Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

इन्फ्रारेड नैनोस्पेक्ट्रोस्कोपी और परमाणु बल माइक्रोस्कोपी द्वारा व्यक्तिगत प्रोटीन सकल की विशेषता

Published: September 12, 2019 doi: 10.3791/60108
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1,3
1Centre for Misfolding Diseases, Department of Chemistry, University of Cambridge, 2Institute of Biotechnology, Life Sciences Center, Vilnius University, 3Cavendish Laboratory, Department of Physics, University of Cambridge

Summary

हम अवरक्त नैनोस्पेक्ट्रोस्कोपी और उच्च संकल्प परमाणु बल माइक्रोस्कोपी के आवेदन का वर्णन करने के लिए अल्पजीवी समुच्चय और एमिलॉयड फाइब्रिल्स, जो बारीकी से शुरुआत और विकास के साथ जुड़ा हुआ है में प्रोटीन स्वयं विधानसभा की प्रक्रिया कल्पना मानव neurodegenerative विकारों की एक विस्तृत श्रृंखला की.

Abstract

प्रोटीन misfolding और एकत्रीकरण की घटना अत्यधिक विषम प्रोटीन समुच्चय के गठन में परिणाम है, जो अल्जाइमर और पार्किंसंस रोगों के रूप में neurodegenerative शर्तों के साथ जुड़े रहे हैं. विशेष रूप से कम आणविक वजन समुच्चय में, एमिलॉयड ओलिगोमर, सामान्य साइटोटॉक्सिक गुणों के अधिकारी को दिखाया गया है और मनोभ्रंश के कई रूपों में neurotoxins के रूप में फंसाया जाता है. हम इन समुच्चय के रूपात्मक, संरचनात्मक और रासायनिक गुणों की विशेषता के चुनौतीपूर्ण कार्य को संबोधित करने के लिए परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) पर आधारित विधियों के उपयोग को स्पष्ट करते हैं, जिनका पारंपरिक संरचनात्मक उपयोग करके अध्ययन करना कठिन है। उनकी विषमता और क्षणिक प्रकृति के कारण तरीके या थोक जैवभौतिक तरीके। स्कैनिंग जांच माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण अब उप-नानोमीटर संकल्प के साथ एमिलॉयड समुच्चय की आकृति विज्ञान की जांच करने में सक्षम हैं। हम यहाँ दिखाते हैं कि अवरक्त (आईआर) नैनोस्पेक्ट्रोस्कोपी (एएफएम-आईआर), जो एक साथ AFM के उच्च संकल्प और आईआर स्पेक्ट्रोस्कोपी की रासायनिक मान्यता शक्ति का शोषण करता है, आगे जा सकते हैं और व्यक्ति के संरचनात्मक गुणों की विशेषता को सक्षम कर सकते हैं प्रोटीन समुच्चय, और इस प्रकार एकत्रीकरण तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं. चूंकि हमारे द्वारा वर्णन किए जाने वाले दृष्टिकोण को छोटे अणुओं और एंटीबॉडी के साथ प्रोटीन असेंबली की बातचीत की जांच के लिए भी लागू किया जा सकता है, इसलिए यह निदान या इलाज के लिए नए चिकित्सीय यौगिकों को विकसित करने के लिए मौलिक जानकारी प्रदान कर सकता है तंत्रिकाअपवर्ती विकार.

Introduction

दुनिया भर में 40 लाख से अधिक लोगों को वर्तमान में neurodegenerative विकारों से प्रभावित हैं, जैसे अल्जाइमर (एडी)1 और पार्किंसंस (पीडी)2 रोगों. अधिक आम तौर पर, पचास से अधिक रोगों प्रोटीन misfolding और एकत्रीकरण के साथ आणविक स्तर पर जुड़े रहे हैं, एक प्रक्रिया है कि अघुलनशील फाइब्रिलार प्रोटीन समुच्चय के प्रसार की ओर जाता है, एमिलॉयड जमा के रूप में जाना जाताहै 3, 4. neurodegeneration के आणविक मूल और प्रोटीन के साथ इसके संबंध amyloid गठन करने के लिए अग्रणी प्रोटीन की संरचना परिवर्तन, तथापि, विषमता के उच्च स्तर की वजह से बड़े हिस्से में स्पष्ट नहीं रह, क्षणिक प्रकृति और नैनोस्केल रोगविज्ञान के आयाम4,5.

पिछले कई दशकों में प्रोटीन संरचनाओं की अत्यधिक सफल जांच व्यापक रूप से एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी, क्रायो-इलेक्ट्रोन माइक्रोस्कोपी और परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी5सहित थोक तरीकों के उपयोग पर आधारितहै। 6 , 7 , 8 , 9.तकनीकों के इस वर्ग के भीतर, अवरक्त (आईआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रोटीन8जैसे जैविक प्रणालियों के रासायनिक गुणों को जानने के लिए एक संवेदनशील विश्लेषणात्मक उपकरण के रूप में उभरा है। आईआर विधियों उनके misfolding और एकत्रीकरण के दौरान प्रोटीन माध्यमिक और चतुष्क संरचनात्मक परिवर्तन के परिमाणकी अनुमति देते हैं. इसके अलावा, सूक्ष्म स्तर पर आगे समझने के लिए उनके एकत्रीकरण के दौरान प्रोटीन के जटिल मुक्त ऊर्जा परिदृश्य में शामिल मशीनी विवरण, एक प्रमुख अग्रिम रासायनिक गतिज उपकरणों का विकास किया गया है जटिल करने के लिए विस्तार करने के लिए आत्म-एसेम्बली पथ जिसमें एमिलॉयड फाइब्रिल्स गठन5,6,7,10,11,12शामिल हैं . हालांकि, थोक स्पेक्ट्रोस्कोपिक तरीकों समाधान में मौजूद प्रजातियों की विषम पहनावा पर केवल औसत जानकारी प्रदान करते हैं या विशिष्ट सूक्ष्म चरणों में शामिल है, इस प्रकार व्यक्ति के biophysical गुणों की जांच प्रतिपादन नैनोस्केल स्तर13,14पर चुनौतीपूर्ण एकत्रित प्रजातियां .

पिछले दशकों में प्रकाश की विवर्तन सीमा से छोटे पैमाने पर प्रचालन की क्षमता वाली अनेक माइक्रोस्कोपी तकनीकें सामने आई हैं। विधियों के इस वर्ग में इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) तथा परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) शामिल हैं। जबकि स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) एक नमूना के दो आयामी (2 डी) छवियों प्रदान करते हैं, AFM एक शक्तिशाली और बहुमुखी तकनीक के रूप में पिछले दशकों में उभरा है तीन आयामी (3 डी) morphologies का अध्ययन करने के लिए, के रूप में साथ ही उप-नानोमीटर संकल्प13,14,15,16,17,18,19के साथ एक नमूने के नैनोमैकेनिकल गुण, 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27एएफएम के माध्यम से प्रोटीन एकत्रीकरण का अध्ययन करने के पीछे तर्क यह है कि यह दृष्टिकोण समाधान13,14,16में उपस्थित अलग-अलग प्रजातियों के आकारिकी की जांच में सक्षम बनाता है, 17,19,20,21,25,27,28,29,30, 31,32,33,34,35,36,37. विशेष रूप से, समय के एक समारोह के रूप में नमूना की निगरानी करके, AFM नमूना के भीतर प्रजातियों की आकृति विज्ञान के विकास की जांच की अनुमति देता है, जो यह संभव का पालन करें और amyloid गठन के रास्ते कल्पना करने के लिए बनाता है23, 25,38,39,40,41,42. इसके अलावा, AFM इस तरह के पार अनुभागीय ऊंचाइयों और समाधान13,19,30,31 में मौजूद व्यक्तिगत प्रजातियों की लंबाई के रूप में संरचनात्मक मानकोंकेपरिमाणीकरण सक्षम बनाता है ,32,33,34,35,36,37,40,43, 44 , 45 , 46 , 47 , 48.तथापि, एक जैवभौतिक संपदा, जैसे आकारिकी का अध्ययन अक्सर विषमांगी और जटिल जैविक प्रणालियों का अध्ययन करते समय पर्याप्त नहीं होता है। एएफएम, एसईएम या टीईएम इमेजिंग तरीके अकेले नैनोस्केल पर एमिलॉयड समुच्चय की विषमांगी प्रजातियों के रासायनिक गुणों को आसानी से प्रकट नहीं करते हैं।

