Biochemistry

적외선 나노 스펙트로펙트 및 원자력 현미경으로 개별 단백질 응집체 특성화

Published: September 12, 2019 doi: 10.3791/60108

Francesco Simone Ruggeri¹, Tomas Šneideris^1,2, Sean Chia¹, Michele Vendruscolo¹, Tuomas P. J. Knowles^1,3

¹Centre for Misfolding Diseases, Department of Chemistry, University of Cambridge, ²Institute of Biotechnology, Life Sciences Center, Vilnius University, ³Cavendish Laboratory, Department of Physics, University of Cambridge

Summary

우리는 개시 및 발달과 밀접하게 연관되는 올리고머 응집체 및 아밀로이드 섬유로 단백질 자기 조립의 과정을 구상하기 위하여 적외선 나노 스펙트로스카 및 고해상도 원자력 현미경 검사법의 응용을 기술합니다 인간의 신경 퇴행성 질환의 넓은 범위의.

Abstract

단백질 오접기 및 응집 현상은 알츠하이머병및 파킨슨 병과 같은 신경 퇴행성 조건과 관련된 고이질성 단백질 응집체의 형성을 초래합니다. 특히 낮은 분자량 응집체, 아밀로이드 올리고머는 일반적인 세포 독성 특성을 가지고 있는 것으로 나타났으며 많은 형태의 치매에서 신경 독소로 연루되어 있습니다. 우리는 기존의 구조적 을 사용하여 연구하기 어려운 이러한 응집체의 형태학적, 구조적 및 화학적 특성을 특성화하는 어려운 과제를 해결하기 위해 원자력 현미경 검사법 (AFM)을 기반으로하는 방법의 사용을 설명합니다. 이질성과 일시적인 성질 때문에 방법 또는 대량 생물 물리학적 방법. 스캐닝 프로브 현미경 접근법은 이제 나노미터 이하의 분해능으로 아밀로이드 응집체의 형태를 조사할 수 있습니다. 우리는 동시에 AFM의 높은 해상도와 IR 분광법의 화학 인식 능력을 악용 적외선 (IR) 나노 스펙트로스법 (AFM-IR)이 더 나아가 개인의 구조적 특성의 특성화를 가능하게 할 수 있음을 보여줍니다 따라서 응집 메커니즘에 대한 통찰력을 제공합니다. 우리가 설명하는 접근은 작은 분자 및 항체를 가진 단백질 집합의 상호 작용의 조사에또한 적용될 수 있기 때문에, 진단하거나 취급하기 위하여 새로운 치료 화합물을 개발하기 위하여 근본적인 정보를 제공할 수 있습니다 신경 퇴행성 질환.

Introduction

전 세계적으로 4천만 명 이상이 현재 알츠하이머(AD)^1및 파킨슨병(PD)^2질환과 같은 신경퇴행성 질환의 영향을 받고 있습니다. 더 일반적으로, 50개 이상의 병리학은 단백질 오측 및 응집과 분자 수준에서 연관되며, 아밀로이드 침전물로 알려진 불용성 섬유소 단백질 응집체의 증식을 유도하는^과정3, ⁴. 신경 변성의 분자 기원과 아밀로이드 형성으로 이어지는 단백질의 단백질 형태 변화와의 연관성은 이질성, 일시적 성질 및 나노 스케일의 높은 수준 때문에 많은 부분에서 불분명하게 남아 있습니다. 병리학 적 응집체 의 크기^4,⁵.

지난 수십 년 동안 단백질 구조에 대한 매우 성공적인 조사는 X 선 결정학, 극저온 전자 현미경 및 핵 자기 공명 분광법을 포함한 벌크 방법의 사용에 널리 기반을 두고 있습니다⁵^, ^6개 ^, ^7명 ^, ^8개 ^, ⁹. 이러한 종류의 기술 내에서 적외선 (IR) 분광법은 단백질^8과같은 생물학적 시스템의 화학적 특성을 해명하는 민감한 분석 도구로 부상했습니다. IR 방법은 잘못 접고 응집하는 동안 단백질 이차 및 사분의 구조적 변화의 정량화를 허용합니다. 또한, 미세한 수준에서 더 해독하기 위해 그들의 응집 동안 단백질의 복잡한 자유 에너지 풍경에 관여하는 기계적 세부 사항은, 복잡한 으로 확장하는 화학 역학 도구의 개발이 주요 진전되었습니다. 아밀로이드 섬유형성^5,^6,^7,^10,^11,^12를포함한 자가 조립 경로. 그러나 대량 분광 방법은 용액에 존재하거나 특정 현미경 단계에 관여하는 종의 이기종 앙상블에 대한 평균 정보만 제공하므로 개인의 생물 물리학적 특성에 대한 조사가 가능합니다. 나노 규모 수준에서 도전 집계 종^13,^14.

빛의 회절 한계보다 작은 저울에서 작동 할 수있는 능력을 가진 여러 현미경 기술이 지난 수십 년 동안 등장했습니다. 방법의 이 부류는 전자 현미경 검사법 (EM) 및 원자력 현미경 검사법 (AFM)를 포함합니다. 주사 전자 현미경 (SEM) 및 전송 전자 현미경 검사법 (TEM)은 표본의 2 차원 (2D) 심상을 제공하는 동안, AFM은 3 차원 (3D) 형태를 연구하는 강력하고 다양한 기술로 지난 수십 년 동안 등장했습니다. 뿐만 아니라 하위 나노 미터 해상도^13,^14,^15,^16,¹⁷^,^18,^19와샘플의 나노 기계적^{특성으로,} ^20개 ^, ^21세 ^, ^22세 ^, ^23세 ^, ^24세 ^, ^25개 ^, ^26세 ^, ²⁷. AFM을 통한 단백질 응집을 연구하는 근거는 이 접근법이 용액^13,^14,^16에존재하는 개별 종의 형태를 조사할 수 있다는 것입니다. ¹⁷^,¹⁹^,^20,^21,25 ,²⁷^,²⁸^,²⁹^,³⁰^, ³¹^,³²^,³³^,³⁴^,³⁵^,³⁶^,³⁷. 특히, 시료를 시간의 함수로 모니터링함으로써, AFM은 시료 내 종의 형태학적 진화에 대한 조사를 가능하게 하며, 이는 아밀로이드^{형성(23)의}경로를 따르고 시각화할 수 있게^한다. ²⁵^,³⁸^,³⁹^,⁴⁰^,⁴¹^,⁴². 또한 AFM은 용액^13,^19,^30,^{31에 존재하는 개별 종의 단면 높이 및 길이와 같은 구조적 파라미터의 정량화를 가능하게 합니다.} ^,³²^,³³^,³⁴^,³⁵^,³⁶^,³⁷^,⁴⁰^,⁴³^, ^44세 ^, ^45세 ^, ^46세 ^, ^47세 ^, ⁴⁸. 그러나 형태학과 같은 단일 생물 물리학적 특성에 대한 연구는 종종 이기종적이고 복잡한 생물학적 체계를 연구할 때 충분하지 않다. AFM, SEM 또는 TEM 이미징 방법만으로는 나노 스케일에서 아밀로이드 응집체의 이질적인 종의 화학적 특성을 쉽게 드러내지 않습니다.

이 규모의 이질성 생물학적 시료의 분석을 위한 주요 진전은 최근 적외선 나노스펙트로스프로그(AFM-IR)^24,^{26, 24, 26의}단백질 응집 분야에 대한 개발 및 적용으로 이루어졌습니다. ³⁸^,⁴²^,⁴⁹^,⁵⁰^,⁵¹^,⁵². 이 혁신적인 방법은 AFM(~1−10 nm)의 공간 분해능과 IR의 화학적 분석 능력을 결합합니다. AFM-IR 기술은 IR 레이저에 의해 구동되는 광열 유도 공진 효과의 측정및 AFM 팁에 의한 조사 중인 시료의 열 팽창 측정을 기반으로 합니다. 샘플은 기존의 적외선 분광법^24,^42,^52,^{53과 마찬가지로 총 내부 반사에서 상부 또는 아래에서 직접 IR 레이저에 의해 조명 될 수 있습니다.}. IR 레이저는 수백 킬로헤르츠(1-1000 kHz)의 순서로 일반적인 주파수로 펄스할 수 있으며 일반적으로 1000-3300^cm-1사이의 넓은 스펙트럼 범위에서 튜닝될 수 있습니다. 레이저 소스가 ~ 30 μm 직경의 영역을 커버하지만, AFM-IR 기술의 공간 해상도는 시스템의 국부적 열 팽창을 감지하는 AFM 팁 직경에 의해 명목상으로 결정됩니다. AFM-IR은 IR 신호가 최대 1-1.5 μm의 두께에 비례하기 때문에 생물학적 샘플을 연구하는 데 적합하며, 생성된 IR 스펙트럼은 일반적으로 해당 FTIR 전송 스펙트럼^13,^{54와 일치합니다.} ^,⁵⁵. 이러한 이유로, 분광학에서 확립된 분석 방법은 제2 유도체^분석에의한 화학적 변화, 대역 형상 변화 및 탈컨볼에 대한 연구와 같은 용이하게 적용될 수 있다. 전반적으로 AFM의 공간 분해능과 IR 분광법의 화학적 인식 력을 결합한 AFM-IR은 나노 스케일에서 시료의 다양한 형태학적, 기계적 및 화학적 특성을 동시에 수집할 수 있게 합니다.

여기서, 우리는 시험관 내 형광 분석법, 고해상도 AFM 이미징 및 나노 스케일 AFM-IR의 조합을 이용하는 단백질 응집 과정의 특성화를 위한 프로토콜을 설명한다. 이 결합된 접근법은 이미 단백질 응집체에 의해 형성된 개별 미세 방울의 화학적 및 구조적 특성을 연구하고, 액체-액체 단백질 상 분리에 대한 연구에서 상세한 결과를 제공하는 데 탁월했습니다. 나노 규모^23,^26,³⁸,⁴⁵^,⁵⁰^,^53에서개별 집계 종의 이질성 및 생물 물리학적 특성을 조사 ⁵⁶^,⁵⁷.

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Protocol

1. 형광 판 판독기에 대한 집계 어설션

참고: 여기에 설명된 프로토콜은 화학 역학에 의한 임의의 단백질 또는 펩티드의 응집을 연구하는 방법의 예이다. 특히, 알츠하이머병^58,^59의발병 및 진행에 관여하는 Aβ42 펩티드의 응집을 연구하기 위한 최적화된 프로토콜을 설명한다. 유사한 프로토콜은 임의의 단백질 또는 펩티드의 응집을 연구하는 쪽으로 조정되고 채택될 수 있다.

Aβ42를 함유하는 단백질 분획을 구별하고, Aβ42의 다른 응집형태로부터 단모분획을 분리하기 위해 이온 교환 및 크기 배제 크로마토그래피 기술을 통해 Aβ42의 고순도 단일모모메액을^{획득하여 58을} 얻었다. ^, ⁵⁹.
Aβ42 펩티드를 20 mM 나트륨 인산염 완충액에서, 200 μM EDTA에서 pH 8.0^58에서 1-5 μM, 1.5 mL 저결합 튜브에서 원하는 최종 농도로 희석시켰다. AFM 측정을 위해 수집된 샘플은 AFM 분석을 위한 샘플 증착 중에 아티팩트를 도입할 수 있으므로 응집 분석(티오플라빈 T, ThT)에 사용되는 형광 염료를 포함하지 않아야 합니다. 따라서, 두 개의 동일한 해결책의 삼중체를 준비: i) AFM에 의한 응집 과정을 따르기 위해 단일성 Aβ42를 함유하는 제1; ii) 20 μM ThT를 첨가하여 Aβ42 단면제를 함유하는 제2는 응집의 역학을 모니터링하는 트레이서로서.
참고: 얼음에 1.1단계와 1.2단계를 수행하는 것이 중요합니다. 이 절차는 단일성 Aβ42 용액이 플레이트 리더에서 개시될 때까지 응집되지 않도록 하는 것이다. 시료를 취급할 때 단백질 샘플에 영향을 줄 수 있는 기포가 발생하지 않도록 주의깊게 파이펫팅하는 것이 필수적입니다.
명확한 바닥과 비 바인딩 표면 검은 폴리스티렌의 96 웰, 반 영역 플레이트의 각 우물에서 각 샘플의 피펫 80 μL.
응집 과정에서 시료의 증발을 최소화하기 위해 호일로 플레이트를 밀봉합니다.
플레이트 리더의 온도를 37°C로 평형화합니다.
440 nm의 여기 파장과 480 nm의 방출 파장에서 고정 된 시간 간격으로 형광 측정을 읽을 응집 프로토콜을 설정합니다. 집계는 정지 조건에서 시작해야 합니다.
플레이트를 플레이트 판독기에 삽입합니다.
참고: 플레이트 판독기를 시작하기 전에 집계가 트리거되지 않도록 플레이트를 처리하는 동안 주의해야 합니다. 게인 조정 설정을 사용하여 각 샘플의 형광을 최적 판독할 수 있습니다.
측정을 시작합니다.
참고: 응집 실험은 ThT 형광 시그모이드 곡선이 고원에 도달하면^58로결론지을 수 있습니다.

2. AFM 및 나노 IR 측정을위한 샘플 준비

접착 탭 또는 양면 테이프를 사용하여 고품질 자기 스테인레스 스틸 디스크에 최고 품질의 V1 운모 디스크를 붙입니다.
운모 표면에 접착 테이프 조각을 놓고 운모의 상단 층을 당겨 에칭 운모. 이 절차는 샘플 증착에 적합한 깨끗하고 원자적으로 평평한 표면을 생성합니다.
참고: 에칭된 표면은 균일하고 매끄러워야 합니다.
주의: 새로 에칭된 운모 바로 위에 닿거나 호흡하지 마십시오.
단백질의 응집 과정 동안 관심 있는 시간을 수집하기 위해 플레이트 판독기 측정을 일시 중지/중지합니다.
밀봉 호일을 제거하고 1.5 mL 로우 바인드 튜브로 잘에서 ThT없이 샘플의 10 μL aliquot를 수집합니다.
갓 에칭된 운파에 시료의 10 μL을 증착합니다. AFM-IR 측정시 샘플은 새로 벗겨진 금 기판에 증착되어야 합니다.
1 분 동안 운모에 용액을 배양하여 물리 살균을 허용합니다.
참고: 배양 시간이 길면 표면에 더 나은 흡수가 허용되지만 인공적인 자기 조직 및 자체^{조립(25)을}유도할 수 있다. 이러한 효과를 피하기 위해, 스프레이^{증착은 25.}
1 mL의 초순수로 3회 헹구어 보시기
공기 환경에서 시료를 측정하기 위해 질소의 부드러운 흐름 하에서 건조하십시오.

3. 단백질 응집체의 형태학의 AFM 화상 진찰

참고: 형태학 측정은 접촉 모드와 동적 모드에서 모두 수행할 수 있으며, 다음 단계에서는 고분해능으로 시료의 3D 형태를 측정하기 위해 횡력을 감소시키기 때문에 후자가 설명합니다. AFM-IR 측정은 접촉 모드에서 수행되어 AFM-IR 신호 대 잡음 비율을 향상시킵니다.

시스템이 열 안정성에 도달할 수 있도록 측정 하기 전에 적어도 30 분 전에 AFM 시스템을 켭니다. 설정을 클릭한 다음 프로브를 클릭합니다. 프로브 변경 창에서 다음을 클릭하여 Z, 포커스 스테이지를준비합니다.
AFM 빔 스위치를 끕니다(전원이 켜져 있는 경우). 도브 테일 잠금 의 잠금을 해제, 시스템에서 머리를 분리하고 다음을 클릭 프로브 변경 창에서.
AFM 캔틸레버를 프로브 홀더에 장착합니다. 헤드를 시스템에 연결하고 도브테일 잠금 장치를 잠급니다.
참고 : 동적 모드에서 생물학적 샘플을 연구하는 최적의 캔틸레버 AFM은 2-40 Nm^-1 사이의 스프링 상수와 2-8 nm¹⁴사이의 정점 반경을 가지고 있습니다.
AFM 레이저 빔 스위치를 켜고 프로브 변경 창을 클릭다음을클릭합니다.
캔틸레버 유형이 변경되지 않은 경우 팝업 창에서 아니요를 클릭합니다. 광 정렬 노브를 조정하여 캔틸레버를 찾습니다. 캔틸레버에 초점을 조정하고 다음을클릭합니다.
팝업 창에서 초점이 캔틸레버에 있는 경우 예를 클릭합니다.
검출 레이저의 노브 제어 위치를 사용하여 캔틸레버 끝에 레이저 빔을 배치합니다. 4사분면 포토다이오드에 의해 측정된 총 신호를 적어도 >1 V로 최대화하여 위치 민감광다이오드(PSPD)에 편향된 레이저 빔의 위치를 제어하는 노브를 사용한다. 프로브 에서 창 변경 다음을 클릭 한 다음 닫기.
캔틸레버가 열 안정성에 도달할 때까지 15분 동안 기다립니다. 필요한 경우 PSPD에서 편향된 레이저 빔의 위치를 재조정합니다.
NCM SWEEP을클릭하고 원하는 진동 진폭을 선택하고 사용 단계를클릭하고 자동을 클릭하고 캔틸레버를 진동의 첫 번째 무료 공진의 최대값에 가깝게 조정하십시오. 40 N m^-1의스프링 상수와 캔틸레버.
참고 : 캔틸레버를 자유 공진의 최대값으로 튜닝하면 측정 값^14의안정성이 높아지도록 보장됩니다.
샘플을 샘플 홀더에 놓습니다. 적합한 이미징 매개 변수를 선택합니다. 일반적인 스캐닝 속도는 1 x 1 μm² ~ 5 x 5 μm^2의스캔 영역에 대해 0.3-1.0 Hz입니다. 일반적인 해상도는 256 x 256에서 1024 x 1024 픽셀 사이입니다. 스캔 영역을 클릭하여 스캔 크기와 픽셀 번호를 선택합니다.
샘플에 광학 뷰를 초점을 맞춥니다. 샘플 표면에 접근하려면 접근 방식을 클릭합니다. 접근법이 완료되면 100 μm 리프트를 클릭하여 시료의 표면 위에 AFM 팁 100 μm를 상승시다. 샘플의 광학 이미지 확장을 클릭합니다. 포커스 스테이지 막대를 클릭하여 샘플 표면에 뷰에 초점을 맞춥니다.
화살표를 사용하여 관심 있는 샘플 의 영역에서 이동합니다. 접근 버튼을 눌러 표면을 맞대고 있습니다. 선 스캔 버튼을 클릭하고 팁이 표면을 잘 따르는지 확인(필요한 경우 설정점을조정).
스캔 버튼을 눌러 샘플 표면 이미징을 시작합니다. 이미징 중에 큰 이미징 력을 피하고 독립적 인 샘플 내에서 일관성을 유지하기 위해 Δ20 °^42를초과하지 않는 위상 변화의 일정한 정권을 유지하십시오.
파일 이름을 입력하고 수집한 이미지가 저장될 기본 디렉토리를 선택합니다.

4. 단백질 응집체의 적외선 나노 스펙트로스내시경 측정

열 안정화를 위해 측정하기 전에 AFM-IR 시스템과 적외선(IR) 레이저^60-60분 전에 켭니다. AFM-IR 계측기의 일반적인 레이저는 광학 파라미터 발진기(OPO) 및 양자 캐스케이드 레이저(QCL)입니다.
내장 소프트웨어를 열어 계측기를 제어합니다. 파일을 클릭한 다음 새 파일을 클릭하여 새 nanoIR 파일을 엽니다. AFM-IR 시스템을 시작하려면 버튼 초기화버튼을 누릅니다.
계측기 커버를 열고 AFM-IR 시스템에 장착할 수 있는 실리콘 골드 코팅 프로브는 공칭 반경 30nm, 스프링 상수 0.2 N/m의 실리콘 골드 코팅 프로브를 사용하여 접촉 모드에서 시료를 측정합니다.
섹션 AFM 프로브에서 로드를 클릭한 다음 다음. 프로브 섹션에 초점에서 캔틸레버에 카메라를 초점을 화살표를 클릭합니다. 섹션 샘플 XY 이동에서화살표를 사용하여 캔틸레버 끝에 교차 공기를 배치합니다.
검출 레이저의 위치를 제어하는 노브를 회전하여 캔틸레버 끝에 레이저를 배치합니다. 레이저 노브를 회전하여 4사분면 포토다이오드로 측정된 합계를 값 >3 V로 감지하고 최대화하여 굴절 노브를 회전시켜 캔틸레버 편향을 -1V로 조정한 다음 다음을클릭합니다. 기기 덮개를 닫습니다.
샘플에 초점을 맞추는 섹션에서 화살표를 사용하여 샘플에 카메라를 초점을 맞춥니다. 그런 다음, 섹션 샘플XY 운동에서 화살표를 사용하여 샘플의 관심 영역으로 이동하고 접근 방식을 클릭하고 참여합니다.
현미경 창에서 샘플의 생물 물리학적 특성을 매핑하기 위해 관심 채널을 입력으로 선택합니다. 특히 형태에 대한 높이, IR 흡수를 위한 진폭 2 및 PLL 주파수를 선택하여 팁 샘플 접촉 공진을 매핑합니다.
컨트롤 창의 AFM 스캔 섹션에서 섹션 3과 유사한 매개 변수를 사용합니다(즉, 스캔 속도 0.1-1.0 Hz, 256 x 256 및 1024 x 1024 픽셀 사이). 샘플 거칠기에 따라 이득값으로 선택합니다: 적분 I = 1-10 및 비례 P = 10−30. 그런 다음 스캔을 클릭하여 형태지도를 획득합니다.
참고: 형태는 동적 태핑 모드에서 유사하게 측정할 수 있지만, AFM-IR 측정은 접촉 모드에서 더 높은 신호 대 잡음 비를 갖기 위해 여기에서 수행됩니다.
형태 매핑이 완료되면 현미경 창에서 높이 맵을 클릭하여 프로브를 하나의 집계 위에 배치합니다. 그런 다음 컨트롤 창의 nanoIR 섹션에서 IR 시작을 클릭하여 IR 레이저로 샘플을 조명합니다.
캔틸레버에 적외선 레이저를 집중하려면 최적화를클릭하십시오. 이 창에서 샘플의 흡광도가 높은 곳에 웨이브넘을 작성하고 추가를클릭합니다. 단백질의 경우, 일반적인 값은 1655 cm^-1이다. 스캔을 클릭하여 IR 레이저 위치를 찾고 업데이트를 클릭하여 캔틸레버에 해당 위치를 정렬합니다. 창을 닫습니다.
나노IR 설정의 섹션 일반에서, 상대 필드에서 높은 흡광도가 예상되는 파수를 작성합니다. 그런 다음 밴드 패스 필터 옵션을 비활성화하고 미터 판독값과 캔틸레버 응답의 빠른 푸리에 변환(FFT)을 봅니다. FFT 창에서 녹색 커서를 이동하여 캔틸레버의 공진 주파수를 읽습니다. 캔틸레버의 공진에 대한 FFT의 전형적인 값은 약 300 kHz입니다. 이 공진 주파수 값을 주파수 중심 필드의 일반 섹션에 작성하고 50kHz의 주파수 창을 사용합니다.
참고: 미터 판독값을 포화시키지 않고 캔틸레버 반응에서 왜곡이 있고 샘플을 과열시키지 않을 만큼 충분히 낮은 레이저 파워를 선택합니다.
공명 향상 모드를 사용하려면 레이저 펄스 조정 창을 클릭합니다. 300kHz의 주파수 중심, 50kHz의 튜닝 범위, 5%의 레이저 듀티 사이클을 선택합니다. 레이저의 펄스 속도를 청소하기 위해 획득을 클릭합니다. 그래프에서 커서를 사용하여 레이저 펄스를 IR 빛을 흡수하는 샘플의 열 팽창의 기계적 반응 주파수로 조정합니다. 그런 다음 PLL 옵션을 선택하여 샘플과 팁 사이의 접촉 공진을 모니터링합니다. PLL 창에서 제로 버튼을 누르고 틱을 사용하여 샘플 팁 접촉 공진을 추적할 수 있습니다. 정수 게인 I = 0.5 및 비례 게인 P = 10을 선택합니다. 창을 닫습니다.
다시 최적화 창을 열고 샘플의 주요 흡광대(amide band I-II-III)에 대응하는 3파중 및 레이저의 각 칩에 대해 적어도 하나의 파수에 대해 IR 레이저의 위치를 찾습니다.
도구 | 클릭 IR 배경 교정 | 새. 창에서 관심 분광 영역을 선택 (단백질 샘플을 연구하기 위해 1800-1200^cm-1); 4.12 단계에서 결정된 것과 동일한 펄스 속도와 5%의 듀티 사이클을 선택합니다. 빠른 수집을 클릭하고 레이저 속도를 선택, 양자 캐스케이드 레이저에 대한 일반적인 범위는 20-500cm^-1사이입니다. IR 레이저 배경을 측정하기 위해 취득을 클릭합니다. 이 배경 스펙트럼은 측정된 나노스케일 국부화 스펙트럼의 정상화에 사용됩니다. 창을 닫습니다.
참고: 빠른 레이저 및 공진 강화 모드를 사용할 수 없는 경우 4.12 단계를 건너뛰고 배경 및 IR 스펙트럼 수집 창모두에서 빠른 스펙트럼 대신 단계별 스펙트럼을 선택합니다. 그러나 단일 집계 감도에 도달하지 않습니다.
IR 스펙트럼 설정에서 1-4cm^-1 사이의 IR 스펙트럼 해상도와 최소 64x의 공동 평균 수를 선택합니다. 획득을 클릭하여 단백질 범위(1800-1200^cm-1)에서나노스케일 국부화된 IR 스펙트럼을 측정하였다.
나노 스케일 해결 된 화학지도를 획득하려면 IR 이미징 옵션을 선택하고 관심있는 파수 (예 : amide band I의 경우 1655cm^-1)를 선택하고 AFM 스캔 창에서 스캔을 클릭합니다.
매핑이 완료되면 파일로 이동하여 측정값을 저장합니다. 형태, 접촉 공명 및 화학뿐만 아니라 나노 스케일 지역화 스펙트럼의 획득 된지도를 분석하려면 내장 된 AFM 이미지 처리 소프트웨어를 사용합니다. 스펙트럼 및 이미지는 상용 소프트웨어로 더 자세한 분석을 위해 .csv 또는 .axz 파일로 저장할 수 있습니다.

5. 단면 치수의 이미지 처리 및 분석

내장 된 AFM 이미지 처리 소프트웨어 또는 상용 소프트웨어를 사용하여 원시 이미지^14,^17,^19,^41,^42,^59를 평평하게합니다.
참고: 분석 의 유물과 측정된 높이의 과소 평가를 피하기 위해 집계를 계산에서 마스키해야 합니다.
이미지를 0순서 평면 맞춤 빼기로 병합합니다.
평면별로 이미지를 평평하게 한 다음^1st 회귀 순서로 선별로 이미지를 병합한 다음 두 번째 단계는 이미지의 선 프로파일의 플랫 베이스라인에 도달할 때까지 반복됩니다.
샘플이 매우 혼잡한 경우, 매우 높은 응집체 또는 스캐너 활 유물이 존재, 2^nd 회귀 순서 적합을 사용하여 이미지를 평평하게 포함.
피브릴 축^14,^17,^19,^41,^42,^59에수직으로 찍은 선 프로파일에서 집계^높이와^폭을측정합니다.
섬유축^14,^17,^19,^41,^42,^59에평행한 섬유방 길이를 측정합니다.

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Representative Results

ThT 형광 분석에 의해 측정된 Aβ42 응집의 대표적인 시간 과정은 도 1에도시되어 있다. 응집 과정은 일반적으로 시그모이드 곡선을 특징으로하며, 여기서 지연 단계가 처음에 관찰되고, 곡선이 평형 정상 상태에 도달하면 고원에 도달하기 전에 가파른 성장 단계가 뒤따릅니다⁶^,⁷ ^, ⁵⁸. 집계 프로세스^58과관련된 분자 세부 사항을 연구하기 위해 고품질 데이터를 생성하는 데 최적화된 집계 프로토콜이 사용되는지 확인하는 것이 필수적입니다.

AFM의 고분해능은 공정의 상이한 시점에서 응집된 종의 형태 및 이질성을 조사할 수 있게 한다. ThT 분석에 의해 모니터링되는 응집 동안, 플레이트 내의 샘플의 aliquots는 AFM 및 나노-IR에 의한 단일 골재 조사를 위해 제조된다(도1). 수동 시료 전처리의 일반적인 공정 흐름은 그림 2에나와 있습니다. 고분해능 및 위상제어 AFM에 의한 시료의 3D 형태 측정이 완료되면, 압전 스캐너의 비선형성을 제거하고 시료의 후처리 분석에서 오차 원을 줄이기 위해 맵이 평평해져 형태학(그림 3). 이어서, 도 4에나타낸 바와 같이 정확하고 민감한 단일 분자 통계 분석을 수행할 수 있다. 3D 형태지도에서 집계 단면 높이, 너비 및 길이 (또는 구형 입자의 경우 직경)를 추출할 수 있으므로 집계 시간 동안 존재하는 뚜렷한 집계 종을 구별하고 특성화 할 수 있습니다. 코스²³^,³⁸. 집계 과정을 조사하는 일반적인 시점은 지연 단계, 성장 단계 및 고원단계(도1)이다. 지연 단계 동안, Aβ42의 단모및 올리고머 종은 주로 존재한다. AFM에 의해 가시화될 때, Aβ42의 단모및 올리고머 종은 전형적으로 구형 입자로 나타나며 직경은 1-15 nm이고 높이는 0.3-2 nm(도1,왼쪽 아래)^38,^39. 길쭉한 프로토필라멘트, 프로토피브릴 및 섬유소의 형성은 Aβ42 응집 시간 코스의 성장 단계에서 볼 수 있다(도 1,하단 중간)^38,^39. 일반적으로 프로토필라멘트는 길이가 수백 나노미터, 높이는 0.5~2nm인 가늘고 긴 특징으로 나타나며, 프로토피브릴은 길이가 1-5nm이고^길이는수백 나노미터로 나타납니다. ³⁹. 고원 단계에서, 섬유는 Aβ42 응집체의 지배적인 종입니다. Aβ42 피브릴은 전형적으로 미분기, 실형 구조로 나타나며, 단면적 직경은 6-10 nm이고 길이는 마이크로미터(도3,오른쪽 아래)인경우^38,^39로나타난다. 놀랍게도, 응집체의 형태학적 특성의 이러한 개략적 표현은 대부분의 응집 단백질 및 펩티드(13,^14)의일반적인 특징이다.

샘플 형태에 대한 조사 후, 나노-IR은 응집 과정에서 존재하는 개별 단백질 골재 종의 화학적 특성을 조사하기 위해 사용될 수 있으며, 공기 중의 나노 스케일 해결 IR 맵과 스펙트럼을 획득하여 네이티브 액체 환경²⁴^,²⁶^,³⁸^,⁴²⁴⁹^,⁵⁰^,⁵¹^,⁵²^. 그림 5는 AFM-IR 설정의 개략적인 그림을 나타낸다. IR 소스는 그림 5a에서와같이 전체 내부 반사 또는 위쪽에서 직접 샘플을 비추는 데 사용됩니다. IR 빛이 샘플에 의해 흡수되는 경우, 존재하는 종의 상응하는 분자 진동 에너지 전환 수준을 자극할 것이다. 진동 에너지는 시료 내부에서 열 가열 형태로 방출되어 시료의 열 팽창을 일으킵니다. 이러한 팽창은 10 nm의 순서로 분해능을 가진 시료와 접촉하는 AFM 팁에 의해 나노스케일에서 측정된다. 각 펄스에서 캔틸레버는 열 팽창을 감지합니다. 특히, 샘플의 빠른 팽창은 샘플과의 접촉에서 캔틸레버를 걷어 차고, 킥 후 캔틸레버가 자연 주파수에서 아래로 울립니다. AFM-IR의 감도를 향상시키기 위해,^{캔틸레버(54)의}진동과 동일한 주파수로 레이저 펄스 주파수를 튜닝할 수 있다. 이 공진 강화 모드에서 작동하려면 일반적으로 1-1000 kHz 사이의 범위에서 작동하는 양자 캐스케이드 레이저와 같은 광범위한 주파수에서 펄스 될 수있는 IR 소스가 필요합니다. 피크 대 피크 진폭과 링다운 신호의 빠른 푸리에 변환, IR 진폭이라고 불리는 원시 캔틸레버 편향은 흡수된 IR 광에 비례합니다. 이러한 신호는 캔틸레버 상단에 초점을 맞춘 빨간색 레이저의 편향을 측정하여 실시간으로 감지됩니다. 화학지도를 획득하기 위해 레이저 파수는 특정 파수로 고정되고 IR 진폭 신호는 지도의 각 지점에서 수집되는 반면, IR 스펙트럼을 획득하는 동안 캔틸레버의 위치는 관심있는 위치에 고정되어 레이저입니다. 파장이 관심의 분광 범위를 따라 휩쓸된다. AFM-IR의 궁극적인 분해능은 그림 6에나타난 바와 같이 약 5 nm의 단면 높이를 가진 단백질 응집체의 화학적 성질을 측정할 수 있게 한다.

그림 1: ThT 형광 및 AFM을 통한 시험관 내 응집 시간 과정의 모니터링.
ThT 형광에 의해 검출된 바와 같이 래그 단계, 성장 단계 및 응집 과정의 고원 단계 동안 채취된 샘플은 고분해능 AFM을 통해 이미지화되었다. 이 그림은 Ruggeri 외^38에서적응되었습니다 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 2: AFM 측정을 위한 기판 제제 및 시료 증착의 개략적 표현.
(A, B) 접착제 테이프를 사용하여 운제 에칭. (C)샘플 증착. (D)샘플 배양. (E)초순수로 시료 헹구. (F)질소의 부드러운 흐름하에서 시료 건조. (G)끝에 날카로운 팁이있는 미세 제작 AFM 캔틸레버를 사용하여 샘플 이미징. (H)아밀로이드 섬유의 처리 된 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: AFM 이미지 처리 절차^42.
각 패널의 상단은 해당 AFM 이미지에 의해 도시된 샘플 표면(빨간색 선)의 프로파일 라인을 표시하고, 아래쪽 부분은 이미지의 모든 픽셀 높이의 히스토그램을 보여 줍니다. (a)이미지 병합 절차 전에 원시 AFM 이미지. (b)AFM 이미지 처리 후 전체 평면을 사용하여 평평해. 섬유질 구조(분홍색)는 평탄화 절차로부터 가려졌다. (c)라인별 병합 절차를 사용하여 처리된 이미지입니다. (d)이미지 처리 절차 후 최종 이미지. 이 수치는 Ruggeri 외^42에서적응되었습니다.

그림 4: AFM 이미지의 단일 집계 통계 분석.
(a)1과 2로 표시된 세브릴라 구조의 높이 와 길이의 추적예. (b)추적 된 섬유및 평균 높이의 섹션그래프. (c)세브릴라 구조의 평균 높이를 나타내는 히스토그램의 예. (d)추적된 섬유1과 2의 정규화된 프로파일이 있는 그래프. (e)정규화된 프로파일 높이 점의 히스토그램 분포. 이 수치는 Ruggeri 외^42에서적응되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: AFM-IR 방법의 기능 원리.
(a)흡수된 IR 광은 시료의 열 팽창을 일으키고, 시료와 접촉하는 AFM 캔틸레버의 기계적 공명을 자극한다. 캔틸레버 진동의 진폭은 IR 흡수에 비례합니다. (b)IR 흡수 맵은 레이저 파장을 고정하면서 샘플상에서 캔틸레버를 스캐닝하여 수득한다. (c)팁 과 접촉 시료는^{샘플(50)의}본질적인 강성에 따라 공진 주파수가 단조롭게 증가하는 결합 스프링의 시스템으로 서 행동한다. (d)국부적인 스펙트럼은 AFM 캔틸레버의 위치를 고정하면서 레이저 파장을 스윕하여 수득된다. (e)단백질의 IR 스펙트럼. (f)요약하자면, AFM-IR은^{나노스케일(26)에서}형태학적, 기계적 및 화학적 특성에 대한 동시 연구를 가능하게 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 6: 단일 아밀로이드 골재의 적외선 나노스펙트(nano-IR).
(a)AFM 형태지도. (b)레이저 공명 피크에서 IR 흡수 맵은 1658cm^-1. (c)피브릴 높이의 단면 치수입니다. (d)fibrillar 구조의 다른 위치에 대한 IR 스펙트럼 (파란색 원이있는 패널 b로 표시) 및 기판 (녹색 원이있는 패널 b에 표시). 골재 구조(단색 검정선)로부터 도출된 평균 순 신호는 평균 피브릴 신호(단색 청색선)로부터 평균 배경 신호(실선 녹색선)를 빼서 얻어졌다. 이 수치는 Ruggeri 외^42에서적응되었습니다.

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Discussion

이 프로토콜의 제1 중요한 단계는 단계 1.1 및 1.2에 기재된 Aβ42 용액의 경우와 같은 단일성 단백질의 제조이다. 고도로 순수한 단일성 용액에서 응집 과정을 시작하는 것이 필수적입니다, 올리고머 또는 응집 종의 존재는 응집 역학의 가난한 재현성 귀착될 수 있기 때문에^58,및 AFM에 있는 유물을 유도하기 위하여 측정 (예를 들어, 섬유종은 집계의 초기 단계에서 분명할 것이며, 이는 데이터의 잘못된 해석으로 이어질 수 있습니다. ThT 형광 분석에 기초한 아밀로이드 형성의 고재현성 역학 데이터, 화학 역학의 마스터 방정식 형식주의와 관련하여^5,^6,^7,Aβ42 응집을 정의할 수 있게 됨 그것의 근본적인 분자 사건의 관점에서 기계장치. 화학 역학은 새로운 응집체가 형성하고 성장할 수 있는 다른 쪽을 고려하여 그들의 거시적인 표현과 아밀로이드 대형의 근본적인 현미경 단계를 연결합니다, 예를 들면 집계 끝 또는 이차에서 신장입니다 골체 표면에 핵형성을 할 수 있습니다. 그러나, 화학적 역학 그 자체로는 단일 분자 방법과의 조합을 요구하는 나노 스케일에서 가능한 핵형성 현상의 시각화를 직접적으로 가능하게 하지 않는다.

이 프로토콜의 두 번째 중요한 단계는 단계 2.2 및 2.6-2.8에 기재된 기판 제제 및 샘플 증착 절차이다. 아티팩트를 피하려면 샘플을 깨끗하고 원자적으로 평평한 표면에 증착해야 합니다. AFM 측정에서 유물없는 고분해능을 달성하기 위해서는 운운의 적절한 에칭이 필수적입니다. 시료 증착 시간또한 매우 중요하며, 배양 시간이 길수록 기판 표면에서 더 나은 흡수가 가능합니다. 그러나, 또한 인공적인 자기 조직 및 자가^{조립(25)을}유도할 수 있으며, 이는 데이터 오인을 초래할 수 있는 유물(예를 들어, 표면 유도 골재 종)을 유도할 수 있다. 또한, 운모 표면은 음전하가 되어 양전하 분자만 쉽게 흡수됩니다. 샘플의 순 전하가 음수이면, 운모의 표면은 더 나은^{피시소퍼레이션(23)을}위해 APTES를 사용하여 긍정적으로 기능화될 수 있다. 미세유체 분무^{증착(25)은} 이러한 효과 및 아티팩트를 피하고 샘플을 단일 단계 및 아티팩트 없는 방식으로 증착하기 위해 이용될 수 있다.

세 번째 중요한 단계는 섹션 3에 설명된 AFM 및 AFM-IR을 통해 샘플 이미징을 위한 적절한 설정 및 이미징 파라미터선택입니다. 시료 이미징에 사용되는 AFM 팁은 고분해능을 달성하고 컨볼루션 효과(팁에 의한 샘플 특징의 확대)를 최소화하기에 충분히 날카롭어야 하며(팁에 의한 샘플 특징의 확대)^14,이는 샘플 이미지의 불확실성을 유발할 수 있다. 이미징 모드, 접촉 또는 동적의 선택도 중요합니다. 기존의 AFM을 통한 시료 이미징의 경우, 후자의 모드가 샘플 손상을 유발하고 측정에 아티팩트를 도입할 수 있는 큰 측면 팁 샘플 마찰력을 유도하기 때문에 접촉 모드보다 동적 모드가 선호됩니다(예: 나노인덴션으로 인한 샘플 높이)^14,^61,^62. 반대로, 접촉 모드는 AFM-IR 신호를 향상시키기 위해 나노-IR을 통한 측정에 바람직하다. 동적 모드에서 측정의 경우, 캔틸레버는 측정의 높은 안정성을 보장하기 위해 진동의 첫 번째 자유 공진의 최대 (태핑 모드) 또는 위의 (비 접촉 모드) 약간 아래에 조정되어야한다^14. 픽셀 수 및 스캔 영역에 의존하는 이미징 해상도는 시편에 존재하는 가장 작은 정도의 디테일을 포착할 수 있을 만큼 충분히 높아야 합니다(예를 들어, 4 x 4 μm² 영역에 대한 1024 x 1024 픽셀)^14,^63. 낮은 이미징 해상도는^{신호(14)의}디지털화 시 수직 및 측면 정보의 손실로 인해 샘플의 이미지에서 왜곡 및 불확실성을 유발할 수 있다. 이미징에 사용되는 스캔 속도는 팁이 표면 특징을 적절하게 따를 수 있을 뿐만 아니라 화학 적 정보를 획득하기에 충분한 시간을 가질 수 있을 만큼 충분히 낮아야 한다^14. 가장 중요한 이미징 매개 변수 중 하나는 이미징 힘입니다. 접촉 모드에서는 낮은 상호 작용력을 사용하여 샘플의 구조를 보존하는 것이 기본적입니다. 동적 모드에서는 뚜렷한 샘플의 형태를 일관되게 비교하기 위해 시료의 에너지 발산을 일정하게 유지해야 합니다. 독립적 인 샘플의 일관된 이미징은 Δ20 °^14,^42를초과하지 않는 위상 변화의 일정한 정권을 유지함으로써 얻을 수 있습니다. 큰 이미징 힘은 샘플 이미지의 왜곡과 불확실성을 유발할 수 있기 때문에 피해야 합니다.

