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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

通过红外纳米光谱和原子力显微镜对单个蛋白质聚合进行特征化

Published: September 12, 2019 doi: 10.3791/60108
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1,3
1Centre for Misfolding Diseases, Department of Chemistry, University of Cambridge, 2Institute of Biotechnology, Life Sciences Center, Vilnius University, 3Cavendish Laboratory, Department of Physics, University of Cambridge

Summary

我们描述了红外纳米光谱学和高分辨率原子力显微镜的应用，将蛋白质自组装过程可视化为寡聚体和淀粉样纤维蛋白，这与发病和发展密切相关广泛的人类神经退行性疾病。

Abstract

蛋白质误折叠和聚集的现象导致形成高度异质蛋白聚集体，这些聚合与神经退行性疾病（如阿尔茨海默氏症和帕金森病）相关。特别是低分子量聚合物，淀粉样寡聚物，已被证明具有一般细胞毒性，并被牵连为神经毒素在许多形式的痴呆症。我们说明了使用基于原子力显微镜（AFM）的方法，以解决这些骨料的形态、结构和化学特性的特性这一具有挑战性的任务，这些特性很难使用传统的结构来研究。方法或散装生物物理方法，因为它们的异质性和瞬态性。扫描探针显微镜方法现在能够研究淀粉样粒体具有亚纳米分辨率的形态。我们在这里表明，红外（IR）纳米光谱（AFM-IR），同时利用AFM的高分辨率和红外光谱的化学识别能力，可以更进一步，使个体的结构特性的表征蛋白质聚合，从而提供对聚合机制的见解。由于我们描述的方法也可以应用于研究蛋白质组件与小分子和抗体的相互作用，它可以提供基本信息，以开发新的治疗化合物来诊断或治疗神经退行性疾病。

Introduction

目前，全世界有超过4000万人受到神经退行性疾病的影响，如阿尔茨海默氏症（AD）1和帕金森氏症（PD）2型疾病。 更一般地，超过五十种病理学在分子水平上与蛋白质误折叠和聚集有关，这一过程导致不溶性纤维蛋白聚集物的增殖，称为淀粉样矿床3， 4.神经退化的分子起源及其与蛋白质形成蛋白的构象变化的联系，然而，仍然不清楚，这在很大程度上是由于异质性、瞬态性和纳米尺度的高水平病理聚合体4，5的尺寸。

在过去的几十年中，蛋白质结构的研究非常成功，广泛基于批量方法的使用，包括X射线晶体学、低温电子显微镜和核磁共振光谱学5，6,7,8,9.在这类技术中，红外（IR）光谱技术已成为一种敏感的分析工具，可以揭示蛋白质8等生物系统的化学性质。红外方法允许在蛋白质误折叠和聚合期间对蛋白质二次和四元结构进行定量。此外，为了在微观层面上进一步破译蛋白质聚合过程中复杂的自由能量景观所涉及的机械细节，一个重大进展是开发化学动力学工具，以扩展到复杂的自组装途径包括淀粉样纤维蛋白形成5，6，7，10，11，12。然而，散装光谱方法只提供关于溶液中存在的物种的异质组合或涉及特定微观步骤的平均信息，从而对个体的生物物理特性进行了调查在纳米级13、14级挑战的聚合物种。

在过去的几十年中，出现了几种显微镜技术，其操作能力小于光的衍射极限。此类方法包括电子显微镜 （EM） 和原子力显微镜 （AFM）。扫描电子显微镜 （SEM） 和传输电子显微镜 （TEM） 提供标本的二维 （2D） 图像，而 AFM 在过去几十年中已成为一种功能强大且用途广泛的技术，用于研究三维 （3D） 形态，如以及亚纳米分辨率13、14、15、16、17、18、19的样品的纳米力学特性。20,21,22,23,24,25,26,27.研究通过AFM的蛋白质聚集的理由是，这种方法能够研究溶液13、14、16中个别物种的形态。 17，19，20，21，25，27，28，29，30 31，32，33，34，35，36，37。特别是，通过监测样本作为时间的函数，AFM允许调查样本内物种形态的演变，从而能够跟踪和可视化淀粉样蛋白形成的途径23。 25，38，39，40，41，42。此外，AFM 能够量化结构参数，如溶液13、19、30、31中存在的单个物种的横截面高度和长度 ，32，33，34，35，36，37，40，43，44,45,46,47,48.然而，在研究异质和复杂的生物系统时，对单一生物物理特性的研究，例如形态学，往往是不够的。AFM、SEM 或 TEM 成像方法本身并不能轻易揭示纳米尺度上异构淀粉样聚合体的化学性质。