इस पैमाने पर विषमांगी जैविक नमूनों के विश्लेषण के लिए एक प्रमुख अग्रिम हाल ही में अवरक्त नैनोस्पेक्ट्रोस्कोपी के प्रोटीन एकत्रीकरण के क्षेत्र में विकास और आवेदन के साथ किया गया है (AFM-IR)24,26, 38,42,49,50,51,52. इस अभिनव विधि आईआर के रासायनिक विश्लेषण शक्ति के साथ AFM के स्थानिक संकल्प के संयोजन का शोषण ($ 1 $ 10 एनएम)। AFM-IR तकनीक एक आईआर लेजर द्वारा संचालित photothermal प्रेरित अनुनाद प्रभाव की माप पर आधारित है, और AFM टिप द्वारा जांच के तहत नमूने के थर्मल विस्तार की माप पर. नमूना आईआर लेजर द्वारा सीधे ऊपर से या कुल आंतरिक प्रतिबिंब में नीचे से प्रकाशित किया जा सकता है, इसी तरह पारंपरिक अवरक्त स्पेक्ट्रोस्कोपी24,42,52,53 में के रूप में . आईआर लेजर किलोहर्ट्ज़ (1 डिग्री 1000 kHz) के सैकड़ों के क्रम में विशिष्ट आवृत्तियों के साथ स्पंदित किया जा सकता है और एक विस्तृत वर्णक्रमीय रेंज पर देखते हैं, आम तौर पर के बीच 1000 $3300 सेमी-1. हालांकि लेजर स्रोत $ 30 डिग्री मीटर व्यास के एक क्षेत्र को शामिल किया गया, AFM-IR तकनीक के स्थानिक संकल्प नाममात्र AFM टिप व्यास है, जो प्रणाली के स्थानीय थर्मल विस्तार का पता लगाता है द्वारा निर्धारित किया जाता है. AFM-IR अच्छी तरह से जैविक नमूनों का अध्ययन करने के लिए अनुकूल है क्योंकि आईआर संकेत उनकी मोटाई के लिए आनुपातिक है 1 $1.5 $m, और जिसके परिणामस्वरूप आईआर स्पेक्ट्रम इसी FTIR संचरण स्पेक्ट्रम के साथ समझौते में आम तौर पर कर रहे हैं13,54 ,55. इस कारण से, स्पेक्ट्रोस्कोपी में विश्लेषण की स्थापित विधियों को आसानी से लागू किया जा सकता है, जैसे रासायनिक बदलाव का अध्ययन, बैंड आकार परिवर्तन और दूसरे डेरिवेटिव विश्लेषण52द्वारा वि-कन्वलन। कुल मिलाकर, आईआर स्पेक्ट्रोस्कोपी की रासायनिक मान्यता शक्ति के साथ AFM के स्थानिक संकल्प के संयोजन, AFM-IR नैनोस्केल पर एक नमूने की आकृतिक, यांत्रिक और रासायनिक गुणों की एक विस्तृत श्रृंखला के एक साथ अधिग्रहण सक्षम बनाता है.

यहाँ, हम प्रोटीन एकत्रीकरण की प्रक्रिया है कि इन विट्रो फ्लोरोसेंट परख, उच्च संकल्प AFM इमेजिंग और नैनोस्केल AFM-IR के संयोजन का शोषण की विशेषता के लिए एक प्रोटोकॉल वर्णन. यह संयुक्त दृष्टिकोण पहले से ही प्रोटीन समुच्चय द्वारा गठित व्यक्तिगत सूक्ष्म बूंदों के रासायनिक और संरचनात्मक गुणों का अध्ययन करने में विस्तृत परिणाम प्रदान करने में उत्कृष्ट है, तरल तरल प्रोटीन चरण जुदाई के अध्ययन में, और में नैनोस्केल 23 ,26,38,45,50,53में अलग - अलग एकत्रित प्रजातियों के विषमता और जैवभौतिक गुणों की जांच करना, 56,57.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. फ्लोरोसेंट प्लेट पाठकों पर एकत्रीकरण परख

नोट: यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल कैसे रासायनिक गतिज द्वारा किसी भी प्रोटीन या पेप्टाइड के एकत्रीकरण का अध्ययन करने के लिए एक उदाहरण है. विशेष रूप से, यह एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए एजेड 42 पेप्टाइड के एकत्रीकरण का अध्ययन, जो अल्जाइमर रोग58,59की शुरुआत और प्रगति में शामिल है. इसी तरह के एक प्रोटोकॉल समायोजित किया जा सकता है और किसी भी प्रोटीन या पेप्टाइड के एकत्रीकरण का अध्ययन करने की दिशा में अपनाया.

  1. एजेड 42 वाले प्रोटीन भिन्नों को अलग करने के लिए आयन-विनिमय और आकार-निष्कर्ष क्रोमैटोग्राफी तकनीकों के माध्यम से एजेड42 का एक अत्यधिक शुद्ध मोनोमेरिक समाधान प्राप्त करें, और एजेड 42 प्राप्त58 के अन्य एकत्रित रूपों से मोनोमेरिक अंश को अलग करने के लिए , 59|
  2. 20 एमएम सोडियम फॉस्फेट बफर में एजेड 42 पेप्टाइड को पतला करें, पीएच 8.058 पर 200 डिग्री सेल्सियस एड्टा को 1 डिग्री 5 डिग्री सेल्सियस के बीच, 1.5 एमएल कम-बाइंड ट्यूबों में एक वांछित अंतिम सांद्रता तक। AFM माप के लिए एकत्र नमूने एकत्रीकरण परख (thioflavin टी, ThT) में इस्तेमाल फ्लोरोसेंट डाई शामिल नहीं होना चाहिए, क्योंकि यह AFM विश्लेषण के लिए नमूना जमा के दौरान कलाकृतियों परिचय हो सकता है. इस प्रकार, दो समान समाधानों के ट्रिप्लीकेट्स तैयार करें: i) एएफएम द्वारा एकत्रीकरण की प्रक्रिया का पालन करने के लिए पहला मोनोमेरिक एजेड42 युक्त; पप) दूसरा जिसमें एजेड42 मोनोमेरिक होता है, जिसमें एकत्रीकरण की गतिज गतिकी की निगरानी करने के लिए अनुरेखक के रूप में 20 डिग्री सेल्सियस थ्रटी का योग होता है।
    नोट: यह बर्फ पर कदम 1.1 और 1.2 प्रदर्शन करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह प्रक्रिया यह सुनिश्चित करने के लिए है कि एकांकी एजेड42 समाधान प्लेट रीडर में आरंभ किए जाने तक एकीकृत नहीं होता है। जब नमूने से निपटने, सावधान pipeting प्रोटीन नमूने को प्रभावित कर सकता है कि किसी भी हवा बुलबुले की शुरूआत से बचने के लिए आवश्यक है.
  3. एक 96-अच्छी तरह से, स्पष्ट नीचे और nonbinding सतहों के साथ काले polystyrene के आधे क्षेत्र थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से प्रत्येक नमूने के 80 डिग्री एल.
  4. एकत्रीकरण के दौरान नमूने के वाष्पीकरण को कम करने के लिए एक पन्नी के साथ प्लेट को सील करें।
  5. प्लेट रीडर के तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस तक बराबर कर दें।
  6. 440 एनएम की उत्तेजना तरंगदैर्ध्य और 480 एनएम की उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य पर, निश्चित समय-बिंदु अंतराल पर फ्लोरोसेंट माप को पढ़ने के लिए एकत्रीकरण प्रोटोकॉल सेट करें। शांत परिस्थितियों में एकत्रीकरण शुरू किया जाना चाहिए।
  7. प्लेट रीडर में प्लेट डालें.
    नोट: यह थाली से निपटने के दौरान सावधान रहना महत्वपूर्ण है, यह सुनिश्चित करने के लिए कि एकत्रीकरण प्लेट रीडर शुरू करने से पहले शुरू नहीं किया गया है. प्रत्येक नमूने के फ्लोरोसेंट के इष्टतम readout सुनिश्चित करने के लिए लाभ समायोजन सेटिंग्स का उपयोग करें.
  8. माप प्रारंभ करें।
    नोट: जब ThT फ्लोरोसेंट सिग्मोइडा वक्र पठार58तक पहुँचता है तो एकत्रीकरण प्रयोग संपन्न होता है।

2. AFM और नैनो-आईआर माप के लिए नमूना तैयारी

  1. गोंद उच्च गुणवत्ता ग्रेड V1 अभ्रक डिस्क चिपकने वाला टैब या डबल पक्षीय टेप का उपयोग कर उच्च गुणवत्ता वाले चुंबकीय स्टेनलेस स्टील डिस्क के लिए।
  2. अभ्रक की सतह पर चिपकने वाला टेप का एक टुकड़ा रखकर और अभ्रक की शीर्ष परत को खींचकर अभ्रक का एक टुकड़ा। इस प्रक्रिया को साफ, atomically फ्लैट सतह, नमूना जमा करने के लिए उपयुक्त का उत्पादन होगा.
    नोट: Etched सतह वर्दी और चिकनी होना चाहिए।
    चेतावनी: स्पर्श या ताजा etched अभ्रक के ऊपर सीधे साँस न लें, क्योंकि यह कलाकृतियों का परिचय देगा।
  3. प्रोटीन के एकत्रीकरण की प्रक्रिया के दौरान ब्याज के समय बिंदु को एकत्र करने के लिए प्लेट रीडर माप को रोकें।
  4. सीलिंग पन्नी निकालें और एक 1.5 एमएल कम बांध ट्यूबों में अच्छी तरह से से ThT बिना नमूनों की 10 $L alicot इकट्ठा.
  5. ताजा etched अभ्रक पर नमूने के 10 डिग्री सेल्सियस जमा. AFM-IR माप नमूने के लिए ताजा छीन लिया सोने सब्सट्रेट पर जमा किया जाना चाहिए.
  6. भौतिक विज्ञान की अनुमति देने के लिए 1 मिनट के लिए अभ्रक पर समाधान को इनक्यूबेट करें।
    नोट: लंबे समय तक ऊष्मायन समय सतह पर बेहतर अवशोषण की अनुमति होगी, लेकिन कृत्रिम आत्म संगठन और आत्म विधानसभा25प्रेरित कर सकते हैं. इन प्रभावों से बचने के लिए, स्प्रे जमा शोषण किया जा सकताहै 25.
  7. अल्ट्राप्यूर पानी के 1 एमएल के साथ तीन बार कुल्ला।
  8. हवा के वातावरण में नमूने को मापने के लिए नाइट्रोजन के एक कोमल प्रवाह के तहत सूखी।

3. प्रोटीन समुच्चय की आकृति विज्ञान के AFM इमेजिंग

नोट: Morphology माप संपर्क और गतिशील मोड में दोनों किया जा सकता है, निम्नलिखित चरणों में बाद में वर्णित है क्योंकि यह पार्श्व बलों को कम कर देता है उच्च संकल्प के साथ नमूना के 3 डी आकृति विज्ञान को मापने के लिए. AFM-IR माप संपर्क मोड में AFM-IR संकेत करने वाली शोर अनुपात को बढ़ाने के लिए प्रदर्शन किया जाएगा.

