De Chiffre, L., Savio, E. Fast technique for AFM vertical drift compensation. Measurement Science and Technology. 18, 689-696 (2007).
  66. Ricci, D., Braga, P. C. Recognizing and avoiding artifacts in AFM imaging (Clifton, N.J.). Methods in Molecular Biology. 242, 25-27 (2004).
  67. Canale, C., Torre, B., Ricci, D., Braga, P. C. Recognizing and avoiding artifacts in atomic force microscopy imaging. Atomic Force Microscopy in Biomedical Research. Braga, P. C., Ricci, D. 736, Humana Press. New York, NY. 31-43 (2011).
  68. Marinello, F., Carmignato, S., Voltan, A., Savio, E., De Chiffre, L. Error Sources in Atomic Force Microscopy for Dimensional Measurements: Taxonomy and Modeling. Journal of Manufacturing Science and Engineering. 132, 030903 (2010).
  69. Ukraintsev, E., Kromka, A., Kozak, H., Reme, Z., Rezek, B. Artifacts in Atomic Force Microscopy of Biological Samples. Atomic Force Microscopy Investigations into Biology - From Cell to Protein. Frewin, C. L. , (2012).
  70. Tsukruk, V. V., Singamaneni, S. Scanning Probe Microscopy of Soft Matter: Fundamentals and Practices. , Wiley-VCH Verlag GmbH. Weinheim, Germany. (2011).

Tags

Biokemi amyloid neurodegeneration protein aggregering atomkraft mikroskopi infraröd nanospektroskopi enkel molekyl analys spektroskopi
Karakterisera enskilda protein aggregat med infraröd Nanospektroskopi och atomkraft mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ruggeri, F. S., Šneideris, T.,… More

Ruggeri, F. S., Šneideris, T., Chia, S., Vendruscolo, M., Knowles, T. P. J. Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (151), e60108, doi:10.3791/60108 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter