Biochemistry

Caratterizzazione degli aggregati proteici individuali mediante nanospettroscopia a infrarossi e microscopia a forza atomica

Published: September 12, 2019 doi: 10.3791/60108

Francesco Simone Ruggeri¹, Tomas Šneideris^1,2, Sean Chia¹, Michele Vendruscolo¹, Tuomas P. J. Knowles^1,3

¹Centre for Misfolding Diseases, Department of Chemistry, University of Cambridge, ²Institute of Biotechnology, Life Sciences Center, Vilnius University, ³Cavendish Laboratory, Department of Physics, University of Cambridge

Summary

Descriviamo l'applicazione della nanospettroscopia a infrarossi e della microscopia a forza atomica ad alta risoluzione per visualizzare il processo di autoassemblaggio delle proteine in aggregati oligomerici e fibrille amiloidi, che è strettamente associato all'insorgenza e allo sviluppo di una vasta gamma di disturbi neurodegenerativi umani.

Abstract

Il fenomeno del ripiegamento e dell'aggregazione delle proteine porta alla formazione di aggregati proteici altamente eterogenei, associati a condizioni neurodegenerative come il morbo di Alzheimer e il morbo di Parkinson. In particolare gli aggregati a basso peso molecolare, gli oligomeri amiloidi, hanno dimostrato di possedere proprietà citotossiche generiche e sono implicati come neurotossine in molte forme di demenza. Illustriamo l'uso di metodi basati sulla microscopia a forza atomica (AFM) per affrontare il difficile compito di caratterizzare le proprietà morfologiche, strutturali e chimiche di questi aggregati, che sono difficili da studiare utilizzando le strutturali convenzionali metodi biofisici sfusi a causa della loro eterogeneità e natura transitoria. Gli approcci di microscopia a sonda a scansione sono ora in grado di studiare la morfologia degli aggregati amiloidi con risoluzione sub-nanometrica. Dimostriamo qui che la nanospettroscopia a infrarossi (AFM-IR), che sfrutta contemporaneamente l'alta risoluzione dell'AFM e il potere di riconoscimento chimico della spettroscopia IR, può andare oltre e consentire la caratterizzazione delle proprietà strutturali dei singoli aggregati proteici, e quindi offrono approfondimenti sui meccanismi di aggregazione. Poiché l'approccio che descriviamo può essere applicato anche alle indagini sulle interazioni delle assemblee proteiche con piccole molecole e anticorpi, può fornire informazioni fondamentali per sviluppare nuovi composti terapeutici per diagnosticare o trattare disturbi neurodegenerativi.

Introduction

Oltre 40 milioni di persone in tutto il mondo sono attualmente colpite da disturbi neurodegenerativi, come il morbo di Alzheimer (AD)¹ e le malattie di Parkinson (PD)^2. Più in generale, più di cinquanta patologie sono associate a livello molecolare a misfolding e aggregazione delle proteine, un processo che porta alla proliferazione di aggregati di proteine fibrillari insolubili, noti come depositi di amiloide³^, ^4.Le origini molecolari della neurodegenerazione e i suoi legami con i cambiamenti conformazionali proteici delle proteine che portano alla formazione di amiloidi, tuttavia, rimangono poco chiare, in gran parte a causa dell'alto livello di eterogeneità, natura transitoria e su scala nanometrica dimensioni degli aggregati patologici⁴^,⁵.

Indagini di grande successo sulle strutture proteiche negli ultimi decenni si sono basate ampiamente sull'uso di metodi sfusi, tra cui la cristallografia a raggi X, la microscopia crioelettronica e la spettroscopia a risonanza magnetica nucleare⁵^, 6 È ^possibile: ^, ^{7 (in} questo stato ^, 8 (IN ^vio ^, ⁹. All'interno di questa classe di tecniche, la spettroscopia a infrarossi (IR) è emersa come uno strumento analitico sensibile per svelare le proprietà chimiche dei sistemi biologici come le proteine⁸. I metodi di iR consentono la quantificazione delle variazioni strutturali secondarie e quaternarie durante il loro misfolding e aggregazione. Inoltre, al fine di decifrare ulteriormente a livello microscopico i dettagli meccanicistici coinvolti nei complessi paesaggi di energia libera delle proteine durante la loro aggregazione, un importante progresso è stato lo sviluppo di strumenti di cinetica chimica per estendere a complessi percorsi di auto-assemblaggio tra cui amiloide fibrille formazione⁵^,⁶^,⁷^,¹⁰^,¹¹^,¹². Tuttavia, i metodi spettroscopici di massa forniscono solo informazioni medie sull'insieme eterogeneo di specie presenti nella soluzione o coinvolte in specifici passaggi microscopici, rendendo così lo studio delle proprietà biofisiche dei singoli specie aggregate impegnative al livello su nanoscala¹³^,¹⁴.

Diverse tecniche di microscopia con la capacità di operare su scale più piccole del limite di diffrazione della luce sono emerse negli ultimi decenni. Questa classe di metodi include la microscopia elettronica (EM) e la microscopia a forza atomica (AFM). Mentre la microscopia elettronica a scansione (SEM) e la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) forniscono immagini bidimensionali (2D) di un campione, l'AFM è emersa negli ultimi decenni come una tecnica potente e versatile per studiare morfologie tridimensionali (3D), come così come le proprietà nanomeccaniche di un campione con risoluzione sub-nanometrica¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^, ^{20 anni} ^, ^{21 Mieto} ^, ^{22 Milia} ^, ²³ del 23 o ^, ²⁴ Mi lasa' di ^, ^{25 mi lato} ^, ²⁶ del sistema di ^, ^27.La logica alla base dello studio dell'aggregazione proteica tramite AFM è che questo approccio consente di studiare la morfologia delle singole specie presenti nella soluzione¹³^,¹⁴^,¹⁶^, ¹⁷^,¹⁹^,²⁰^,²¹^,²⁵^,²⁷^,²⁸^,²⁹^,³⁰^, ³¹^,³²^,³³^,³⁴^,³⁵^,³⁶^,³⁷. In particolare, monitorando il campione in funzione del tempo, AFM consente di sforare l'evoluzione della morfologia della specie all'interno del campione, che permette di seguire e visualizzare i percorsi di formazione di amiloidi²³^, ²⁵^,³⁸^,³⁹^,⁴⁰^,⁴¹^,⁴². Inoltre, AFM consente la quantificazione dei parametri strutturali come le altezze e le lunghezze trasversali delle singole specie presenti nella soluzione¹³^,¹⁹^,³⁰^,³¹ ^,³²^,³³^,³⁴^,³⁵^,³⁶^,³⁷^,⁴⁰^,⁴³^, ^{44 (di sistema)} ^, ^{45 anni} ^, ⁴⁶ per quanto ^, ^{47 o} ^, ⁴⁸. Tuttavia, lo studio di una singola proprietà biofisica, come la morfologia, spesso non è sufficiente quando si studiano sistemi biologici eterogenei e complessi. I metodi di imaging AFM, SEM o TEM da soli non rivelano facilmente le proprietà chimiche delle specie eterogenee di aggregati amiloidi su scala nanometrica.

Un importante progresso per l'analisi di campioni biologici eterogenei di questa portata è stato recentemente fatto con lo sviluppo e l'applicazione al campo dell'aggregazione proteica della nanospettroscopia infrarossa (AFM-IR)²⁴^,²⁶^, ³⁸^,⁴²^,⁴⁹^,⁵⁰^,⁵¹^,⁵². Questo metodo innovativo sfrutta la combinazione della risoluzione spaziale dell'AFM (1-10 nm) con il potere di analisi chimica di IR. La tecnica AFM-IR si basa sulla misurazione dell'effetto di risonanza indotta fototermica guidato da un laser AIR e sulla misurazione dell'espansione termica del campione in esame da parte della punta AFM. Il campione può essere illuminato dal laser a infrarossi direttamente dall'alto o dal basso nella riflessione interna totale, come nella spettroscopia a infrarossi convenzionale²⁴^,⁴²^,⁵²^,⁵³. Il laser a raggi IR può essere pulsato con frequenze tipiche nell'ordine di centinaia di kilohertz (1,1000 kHz) e sintonizzato su un'ampia gamma spettrale, in genere tra i 1000-3300 cm^-1. Anche se la sorgente laser copre un'area di 30 m di diametro, la risoluzione spaziale della tecnica AFM-IR è determinata nominalmente dal diametro della punta AFM, che rileva l'espansione termica locale del sistema. AFM-IR è adatto per studiare campioni biologici perché il segnale IR è proporzionale al loro spessore fino a 1,5 m, e gli spettri IR risultanti sono generalmente in accordo con i corrispondenti spettri di trasmissione FTIR¹³^,⁵⁴ ^,⁵⁵. Per questo motivo, i metodi stabiliti di analisi in spettroscopia possono essere facilmente applicati, come lo studio dei cambiamenti chimici, il cambiamento della forma della banda e la de-convoluzione mediante l'analisi dei secondi derivati⁵². Nel complesso, combinando la risoluzione spaziale dell'AFM con il potere di riconoscimento chimico della spettroscopia IR, AFM-IR consente l'acquisizione simultanea di un'ampia gamma di proprietà morfologiche, meccaniche e chimiche di un campione su scala nanometrica.

Qui, illustriamo un protocollo per la caratterizzazione del processo di aggregazione proteica che sfrutta la combinazione di saggi di fluorescenza in vitro, imaging AFM ad alta risoluzione e AFM-IR su nanometrica. Questo approccio combinato ha già eccellere nel fornire risultati dettagliati nello studio delle proprietà chimiche e strutturali delle singole micro-goccioline formate da aggregati proteici, nello studio della separazione di fase delle proteine liquide liquide e in studiare l'eterogeneità e le proprietà biofisiche delle singole specie aggregate su nanoscala²³^,²⁶^,³⁸^,⁴⁵^,⁵⁰^,⁵³^, ⁵⁶^,⁵⁷.

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Protocol

1. Saggi di aggregazione sui lettori di placche a fluorescenza

NOTA: Il protocollo qui descritto è un esempio di come studiare l'aggregazione di qualsiasi proteina o peptide da cinetica chimica. In particolare, descrive un protocollo ottimizzato per studiare l'aggregazione del peptide A42, che è coinvolto nell'insorgenza e nella progressione del morbo di Alzheimer⁵⁸^,⁵⁹. Un protocollo simile può essere regolato e adottato per studiare l'aggregazione di qualsiasi proteina o peptide.

Ottenere una soluzione monomerica altamente pura di A -42 attraverso tecniche di cromatografia di scambio io-io e di esclusione delle dimensioni per distinguere le frazioni proteiche che contengono L'A42, e per isolare la frazione monomerica da altre forme aggregate di A42 ottenuta⁵⁸ ^, ⁵⁹.
Diluire il peptide in un cuscinetto di fosfato di sodio da 20 mM, 200 EDTA a 200 m EDTA a pH 8,0⁵⁸ a una concentrazione finale desiderata che va da 1,5 ml, in tubi a basso legame da 1,5 ml. I campioni raccolti per le misurazioni AFM non devono contenere il tinrito fluorescente utilizzato nell'analisi di aggregazione (thioflavin T, ThT), in quanto potrebbe introdurre artefatti durante la deposizione del campione per l'analisi AFM. Quindi, preparate triplicati di due soluzioni identiche: i) la prima contenente il monomerico A-42 a seguire il processo di aggregazione da parte dell'AFM; ii) il secondo contenente il monomerico A42 con l'aggiunta di 20 M ThT come tracciante per monitorare la cinetica dell'aggregazione.
NOTA: è importante eseguire i passaggi 1.1 e 1.2 sul ghiaccio. Questa procedura è quella di garantire che la soluzione monomerica A-42 non si aggrega fino a quando non viene avviata nel lettore di piastre. Quando si maneggiano i campioni, è essenziale un'attenta pipettatura per evitare l'introduzione di bolle d'aria che possono influenzare il campione proteico.
Pipette 80 -L di ogni campione in ogni pozzo di una piastra a 96 pozze, a mezza area di polistirolo nero con fondo chiaro e superfici non vincolanti.
Sigillare la piastra con un foglio per ridurre al minimo l'evaporazione del campione nel corso dell'aggregazione.
Equilibrio e la temperatura del lettore di piastre a 37 gradi centigradi.
Impostare il protocollo di aggregazione per leggere le misurazioni della fluorescenza a intervalli di tempo fissi, a una lunghezza d'onda di eccitazione di 440 nm e a una lunghezza d'onda di emissione di 480 nm. L'aggregazione deve essere avviata in condizioni di quiescente.
Inserire la piastra nel lettore di piastre.
NOTA: è importante prestare attenzione durante la gestione della piastra, per garantire che l'aggregazione non venga attivata prima di avviare il lettore di piastre. Utilizzare le impostazioni di regolazione del guadagno per garantire la lettura ottimale della fluorescenza di ogni campione.
Avviare la misurazione.
NOTA: L'esperimento di aggregazione si conclude quando la curva sigmoidale a fluorescenza ThT raggiunge un altopiano⁵⁸.

2. Preparazione del campione per le misurazioni AFM e nano-IR

Incolla il disco V1 mica di alta qualità al disco in acciaio magnetico in acciaio inox di alta qualità utilizzando schede adesive o nastro a doppio lato.
Incisa mica posizionando un pezzo di nastro adesivo sulla superficie della mica e tirando fuori lo strato superiore della mica. Questa procedura produrrà una superficie pulita, atomicamente piana, adatta per la deposizione del campione.
NOTA: La superficie incisa deve essere uniforme e liscia.
DESTRA: Non toccare o respirare direttamente sopra la mica appena incisa, in quanto ciò introdurrà artefatti.
Mettere in pausa/interrompere la misurazione del lettore di piastre per raccogliere il punto di interesse durante il processo di aggregazione della proteina.
Rimuovere la pellicola di guarnizione e raccogliere 10 gradini dei campioni senza ThT dal pozzo in un tubo a bassa legatura da 1,5 ml.
Depositare i 10 l del campione sulla mica appena incisa. Per le misurazioni AFM-IR i campioni devono essere depositati su substrato d'oro appena spogliato.
Incubare la soluzione sulla mica per 1 min per consentire la fisisorbazione.
NOTA: Tempi di incubazione più lunghi consentirebbero un migliore assorbimento in superficie, ma può indurre l'auto-organizzazione artificiale e l'auto-assemblaggio²⁵. Per evitare questi effetti, la deposizione spray può essere sfruttata²⁵.
Risciacquare tre volte con 1 mL di acqua ultrapura.
Asciugare sotto un delicato flusso di azoto per misurare il campione nell'ambiente atmosferico.

3. Imaging AFM della morfologia degli aggregati proteici

NOTA: Le misurazioni morfologia possono essere eseguite sia in modalità di contatto che dinamica, nei passaggi seguenti quest'ultimo viene descritto poiché riduce le forze laterali per misurare la morfologia 3D del campione ad alta risoluzione. Le misurazioni AFM-IR verranno eseguite in modalità di contatto per migliorare il rapporto segnale-rumore AFM-IR.

Accendere il sistema AFM almeno 30 min prima delle misurazioni per consentire al sistema di raggiungere la stabilità termica. Fare clic su Setup (Setup),quindi su Probe (Sonda). Nella finestra Cambio sonda, fare clic su Avanti per preparare lo stage di messaa fuoco .
Spegnere l'interruttore del fascio AFM (se è acceso). Sbloccare i blocchi coda di colomba, scollegare la testa dal sistema e in Sonda Cambia finestra fare clic su Avanti.
Montare lo sbalzo AFM sul supporto della sonda. Collegare la testa al sistema e bloccare le serrature a coda di rondine.
NOTA: I cantilever ottimali per studiare campioni biologici in modalità dinamica AFM hanno una costante a molla compresa tra 2-40 N m^-1 e un radii dell'apice compreso tra 2-8 nm¹⁴.
Attivare l'interruttore del fascio laser AFM e nella finestra Cambio sonda fare clic su Avanti.
Nella finestra pop-up fare clic su No se il tipo di sbalzo non è cambiato. Regolare le manopole di allineamento ottiche per trovare il cantilever. Regolare lo stato attivo sul cantilever e fare clic su Avanti.
Nella finestra pop-up fare clic su Sì se lo stato attivo è sul cantilever.
Posizionare il raggio laser all'estremità del cantilever utilizzando le manopole di controllo della posizione del laser di rilevamento. Massimizzare il segnale totale misurato dal fotodiodo a quattro quadranti almeno >1 V utilizzando le manopole che controllano la posizione del fascio laser deviato sul fotodiode sensibile alla posizione (PSPD). Nella finestra Cambio sonda fare clic su Avanti e quindi su Chiudi.
Attendere 15 min per lo sbalzo per raggiungere la stabilità termica. Se necessario, riadattare la posizione del raggio laser deviato sul PSPD.
Fare clic su NCM SWEEP, scegliere l'ampiezza desiderata di oscillazione, fare clic su Usa fase, fare clic su auto e sintonizzare il cantilever vicino al massimo della sua prima risonanza libera di oscillazione, che è di circa 300 kHz per un sbalzo con una costante di molla di 40 N m^-1.
NOTA: Sintonizzare il cantilever dal massimo della sua risonanza libera assicura una maggiore stabilità delle misurazioni¹⁴.
Posizionare il campione sul supporto del campione. Scegliere i parametri di imaging adatti. La velocità di scansione tipica è di 0,3,0 Hz per un'area di scansione di 1 x 1 m^{da 2} a 5 x 5 m². La risoluzione tipica necessaria è compresa tra 256 x 256 e 1024 x 1024 pixel. Fare clic su Area di scansione per scegliere la dimensione della scansione e il numero di pixel.
Concentrare la vista ottica sul campione. Fare clic su Approccio per avvicinarsi alla superficie di campionamento. Una volta completato l'approccio clicca sul Sollevamento di 100 m per alzare la punta AFM di 100 m sopra la superficie del campione. Fare clic su Espandi sull'immagine ottica del campione. Fare clic sulla barra dello stage di messa a fuoco per mettere a fuoco la vista sulla superficie del campione.
Utilizzare le frecce per spostarsi nella regione del campione di interesse. Attivare la superficie premendo il pulsante Avvicina. Fare clic sul pulsante Scansione linea e verificare se la punta segue bene la superficie, se necessario, regolare il Puntodi impostazione .
Iniziare a imaging la superficie campione premendo il pulsante Scansione. Durante l'imaging, per evitare una forza di imaging di grandi dimensioni e mantenere la coerenza all'interno di campioni indipendenti, mantenere un regime costante di cambiamento di fase che non superi i⁴²gradi.
Immettere il nome del file e scegliere la directory di base in cui verrà salvata l'immagine acquisita.

4. Misurazioni di nanosptroscopia infrarossi di aggregati proteici

Accendere il sistema AFM-IR e il laser a infrarossi (IR)⁶⁰ 30-60 min prima delle misurazioni per la stabilizzazione termica. I laser tipici degli strumenti AFM-IR sono gli oscillatori di parametri ottici (OPO) e i laser a cascata quantistica (QCL).
Aprire il software integrato per controllare lo strumento. Fare clic sul file e quindi su nuovo per aprire un nuovo file nanoIR. Premere il pulsante inizializzare per avviare il sistema AFM-IR.
Aprire il coperchio dello strumento e montare sul sistema AFM-IR una sonda rivestita in oro di silicio con un raggio nominale di 30 nm e una costante di molla di 0,2 N/m per misurare il campione in modalità di contatto.
Fare clic su Carica nella sezione Sonda AFM e quindi su Avanti. Nella parte d'accorto sulla sezione sonda fare clic sulle frecce per mettere a fuoco la fotocamera sul cantilever. Nella sezione campione di movimento XY, utilizzare le frecce per posizionare l'aria trasversale alla fine dello sbalzo.
Ruotare le manopole che controllano la posizione del laser di rilevamento per posizionare il laser alla fine dello sbalzo. Ruotare le manopole laser per rilevare e massimizzare la somma misurata dal fotodiodo a quattro quadranti su un valore >3 V. Ruotare la manopola di deflessione per regolare la deflessione a sbalzo a -1 V e quindi fare clic su Avanti. Chiudere il coperchio dello strumento.
Nella sezione concentrarsi sul campione utilizzare le frecce per mettere a fuoco la fotocamera sul campione. Quindi, nella sezione campione movimento XY utilizzare le frecce per muoversi nella regione di interesse del campione e fare clic su avvicinarsi e coinvolgere.
Nella finestra del microscopio selezionare come input i canali di interesse per mappare le proprietà biofisiche del campione. In particolare, scegliere l'altezza per la morfologia, l'ampiezza 2 per l'assorbimento IR e la frequenza PLL per mappare la risonanza di contatto tip-sample.
Nella sezione di scansione AFM della finestra dei controlli, utilizzare parametri simili come nella sezione 3 (ad esempio, la frequenza di scansione 0,1-1,0 Hz, tra 256 x 256 e 1024 x 1024 pixel). Scegli come valore dei guadagni in base alla rugosità del campione: integrale I - 1/10 e P proporzionale - 10/30. Quindi, fare clic su scansione per acquisire una mappa di morfologia.
NOTA: la morfologia può essere misurata in modo simile nella modalità di maschiatura dinamica, ma le misurazioni AFM-IR vengono eseguite qui in modalità di contatto per avere rapporti segnale/rumore più elevati.
Al termine della mappatura della morfologia, nella finestra del microscopio, fare clic sulla mappa dell'altezza per posizionare la sonda sulla parte superiore di un aggregato. Quindi, nella sezione nanoIR della finestra dei controlli, fare clic su Avvia IR per illuminare il campione con il laser a iR.
Per mettere a fuoco il laser a infrarossi sul cantilever, fare clic sull'ottimizzazione. In questa finestra, scrivere un numero d'onda in cui il campione avrà un'elevata assorbimento e fare clic su aggiungi. Per le proteine, un valore tipico è 1655 cm^-1. Fare clic sulla scansione per trovare la posizione laser a iR e fare clic su Aggiorna per allineare la sua posizione con lo sbalzo. Chiudere la finestra.
Nella sezione generale dell'impostazione nanoIR, scrivere un numero d'onda in cui è prevista un'elevata assorbimento nel campo relativo. Quindi, disattivare l'opzione Filtro passaggio banda e osservare la lettura del contatore e la rapida trasformazione di Fourier (FFT) della risposta a sbalzo. Nella finestra FFT spostare il cursore verde per leggere la frequenza di risonanza del sbalzo. Un valore tipico della FFT della risonanza dei cantileverèè di circa 300 kHz. Scrivere questo valore di frequenza di risonanza nella sezione generale nel campo del centro freq e utilizzare una finestra freq.
NOTA: Selezionare una potenza laser sufficientemente bassa da non saturare la lettura del misuratore e per avere distorsioni nella risposta a sbalzo e per non surriscaldare il campione.
Fare clic sulla finestra di sintonizzazione a impulsi laser per utilizzare la modalità avanzata di risonanza. Scegli un centro di frequenza di 300 kHz, una gamma di accordatoria di 50 kHz e un ciclo di servizio del laser del 5%. Fare clic sull'acquisizione per spazzare la frequenza cardiaca del laser. Utilizzando il cursore nel grafico, regolare l'impulso laser alla frequenza della risposta meccanica dell'espansione termica del campione che assorbe la luce IR. Quindi, selezionare l'opzione PLL per monitorare la risonanza del contatto tra il campione e la mancia. Premere il pulsante zero nella finestra PLL e selezionare enable per tenere traccia della risonanza di contatto del suggerimento di esempio. Scegli un guadagno integrale I - 0,5 e il guadagno proporzionale P - 10. Chiudere la finestra.
Aprire nuovamente la finestra di ottimizzazione e trovare la posizione del laser AIR per almeno 3 numeri d'onda corrispondenti alle principali bande di assorbimento del campione (amide banda I-II-III) e per almeno un numero d'onda per ogni chip del laser.
Fare clic su Strumenti . Calibrazione dello sfondo IR Nuovofile . Nella finestra selezionare la regione spettroscopica di interesse (1800-1200 cm^-1 per studiare campioni proteici); scegliere la stessa frequenza cardiaca determinata al punto 4.12 e un ciclo di servizio del 5%; clicca sull'acquisizione veloce e seleziona la velocità del laser, la gamma tipica per un laser a cascata quantistica è tra 20-500 cm^-1. Fare clic su Acquisisci per misurare lo sfondo laser a iR. Questo spettro di fondo verrà utilizzato per la normalizzazione degli spettri localizzati su nanoscala misurati. Chiudere la finestra.
NOTA: se non è disponibile una modalità avanzata laser e risonanza veloce, salta il passaggio 4.12 e seleziona gli spettri passo invece di velocizzare sia in background che nelle finestre di acquisizione degli spettri IR. Tuttavia, la sensibilità aggregata singola non sarà raggiunta.
Nelle impostazioni degli spettri IR, scegliete una risoluzione dello spettro IR compresa tra 1 -4 cm^-1 e un numero di co-medie di almeno 64x. Fare clic su Acquisisci per misurare uno spettro iR localizzato su scala nanometrica nella gamma proteica (1800-1200 cm^-1).
Per acquisire una mappa chimica risolta su nanoscala, selezionare l'opzione di imaging IR, scegliere un numero d'onda di interesse (ad esempio, 1655 cm^-1 per la banda interna I) e fare clic sulla scansione nella finestra di scansione AFM.
Una volta completata la mappatura, andare su file e salvare le misure. Per analizzare le mappe acquisite di morfologia, risonanza di contatto e chimica, nonché gli spettri localizzati su nanoscala, utilizzare il software di elaborazione delle immagini AFM integrato. Spectra e Immagini possono essere salvati come file .csv o .axz per un'ulteriore analisi dettagliata con software commerciale.

5. Elaborazione e analisi delle dimensioni trasversali

Appiattire le immagini raw¹⁴^,¹⁷^,¹⁹^,⁴¹^,⁴²^,⁵⁹ utilizzando il software di elaborazione delle immagini AFM incorporato o il software commerciale.
NOTA: le aggregazioni devono essere mascherate dal calcolo per evitare artefatti di analisi e sottovalutazione della loro altezza misurata.
Appiattire l'immagine per 0 ordine di adattamento sottrazione.
Appiattire l'immagine in base al piano e quindi riga per riga in un ordine di regressione di 1^st, il secondo passaggio viene ripetuto fino a raggiungere la linea di base piatta nel profilo di linea dell'immagine.
Se il campione è molto affollato, contiene aggregati eccezionalmente elevati o l'artefatto dell'arco dello scanner è presente, appiattire l'immagine utilizzando l'adattamento dell'ordine di regressione 2^nd.
Misurare l'altezza e la larghezza aggregate da un profilo di linea preso perpendicolare all'asse fibrilla¹⁴^,¹⁷^,¹⁹^,⁴¹^,⁴²^,⁵⁹.
Misurare la lunghezza della fibrilla parallela all'asse fibrilla¹⁴^,¹⁷^,¹⁹^,⁴¹^,⁴²^,⁵⁹.

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Representative Results

Nella figura 1 è illustrato un corso di tempo rappresentativo di aggregazione a 42, misurato dal saggio di fluorescenza ThT, nella Figura 1. Il processo di aggregazione è comunemente caratterizzato da una curva sigmoidale, in cui si osserva inizialmente una fase di ritardo, ed è seguito da una fase di crescita ripida, prima che la curva raggiunga un altopiano quando viene raggiunto uno stato stabile di equilibrio⁶^,⁷ ^, ⁵⁸. È essenziale garantire che venga utilizzato un protocollo di aggregazione ottimizzato per generare dati di alta qualità per studiare i dettagli molecolari relativi ai processi di aggregazione⁵⁸.

L'alta risoluzione dell'AFM consente di studiare la morfologia e l'eterogeneità delle specie aggregate in diversi momenti del processo. Durante l'aggregazione, monitorata dal saggio ThT, i valori del campione nelle piastre vengono preparati per un'indagine aggregata singola da AFM e nano-IR (Figura 1). Il flusso di processo tipico della preparazione manuale dei campioni è illustrato nella Figura 2. Al completamento della misurazione della morfologia 3D del campione mediante AFM ad alta risoluzione e a controllo di fase, le mappe vengono appiattite per rimuovere la non linearità dello scanner piezoelettrico e ridurre le fonti di errore nell'analisi post-elaborazione del campione morfologia (Figura 3). Successivamente, è possibile eseguire un'analisi statistica accurata e sensibile di una singola molecola, come illustrato nella Figura 4. Da una mappa morfologia 3D, è possibile estrarre l'altezza, la larghezza e la lunghezza della sezione trasversale aggregata (o diametro in caso di particelle sferoidali), che permette di distinguere e caratterizzare specie distinte di aggregati presenti durante il tempo di aggregazione corso²³^,³⁸. I punti di interesse tipici per studiare il processo di aggregazione sono la fase di ritardo, la fase di crescita e la fase di plateau (Figura 1). Durante la fase di ritardo, sono presenti principalmente specie monomeriche e oligomeriche di A-42. Quando viene visualizzata dall'AFM, le specie monomeriche e oligomeriche dell'A-42 appaiono in genere come particelle sferoidali di 1-15 nm di diametro e 0,3 nm di altezza (Figura 1, in bassoa sinistra)³⁸^,³⁹. Durante la fase di crescita del corso di aggregazione a 42 ( Figura1,medio -min)^èvisibile la formazione di protofilamenti allungati, protofibrille e fibrille. Tipicamente, i protofilamenti appaiono come caratteristiche allungate di centinaia di nanometri di lunghezza e 0,5-2 nm di altezza, mentre le protofibrille appaiono come aggregati lineari o curvilinei allungati 1-5 nm in altezza e centinaia di nanometri di lunghezza³⁸^, ³⁹. Durante la fase dell'altopiano, le fibrille sono la specie dominante di aggregati A-42. Le fibrille di A42 appaiono in genere come strutture non ramificate, simili a filettature, con un diametro trasversale di 6-10 nm e lunghezza nell'ordine in cui i micrometri (Figura 3, in bassoa destra)³⁸^,³⁹. Sorprendentemente, questa rappresentazione schematica delle proprietà morfologiche degli aggregati è una caratteristica generale della maggior parte dell'aggregazione di proteine e peptidi¹³^,¹⁴.

Dopo l'indagine della morfologia del campione, il nano-IR può essere utilizzato per studiare le proprietà chimiche delle singole specie aggregate proteiche presenti durante il processo di aggregazione, acquisendo mappe IR e spettri risolti su nanoscala sia nell'aria che negli spettri ambiente liquido nativo²⁴^,²⁶^,³⁸^,⁴²⁴⁹^,⁵⁰^,⁵¹^,⁵²^,. Figura 5 mostra un'illustrazione schematica della configurazione AFM-IR. Un'origine IR viene utilizzata per illuminare il campione dal basso in riflessione interna totale o direttamente dall'alto come nella Figura 5a. Se la luce IR viene assorbita dal campione, eccita i corrispondenti livelli di transizione dell'energia vibrazionale molecolare delle specie presenti. L'energia vibrazionale viene dissipata all'interno del campione sotto forma di riscaldamento termico, che provoca l'espansione termica del campione. Questa espansione è misurata su scala nanometrica dalla punta AFM a contatto con il campione con una risoluzione nell'ordine di 10 nm. Ad ogni impulso, lo sbalzo rileva l'espansione termica. In particolare, la rapida espansione del campione solleva il cantilever dal contatto con il campione, e dopo il calcio fuori il cantilever squilla alle sue frequenze naturali. Al fine di migliorare la sensibilità di AFM-IR, è possibile sintonizzare la frequenza dell'impulso laser alla stessa frequenza dell'oscillazione del cantilever⁵⁴. Per lavorare in questa modalità con risonanza avanzata, è necessario disporre di sorgenti irofanti che possono essere pulsate in un'ampia gamma di frequenze, come i laser a cascata quantistica che operano tipicamente in un intervallo compreso tra 1,1000 kHz. L'ampiezza picco-picco e la rapida trasformazione di Fourier del segnale ringdown, definita ampiezza IR, della deflessione a sbalzo grezzo sono proporzionali alla luce IR assorbita. Questi segnali vengono rilevati in tempo reale misurando la deviazione di un laser rosso focalizzato sulla parte superiore del cantilever. Al fine di acquisire mappe chimiche, il numero d'onda laser è fissato ad un certo numero d'onda e il segnale di ampiezza IR viene raccolto in ogni punto della mappa, mentre, per acquisire spettri IR, la posizione del cantilever è fissata in una posizione di interesse e il laser lunghezza d'onda viene spazzata lungo l'intervallo spettroscopico di interesse. La risoluzione finale di AFM-IR consente la misurazione delle proprietà chimiche degli aggregati proteici con un'altezza trasversale di circa 5 nm, come indicato nella Figura 6.

Figura 1: Monitoraggio del corso temporale di aggregazione in vitro tramite fluorescenza ThT e AFM.
I campioni prelevati durante la fase di ritardo, la fase di crescita e la fase dell'altopiano del processo di aggregazione rilevati dalla fluorescenza ThT sono stati immagini tramite AFM ad alta risoluzione. Questa cifra è stata adattata da Ruggeri et al.³⁸. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Rappresentazione schematica della preparazione del substrato e deposizione del campione per le misurazioni AFM.
(A, B) Incisione Mica con nastro adesivo. (C) Deposizione di campioni. (D) Esempio di incubazione. (E) Campione di risciacquo con acqua ultrapura. (F) Essiccazione del campione sotto flusso delicato di azoto. (G) Esempio di imaging con sbalzo AFM microfabbricato con punta affilata sulla sua estremità. (H) Immagine elaborata delle fibrille amiloidi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: procedura di elaborazione delle immagini AFM⁴².
La parte superiore di ogni pannello mostra una linea di profilo della superficie campione (linea rossa) illustrata dall'immagine AFM corrispondente, mentre la parte inferiore mostra un istogramma dell'altezza di tutti i pixel dell'immagine. (a) Procedura di appiattimento dell'immagine prima della procedura di appiattimento dell'immagine. (b) Immagine AFM dopo la procedura di elaborazione utilizzando l'intero appiattimento del piano. Le strutture fibrillare (colore rosa) sono state mascherate dalla procedura di appiattimento. (c) Immagine elaborata utilizzando la procedura di appiattimento riga per riga. (d) Immagine finale dopo la procedura di elaborazione delle immagini. Questa cifra è stata adattata da Ruggeri et al.⁴².

Figura 4: Singola analisi statistica aggregata delle immagini AFM.
(a) Esempio di tracciamento delle altezze e delle lunghezze delle strutture fibrillari, indicato con 1 e 2. (b) Grafico con sezioni delle fibrille tracciate e la loro altezza media. (c) Esempio di istogramma che mostra l'altezza media delle strutture fibrillari. (d) Grafico con profilo normalizzato delle fibrille tracciate 1 e 2. (e) Distribuzione istogramma dei punti di altezza del profilo normalizzati. Questa cifra è stata adattata da Ruggeri et al.⁴². Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Principio di funzione del metodo AFM-IR.
(a) La luce IR assorbita provoca l'espansione termica del campione, eccitando le risonanze meccaniche del cantilever AFM a contatto con il campione. L'ampiezza delle oscillazioni a sbalzo è proporzionale all'assorbimento IR. (b) Si ottengono mappe di assorbimento iR che scansionano il cantilever sul campione mentre fissano la lunghezza d'onda laser. (c) La punta e il campione a contatto si comportano come un sistema di molle accoppiate la cui frequenza di risonanza aumenta monotonamente con la rigidità intrinseca del campione⁵⁰. (d) Gli spettri localizzati si ottengono spazzando la lunghezza d'onda laser mentre si fissa la posizione del cantilever AFM. (e) Spettro IR di proteine. (f) In sintesi, l'AFM-IR consente lo studio simultaneo delle proprietà morfologiche, meccaniche e chimiche su nanoscala²⁶. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Nanospettroscopia a infrarossi (nano-IR) di un singolo aggregato amiloide.
(a) Mappa morfologia AFM. (b) Mappa di assorbimento IR al picco di risonanza laser a 1658 cm^-1. (c) Dimensioni selvatri e trasversali dell'altezza della fibrilla. (d) Spettri IR su diverse posizioni della struttura fibrillare (contrassegnati nel pannello b con cerchi blu) e del substrato (contrassegnato nel pannello b con cerchi verdi). Il segnale netto medio derivante dalla struttura aggregata (linea nera continua) è stato ottenuto sottraendo il segnale di sfondo medio (linea verde solida) dal segnale fibrillo medio (linea blu solida). Questa cifra è stata adattata da Ruggeri et al.⁴².

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Discussion

Il primo passo critico di questo protocollo è la preparazione di proteine monomeriche, come nel caso della soluzione A42 descritta nei passaggi 1.1 e 1.2. È essenziale avviare il processo di aggregazione da una soluzione monomerica altamente pura, in quanto la presenza di specie oligomeriche o aggregate può provocare una scarsa riproducibilità della cinetica di aggregazione⁵⁸e indurre artefatti nell'AFM misurazioni (ad esempio, le specie di fibrillar saranno evidenti nelle fasi iniziali dell'aggregazione), che possono portare a un'errata interpretazione dei dati. I dati cinetica altamente riproducibili della formazione di amiloide basati sul saggio di fluorescenza ThT, in associazione con il formalismo dell'equazione principale della cinetica chimica⁵^,⁶^,⁷, hanno permesso di definire l'aggregazione a42 meccanismo in termini di eventi molecolari sottostanti. La cinetica chimica collega i passaggi microscopici alla base della formazione di amiloidi con le loro manifestazioni macroscopiche considerando i diversi modi in cui nuovi aggregati possono formarsi e crescere, che sono ad esempio l'allungamento alle estremità aggregate o secondari nucleazione sulla superficie aggregata. Tuttavia, la cinetica chimica di per sé non consente direttamente la visualizzazione dei possibili fenomeni di nucleazione su nanoscala che richiedono la loro combinazione con metodi a singola molecola.

Il secondo passaggio critico di questo protocollo è la preparazione del substrato e le procedure di deposizione dei campioni descritte nei passaggi 2.2 e 2.6.2.8. Per evitare artefatti, il campione deve essere depositato su una superficie pulita e atomicamente piatta. Una corretta incisione della mica è essenziale per ottenere misure AFM prive di artefatti e ad alta risoluzione. Anche il tempo di deposizione del campione è estremamente importante, poiché un tempo di incubazione più lungo consente un migliore assorbimento sulla superficie del substrato. Tuttavia, potrebbe anche indurre l'auto-organizzazione artificiale e l'auto-assemblaggio²⁵, che può indurre artefatti (ad esempio, specie aggregate indotte dalla superficie) che possono portare a un'errata interpretazione dei dati. Inoltre, la superficie mica è caricata negativamente, il che significa che solo le molecole caricate positivamente si assorbono facilmente su di esso. Se la carica netta del campione è negativa, la superficie della mica può essere positivamente funzionalizzata utilizzando APTES per una migliore pisisortion²³. La deposizione a spruzzo microfluidico²⁵ può essere sfruttata per evitare questi effetti e artefatti e depositare il campione in un unico passaggio e senza artefatti.

Il terzo passaggio critico è la corretta configurazione e la scelta dei parametri di imaging per l'imaging dei campioni tramite AFM e AFM-IR descritti nella sezione 3. I suggerimenti AFM utilizzati per l'imaging del campione devono essere sufficientemente nitidi (apex radii di 2-8 nm) per ottenere un'alta risoluzione e ridurre al minimo gli effetti di convoluzione (ampliamento delle caratteristiche del campione da parte della punta)¹⁴, che possono indurre incertezze nell'immagine del campione. Anche la scelta della modalità di imaging, contatto o dinamica, è importante. Per l'imaging campione tramite AFM convenzionale, la modalità dinamica è preferita rispetto alla modalità di contatto, poiché quest'ultima modalità induce grandi forze di attrito del campione laterale che possono causare danni al campione e introdurre artefatti nelle misurazioni (ad es. riduzione dell'altezza del campione dovuta alla nanoindentazione)¹⁴^,⁶¹^,⁶². Al contrario, la modalità di contatto è preferita per le misurazioni tramite nano-IR per migliorare il segnale AFM-IR. Per le misurazioni in modalità dinamica, il cantilever deve essere sintonizzato appena al di sotto (modalità di maschiatura) o superiore (modalità non contatto) il massimo della sua prima risonanza libera di oscillazione per garantire una maggiore stabilità delle misure¹⁴. La risoluzione dell'imaging, che dipende dal numero di pixel e dall'area di scansione, dovrebbe essere sufficientemente elevata da catturare il minimo grado di dettaglio presente in un campione (ad esempio, 1024 x 1024 pixel per un'area 4 x 4 m²⁾ ¹⁴^,⁶³. Una bassa risoluzione dell'imaging può indurre distorsioni e incertezze nell'immagine del campione a causa della perdita delle informazioni verticali e laterali dopo la digitalizzazione del segnale¹⁴. La velocità di scansione, utilizzata per l'imaging, dovrebbe essere sufficientemente bassa da poter seguire correttamente le caratteristiche della superficie e avere abbastanza tempo per acquisire informazioni chimiche¹⁴. Uno dei parametri di imaging più importanti è la forza di imaging. In modalità di contatto, è fondamentale utilizzare una forza di interazione bassa per preservare la struttura del campione. In modalità dinamica, la dissipazione di energia sui campioni deve essere mantenuta costante al fine di confrontare costantemente la morfologia di campioni distinti; l'imaging coerente di campioni indipendenti può essere ottenuto mantenendo un regime costante di un cambiamento di fase che non superi i¹⁴^,⁴². Le forze di imaging di grandi dimensioni devono essere evitate in quanto possono indurre distorsioni e incertezze nelle immagini di esempio.

La deriva termica causata dall'espansione e dalla contrazione delle parti AFM dovute a fluttuazioni termiche può indurre distorsioni e artefatti nell'immagine del campione⁶⁴^,⁶⁵. Le derapate nella direzione verticale possono causare la perdita di traccia della superficie e lo schianto sulla superficie, mentre le derapate nella direzione laterale di solito si traducono in allungamento delle caratteristiche della superficie e della distorsione dell'immagine, il che rende difficile misurazioni precise delle caratteristiche del campione. L'effetto di queste derive termiche può essere ridotto al minimo controllando la temperatura accurata del laboratorio e dando abbastanza tempo (circa 30 min) per il sistema di diventare stabile o eseguendo scansioni veloci⁶⁶^,⁶⁷^,⁶⁸ ^, ^{69 del} sistema di ^, ⁷⁰.

La qualità dell'imaging nano-IR e della raccolta di spettri da parte dell'AFM-IR può essere influenzata da diversi fattori, dei quali i più importanti sono: (i) una divisione errata del segnale IR sul campione per lo sfondo IR, (ii) una grande variazione del contatto nanomeccanico tra la mancia e il campione, e (iii) un riscaldamento eccessivo del campione causandone l'ammorbidimento. Per dividere correttamente lo spettro IR del campione per lo sfondo raccolto, è fondamentale che siano raccolti con la stessa potenza laser. Infatti, la forma della linea spettrale dello sfondo laser a iR dipende dalla potenza del laser. Quindi, al fine di evitare l'influenza delle proprietà meccaniche del campione nelle informazioni chimiche misurate, è fondamentale monitorare e monitorare la risonanza di contatto tra il campione e la punta durante l'acquisizione di spettri e immagini. Per l'acquisizione di spettri, idealmente, è sufficiente pulsare il laser a una risonanza a contatto fissa. Tuttavia, se lo spettro viene acquisito su una vasta gamma spettroscopica, picchi ad alta intensità potrebbero causare un forte riscaldamento del campione e il suo ammorbidimento, cambiando così la risonanza di contatto del campione di punta e riducendo artificialmente l'ampiezza del picco IR. Per questo motivo, è importante monitorare la risonanza di contatto durante l'acquisizione degli spettri al fine di verificare che lo spettro non sia influenzato dall'eccessivo riscaldamento del campione.

In conclusione, ai convenzionali AFM e nano-IR sono in grado di studiare con alta risoluzione le proprietà morfologiche, strutturali e chimiche delle singole specie che formano durante^{l'aggregazione}proteica 24^,³⁸. Tuttavia, non hanno la capacità della cinetica chimica di seguire la loro rapida cinetica di formazione in condizioni di massa autoctone. Al fine di svelare i cambiamenti conformazionali che le proteine subiscono durante la loro aggregazione e misfolding, è necessario sviluppare e applicare nuovi metodi biofisici in grado di unire le capacità dei metodi biofisici di massa con il l'indagine sull'eterogeneità e sulle proprietà ultrastrutturali dell'aggregazione proteica su nanoscala. Questo approccio rappresenta una strada fruttuosa per affrontare la sfida di comprendere il problema dell'auto-assemblaggio delle proteine e il suo ruolo nella salute e nella malattia. Infatti, singoli approcci aggregati sono in grado di svelare e chiarire i meccanismi molecolari del polimorfismo e della formazione dell'aggregazione delle proteine. Queste informazioni sono fondamentali per affrontare la sfida di comprendere l'aggregazione delle proteine e il suo ruolo nell'insorgenza e nella progressione delle malattie umane, nonché di comprenderne le proprietà biofisiche per le applicazioni biotecnologiche.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Gli autori ringraziano la Fondazione nazionale svizzera per la scienza (SNF) per il sostegno finanziario (numero di sovvenzione P2ELP2_162116 e P300P2_171219), il programma Darwin College, Erasmus la ricerca che ha portato a questi risultati ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio europeo della ricerca nell'ambito del settimo programma quadro dell'Unione europea (FP7/2007-2013) attraverso la sovvenzione del CER PhysProt (numero di accordo 337969), la Newman Foundation (T.P.J.K.) e la Cambridge Centre for Misfolding Diseases (C.G., M.V. e T.P.J.K.).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AFM-IR system	Anasys Instruments	nanoIR 2 or 3	Systems to measure thermal expansion in contact and resonance mode
Corning 96-well Half Area Black/Clear Bottom Polystyrene NBS Microplate	Corning	3881
Corning Microplate Aluminium Sealing Tape	Corning	6570
Double Sided Adhesive Discs	AGAR Scientific	AGG3347N
FLUOstar Omega	BMG Labtech	415-101	Platereader
Mica Disc 10mm V1	AGAR Scientific	AGF7013
Park NX10 AFM system	Park Systems	N/A	Atomic Force Microscope
Platypus Ultra-Flat Gold Chips	Platypus Technologies	AU.1000.SWTSG
PPP-NCHR-10 cantilevers	Park Systems	PPP-NCHR-10
Protein LowBind Tubes, 2.0mL	Eppendorf	30108132
Silicon gold coated cantilevers	Anasys Instruments	PR-EX-nIR2
SPM Specimen Discs 12mm	AGAR Scientific	AGF7001

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Biochemistry

Caratterizzazione degli aggregati proteici individuali mediante nanospettroscopia a infrarossi e microscopia a forza atomica

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

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