  1. थर्मल स्थिरता तक पहुँचने के लिए प्रणाली को सक्षम करने के क्रम में माप से पहले कम से कम 30 मिनट AFM प्रणाली चालू करें. सेटअपपर क्लिक करें , तो जांचपर . जांच बदलें विंडो में तैयार करने के लिए अगले पर क्लिक करें ,, फोकस स्टेज|
  2. AFM बीम स्विच बंद करें (यदि यह चालू है). Dovetail ताले अनलॉक, प्रणाली से सिर डिस्कनेक्ट और जांच बदलें खिड़की में अगलापर क्लिक करें.
  3. जांच धारक पर AFM cantilver माउंट. प्रणाली के लिए सिर कनेक्ट और dovetail ताले ताला।
    नोट: गतिशील मोड एएफएम में जैविक नमूनों का अध्ययन करने के लिए इष्टतम कैन्टीलवर्स में 2 डिग्री 40 एन उ-1 और 2 डिग्री 8 दउ14के बीच एक शीर्ष त्रिज्या एंटिस के बीच वसंत स्थिर होता है।
  4. AFM लेजर बीम स्विच चालू करें और जांच बदलें विंडो में अगलापर क्लिक करें.
  5. पॉप-अप विंडो में नहीं पर क्लिक करें यदि cantilver प्रकार परिवर्तित नहीं हुआ। कैन्टीलवर को खोजने के लिए ऑप्टिकल संरेखण knobs समायोजित करें। कैंटिलवर पर फोकस समायोजित करें और अगलापर क्लिक करें.
  6. पॉप-अप विंडो में हाँ पर क्लिक करें यदि ध्यान cantilver पर है.
  7. का पता लगाने लेजर की स्थिति को नियंत्रित knobs का उपयोग कर cantilver के अंत में लेजर बीम स्थिति. स्थिति संवेदनशील photodiode (PSPD) पर deflected लेजर बीम की स्थिति को नियंत्रित knobs का उपयोग कर कम से कम gt; 1 वी करने के लिए चार-चौदह फोटोडिओड द्वारा मापा कुल संकेत अधिकतम। जांच बदलें विंडो में अगला पर क्लिक करें और फिर बंदकरें पर क्लिक करें.
  8. थर्मल स्थिरता तक पहुँचने के लिए कैंटिलर के लिए 15 मिनट प्रतीक्षा करें। यदि आवश्यक हो तो PSPD पर विक्षेपित लेजर बीम की स्थिति को पढ़ें।
  9. NCM SWEEPपर क्लिक करें, दोलन के वांछित आयाम का चयन करें, चरण का उपयोग करेंपर क्लिक करें, ऑटो पर क्लिक करें और दोलन की अपनी पहली मुक्त अनुनाद की अधिकतम के करीब cantilver धुन, जो एक के लिए लगभग 300 kHz की है 40 छ मीटर-1के वसंत स्थिरांक के साथ कैन्टीलवर .
    नोट: अपनी मुक्त अनुनाद की अधिकतम से बाहर cantilever ट्यूनिंग माप14की उच्च स्थिरता का आश्वासन दिया.
  10. नमूना धारक पर नमूना रखें। उपयुक्त इमेजिंग पैरामीटर चुनें. 1 x 1 डिग्री उ2 से 5 x 5 डिग्रीउ2 के स्कैन क्षेत्र के लिए विशिष्ट स्कैनिंग दर 0ण्3 डिग्री 1.0 भ्र है। ठेठ संकल्प की जरूरत है 256 x 256 और 1024 x 1024 पिक्सल के बीच है. स्कैन आकार और पिक्सेल संख्या का चयन करने के लिए स्कैन क्षेत्र पर क्लिक करें।
  11. नमूने पर ऑप्टिकल दृश्य फोकस. दृष्टिकोण पर क्लिक करें नमूना सतह दृष्टिकोण. एक बार दृष्टिकोण पूरा हो गया है लिफ्ट पर क्लिक करें 100 डिग्री m AFM टिप वृद्धि करने के लिए 100 डिग्री मीटर नमूना की सतह से ऊपर. नमूने की ऑप्टिकल छवि पर विस्तृत करें क्लिक करें. नमूने की सतह पर दृश्य को फ़ोकस करने के लिए फ़ोकस स्टेज पट्टी पर क्लिक करें.
  12. ब्याज के नमूने के क्षेत्र में स्थानांतरित करने के लिए तीर का उपयोग करें. दृष्टिकोण बटन दबाकर सतह संलग्न करें। लाइन स्कैन बटन पर क्लिक करें, और जाँच करें कि टिप सतह अच्छी तरह से पीछा कर रहा है, यदि आवश्यक हो, सेट प्वाइंटसमायोजित करें।
  13. स्कैन बटन दबाकर नमूना सतह इमेजिंग शुरू करो. इमेजिंग के दौरान, बड़ी इमेजिंग बल से बचने और स्वतंत्र नमूनों के भीतर की स्थिरता रखने के लिए, चरण परिवर्तन की एक निरंतर शासन को बनाए रखने के लिए $20 डिग्री42से अधिक नहीं है.
  14. फ़ाइल नाम दर्ज करें और आधार निर्देशिका चुनें जहां अधिग्रहीत छवि सहेजी जाएगी।

4. प्रोटीन समुच्चय की इन्फ्रारेड नैनोस्पेक्ट्रोस्कोपी माप

  1. AFM-IR प्रणाली और अवरक्त (आईआर) लेजर60 30 30 -60 मिनट थर्मल स्थिरीकरण के लिए माप से पहले चालू करें. AFM-IR उपकरणों के लिए विशिष्ट लेज़रों ऑप्टिकल पैरामीटर oscillators (OPO) और क्वांटम झरना लेज़रों (QCL) हैं.
  2. साधन को नियंत्रित करने के लिए निर्मित सॉफ्टवेयर खोलें। फ़ाइल पर क्लिक करें और फिर एक नई नैनोIR फ़ाइल को खोलने के लिए नए पर क्लिक करें। AFM-IR सिस्टम प्रारंभ करने के लिए बटन प्रारंभ करें दबाएँ.
  3. साधन कवर खोलें और AFM-IR प्रणाली पर माउंट 30 एनएम के एक नाममात्र त्रिज्या और संपर्क मोड में नमूने को मापने के लिए 0.2 N/m के एक वसंत निरंतर के साथ एक सिलिकॉन सोने लेपित जांच।
  4. अनुभाग AFM जांच में लोड पर क्लिक करें और फिर अगले| जांच अनुभाग पर ध्यान केंद्रित करने में cantilver पर कैमरा ध्यान केंद्रित करने के लिए तीर पर क्लिक करें. अनुभाग नमूना XY आंदोलनमें, cantilver के अंत में पार हवा जगह करने के लिए तीर का उपयोग करें।
  5. कैन्टीलवर के अंत में लेजर की स्थिति के लिए पता लगाने लेजर की स्थिति को नियंत्रित knobs घुमाएँ. एक मूल्य के लिए चार-चौदह फोटोडिओड द्वारा मापा योग का पता लगाने और अधिकतम करने के लिए लेजर knobs घुमाएँ और 3 वी -1 वी करने के लिए cantilver विक्षेप को समायोजित करने के लिए विक्षेप घुंडी घुमाएँ और फिर अगलेक्लिक करें। उपकरण के आवरण को बंद कर दें।
  6. नमूना पर ध्यान केंद्रित अनुभाग में नमूने पर कैमरा ध्यान केंद्रित करने के लिए तीर का उपयोग करें. फिर, अनुभाग नमूना XY आंदोलन में नमूने के हित के क्षेत्र में ले जाने के लिए तीर का उपयोग करें और दृष्टिकोण पर क्लिक करें और संलग्न हैं।
  7. माइक्रोस्कोप विंडो में नमूने के जैवभौतिक गुणों को मैप करने के लिए ब्याज के चैनलों का चयन करें। विशेष रूप से, टिप नमूना संपर्क अनुनाद नक्शा करने के लिए आईआर अवशोषण और PLL आवृत्ति के लिए आकृति विज्ञान, आयाम 2 के लिए ऊंचाई का चयन करें।
  8. नियंत्रण विंडो के AFM स्कैन अनुभाग में, अनुभाग 3 में के रूप में समान पैरामीटर का उपयोग करें (यानी, स्कैन दर 0.1$1.0 हर्ट्ज, 256 x 256 और 1024 x 1024 पिक्सेल के बीच)। नमूना खुरदरापन के अनुसार लाभ के मूल्य के रूप में चुनें: अभिन्न मैं ] 1 $10 और आनुपातिक P ] 10 ]30. फिर, एक आकृति विज्ञान नक्शा प्राप्त करने के लिए स्कैन पर क्लिक करें।
    नोट: आकृति विज्ञान इसी तरह गतिशील दोहन मोड में मापा जा सकता है, लेकिन AFM-IR माप संपर्क मोड में यहाँ प्रदर्शन कर रहे हैं शोर अनुपात के लिए उच्च संकेत है.
  9. आकृति विज्ञान की मानचित्रण समाप्त होने के बाद, माइक्रोस्कोप विंडो में, एक कुल के शीर्ष पर जांच की स्थिति के लिए ऊंचाई के नक्शे पर क्लिक करें। फिर नियंत्रण विंडो के नैनोआईआर अनुभाग में, आईआर लेजर के साथ नमूना रोशन करने के लिए प्रारंभ IR पर क्लिक करें।
  10. कैन्टीलवर पर अवरक्त लेजर ध्यान केंद्रित करने के लिए, अनुकूलनपर क्लिक करें। इस विंडो में, एक तरंग संख्या लिखें जहां नमूना उच्च अवशोषण करने जा रहा है और जोड़ेंक्लिक करें। प्रोटीन के लिए, एक विशिष्ट मूल्य 1655 सेमी-1है। IR लेजर स्थिति खोजने के लिए स्कैन पर क्लिक करें और cantilver के साथ अपनी स्थिति संरेखित करने के लिए अद्यतन पर क्लिक करें। विंडो बंद करें.
  11. नैनोआईआर सेटिंग के अनुभाग सामान्य में, एक तरंग संख्या लिखें जहां सापेक्ष क्षेत्र में उच्च अवशोषण की अपेक्षा की जाती है। फिर, बैंड पास फ़िल्टर विकल्प को निष्क्रिय और मीटर पढ़ने को देखो और तेजी से फूरिये परिवर्तन (FFT) cantilver प्रतिक्रिया के पर. FFT विंडो में कैन्टीलवर की अनुनाद आवृत्ति को पढ़ने के लिए हरी कर्सर ले जाएँ। कैन्टीलवर्स की अनुनाद के एफएफटी का एक विशिष्ट मूल्य लगभग 300 kHz है। इस अनुनाद आवृत्ति मान को फ्रेक केंद्र क्षेत्र में सामान्य खंड में लिखिए तथा 50 कझकी की एक फ्रेक. खिडक़ी का प्रयोग कीजिए।
    नोट: मीटर पढ़ने तर नहीं करने के लिए पर्याप्त कम है कि एक लेजर शक्ति का चयन करें और cantilver प्रतिक्रिया में विरूपण है और नमूना अधिक गरम नहीं करने के लिए.
  12. गूंज बढ़ाया मोड का उपयोग करने के लिए लेजर पल्स धुन खिड़की पर क्लिक करें। 300 kHz, 50 kHz की एक धुन रेंज और 5% की लेजर का एक कर्तव्य चक्र की एक आवृत्ति केंद्र चुनें. लेजर की पल्स दर स्वीप करने के लिए प्राप्त करने पर क्लिक करें. ग्राफ में कर्सर का उपयोग करके, आईआर प्रकाश को अवशोषित नमूना के थर्मल विस्तार की यांत्रिक प्रतिक्रिया की आवृत्ति के लिए लेजर पल्स धुन. फिर, नमूना और टिप के बीच संपर्क अनुनाद की निगरानी करने के लिए विकल्प PLL का चयन करें. PLL विंडो में शून्य बटन दबाएँ और नमूना टिप संपर्क अनुनाद को ट्रैक करने के लिए सक्षम टिक. एक अभिन्न लाभ I को चुनें I र् 0ण्5 तथा समानुपातिक लाभ च् ] 10। विंडो बंद करें.
  13. अनुकूलन खिड़की फिर से खोलें और नमूने के प्रमुख अवशोषण बैंड के लिए इसी कम से कम 3 wavenumbers के लिए और लेजर के प्रत्येक चिप के लिए कम से कम एक wavenumber के लिए आईआर लेजर की स्थिति पाते हैं.
  14. उपकरण पर क्लिक करें ] IR पृष्ठभूमि अंशांकन | नया| विंडो में प्रोटीन नमूनों का अध्ययन करने के लिए ब्याज के स्पेक्ट्रमदर्शी क्षेत्र (1800 डिग्री 1200 सेमी-1) का चयन करें; चरण 4.12 में निर्धारित के रूप में एक ही पल्स दर और 5% का एक कर्तव्य चक्र का चयन; तेजी से अधिग्रहण पर क्लिक करें और लेजर गति का चयन करें, एक क्वांटम झरना लेजर के लिए विशिष्ट रेंज के बीच है 20 -500 सेमी-1. आईआर लेजर पृष्ठभूमि को मापने के लिए प्राप्त पर क्लिक करें. इस पृष्ठभूमि स्पेक्ट्रम मापा नैनोस्केल स्थानीयकृत स्पेक्ट्रम के सामान्यीकरण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. विंडो बंद करें.
    नोट: एक तेजी से लेजर और गूंज बढ़ाया मोड उपलब्ध नहीं है, तो चरण 4.12 छोड़ और दोनों पृष्ठभूमि और आईआर स्पेक्ट्रम अधिग्रहण खिड़कियों में तेजी के बजाय कदम रखा स्पेक्ट्रम का चयन करें। हालांकि, एकल कुल संवेदनशीलता तक नहीं पहुँच जाएगा।
  15. IR स्पेक्ट्रम सेटिंग्स में, 1 "4 सेमी-1 और कम से कम 64x के सह-औसत की एक संख्या के बीच एक आईआर स्पेक्ट्रम संकल्प का चयन करें। प्रोटीन रेंज में नैनोस्केल स्थानीयकृत आईआर स्पेक्ट्रम को मापने के लिए प्राप्त करने पर क्लिक करें (1800 डिग्री 1200 सेमी-1)।
  16. एक नैनोस्केल हल रासायनिक नक्शा प्राप्त करने के लिए, आईआर इमेजिंग विकल्प का चयन करें, ब्याज की एक wavenumber चुनें (उदाहरण के लिए, 1655 सेमी-1 amide बैंड मैं के लिए) और AFM स्कैन विंडो में स्कैन पर क्लिक करें.
  17. मैपिंग पूर्ण होने के बाद, फ़ाइल पर जाएँ और माप सहेजें. आकृति विज्ञान के अधिग्रहीत नक्शे का विश्लेषण करने के लिए, संपर्क अनुनाद और रसायन विज्ञान, साथ ही नैनोस्केल स्थानीयकृत स्पेक्ट्रम, निर्मित में AFM छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें. स्पेक्ट्रा और छवियाँ वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर के साथ आगे विस्तृत विश्लेषण के लिए .csv या .axz फ़ाइलों के रूप में सहेजा जा सकता है।

5. छवि प्रसंस्करण और पार अनुभागीय आयामों का विश्लेषण

  1. सपाट कच्चे छवियों14,17,19,41,42,59 का उपयोग कर निर्मित AFM छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर या वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर.
    नोट: समुच्चय विश्लेषण की कलाकृतियों और उनके मापा ऊंचाई के underestimation से बचने के लिए गणना से नकाबपोश किया जाना चाहिए।
  2. 0 आदेश विमान फिट घटाव द्वारा छवि समतल.
  3. 1st प्रतिगमन क्रम में रेखा द्वारा छवि समतल और फिर पंक्ति द्वारा पंक्ति, दूसरा चरण रेखा प्रोफ़ाइल में समतल आधार रेखा तक पहुँच जाता है जब तक दोहराया जाता है।
  4. यदि नमूना बहुत भीड़ है, असाधारण उच्च समुच्चय या स्कैनर धनुष artefact मौजूद है, 2एन डी प्रतिगमन आदेश फिट का उपयोग कर छवि समतल शामिल हैं.
  5. फाइब्रिल अक्ष 14 ,17,19,41,42,59के लंबवत एक लाइन प्रोफाइल से कुल ऊंचाई और चौड़ाई मापें .
  6. फाइब्रिल अक्ष14, 17,19,41,42,59के समानांतर तंतु मापें .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ThT फ्लोरोसेंट परख द्वारा मापा गया ए $ 42 एकत्रीकरण का एक प्रतिनिधि समय पाठ्यक्रम चित्र 1में दिखाया गया है। एकत्रीकरण प्रक्रिया आमतौर पर एक सिग्मीडाल वक्र द्वारा विशेषता है, जहां एक अंतराल चरण शुरू में मनाया जाता है, और एक खड़ी विकास चरण द्वारा पीछा किया जाता है, इससे पहले कि वक्र एक पठार तक पहुँचता है जब एक संतुलन स्थिर अवस्था6,7 तक पहुँच जाता है , 58. यह सुनिश्चित करना आवश्यक है कि एक अनुकूलित एकत्रीकरण प्रोटोकॉल का उपयोग एकत्रीकरण प्रक्रियाओंसेसंबंधित आणविक विवरणों का अध्ययन करने के लिए उच्च गुणवत्ता वाले डेटा उत्पन्न करने के लिए किया जाता है .

एएफएम के उच्च संकल्प प्रक्रिया के विभिन्न समय बिंदुओं पर एकत्रित प्रजातियों की आकृति विज्ञान और विषमता की जांच करने के लिए सक्षम बनाता है। एकत्रीकरण के दौरान, ThT परख द्वारा निगरानी, प्लेटों में नमूने के alicots AFM और नैनो-IR द्वारा एकल कुल जांच के लिए तैयार कर रहे हैं (चित्र 1). मैनुअल नमूना तैयारी की विशिष्ट प्रक्रिया प्रवाह चित्र 2में दिखाया गया है। उच्च संकल्प और चरण नियंत्रित AFM द्वारा नमूने के 3 डी आकृति विज्ञान की माप के पूरा होने पर, नक्शे piezoelectric स्कैनर के गैर linearity को दूर करने और नमूना के बाद प्रसंस्करण विश्लेषण में त्रुटि के स्रोतों को कम करने के लिए चपटा कर रहे हैं आकारिकी (चित्र 3)। इसके बाद, एक सटीक और संवेदनशील एकल अणु सांख्यिकीय विश्लेषण किया जा सकता है, जैसा कि चित्र 4में दिखाया गया है। एक 3 डी आकृति विज्ञान के नक्शे से, यह समग्र पार अनुभागीय ऊंचाई, चौड़ाई और लंबाई (या गोलाभ कणों के मामले में व्यास) निकालने के लिए संभव है, जो अलग और एकत्रीकरण समय के दौरान मौजूद समुच्चयों की अलग प्रजातियों की विशेषता की अनुमति देता है पाठ्यक्रम23,38. एकत्रीकरण की प्रक्रिया की जांच करने के लिए ब्याज के विशिष्ट समय बिंदु अंतराल चरण, विकास चरण और पठार चरण (चित्र 1) हैं। अंतराल चरण के दौरान, एजेड 42 की एकमेरिक और अल्पगोलिक प्रजातियां मुख्य रूप से मौजूद हैं। जब एएफएम द्वारा कल्पना की जाती है, तो एजेड 42 की एकामेरिक और अल्पगोलिक प्रजातियां आमतौर पर गोलाभ कणों के रूप में दिखाई देती हैं 1 $15 एनएम व्यास में और 0ण्3 दृउ की ऊंचाई में (चित्र 1,नीचे बाएँ)38,39. दीर्घित प्रोटोफिलामेंट , प्रोटोफिलिल्स और फाइब्रिल का निर्माण एजेड 42 समुच्चय समय पाठ्यक्रम के विकास चरण के दौरान दिखाई देता है (चित्र 1,तल मध्य) 38,39. आमतौर पर, प्रोटोफिलामेंट लंबाई में नैनोमीटर के सैकड़ों और ऊंचाई में 0.5 डिग्री 2 एनएम के रूप में दिखाई देते हैं, जबकि प्रोटोफ़िब्रिल्स लम्बी रैखिक या वक्ररेखी समुच्चय के रूप में दिखाई देते हैं 1 डिग्री 5 एनएम ऊंचाई में और लंबाई में नैनोमीटर के सैकड़ों38, 39. पठारी प्रावस्था के दौरान तंतुक एजेड42 समुच्चय की प्रमुख प्रजातियां होती हैं। एजेड42 फाइब्रिल्स आमतौर पर बिना ब्राका हुआ, धागे की तरह संरचनाओं के रूप में दिखाई देते हैं, जिसका एक क्रॉस-सेक्शनल व्यास 6 डिग्री 10 एनएम और लंबाई क्रम में यदि माइक्रोमीटर (चित्र 3,नीचे दाएँ)38,39हैं। उल्लेखनीय है कि समुच्चयों के रूपात्मक गुणों का यह योजनाबद्ध निरूपण सबसे अधिक एकत्रित प्रोटीन और पेप्टाइड्स13,14की एक सामान्य विशेषता है।