随着红外纳米光谱（AFM-IR）24、26、24、26、24、26 、24、26 、24、26、24、26、26 、26 、26 、26 、26 、26 、26 、26、26、24、24、26、24、26、26、26、24、26、26、24、26、26、24、26、24、26、26、24、26、24、26、26、26、24、26号蛋白质聚集领域的开发 38，42，49，50，51，52.这种创新方法利用了AFM（±1~10nm）的空间分辨率与红外化学分析能力的结合。AFM-IR 技术基于红外激光驱动的光热感应共振效应的测量，以及 AFM 尖端所调查样品的热膨胀的测量。样品可以直接由红外激光从顶部或底部在总内部反射中照亮，类似于传统的红外光谱24、42、52、53.红外激光器的典型频率可按数百千赫（1~1000 kHz）的顺序进行脉冲，并在宽光谱范围内进行调谐，通常在1000~3300厘米-1之间。虽然激光源的直径为 ±30 μm，但 AFM-IR 技术的空间分辨率名义上由 AFM 尖端直径确定，该直径可检测系统的局部热膨胀。AFM-IR 非常适合研究生物样品，因为红外信号与其厚度成正比，高达 1~1.5 μm，并且生成的红外光谱通常与相应的 FTIR 透射光谱13、54 一致 ， 55.因此，在光谱学中可以容易地应用既定的分析方法，例如通过第二导数分析研究化学变化、带形变化和去卷积。总体而言，AFM 的空间分辨率与红外光谱的化学识别能力相结合，使样品能够在纳米尺度上同时采集各种形态、机械和化学特性。

在这里，我们演示了蛋白质聚合过程的表征方案，该协议利用体外荧光测定、高分辨率 AFM 成像和纳米级 AFM-IR 的组合。这种组合方法在研究蛋白质聚合形成的单个微液滴的化学和结构特性、液-液蛋白相分离的研究以及在纳米尺度23、26、38、45、50、53， 56，57.

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Protocol

1. 荧光板读取器上的聚合测定

注：此处描述的协议是如何通过化学动力学研究任何蛋白质或肽的聚合的示例。特别是，它描述了一个优化的协议，以研究A+42肽的聚合，它参与阿尔茨海默氏病的发病和进展58，59。类似的方案可以调整和采用，以研究任何蛋白质或肽的聚合。

  1. 通过电离交换和大小排除色谱技术获得A+42的超纯单体溶液，以区分含有A+42的蛋白质成分，并将单体部分与其他A+42聚合形式分离为58,59.
  2. 在 20 mM 磷酸钠缓冲液中稀释 A+42 肽，在 pH 8.058时将 200 μM EDTA 稀释至 1.5 mL 低结合管中所需的最终浓度范围为 1⁄5 μM。为 AFM 测量收集的样品不应包含聚合测定中使用的荧光染料（Thioflavin T、ThT），因为它可能在 AFM 分析的样品沉积过程中引入人工制品。因此，准备两个相同溶液的三元数：i） 第一个包含单体 A+42 的 AFM 遵循聚合过程;ii） 包含 A_42 单体的第二个，添加 20 μM ThT 作为示踪剂来监测聚合的动力学。
    注： 在冰上执行步骤 1.1 和 1.2 非常重要。此过程是为了确保单体 A_42 溶液在板读器中启动之前不会聚合。处理样品时，小心移液对于避免引入可能影响蛋白质样品的任何气泡至关重要。
  3. 每个孔中每个样品的移液器 80 μL，每个样品的 96 孔半区域板为黑色聚苯乙烯，底部为透明且不结合的表面。
  4. 用箔片密封板，以尽量减少样品在聚集过程中的蒸发。
  5. 将板式读取器的温度平衡到 37°C。
  6. 设置聚合协议，以固定时间点间隔读取荧光测量，激发波长为 440 nm，发射波长为 480 nm。聚合应在静止条件下启动。
  7. 将板插入板读取器。
    注： 处理板时必须小心，以确保在启动板读取器之前不会触发聚合。使用增益调整设置确保每个样品的荧光得到最佳读出。
  8. 开始测量。
    注：当ThT荧光sigmoidal曲线达到58的高原时，聚合实验结束。

2. AFM 和纳米红外测量的样品制备

  1. 使用粘合卡舌或双面胶带将最高质量的 V1 云母盘粘附到高品质磁性不锈钢光盘中。
  2. 将一块胶带放在云母表面并拉出云母的顶层，蚀刻云母。此过程将产生清洁、原子平坦的表面，适合样品沉积。
    注：蚀刻表面必须均匀光滑。
    注意：不要触摸或呼吸正上方新鲜蚀刻的云母，因为这将引入人工制品。
  3. 暂停/停止板读取器测量，以收集蛋白质聚合过程中的时间点。
  4. 取出密封箔，将10 μL无ThT的样品从井中收集到1.5 mL低粘结管中。
  5. 将样品的 10 μL 沉积在刚蚀刻的云母上。对于 AFM-IR 测量，样品必须沉积在刚剥离的黄金基板上。
  6. 在云母上孵育溶液1分钟，以便进行物理治疗。
    注：较长的孵育时间可以更好地吸收表面，但可能诱导人工自组织和自组装25。为了避免这些影响，喷雾沉积可能被利用25。
  7. 用1 mL的超纯水冲洗三次。
  8. 在温和的氮气流下干燥，以测量空气环境中的样品。

3. 蛋白质聚合形态的AFM成像

注： 形态测量可以在接触和动态模式下执行，在以下步骤中，描述后者，因为它减少了横向力，以高分辨率测量样品的 3D 形态。AFM-IR 测量将在接触模式下执行，以提高 AFM-IR 信噪比。

  1. 在测量前至少 30 分钟打开 AFM 系统，以使系统达到热稳定性。单击"设置"，然后单击"探测"。在"探测更改"窗口中，单击"下一步"准备Z，对焦阶段。
  2. 关闭 AFM 光束开关（如果打开）。解锁尾锁，断开头部与系统的连接，并在"探测更改"窗口中单击"下一步"。
  3. 将 AFM 悬臂安装在探头支架上。将头连接到系统并锁定尾部锁。
    注：在动态模式下研究生物样品的最佳吊臂具有2~40 Nm-1和2~8 nm14之间的顶半径差。
  4. 打开 AFM 激光束开关，在探头更改窗口中单击"下一步"。
  5. 在弹出窗口中，如果悬臂类型未更改，请单击"否"。调整光学定位旋钮以查找悬臂。将焦点调整到悬臂上，然后单击"下一步"。
  6. 在弹出窗口中，如果焦点位于悬臂上，请单击"是"。
  7. 使用控制检测激光器的旋钮将激光束置于悬臂末端。使用控制位置敏感光电二极管 （PSPD） 上偏转激光束位置的旋钮，将四象限光电二极管测量的总信号最大化至至少 >1 V。在"探测更改"窗口中单击"下一步"，然后单击"关闭"。
  8. 等待 15 分钟，使悬臂达到热稳定性。如有必要，调整偏转激光束在 PSPD 上的位置。
  9. 单击NCM SWEEP，选择所需的振荡振幅，单击"使用相位"，单击自动，并调整悬臂接近其第一次自由共振振荡的最大值，该振荡约为 300 kHz悬臂的弹簧常数为40 Nm-1。
    注：将悬臂调出其自由共振的最大最大值可确保测量值14的更高稳定性。
  10. 将样品放在样品架上。选择合适的成像参数。对于 1 x 1 μm2到 5 x 5 μm2的扫描区域，典型扫描速率为 0.3±1.0 Hz。所需的典型分辨率介于 256 x 256 和 1024 x 1024 像素之间。单击"扫描区域"以选择扫描大小和像素数。
  11. 将光学视图聚焦在样品上。单击"接近"以接近样本表面。接近完成后，单击提升100 μm将 AFM 尖端升高到样品表面上方 100 μm。单击"展开"样本的光学图像。单击"焦点阶段"栏将视图聚焦在示例表面。
  12. 使用箭头在感兴趣示例的区域中移动。按下"接近"按钮，使表面接合。单击"线扫描"按钮，并检查笔尖是否很好地跟随表面，如有必要，调整设定点。
  13. 按"扫描"按钮开始对样品表面进行成像。在成像过程中，为了避免大的成像力并保持独立样品内的一致性，保持不超过[20°42]的相变的恒定状态。
  14. 输入文件名并选择将保存获取图像的基本目录。

4. 蛋白质聚合体的红外纳米光谱测量

  1. 在测量热稳定性之前，请打开 AFM-IR 系统和红外 （IR） 激光60 30–60 分钟。AFM-IR 仪器的典型激光器是光学参数振荡器 （OPO） 和量子级联激光器 （QCL）。
  2. 打开内置软件来控制仪器。单击文件，然后打开新文件以打开新的nanoIR文件。按初始按钮启动 AFM-IR 系统。
  3. 打开仪器盖并将其安装在 AFM-IR 系统上，将一个标称半径为 30 nm、弹簧常数为 0.2 N/m的硅镀金探头安装在 AFM-IR 系统上，以在接触模式下测量样品。
  4. 单击AFM 探测部分中的"加载"，然后单击下一个。在聚焦探头部分时，单击箭头将相机聚焦在悬臂上。在部分示例 XY 运动中，使用箭头将交叉空气置于悬臂的末端。
  5. 旋转控制检测激光位置的旋钮，将激光定位在悬臂末端。旋转激光旋钮以检测四象限光电二极管测量的总和并将其最大化到值 >3 V. 旋转偏转旋钮以将悬臂偏转调整到 -1 V，然后单击下一个。关闭仪器盖。
  6. 在"对示例的聚焦"部分中，使用箭头将相机聚焦在样本上。然后，在部分示例 XY 移动中使用箭头在示例感兴趣的区域中移动，然后单击方法并参与。
  7. 在显微镜窗口中选择作为输入感兴趣的通道来映射样品的生物物理特性。特别是，选择形态高度，振幅2为红外吸收，PLL频率图尖样品接触共振。
  8. 在控件窗口的AFM 扫描部分中，使用与第 3 节类似的参数（即扫描速率 0.1±1.0 Hz，介于 256 x 256 和 1024 x 1024 像素之间）。根据样本粗糙度选择增益值：积分 I = 1⁄10，比例 P = 10*30。然后，单击扫描以获取形态图。
    注： 在动态攻丝模式下，形态可以类似地测量，但 AFM-IR 测量在接触模式下执行，以具有较高的信噪比。
  9. 形态图绘制完成后，在显微镜窗口中，单击高度图将探头放置在一个聚合的顶部。然后在控制窗口的纳米IR部分，单击启动IR以用红外激光照亮样品。
  10. 要将红外激光聚焦在悬臂上，请单击优化。在此窗口中，写入一个波号，其中样本将具有高吸收度，然后单击"添加"。对于蛋白质，典型值为1655厘米-1。单击扫描以查找红外激光位置，然后单击更新以将其位置与悬臂对齐。关闭窗口。
  11. 在纳米红外设置的一般部分中，在相对字段中需要高吸收度的地方写入波数。然后，停用带通滤波器选项，查看仪表读数和悬臂响应的快速傅立叶变换 （FFT）。在 FFT 窗口中，移动绿色光标以读取悬臂的谐振频率。悬臂共振的FFT的典型值约为300 kHz。在freq. 中心场的一般部分中写入此谐振频率值，并使用 50 kHz 的freq. 窗口。
    注：选择足够低的激光功率，使仪表读数不饱和，使悬臂响应失真，且样品不会过热。
  12. 单击激光脉冲调谐窗口以使用谐振增强模式。选择 300 kHz 的频率中心、50 kHz 的调谐范围和 5% 的激光占空比。点击获取以扫描激光的脉冲速率。通过使用图中的光标，将激光脉冲调谐到吸收红外光的样品热膨胀的机械响应频率。然后，选择选项 PLL 以监控样品和尖端之间的接触共振。按 PLL 窗口中的零按钮，勾选启用以跟踪采样尖端触点谐振。选择积分增益 I = 0.5，按比例增益 P = 10。关闭窗口。
  13. 再次打开优化窗口，找到红外激光器的位置，找到至少3个波数的位置，这些波数对应于样品的主要吸光带（酰石带I-II-III），以及激光的每个芯片至少一个波数。
  14. 点击工具|红外背景校准|新建.在窗口中选择感兴趣的光谱区域（1800~1200cm-1来研究蛋白质样品）;选择步骤 4.12 中确定的相同脉冲速率和 5% 的占空比;点击快速采集并选择激光速度，量子级联激光的典型范围在20~500厘米-1之间。点击采集以测量红外激光背景。该背景光谱将用于测量的纳米尺度局部光谱的规范化。关闭窗口。
    注： 如果快速激光和谐振增强模式不可用，请跳过步骤 4.12，在背景和红外光谱采集窗口中选择阶梯光谱而不是快速。但是，不会达到单个聚合灵敏度。
  15. 在红外光谱设置中，选择 1⁄4cm-1之间的红外光谱分辨率和至少 64 倍的共同平均值。点击采集，测量蛋白质范围内的纳米级局部红外光谱（1800~1200cm-1）。
  16. 要获取纳米级解析化学图，请选择红外成像选项，选择感兴趣的波数（例如，1655cm-1用于胺带 I），然后单击AFM 扫描窗口中的扫描。
  17. 映射完成后，转到文件并保存测量值。要分析获得的形态图、接触共振和化学图以及纳米级局部光谱，请使用内置的AFM图像处理软件。光谱和图像可以保存为 .csv 或 .axz 文件，以便使用商业软件进行进一步的详细分析。