열 변동에 의한 AFM 부품의 팽창 및 수축에 의한 열 드리프트는 샘플^64,^65의이미지에서 왜곡 및 유물을 유발할 수 있다. 수직 방향으로 드리프트는 캔틸레버가 표면의 트랙을 잃고 표면에 충돌할 수 있으며, 측면 방향으로 의 드리프트는 일반적으로 표면 특징과 이미지 왜곡의 연신을 초래하여 시료 피처의 정밀한 측정을 달성할 수 있습니다. 이러한 열 드리프트의 효과는 실험실의 정확한 온도 제어뿐만 아니라 시스템이 안정되거나 빠른 스캔^66,⁶⁷^,^68을 수행하여 충분한 시간 (약 30 분)을 제공함으로써 최소화 할 수 있습니다. ^, ^69세 ^, ⁷⁰.

AFM-IR에 의한 나노-IR 이미징 및 스펙트럼 콜렉션의 품질은 여러 가지 요인에 의해 영향을 받을 수 있으며, 그 중 가장 중요한 요인은 다음과 같습니다: (i) IR 배경에 의한 시료에 대한 IR 신호의 잘못된 분열, (ii) 팁 사이의 나노 기계적 접촉의 큰 변화 및 시료를(iii) 시료의 과다가열로 인해 연화를 일으킨다. 샘플의 IR 스펙트럼을 수집된 배경으로 올바르게 나누려면 동일한 레이저 전력으로 수집하는 것이 중요합니다. 실제로, IR 레이저 배경의 스펙트럼 라인 모양은 레이저의 힘에 따라 달라집니다. 그런 다음, 측정된 화학 물질 정보로 시료의 기계적 특성의 영향을 피하기 위해, 스펙트럼 및 이미지 수집 중에 샘플과 팁 사이의 접촉 공진을 모니터링하고 추적하는 것이 중요합니다. 스펙트럼 수집의 경우, 이상적으로는 고정 접촉 공진으로 레이저를 펄스하는 것으로 충분합니다. 그러나 스펙트럼이 큰 분광 범위에서 획득되면 고강도 피크가 시료와 연화의 강한 가열을 유발하여 팁 시료 접촉 공진을 변경하고 IR 피크 진폭을 인위적으로 감소시킬 수 있습니다. 이러한 이유로 스펙트럼이 시료의 과도한 가열에 의해 영향을 받지 않는지 확인하기 위해 스펙트럼 수집 중에 접촉 공진을 추적하는 것이 중요합니다.

결론적으로, 종래의 AFM 및 나노-IR은 단백질 응집 동안 형성되는 개별 종의 형태학적, 구조적 및 화학적 특성을 고분해서 조사할 수^있다(24,^38). 그러나, 그들은 네이티브 대량 조건에서 형성의 그들의 급속 한 역학을 따라 화학 역학의 능력 부족. 단백질이 응집 및 잘못된 접기 동안 겪는 형태 변화를 해명하기 위해서는 대량 생물 물리학 적 방법의 기능을 함께 가져올 수있는 새로운 생물 물리학 적 방법을 개발하고 적용해야합니다. 나노 스케일에서 단백질 응집의 이질성 및 초구조적 특성에 대한 조사. 이 접근법은 단백질 자가 조립의 문제와 건강과 질병에 대한 그 역할을 이해하는 과제를 해결하기 위한 유익한 길을 나타냅니다. 실제로, 단 하나 골재 접근은 단백질 응집 다형성 및 대형의 분자 기계장치를 해명하고 해명할 수 있습니다. 이 정보는 단백질 응집및 인간 질병의 발병 및 진행에 대한 그 역할을 이해하는 과제뿐만 아니라 생명 공학 응용 프로그램에 대한 생물 물리학적 특성을 이해하는 데 핵심적입니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

저자는 재정 지원 (보조금 번호 P2ELP2_162116 및 P300P2_171219), 금융 지원을위한 다윈 대학, 에라스무스 + 프로그램 (보조금 번호 2018-1-LT01-KA103-KA103-046719-15400-P3)에 대한 스위스 국립 과학 재단 (SNF)에 감사드립니다 이러한 결과로 이어지는 연구는 ERC 보조금 PhysProt (계약 번호 337969), 뉴먼 재단 (T.P.J.K.) 및 유럽 연합 (EU)의 일곱 번째 프레임 워크 프로그램 (FP7 / 2007-2013)에 따라 유럽 연구위원회로부터 자금을 받았다 잘못 접는 질병을 위한 캠브리지 센터 (C.G., M.V., 및 T.P.J.K.).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AFM-IR system	Anasys Instruments	nanoIR 2 or 3	Systems to measure thermal expansion in contact and resonance mode
Corning 96-well Half Area Black/Clear Bottom Polystyrene NBS Microplate	Corning	3881
Corning Microplate Aluminium Sealing Tape	Corning	6570
Double Sided Adhesive Discs	AGAR Scientific	AGG3347N
FLUOstar Omega	BMG Labtech	415-101	Platereader
Mica Disc 10mm V1	AGAR Scientific	AGF7013
Park NX10 AFM system	Park Systems	N/A	Atomic Force Microscope
Platypus Ultra-Flat Gold Chips	Platypus Technologies	AU.1000.SWTSG
PPP-NCHR-10 cantilevers	Park Systems	PPP-NCHR-10
Protein LowBind Tubes, 2.0mL	Eppendorf	30108132
Silicon gold coated cantilevers	Anasys Instruments	PR-EX-nIR2
SPM Specimen Discs 12mm	AGAR Scientific	AGF7001

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Biochemistry

적외선 나노 스펙트로펙트 및 원자력 현미경으로 개별 단백질 응집체 특성화

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Materials

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