नमूना आकारिकी की जांच के बाद, नैनो-आईआर का उपयोग एकत्रीकरण की प्रक्रिया के दौरान मौजूद व्यक्तिगत प्रोटीन कुल प्रजातियों के रासायनिक गुणों की जांच करने के लिए किया जा सकता है, नैनोस्केल-समाधान ित आईआर मानचित्रों और स्पेक्ट्रम को हवा में और देशी तरल वातावरण24,26,38,4249,50,51,52,. चित्र 5 AFM-IR सेटअप का एक योजनाबद्ध उदाहरण दिखाता है. आईआर स्रोत का प्रयोग कुल आंतरिक परावर्तन में नीचे से या सीधे ऊपर से चित्र 5कके रूप में प्रकाशित करने के लिए किया जाता है। आईआर प्रकाश नमूने द्वारा अवशोषित कर लेता है, तो यह मौजूद प्रजातियों की इसी आणविक कंपन ऊर्जा संक्रमण के स्तर को उत्तेजित करेगा। कंपन ऊर्जा थर्मल हीटिंग, जो नमूना के थर्मल विस्तार का कारण बनता है के रूप में नमूना के अंदर नष्ट कर दिया है. इस विस्तार के क्रम में एक संकल्प के साथ नमूने के साथ संपर्क में AFM टिप द्वारा नैनोस्केल पर मापा जाता है 10 एनएम. प्रत्येक नाड़ी में, कैन्टीलवर थर्मल विस्तार का पता लगाता है। विशेष रूप से, नमूना के तेजी से विस्तार नमूने के साथ संपर्क से cantilever बाहर kicks, और बाहर लात के बाद कैंटिलवर अपनी प्राकृतिक आवृत्तियों पर नीचे बजता है. AFM-IR की संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए, यह cantilver54के दोलन की एक ही आवृत्ति पर लेजर पल्स आवृत्ति धुन करने के लिए संभव है। आदेश में इस अनुनाद बढ़ाया मोड में काम करने के लिए, यह इस तरह के क्वांटम झरना लेज़रों कि आम तौर पर 1 के बीच एक सीमा में काम के रूप में आवृत्तियों की एक विस्तृत श्रृंखला में स्पंदित किया जा सकता है कि आईआर स्रोतों के लिए आवश्यक है 1 $1000 kHz. पीक-टू-पीक आयाम और रिंगडाउन संकेत के तेजी से फूरिये रूपांतर, जिसे आईआर आयाम कहा जाता है, कच्चे कैन्टीलवर विक्षेप के आईआर प्रकाश अवशोषित करने के लिए आनुपातिक होते हैं। इन संकेतों को एक लाल लेजर के विक्षेप को मापने के द्वारा वास्तविक समय में पता चला रहे हैं cantilver के शीर्ष पर ध्यान केंद्रित. रासायनिक नक्शे प्राप्त करने के लिए, लेजर wavenumber एक निश्चित wavenumber पर तय की है और आईआर आयाम संकेत नक्शे के प्रत्येक बिंदु पर एकत्र की है, जबकि, आईआर स्पेक्ट्रम प्राप्त करने के लिए, cantilever की स्थिति ब्याज और लेजर की स्थिति में तय हो गई है तरंगदैर्ध्य ब्याज की स्पेक्ट्रमदर्शी श्रेणी के साथ बह रहा है. एएफएम-आईआर का अंतिम संकल्प प्रोटीन समुच्चय के रासायनिक गुणों की माप को लगभग 5 दउ की क्रॉस-सेक्शनल ऊंचाई के साथ माप में सक्षम बनाता है, जैसा कि चित्र 6में निरूपित किया गया है।

Figure 1
चित्र 1: ThT फ्लोरोसेंट और AFM के माध्यम से इन विट्रो में एकत्रीकरण समय पाठ्यक्रम की निगरानी.
ThT फ्लोरोसेंट द्वारा पता लगाया के रूप में अंतराल चरण, विकास चरण, और एकत्रीकरण प्रक्रिया के पठार चरण के दौरान लिया नमूने उच्च संकल्प एएफएम के माध्यम से छवि थे. यह आंकड़ा Ruggeri एट अल38से अनुकूलित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: सब्सट्रेट तैयारी और AFM माप के लिए नमूना जमा की Schematic प्रतिनिधित्व.
(ए, बी) चिपकने वाला टेप का उपयोग कर Mica etching. (सी) नमूना जमा. (डी)नमूना ऊष्मायन। (ई) अल्ट्राप्यूर पानी के साथ नमूना rinsing. (च)नाइट्रोजन के कोमल प्रवाह में नमूना सुखाने। (जी) नमूना इमेजिंग माइक्रोफेब्रिफेब्रिकेड एएफएम कैन्टीलवर का उपयोग इसके अंत पर तेज टिप के साथ। (ज) एमिलॉयड फाइब्रिल्स की संसाधित छवि। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: AFM छवि प्रसंस्करण प्रक्रिया42|
प्रत्येक पैनल के शीर्ष नमूना सतह (लाल रेखा) इसी AFM छवि द्वारा सचित्र की एक प्रोफ़ाइल लाइन से पता चलता है, जबकि निचले भाग छवि में सभी पिक्सल की ऊंचाई का एक हिस्टोग्राम से पता चलता है. (क)छवि समतल प्रक्रिया से पहले कच्चे AFM छवि. (ख)पूरे विमान समतल का उपयोग कर प्रसंस्करण प्रक्रिया के बाद AFM छवि. Fibrillar संरचनाओं (गुलाबी रंग) समतल प्रक्रिया से नकाबपोश थे. (ग)छवि लाइन-बाय-लाइन समतलीकरण प्रक्रिया का उपयोग कर संसाधित। (घ)छवि प्रक्रमण प्रक्रिया के बाद अंतिम प्रतिबिंब। यह आंकड़ा Ruggeri एट अल42से अनुकूलित किया गया है.

Figure 4
चित्रा 4: AFM छवियों का एकल समग्र सांख्यिकीय विश्लेषण.
(अ)फाइब्रिलर संरचनाओं की ऊँचाई और लंबाई का अनुरेखण का उदाहरण, जो 1 और 2 से दर्शाया गया है। (ख)ट्रेस किए गए फाइब्रिल के वर्गों और उनकी औसत ऊंचाई के साथ ग्राफ। (ग)एक हिस्टोग्राम का उदाहरण जो फाइब्रिलर संरचनाओं की औसत ऊँचाई दर्शाता है। (घ)ट्रेस किए गए फाइब्रिल्स 1 और 2 के सामान्यीकृत प्रोफाइल के साथ ग्राफ। (ई)सामान्यीकृत प्रोफाइल ऊंचाई अंक के हिस्टोग्राम वितरण। यह आंकड़ा Ruggeri एट अल42से अनुकूलित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: AFM-IR विधि के समारोह के सिद्धांत.
(क) अवशोषित आईआर प्रकाश नमूने के थर्मल विस्तार का कारण बनता है, नमूने के साथ संपर्क में AFM cantilver के यांत्रिक अनुनादों रोमांचक. कैन्टीलवर दोलनों का आयाम आईआर अवशोषण के लिए आनुपातिक होता है। (ख)आईआर अवशोषण मानचित्र लेजर तरंगदैर्ध्य को ठीक करते समय नमूने पर कैन्टीलवर को स्कैन करते हुए प्राप्त किए जाते हैं। (ग) संपर्क में टिप और नमूना युग्मित स्प्रिंग्स की एक प्रणाली के रूप में व्यवहार करते हैं , जिसकी गुंजयमान आवृत्ति नमूने की आंतरिक कठोरता के साथ एकरसता से बढ जातीहै. (घ)एएफएम कैन्टीलवर की स्थिति को स्थिर करते समय लेजर तरंगदैर्ध्य को व्यापक करके स्थानीयकृत स्पेक्ट्रम प्राप्त किया जाता है। (ई) प्रोटीन का आईआर स्पेक्ट्रम। (च)संक्षेप में, एएफएम-आईआर नैनोस्केल26पर रूपात्मक, यांत्रिक और रासायनिक गुणों का एक साथ अध्ययन करने में सक्षम बनाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: एक एकल एमिलॉयड कुल के इन्फ्रारेड नैनोस्पेक्ट्रोस्कोपी (नैनो-आईआर)।
(क)एएफएम आकारिकी मानचित्र। (ख) लेजर अनुनाद शिखर पर 1658 बउ-1पर आईआर अवशोषण मानचित्र . (ग)तंतुक ऊँचाई के क्रॉस अनुभागीय आयाम। (घ)फाइब्रिलर संरचना के विभिन्न पदों पर आईआर स्पेक्ट्रम (नीले घेरे के साथ पैनल ख में चिह्नित) और सब्सट्रेट (हरे घेरे के साथ पैनल ख में चिह्नित)। कुल संरचना (ठोस काली रेखा) से प्राप्त औसत शुद्ध संकेत औसत फाइब्रिल संकेत (ठोस नीली रेखा) से औसत पृष्ठभूमि संकेत (ठोस हरी रेखा) घटाकर प्राप्त किया गया था। यह आंकड़ा Ruggeri एट अल42से अनुकूलित किया गया है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस प्रोटोकॉल में पहला महत्वपूर्ण कदम मोनोमेरिक प्रोटीन की तैयारी है, जैसे कि चरण 1.1 और 1.2 में वर्णित एजेड 42 समाधान के मामले में। यह एक अत्यधिक शुद्ध, monomeric समाधान से एकत्रीकरण प्रक्रिया आरंभ करने के लिए आवश्यक है, के रूप में अल्पजीवी या एकत्रित प्रजातियों की उपस्थिति एकत्रीकरण गतिज58के गरीब reproducibility में परिणाम हो सकता है , और AFM में कलाकृतियों प्रेरित माप (उदा., फाइब्रिलर प्रजातियां एकत्रीकरण के प्रारंभिक चरणों में स्पष्ट हो जाएगी), जो डेटा की गलत व्याख्या का कारण बन सकती हैं। थट फ्लोरोसेंट परख के आधार पर एमिलॉयड गठन के अत्यधिक पुनरुत्पादक गतिज आंकड़ों, रासायनिक गतिज5,6,7के मास्टर समीकरण औपचारिकता के साथ मिलकर एजेड42 एकत्रीकरण को परिभाषित करने की अनुमति दी है इसके अंतर्निहित आणविक घटनाओं के संदर्भ में तंत्र. रासायनिक गतिकी विभिन्न तरीकों से नए समुच्चय के रूप में और विकसित कर सकते हैं, जो उदाहरण के लिए कुल समाप्त होता है या माध्यमिक पर लंबी अवधि के लिए कर रहे हैं पर विचार करके अपने स्थूल अभिव्यक्ति के साथ एमिलॉयड गठन अंतर्निहित सूक्ष्म चरणों को जोड़ता है कुल सतह पर नाभिक. तथापि, रासायनिक गतिज अपने आप में एक अणु विधियों के साथ उनके संयोजन की आवश्यकता होती है नैनोस्केल पर संभव नाभिक घटना के दृश्य को सक्षम नहीं करता है।

इस प्रोटोकॉल में दूसरा महत्वपूर्ण कदम सब्सट्रेट तैयारी और नमूना जमा प्रक्रियाओं चरण 2.2 और 2.6 में वर्णित है 2.2.8. कलाकृतियों से बचने के लिए, नमूना एक स्वच्छ, परमाणु रूप से फ्लैट सतह पर जमा किया जाना चाहिए। अभ्रक की उचित उत्कीर्णन AFM माप में कलाकृति मुक्त, उच्च संकल्प को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। नमूना जमा समय भी अत्यंत महत्वपूर्ण है, के रूप में लंबे समय तक ऊष्मायन समय सब्सट्रेट सतह पर बेहतर अवशोषण की अनुमति देता है. हालांकि, यह कृत्रिम स्व-संगठन और आत्म-विधानसभा25को भी प्रेरित कर सकता है, जो कलाकृतियों (जैसे, सतह प्रेरित कुल प्रजातियों) को प्रेरित कर सकता है जो डेटा की गलत व्याख्या कर सकता है। इसके अतिरिक्त, अभ्रक की सतह पर ऋणात्मक आवेशित होता है, जिसका अर्थ है कि केवल धनावेशित अणु ही उस पर आसानी से अवशोषित हो जाते हैं। यदि नमूने का नेट आवेश ऋणात्मक है तो बेहतर पिसी शोषण23के लिए एपीटीईएस का उपयोग करते हुए अभ्रक की सतह को सकारात्मक रूप से कार्यात्मक बनाया जा सकता है। Microfluidic स्प्रे जमा25 इन प्रभावों और कलाकृतियों से बचने और एक ही कदम और artefact मुक्त तरीके से नमूना जमा करने के लिए शोषण किया जा सकता है.

तीसरा महत्वपूर्ण कदम उचित सेटअप और AFM और AFM-IR अनुभाग 3 में वर्णित के माध्यम से नमूना इमेजिंग के लिए इमेजिंग मापदंडों का विकल्प है. नमूना इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया AFM युक्तियाँ काफी तेज होना चाहिए (2 डिग्री 8 एनएम के apex रेडी) उच्च संकल्प को प्राप्त करने और convolution प्रभाव को कम से कम (टिप द्वारा नमूना सुविधाओं के प्रसार)14,जो नमूना की छवि में अनिश्चितताओं प्रेरित कर सकते हैं. इमेजिंग मोड, संपर्क या गतिशील का चुनाव भी महत्वपूर्ण है. पारंपरिक AFM के माध्यम से नमूना इमेजिंग के लिए, गतिशील मोड संपर्क मोड पर पसंद किया जाता है के रूप में उत्तरार्द्ध मोड बड़े पार्श्व टिप नमूना घर्षण बलों है कि नमूना क्षति का कारण हो सकता है और माप में कलाकृतियों परिचय लाती है (उदाहरण के लिए, में कमी नैनोइंडेंटेशन के कारण नमूना ऊंचाई )14,61,62. इसके विपरीत, संपर्क मोड AFM-IR संकेत को बढ़ाने के लिए नैनो-आईआर के माध्यम से माप के लिए पसंद किया जाता है। गतिशील मोड में माप के लिए, cantilever माप14की उच्च स्थिरता को आश्वस्त करने के लिए दोलन की अपनी पहली मुक्त अनुनाद की अधिकतम (टैपिंग मोड) या ऊपर (अटैपिंग मोड) बस थोड़ा नीचे tuned किया जाना चाहिए। इमेजिंग रिज़ॉल्यूशन, जो पिक्सेल संख्या और स्कैन क्षेत्र पर निर्भर करता है, एक नमूने में मौजूद विवरण की सबसे छोटी डिग्री को कैप्चर करने के लिए पर्याप्त उच्च होना चाहिए (उदाहरण के लिए, 1024 x 1024 पिक्सेल एक 4 x 4 डिग्री2 क्षेत्र के लिए)14,63. कम इमेजिंग संकल्प संकेत14के डिजिटीकरण पर ऊर्ध्वाधर और पार्श्व जानकारी के नुकसान के कारण नमूने की छवि में विकृति और अनिश्चितताओं को प्रेरित कर सकता है . स्कैन दर, इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया, टिप के लिए पर्याप्त कम होना चाहिए सतह सुविधाओं का ठीक से पालन करने के रूप में अच्छी तरह के रूप में रासायनिक जानकारी प्राप्त करने के लिए पर्याप्त समय के रूप में सक्षम होने के लिए14. सबसे महत्वपूर्ण इमेजिंग मापदंडों में से एक इमेजिंग बल है. संपर्क मोड में, नमूने की संरचना को संरक्षित करने के लिए कम इंटरैक्शन बल का उपयोग करना मूलभूत होता है। गतिशील मोड में, नमूनों पर ऊर्जा अपव्यय लगातार अलग नमूनों की आकृति विज्ञान की तुलना करने के क्रम में स्थिर रखा जाना चाहिए; स्वतंत्र नमूनों की संगत इमेजिंग एक चरण परिवर्तन की निरंतर व्यवस्था बनाए रखने के द्वारा प्राप्त की जा सकती है जो $20 डिग्री14,42से अधिक नहीं है . बड़ी इमेजिंग बलों से बचा जाना चाहिए क्योंकि वे नमूना छवियों में विकृति और अनिश्चितताओं को प्रेरित कर सकते हैं।

तापीय उतार -चढ़ाव के कारण एएफएम भागों के विस्तार और संकुचन के कारण तापीय बहाव नमूना64,65की छवि में विकृति और कलाकृतियों को प्रेरित कर सकता है . ऊर्ध्वाधर दिशा में बहाव के कारण सतह का ट्रैक खोने के साथ ही सतह में दुर्घटना हो सकती है, जबकि पार्श्व दिशा में drifts आमतौर पर सतह सुविधाओं और छवि विरूपण, जो यह मुश्किल के लिए बनाता है की लंबाई में परिणाम नमूना सुविधाओं का सटीक माप प्राप्त. इन थर्मल drifts के प्रभाव प्रयोगशाला के सटीक तापमान नियंत्रण के साथ ही पर्याप्त समय देने के रूप में (लगभग 30 मिनट) प्रणाली स्थिर बनने के लिए या तेजी से स्कैन प्रदर्शन करके कम से कम किया जा सकताहै 66,67,68 , 69 , 70|

AFM-IR द्वारा नैनो-आईआर इमेजिंग और स्पेक्ट्रम संग्रह की गुणवत्ता कई कारकों से प्रभावित हो सकती है, जिनमें से सबसे महत्वपूर्ण हैं: (i) आईआर पृष्ठभूमि द्वारा नमूने पर आईआर सिग्नल का गलत विभाजन, (ii) टिप के बीच नैनोमैकेनिकल संपर्क का एक बड़ा अंतर और नमूना, और (iii) नमूने की अत्यधिक तापन इसके नरम होने के कारण. सही ढंग से एकत्र पृष्ठभूमि द्वारा नमूने के आईआर स्पेक्ट्रम विभाजित करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि वे एक ही लेजर शक्ति पर एकत्र कर रहे हैं. दरअसल, आईआर लेजर पृष्ठभूमि के वर्णक्रमीय लाइन आकार लेजर की शक्ति पर निर्भर करता है. फिर, मापा रासायनिक जानकारी में नमूना के यांत्रिक गुणों के प्रभाव से बचने के लिए, यह निगरानी और स्पेक्ट्रम और छवि अधिग्रहण के दौरान नमूना और टिप के बीच संपर्क अनुनाद ट्रैक करने के लिए महत्वपूर्ण है. स्पेक्ट्रम अधिग्रहण के लिए, आदर्श, यह एक निश्चित संपर्क अनुनाद पर लेजर नाड़ी के लिए पर्याप्त है. हालांकि, अगर स्पेक्ट्रम एक बड़े स्पेक्ट्रोस्कोपिक रेंज पर अधिग्रहण कर लिया है, उच्च तीव्रता चोटियों नमूना और उसके नरम के मजबूत हीटिंग पैदा कर सकता है, इस प्रकार टिप नमूना संपर्क अनुनाद बदलने और कृत्रिम रूप से आईआर चोटी आयाम को कम करने. इस कारण से, यह स्पेक्ट्रम अधिग्रहण के दौरान संपर्क अनुनाद ट्रैक करने के लिए सत्यापित करें कि स्पेक्ट्रम नमूना की अत्यधिक हीटिंग से प्रभावित नहीं है महत्वपूर्ण है.