5. 横截面尺寸的图像处理与分析

  1. 使用内置的AFM图像处理软件或商业软件拼合原始图像14，17，19，41，42，59。
    注： 应从计算中屏蔽聚合体，以避免分析伪影和低估其测量高度。
  2. 将图像拼平 0 阶平面适合减法。
  3. 以平面平展图像，然后按 1级回归顺序逐行平展图像，重复第二步，直到达到图像线轮廓中的平面基线。
  4. 如果样本非常拥挤，包含非常高的聚合体或存在扫描仪弓形艺术品，则使用第 2个回归顺序拟合将图像拼平。
  5. 从垂直于纤维轴14、17、19、41、42、59的线轮廓测量聚合高度和宽度。
  6. 测量与纤维轴14、17、19、41、42、59平行的纤维长度。

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Representative Results

A_42聚合的代表性时间过程，由ThT荧光测定测量，如图1所示。聚合过程通常以 sigmoidal 曲线为特征，其中最初观察到滞后阶段，然后是陡峭的生长阶段，在达到平衡稳定状态达到6、7时曲线达到稳定状态之前,58.必须确保使用优化的聚合协议来生成高质量的数据，以研究与聚合过程有关的分子细节58。

AFM 的高分辨率能够研究在过程的不同时间点聚合物种的形态和异质性。在通过ThT测定监测的聚合过程中，板中的样本等分准备由AFM和纳米红外进行单次聚合调查（图1）。手动样品制备的典型工艺流程如图2所示。在完成通过高分辨率和相控AFM对样品的三维形态的测量时，将地图拼合，以消除压电扫描仪的非线性，减少样品后处理分析中的误差源形态学（图3）。随后，可以进行准确和敏感的单分子统计分析，如图4所示。从 3D 形态图中，可以提取聚合横截面高度、宽度和长度（或球形颗粒的直径），从而能够区分和描述聚合期间存在的不同种类的聚合物课程23，38.研究聚合过程的典型时间点是滞后阶段、生长阶段和高原阶段（图1）。在滞后阶段，A+42的单体和寡聚种主要存在。当AFM可视化时，A_42的单体和寡聚物种通常显示为直径1~15纳米的球形颗粒和0.3+2纳米的高度（图1，左下）38，39。在A+42聚合时间段的生长阶段（图1，中下）38、39，可看到细长原纤维、原纤维和纤维蛋白的形成。通常，原丝显示为长数百纳米长，高度为0.5±2纳米，而原纤维状体显示为细长线性或曲线聚合体，高度为1~5纳米，长度为38的数百纳米。 39.在高原阶段，纤维蛋白是A+42聚合体的主要物种。A_42 纤维通常显示为无分支的线状结构，横截面直径为 6×10 nm，长度顺序为微米（图3，右下角）38、39。值得注意的是，这种聚合体形态特性的原理图表示是大多数聚合蛋白和肽13、14的一般特征。

在样品形态学调查后，纳米红外可用于研究聚合过程中存在的单个蛋白质聚合物种的化学性质，从而获取在空气和本地液体环境24，26，38，4249，50，51，52，.图 5显示了 AFM-IR 设置的示意图。红外源用于在总内部反射中或直接从顶部从底部照亮样品，如图 5a所示。如果红外光被样品吸收，它将激发存在物种的相应分子振动能量过渡水平。振动能量以热加热的形式在样品内部消散，从而导致样品的热膨胀。这种膨胀由AFM尖端在纳米尺度上测量，与样品接触，分辨率为10nm。在每个脉冲处，悬臂检测热膨胀。特别是，样品的快速膨胀使悬臂与样品接触，在踢出悬臂环后，其自然频率下降。为了提高AFM-IR的灵敏度，可以调整悬臂54振荡频率相同的激光脉冲频率。为了在这种谐振增强模式下工作，必须有可在广泛频率范围内脉冲的红外源，例如通常在 1~1000 kHz 范围内工作的量子级联激光器。原始悬臂偏转的环形信号的峰值到峰值振幅和称为红外振幅的快速傅立叶变换与吸收的红外光成正比。通过测量聚焦在悬臂顶部的红色激光的偏转，实时检测这些信号。为了获得化学图，激光波数固定在一定的波数，并在地图的每个点收集红外振幅信号，而为了获得红外光谱，悬臂的位置固定在感兴趣的位置，激光波长沿感兴趣的光谱范围扫描。AFM-IR的最终分辨率能够测量横截面高度约为5nm的蛋白质聚合体的化学特性，如图6所示。

Figure 1
图1：通过ThT荧光和AFM监测体外聚集时间过程。
在ThT荧光检测到的聚合过程的滞后阶段、生长阶段和高原阶段采集的样本通过高分辨率AFM进行成像。这个数字是从Ruggeri等人38。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2：用于AFM测量的基板制备和样品沉积的原理图表示。
（A， B）使用胶带进行米卡蚀刻。（C） 样品沉积.（D） 样本孵化.（E） 用超纯水取样。（F） 在氮气的温和流动下进行样品干燥。（G） 使用微制 AFM 悬臂进行样品成像，其末端有尖尖。（H） 淀粉样纤维蛋白的已处理图像.请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3：AFM图像处理过程42。
每个面板的顶部显示由相应的 AFM 图像绘制的样本表面的轮廓线（红线），而下部显示图像中所有像素高度的直方图。（a） 图像拼合过程前的原始 AFM 图像。（b） AFM图像处理后使用整个平面展平。纤维结构（粉红色）从平展过程中被遮盖。（c） 使用逐行拼合过程处理的图像。（d） 图像处理程序后的最终图像。这个数字是从Ruggeri等人42。

Figure 4
图4：AFM图像的单次聚合统计分析。
（a） 纤维结构的高度和长度的跟踪示例，以 1 和 2 表示。（b） 与追踪纤维的各个部分及其平均高度的图表。（c） 显示纤维结构平均高度的直方图示例。（d） 具有追踪纤维1和2的规范化轮廓的图形。（e） 归一化剖面高度点的直方图分布.这个数字是从Ruggeri等人42。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图5：AFM-IR方法的功能原理。
（a） 吸收的红外光会导致样品的热膨胀，刺激AFM悬臂与样品接触的机械共振。悬臂振荡的振幅与红外吸收成正比。（b） 在固定激光波长的同时，可扫描样品上的悬臂，获得红外吸收图。（c） 接触中的提示和样品作为耦合弹簧系统，其谐振频率随样品50的内在刚度单调增加。（d） 局部光谱是通过扫描激光波长而获得的，同时固定AFM悬臂的位置。（e） 蛋白质的红外光谱.（f） 综上所述，AFM-IR能够同时研究纳米尺度26的形态、机械和化学性质。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 6
图6：单个淀粉样聚合体红外纳米光谱（纳米红外）。
（a） AFM 形态图.（b） 激光共振峰值为1658cm-1的红外吸收图。（c） 纤维高度的横截面尺寸。（d） 纤维结构的不同位置（用蓝色圆圈标记在面板 b 中）和基板（在面板 b 中标有绿色圆圈）上的红外光谱。通过从平均纤维信号（实蓝线）中减去平均背景信号（实心绿线）从聚合结构（实心黑线）获得的平均净信号。这个数字是从Ruggeri等人42。

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Discussion

该协议的第一个关键步骤是制备单体蛋白，如步骤1.1和1.2中描述的A_42溶液。从高度纯、单一的溶液启动聚合过程至关重要，因为寡头或聚合物种的存在可能导致聚合动力学58的可重复性差，并诱导 AFM 中的人工制品测量（例如，纤维素物种在聚集的初始阶段将明显），这可能导致对数据的误解。基于ThT荧光测定的淀粉样形成的高度可重复动力学数据，与化学动力学5、6、7的主方程形式性有关，允许定义A_42聚合机制在其潜在的分子事件。化学动力学通过考虑新聚合体形成和生长的不同方式，将淀粉样蛋白形成背后的微观步骤与其宏观表现联系起来，例如，在聚合端或次端的伸长聚合表面上的成核。然而，化学动力学本身并不能直接实现纳米尺度上可能的核化现象的可视化，需要它们与单分子方法相结合。

该协议的第二个关键步骤是步骤 2.2 和 2.6_2.8 中描述的基板制备和样品沉积过程。为了避免人工制品，样品必须沉积在干净、原子平坦的表面上。在 AFM 测量中，正确蚀刻云母对于实现无制造、高分辨率至关重要。样品沉积时间也非常重要，因为较长的孵育时间允许在基材表面更好地吸收。然而，它也可能诱发人工自组织和自组装25，这可能会导致人工（如表面诱导的聚合物种），可能导致数据误解。此外，云母表面有负电荷，这意味着只有带正电的分子才容易吸收。如果样品的净电荷为负，使用APTES可以积极使云母表面功能化，从而获得更好的球菌23。微流体喷雾沉积25可用于避免这些影响和人工制品，并以单步和无物的方式沉积样品。

第三个关键步骤是通过 AFM 和 AFM-IR 进行样品成像的正确设置和成像参数的选择，第 3 节所述。用于样品成像的AFM尖端应足够锋利（半径为2~8nm），以实现高分辨率和最小化卷积效应（通过尖端扩大样品特征）14，这可能会导致样品图像的不确定性。选择成像模式（接触或动态）也很重要。对于通过传统 AFM 进行样品成像，动态模式优先于接触模式，因为后一种模式会诱发较大的横向尖端样品摩擦力，从而可能导致样品损坏，并在测量中引入人工制品（例如，样品高度由于纳米凹陷）14，61，62.相反，通过纳米红外进行测量时，接触模式是增强 AFM-IR 信号的首选。对于动态模式下的测量，悬臂应略微低于（攻丝模式）或高于其第一次自由共振振荡的最大值，以确保测量值 14的更高稳定性。成像分辨率取决于像素数和扫描区域，应足够高，以捕获样本中存在的最小细节程度（例如，4 x 4 μm2面积的 1024 x 1024 像素）14、63。低成像分辨率会导致样本图像失真和不确定性，因为信号14数字化时垂直和横向信息丢失。用于成像的扫描速率应足够低，以便尖端能够正确跟踪表面特征，并有足够的时间获取化学信息14。最重要的成像参数之一是成像力。在接触模式下，使用低交互力来保留样品的结构至关重要。在动态模式下，样品的能量耗散应保持不变，以便一致地比较不同样品的形态;通过保持不超过[20]14、42的相变的恒定状态，可以获得独立样品的一致成像。应避免使用较大的成像力，因为它们可能会引起样本图像中的扭曲和不确定性。

由热波动引起的AFM部件膨胀和收缩引起的热漂移，会诱发样本64、65图像中的变形和伪影。垂直方向的漂移可能导致悬臂失去表面轨道并撞到表面，而横向漂移通常会导致表面特征的伸长和图像失真，从而难以实现对样品特征的精确测量。通过对实验室进行精确的温度控制，以及给系统足够的时间（约30分钟）以稳定或执行快速扫描 66、67、68，可以最大限度地减少这些热漂移的影响。,69,70.

AFM-IR 的纳米红外成像和光谱收集的质量可能受多种因素影响，其中最重要的因素是：（i） 红外背景对样品的红外信号划分错误，（ii） 尖端之间的纳米力学接触变化很大和样品，以及（iii）样品过热导致其软化。要将样品的红外光谱正确划分为收集的背景，在相同的激光功率下收集它们至关重要。事实上，红外激光背景的光谱线形状取决于激光的功率。然后，为了避免样品的机械特性对所测化学信息的影响，在光谱和图像采集过程中，监测和跟踪样品与尖端之间的接触共振至关重要。理想情况下，对于光谱采集，在固定接触谐振下脉冲激光就足够了。但是，如果在较大的光谱范围内获取光谱，高强度峰值可能导致样品的强加热及其软化，从而改变尖端样品接触共振，人为地减小红外峰值振幅。因此，在光谱采集过程中跟踪接触共振非常重要，以验证光谱是否不受样品过热的影响。

总之，传统的AFM和纳米红外能够以高分辨率研究在蛋白质聚集24、38期间形成的单个物种的形态、结构和化学性质。然而，它们缺乏化学动力学的能力，无法跟踪它们在原生散装条件下形成的快速动力学。为了解开蛋白质在聚集和误折叠过程中发生的构象变化，有必要开发和应用新的生物物理方法，能够将散装生物物理方法的能力与纳米尺度蛋白质聚合的异质性和超结构特性的研究。这种方法是解决了解蛋白质自我组装问题及其在健康和疾病中的作用的挑战的富有成果的途径。事实上，单一聚合方法能够解开和阐明蛋白质聚合多态性和形成的分子机制。这些信息对于解决了解蛋白质聚集及其在人类疾病发病和进展中的作用的挑战，以及了解其生物技术应用的生物物理特性至关重要。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

作者感谢瑞士国家科学基金会（SNF）的财政支持（赠款号P2ELP2_162116和P300P2_171219），达尔文学院，伊拉斯谟®计划的财政支持（赠款号2018-1-LT01-KA103-046719-15400-P3）和导致这些结果的研究通过ERC赠款PhysProt（协议号337969）、纽曼基金会（T.P.J.K.）和剑桥错折疾病中心（C.G.、M.V.和T.P.J.K.）。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AFM-IR system Anasys Instruments nanoIR 2 or 3 Systems to measure thermal expansion in contact and resonance mode
Corning 96-well Half Area Black/Clear Bottom Polystyrene NBS Microplate Corning 3881
Corning Microplate Aluminium Sealing Tape Corning 6570
Double Sided Adhesive Discs AGAR Scientific AGG3347N
FLUOstar Omega BMG Labtech 415-101 Platereader
Mica Disc 10mm V1 AGAR Scientific AGF7013
Park NX10 AFM system Park Systems N/A Atomic Force Microscope
Platypus Ultra-Flat Gold Chips Platypus Technologies AU.1000.SWTSG
PPP-NCHR-10 cantilevers Park Systems PPP-NCHR-10
Protein LowBind Tubes, 2.0mL Eppendorf 30108132
Silicon gold coated cantilevers Anasys Instruments PR-EX-nIR2
SPM Specimen Discs 12mm AGAR Scientific AGF7001

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生物化学， 问题 151， 淀粉样蛋白， 神经变性， 蛋白质聚合， 原子力显微镜， 红外纳米光谱， 单分子分析， 光谱
通过红外纳米光谱和原子力显微镜对单个蛋白质聚合进行特征化
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Ruggeri, F. S., Šneideris, T., Chia, S., Vendruscolo, M., Knowles, T. P. J. Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (151), e60108, doi:10.3791/60108 (2019).

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