अंत में, पारंपरिक एएफएम और नैनो-आईआर उच्च संकल्प के साथ प्रोटीन एकत्रीकरण24,38के दौरान गठन व्यक्तिगत प्रजातियों के रूपात्मक, संरचनात्मक और रासायनिक गुणों की जांच करने में सक्षम हैं। तथापि, वे रासायनिक गतिजता की क्षमता की कमी के लिए देशी थोक स्थितियों में गठन के अपने तेजी से गतिजता का पालन करें. प्रोटीन उनके एकत्रीकरण और misfolding के दौरान से गुजरना है कि अनुरूप परिवर्तन जानने के लिए, यह विकसित करने और एक साथ थोक biophysical तरीकों की क्षमताओं को एक साथ लाने में सक्षम उपन्यास biophysical तरीकों को लागू करने के लिए आवश्यक है नैनोस्केल पर प्रोटीन एकत्रीकरण के विषमता और अल्ट्रास्ट्रक्चरल गुणों की जांच। यह दृष्टिकोण प्रोटीन आत्म-विधानसभा की समस्या और स्वास्थ्य और रोग में इसकी भूमिका को समझने की चुनौती का समाधान करने के लिए एक उपयोगी अवसर का प्रतिनिधित्व करता है। वास्तव में, एक कुल दृष्टिकोण को जानने और प्रोटीन एकत्रीकरण बहुरूपता और गठन के आणविक तंत्र स्पष्ट करने में सक्षम हैं. यह जानकारी प्रोटीन एकत्रीकरण और शुरुआत और मानव रोगों की प्रगति में अपनी भूमिका को समझने की चुनौती को संबोधित करने के लिए केंद्रीय है, साथ ही जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों के लिए अपने biophysical गुणों को समझने के रूप में.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों वित्तीय सहायता के लिए स्विस नेशनल फाउंडेशन (SNF) धन्यवाद (अनुदान संख्या P2ELP2$162116 और P300P2]171219), डार्विन कॉलेज, इरास्मस + वित्तीय सहायता के लिए कार्यक्रम (अनुदान संख्या 2018-1-LT01-KA103-046719-15400-P3) और इन परिणामों के लिए अग्रणी अनुसंधान यूरोपीय संघ के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम के तहत यूरोपीय अनुसंधान परिषद से धन प्राप्त हुआ है (FP7/2007-2013) ईआरसी अनुदान PhysProt के माध्यम से (समझौता संख्या 337969), न्यूमैन फाउंडेशन (T.P.J.K.) और The कैम्ब्रिज सेंटर फॉर मिसफोल्डिंग रोग (सी.जी., एम.वी., और टी.पी.जे.के.)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AFM-IR system Anasys Instruments nanoIR 2 or 3 Systems to measure thermal expansion in contact and resonance mode
Corning 96-well Half Area Black/Clear Bottom Polystyrene NBS Microplate Corning 3881
Corning Microplate Aluminium Sealing Tape Corning 6570
Double Sided Adhesive Discs AGAR Scientific AGG3347N
FLUOstar Omega BMG Labtech 415-101 Platereader
Mica Disc 10mm V1 AGAR Scientific AGF7013
Park NX10 AFM system Park Systems N/A Atomic Force Microscope
Platypus Ultra-Flat Gold Chips Platypus Technologies AU.1000.SWTSG
PPP-NCHR-10 cantilevers Park Systems PPP-NCHR-10
Protein LowBind Tubes, 2.0mL Eppendorf 30108132
Silicon gold coated cantilevers Anasys Instruments PR-EX-nIR2
SPM Specimen Discs 12mm AGAR Scientific AGF7001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease at 25 years. EMBO Molecular Medicine. 8, 595-608 (2016).
  2. Poewe, W., et al. Parkinson disease. Nature Reviews Disease Primers. 3, 1-21 (2017).
  3. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annual Review of Biochemistry. 75, 333-366 (2006).
  4. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, amyloid formation, and human disease: A summary of progress over the last decade. Annual Review of Biochemistry. 86, 27-68 (2017).
  5. Knowles, T. P. J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, 384-396 (2014).
  6. Meisl, G., et al. Molecular mechanisms of protein aggregation from global fitting of kinetic models. Nature Protocols. 11, 252-272 (2016).
  7. Knowles, T. P. J., et al. An analytical solution to the kinetics of breakable filament assembly. Science. 326, 1533-1537 (2009).
  8. Barth, A. Infrared spectroscopy of proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1767, 1073-1101 (2007).
  9. Fitzpatrick, A. W. P., et al. Atomic structure and hierarchical assembly of a cross- amyloid fibril. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 5468-5473 (2013).
  10. Cohen, S. I. A., et al. Proliferation of amyloid-β42 aggregates occurs through a secondary nucleation mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 9758-9763 (2013).
  11. Michaels, T. C. T., Lazell, H. W., Arosio, P., Knowles, T. P. J. Dynamics of protein aggregation and oligomer formation governed by secondary nucleation. Journal of Chemical Physics. 143, (2015).
  12. Šarić, A., Michaels, T. C. T., Zaccone, A., Knowles, T. P. J., Frenkel, D. Kinetics of spontaneous filament nucleation via oligomers: Insights from theory and simulation. The Journal of Chemical Physics. 145, 211926 (2016).
  13. Ruggeri, F. S., Habchi, J., Cerreta, A., Dietler, G. AFM-based single molecule techniques: Unraveling the amyloid pathogenic species. Current Pharmaceutical Design. 22, 3950-3970 (2016).
  14. Ruggeri, F. S., Šneideris, T., Vendruscolo, M., Knowles, T. P. J. Atomic force microscopy for single molecule characterisation of protein aggregation. Archives of Biochemistry and Biophysics. 664, 134-138 (2019).
  15. Iljina, M., et al. Nanobodies raised against monomeric α-synuclein inhibit fibril formation and destabilize toxic oligomeric species. BMC Biology. 15, 1-14 (2017).
  16. Schilling, C., et al. Sequence-Optimized Peptide Nanofibers as Growth Stimulators for Regeneration of Peripheral Neurons. Advanced Functional Materials. 1809112, 1-15 (2019).
  17. Chiki, A., et al. Mutant exon1 huntingtin aggregation is regulated by T3 phosphorylation-induced structural changes and crosstalk between T3 phosphorylation and acetylation at K6. Angewandte Chemie - International Edition. 56, 5202-5207 (2017).
  18. Sieste, S., et al. Water-dispersible polydopamine-coated nanofibers for stimulation of neuronal growth and adhesion. Advanced Healthcare Materials. 7, 1-11 (2018).
  19. De, S., et al. Different soluble aggregates of Aβ42 can give rise to cellular toxicity through different mechanisms. Nature Communications. 10, 1541 (2019).
  20. Chang, K. C., Chiang, Y. W., Yang, C. H., Liou, J. W. Atomic force microscopy in biology and biomedicine. Tzu Chi Medical Journal. 24, 162-169 (2012).
  21. Variola, F. Atomic force microscopy in biomaterials surface science. Physical Chemistry Chemical Physics. 17, 2950-2959 (2015).
  22. Drolle, E., Hane, F., Lee, B., Leonenko, Z. Atomic force microscopy to study molecular mechanisms of amyloid fibril formation and toxicity in Alzheimer’s disease. Drug Metabolism Reviews. 46, 207-223 (2014).
  23. Ruggeri, F. S., et al. Identification and nanomechanical characterization of the fundamental single-strand protofilaments of amyloid α-synuclein fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (28), 7230-7235 (2018).
  24. Ruggeri, F. S., et al. Infrared nanospectroscopy characterization of oligomeric and fibrillar aggregates during amyloid formation. Nature Communications. 6, 1-9 (2015).
  25. Ruggeri, F. S., et al. Microfluidic deposition for resolving single-molecule protein architecture and heterogeneity. Nature Communications. 9, (2018).
  26. Qamar, S., et al. FUS phase peparation is modulated by a molecular chaperone and methylation of arginine cation-π interactions. Cell. 173, 720-734 (2018).
  27. Habchi, J., et al. Cholesterol catalyses Aβ42 aggregation through a heterogeneous nucleation pathway in the presence of lipid membranes. Nature Chemistry. 10, 673-683 (2018).
  28. Sweers, K. K. M., Stöckl, M., Bennink, M. L., Subramaniam, V. Characterizing nanoscale morphologic and mechanical properties of α-Synuclein amyloid fibrils with atomic force microscopy. Bio-nanoimaging: Protein Misfolding & Aggregation. Uversky, V. N., Lyubchenko, Y. L. , London, UK. 309-322 (2014).
  29. Goldsbury, C., et al. Amyloid structure and assembly Insights from scanning transmission electron microscopy. Journal of Structural Biology. 173, 1-13 (2011).
  30. Knowles, T. P. J., Smith, J. F., Devlin, G. L., Dobson, C. M., Welland, M. E. Analysis of structural order in amyloid fibrils. Nanotechnology. 18, (2007).
  31. Knowles, T. P. J., Mezzenga, R. Amyloid fibrils as building blocks for natural and artificial functional materials. Advanced Materials. , 6546-6561 (2016).
  32. Knowles, T. P. J., Oppenheim, T. W., Buell, A. K., Chirgadze, D. Y., Welland, M. E. Nanostructured films from hierarchical self-assembly of amyloidogenic proteins. Nature Nanotechnology. 5, 204-207 (2010).
  33. Knowles, T. P. J., Smith, J. F., Craig, A., Dobson, C. M., Welland, M. E. Spatial persistence of angular correlations in amyloid fibrils. Physical Review Letters. 96, 1-4 (2006).
  34. Knowles, T. P. J., et al. Twisting transition between crystalline and fibrillar phases of aggregated peptides. Physical Review Letters. 109, 158101 (2012).
  35. Knowles, T. P., et al. Role of intermolecular forces in defining material properties of protein nanofibrils. Science. 318, 1900-1903 (2007).
  36. Smith, J. F., Knowles, T. P. J., Dobson, C. M., MacPhee, C. E., Welland, M. E. Characterization of the nanoscale properties of individual amyloid fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 15806-15811 (2006).
  37. Sokolov, D. V. Atomic force microscopy for protein nanotechnology. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 300, 323-367 (2013).
  38. Ruggeri, F. S., et al. Influence of the β-sheet content on the mechanical properties of aggregates during amyloid fibrillization. Angewandte Chemie - International Edition. 54, 2462-2466 (2015).
  39. Jeong, J. S., Ansaloni, A., Mezzenga, R., Lashuel, H. A., Dietler, G. Novel mechanistic insight into the molecular basis of amyloid polymorphism and secondary nucleation during amyloid formation. Journal of Molecular Biology. 425, 1765-1781 (2013).
  40. Adamcik, J., Mezzenga, R. Study of amyloid fibrils via atomic force microscopy. Current Opinion in Colloid and Interface Science. 17, 369-376 (2012).
  41. Deguire, S. M., et al. N-terminal huntingtin (Htt) phosphorylation is a molecular switch regulating Htt aggregation, helical conformation, internalization, and nuclear targeting. Journal of Biological Chemistry. , (2018).
  42. Ruggeri, F. S., et al. Nanoscale studies link amyloid maturity with polyglutamine diseases onset. Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).
  43. Adamcik, J., et al. Understanding amyloid aggregation by statistical analysis of atomic force microscopy images. Nature Nanotechnology. 5, 423-428 (2010).
  44. Lin, Y. C., Komatsu, H., Ma, J., Axelsen, P. H., Fakhraai, Z. Quantitative analysis of amyloid polymorphism using height histograms to correct for tip convolution effects in atomic force microscopy imaging. RSC Advances. 6, 114286-114295 (2016).
  45. Mannini, B., et al. Stabilization and characterization of cytotoxic Aβ40 oligomers isolated from an aggregation reaction in the presence of zinc ions. ACS Chemical Neuroscience. , (2018).
  46. Medalsy, I., Hensen, U., Muller, D. J. Imaging and quantifying chemical and physical properties of native proteins at molecular resolution by force-volume AFM. Angewandte Chemie - International Edition. 50, 12103-12108 (2011).
  47. Dufrêne, Y. F., Martínez-Martín, D., Medalsy, I., Alsteens, D., Müller, D. J. Multiparametric imaging of biological systems by force-distance curve–based AFM. Nature Methods. 10, 847-854 (2013).
  48. Takai, E., et al. Scanning electron microscope imaging of amyloid fibrils. American Journal of Biochemistry and Biotechnology. 10, 31-39 (2014).
  49. Dazzi, A., et al. AFM-IR: Combining atomic force microscopy and infrared spectroscopy for nanoscale chemical characterization. Applied Spectroscopy. 66, 1365-1384 (2012).
  50. Volpatti, L. R., et al. Micro- and nanoscale hierarchical structure of core-shell protein microgels. Journal of Materials Chemistry B. 4, 7989-7999 (2016).
  51. Galante, D., et al. A critical concentration of N-terminal pyroglutamylated amyloid beta drives the misfolding of Ab1-42 into more toxic aggregates. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 79, 261-270 (2016).
  52. Ruggeri, F. S., et al. Identification of oxidative stress in red blood cells with nanoscale chemical resolution by infrared nanospectroscopy. International Journal of Molecular Sciences. 19, 1-14 (2018).
  53. Ramer, G., Ruggeri, F. S., Levin, A., Knowles, T. P. J., Centrone, A. Determination of polypeptide conformation with nanoscale resolution in water. ACS Nano. 12 (7), 6612-6619 (2018).
  54. Dazzi, A., Prater, C. B. AFM-IR: Technology and applications in nanoscale infrared spectroscopy and chemical imaging. Chemical Reviews. 117, 5146-5173 (2017).
  55. Lahiri, B., Holland, G., Centrone, A. Chemical imaging beyond the diffraction limit: experimental validation of the PTIR technique. Small. 9 (3), 439-445 (2013).
  56. Ansaloni, A., et al. One-pot semisynthesis of exon 1 of the huntingtin protein: New tools for elucidating the role of posttranslational modifications in the pathogenesis of Huntington’s disease. Angewandte Chemie - International Edition. 53 (7), 1928-1933 (2014).
  57. Khalaf, O., et al. The H50Q mutation enhances α-synuclein aggregation, secretion, and toxicity. Journal of Biological Chemistry. 289, 21856-21876 (2014).
  58. Hellstrand, E., Boland, B., Walsh, D. M., Linse, S. Amyloid β-protein aggregation produces highly reproducible kinetic data and occurs by a two-phase process. ACS Chemical Neuroscience. 1, 13-18 (2010).
  59. Limbocker, R., et al. Trodusquemine enhances Aβ42 aggregation but suppresses its toxicity by displacing oligomers from cell membranes. Nature Communications. 10 (1), 225 (2019).
  60. Lu, F., Belkin, M. A. Infrared absorption nano-spectroscopy using sample photoexpansion induced by tunable quantum cascade lasers. Optics Express. 19, 1902-1904 (2011).
  61. Jiao, Y., Schäffer, T. E. Accurate height and volume measurements on soft samples with the atomic force microscope. Langmuir. 20, 10038-10045 (2004).
  62. Müller, D. J., Engel, A. The height of biomolecules measured with the atomic force microscope depends on electrostatic interactions. Biophysical Journal. 73, 1633-1644 (1997).
  63. Heymann, J. B., Moller, C., Muller, D. J. Sampling effects influence heights measured with atomic force microscopy. Journal Of Microscopy-Oxford. 207, 43-51 (2002).
  64. Marinello, F., Balcon, M., Schiavuta, P., Carmignato, S., Savio, E. Thermal drift study on different commercial scanning probe microscopes during the initial warming-up phase. Measurement Science and Technology. 22, 9 (2011).
  65. Marinello, F., Bariani, P., De Chiffre, L., Savio, E. Fast technique for AFM vertical drift compensation. Measurement Science and Technology. 18, 689-696 (2007).
  66. Ricci, D., Braga, P. C. Recognizing and avoiding artifacts in AFM imaging (Clifton, N.J.). Methods in Molecular Biology. 242, 25-27 (2004).
  67. Canale, C., Torre, B., Ricci, D., Braga, P. C. Recognizing and avoiding artifacts in atomic force microscopy imaging. Atomic Force Microscopy in Biomedical Research. Braga, P. C., Ricci, D. 736, Humana Press. New York, NY. 31-43 (2011).
  68. Marinello, F., Carmignato, S., Voltan, A., Savio, E., De Chiffre, L. Error Sources in Atomic Force Microscopy for Dimensional Measurements: Taxonomy and Modeling. Journal of Manufacturing Science and Engineering. 132, 030903 (2010).
  69. Ukraintsev, E., Kromka, A., Kozak, H., Reme, Z., Rezek, B. Artifacts in Atomic Force Microscopy of Biological Samples. Atomic Force Microscopy Investigations into Biology - From Cell to Protein. Frewin, C. L. , (2012).
  70. Tsukruk, V. V., Singamaneni, S. Scanning Probe Microscopy of Soft Matter: Fundamentals and Practices. , Wiley-VCH Verlag GmbH. Weinheim, Germany. (2011).

Tags

जैव रसायन अंक 151 एमिलॉयड neurodegeneration प्रोटीन एकत्रीकरण परमाणु बल माइक्रोस्कोपी अवरक्त नैनोस्पेक्ट्रोस्कोपी एकल अणु विश्लेषण स्पेक्ट्रोस्कोपी
इन्फ्रारेड नैनोस्पेक्ट्रोस्कोपी और परमाणु बल माइक्रोस्कोपी द्वारा व्यक्तिगत प्रोटीन सकल की विशेषता
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ruggeri, F. S., Šneideris, T.,… More

Ruggeri, F. S., Šneideris, T., Chia, S., Vendruscolo, M., Knowles, T. P. J. Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (151), e60108, doi:10.3791/60108 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter