Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Karakteriserer individuelle protein aggregater av infrarød Nanospectroscopy og Atomic Force mikroskopi

Published: September 12, 2019 doi: 10.3791/60108
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1,3
1Centre for Misfolding Diseases, Department of Chemistry, University of Cambridge, 2Institute of Biotechnology, Life Sciences Center, Vilnius University, 3Cavendish Laboratory, Department of Physics, University of Cambridge

Summary

Vi beskriver anvendelsen av infrarød nanospectroscopy og høyoppløselig Atomic Force mikroskopi å visualisere prosessen av protein selv-montering i oligomer aggregater og amyloid fibrils, som er nært knyttet til utbruddet og utvikling av et bredt spekter av menneskelige nevrodegenerative lidelser.

Abstract

Fenomenet protein misfolding og aggregering resulterer i dannelsen av svært heterogene protein aggregater, som er forbundet med nevrodegenerative forhold som Alzheimers og Parkinsons sykdommer. Spesielt lav molekylvekt aggregater, amyloid oligomers, har vist å ha generiske cytotoksisk egenskaper og er innblandet som nervegifter i mange former for demens. Vi illustrerer bruken av metoder basert på Atomic Force mikroskopi (AFM) for å ta opp den utfordrende oppgaven med å karakteriserer de morfologiske, strukturelle og kjemiske egenskapene til disse aggregater, som er vanskelig å studere ved hjelp av konvensjonelle strukturelle metoder eller bulk Biofysiske metoder på grunn av deres heterogenitet og forbigående natur. Skanning sonde mikroskopi tilnærminger er nå i stand til å undersøke morfologi av amyloid aggregater med sub-nanometer oppløsning. Vi viser her at infrarød (IR) nanospectroscopy (AFM-IR), som samtidig utnytter den høye oppløsningen av AFM og kjemisk anerkjennelse makt IR spektroskopi, kan gå videre og aktivere karakterisering av de strukturelle egenskapene til individuelle protein aggregater, og dermed gi innsikt i aggregering mekanismer. Siden tilnærmingen som vi beskriver kan brukes også til undersøkelser av interaksjoner av protein forsamlinger med små molekyler og antistoffer, kan det levere grunnleggende informasjon for å utvikle nye terapeutiske forbindelser å diagnostisere eller behandle nevrodegenerative lidelser.

Introduction

Over 40 000 000 mennesker over hele verden er for tiden påvirket av nevrodegenerative lidelser, slik som Alzheimers (AD)1 og PARKINSONS (PD)2 sykdommer. Mer generelt er mer enn 50 patologi forbundet på molekylnivå med protein misfolding og aggregering, en prosess som fører til spredning av uløselig fibrillær protein aggregater, kjent som amyloid innskudd3, 4. den molekylære opprinnelsen til neurodegeneration og dens forbindelser med protein conformational endringer av proteiner som fører til amyloid dannelse, er imidlertid fortsatt uklart, i stor grad på grunn av det høye nivået av heterogenitet, forbigående natur og nanoskala dimensjoner av patologisk aggregater4,5.

Svært vellykkede undersøkelser av proteinstrukturer i de siste flere ti år har vært basert mye på bruk av bulk metoder, inkludert røntgen crystallography, mikroskopi og kjernefysisk magnetisk resonans spektroskopi5, 6 andre priser , 7 andre er , 8 på alle , 9. innenfor denne klassen av teknikker, infrarød (IR) spektroskopi har dukket opp som en følsom analytisk verktøy for å løse de kjemiske egenskapene til biologiske systemer som proteiner8. IR metoder tillate kvantifisering av protein sekundær og kvartær strukturelle endringer i løpet av deres misfolding og aggregering. I tillegg, for å ytterligere dechiffrere på mikroskopisk nivå mekanistisk detaljer involvert i komplekse gratis energi landskap protein under aggregering deres, en stor forhånd har vært utviklingen av kjemiske Kinetics verktøy for å utvide til komplekse selv montering trasé inkludert amyloid fibrils formasjon5,6,7,10,11,12. Men bulk spektroskopiske metoder gir bare gjennomsnittlig informasjon om den heterogene ensemble av arter til stede i løsning eller involvert i bestemte mikroskopiske skritt, og dermed rendering etterforskningen av Biofysiske egenskapene til individuelle aggregerte arter utfordrende på nanoskala nivå13,14.

Flere mikroskopi teknikker med evne til å operere på skalaer mindre enn den Diffraksjon grensen av lys har dukket opp i de siste ti årene. Denne klassen av metoder inkluderer elektron mikroskopi (EM) og Atomic Force mikroskopi (AFM). Mens skanning elektron mikroskopi (SEM) og overføring elektron mikroskopi (TEM) gir to-dimensjonale (2D) bilder av en prøve, har AFM dukket opp i de siste ti årene som en kraftfull og allsidig teknikk for å studere tredimensjonale (3D) morfologier, som vel som nanomekanikk egenskapene til en prøve med sub-nanometer oppløsning13,14,15,16,17,18,19, 20 priser og , 21 priser og , 22 av , 23 andre , 24 priser og , 25 priser og , 26 i , 27. begrunnelsen bak studere protein aggregering via AFM er at denne tilnærmingen gjør det mulig etterforskning av morfologi av enkelte arter til stede i løsning13,14,16, 17,19,20,21,25,27,28,29,30, 31,32,33,34,35,36,37. Spesielt ved å overvåke prøven som en funksjon av tid, kan AFM etterforskningen av utviklingen av morfologi av artene i prøven, noe som gjør det mulig å følge og visualisere trasé av amyloid formasjon23, 25,38,39,40,41,42. Videre gjør AFM kvantifisering av strukturelle parametre som tverrsnitt høyder og lengder av de enkelte artene som finnes i løsning13,19,30,31 ,32,33,34,35,36,37,40,43, 44 for alle , 45 for alle , 46 for alle , 47 for alle , 48. men studiet av en enkelt Biofysiske eiendom, for eksempel morfologi, er ofte ikke tilstrekkelig når man studerer heterogene og komplekse biologiske systemer. AFM, SEM eller TEM Imaging metoder alene ikke lett avsløre kjemiske egenskaper av heterogene arter av amyloid aggregater på nanoskala.

Et stort forskudd for analyse av heterogene biologiske prøver på denne skalaen har blitt gjort nylig med utvikling og anvendelse på feltet protein aggregering av infrarød nanospectroscopy (AFM-IR)24,26, 38,42,49,50,51,52. Denne innovative metoden utnytter kombinasjonen av romlig oppløsning av AFM (~ 1 − 10 NM) med den kjemiske analyse kraft av IR. Den AFM-IR teknikk er basert på måling av photothermal indusert resonans Effektdrevet av en IR laser, og på måling av termisk ekspansjon av prøven under etterforskning av AFM spissen. Prøven kan være opplyst av IR laser direkte fra toppen eller fra bunnen i total intern refleksjon, på samme måte som i konvensjonell infrarød spektroskopi24,42,52,53 . IR-laseren kan være pulserende med typiske frekvenser i rekkefølgen av hundrevis av kilohertz (1 − 1000 kHz) og innstilt over et bredt Spectral-område, vanligvis mellom 1000 − 3300 cm-1. Selv om laser kilden dekker et område på ~ 30 μm diameter, den romlige oppløsningen av AFM-IR teknikk bestemmes nominelt av AFM spissen diameter, som oppdager den lokale termiske utvidelsen av systemet. AFM-IR er godt egnet til å studere biologiske prøver fordi IR-signalet er proporsjonal med deres tykkelse opp til 1 − 1.5 μm, og den resulterende IR Spectra er generelt enige med den tilsvarende FTIR overføring Spectra13,54 ,55. Av denne grunn, etablerte metoder for analyse i spektroskopi kan lett anvendes, slik som studiet av kjemiske SKIFT, band form endring og de-convolution av andre derivater analyse52. Samlet kombinerer romlig oppløsning av AFM med kjemisk anerkjennelse makt IR spektroskopi, AFM-IR muliggjør samtidig oppkjøp av et bredt spekter av morfologiske, mekaniske og kjemiske egenskaper av en prøve på nanoskala.

Her illustrerer vi en protokoll for karakterisering av prosessen med protein aggregering som utnytter kombinasjonen av in vitro fluorescens analyser, høyoppløselig AFM Imaging og nanoskala AFM-IR. Denne kombinerte tilnærmingen har allerede utmerket seg i å gi detaljerte resultater i å studere de kjemiske og strukturelle egenskapene til individuelle mikro-dråper dannet av protein aggregater, i studiet av væske-flytende protein fase separasjon, og i gransker heterogenitet og Biofysiske egenskaper for individuelle aggregerte arter ved nanoskala23,26,38,45,50,53, 56,57.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. aggregering analyser på fluorescens plate lesere

Merk: protokollen beskrevet her er et eksempel på hvordan å studere aggregering av protein eller peptid av kjemiske Kinetics. Spesielt beskriver det en optimalisert protokoll for å studere aggregering av aβ 42 peptid, som er involvert i utbruddet og progresjon av Alzheimers sykdom58,59. En lignende protokoll kan justeres og vedtatt mot studere aggregering av protein eller peptid.

  1. Få en svært ren monomere løsning av Aβ 42 gjennom ion-utveksling og størrelse-utelukkelse kromatografi teknikker for å skille protein fraksjoner som inneholder Aβ 42, og å isolere monomere brøkdel fra andre aggregerte former for Aβ 42 innhentet58 , i 59.
  2. Fortynne Aβ 42 peptid i 20 mM natrium fosfat buffer, 200 μM EDTA ved pH 8,058 til en ønsket endelig konsentrasjon mellom 1 − 5 μM, i 1,5 ml lav-bind rør. Prøver samlet for AFM målinger bør ikke inneholde fluorescerende fargestoff som brukes i aggregering analysen (thioflavin T, ThT), som det kan innføre gjenstander under prøven avsetning for AFM analyse. Dermed forberede triplicates av to identiske løsninger: i) den første inneholder monomere Aβ 42 å følge prosessen med aggregering av AFM; II) den andre inneholder Aβ 42 monomere med tillegg av 20 μM ThT som Tracer for å overvåke Kinetics av aggregering.
    Merk: det er viktig å utføre trinn 1,1 og 1,2 på is. Denne fremgangsmåten er å sikre at monomere Aβ 42 løsningen ikke samlet før initiert i plate leseren. Når du håndterer prøver, er forsiktig pipettering viktig for å unngå innføringen av eventuelle luftbobler som kan påvirke protein prøven.
  3. Pipetter 80 μL av hver prøve i hver brønn av en 96-brønn, halv-område plate av svart polystyren med klare bunn og bindende overflater.
  4. Forsegle platen med en folie for å minimere fordampning av prøven i løpet av aggregering.
  5. Likevekt temperaturen på plate leseren til 37 ° c.
  6. Sett opp aggregering protokollen for å lese fluorescens målinger ved faste tids punkt intervaller, på en eksitasjon bølgelengde på 440 NM og en utslipps bølgelengde på 480 NM. Samlingen skal igangsettes i Quiescent forhold.
  7. Sett inn platen i plate leseren.
    Merk: det er viktig å være forsiktig når du håndterer platen, for å sikre at aggregering ikke utløses før du starter plate leseren. Bruk innstillingene for forsterknings justering for å sikre optimal avlesning av fluorescens for hvert utvalg.
  8. Start målingen.
    Merk: aggregering eksperimentet er avsluttet når ThT fluorescens sigmoidal kurven når et platå58.

2. sample forberedelse for AFM og nano-IR målinger

  1. Lim høyeste kvalitet grade v1 glimmer plate til høy kvalitet magnetiske rustfritt stål ved hjelp av selvklebende faner eller dobbeltsidig tape.
  2. Etse glimmer ved å plassere et stykke selvklebende tape på glimmer overflaten og trekke av det øverste laget av glimmer. Denne prosedyren vil produsere ren, atomically flat overflate, egnet for prøven deponering.
    Merk: etset overflate må være ensartet og glatt.
    FORSIKTIG: ikke berør eller pust direkte over nylig etset glimmer, da dette vil introdusere gjenstander.
  3. Pause/stopp plate leser målingen for å samle inn tids punktet av interesse under sammendrags prosessen av proteinet.
  4. Fjern tetnings folien og samle 10 μL alikvot av prøvene uten ThT fra brønnen inn i en 1,5 mL lav-bind rør.
  5. Sett inn 10 μL av prøven på fersk etset glimmer. For AFM-IR målinger prøver må deponeres på fersk strippet gull substrat.
  6. Ruge løsningen på glimmer i 1 min for å tillate physisorbtion.
    Merk: lengre inkubasjonstid ville tillate bedre absorpsjon på overflaten, men kan indusere kunstig selv-organisering og selv-montering25. For å unngå disse effektene kan sprøyte deponering utnyttes25.
  7. Skyll tre ganger med 1 mL ultrarent vann.
  8. Tørk under en skånsom strøm av nitrogen for å måle prøven i luft miljøet.

3. AFM Imaging av morfologi av protein aggregater

Merk: morfologi målinger kan utføres både i kontakt og dynamisk modus, i følgende trinn sistnevnte er beskrevet siden det reduserer lateral krefter for å måle 3D morfologi av prøven med høy oppløsning. AFM-IR målinger vil bli utført i kontakt modus for å forbedre AFM-IR signal-til-støy-forhold.

  1. Slå på AFM systemet minst 30 min før målingene for å aktivere systemet for å nå termisk stabilitet. Klikk på setup, deretter på sonde. I probe endre vinduet klikker du på neste for å forberede Z, Focus Stage.
  2. Slå av AFM strålen bryteren (hvis den er på). Lås opp svalehale låsene, koble hodet fra systemet og i sonde endre vinduet Klikk på neste.
  3. Monter AFM-cantilever på sonde holde ren. Koble hodet til systemet og lås svalehale låsene.
    Merk: optimal utkragning for å studere biologiske prøver i dynamisk modus AFM har fjær konstant som spenner mellom 2 − 40 N m-1 og en Apex radier som spenner mellom 2 − 8 NM14.
  4. Slå på AFM laserstrålen bryteren og i sonde endre vinduet klikker du på neste.
  5. I popup-vinduet klikker du på Nei hvis cantilever-typen ikke ble endret. Juster de optiske justeringsknottene for å finne cantilever. Juster fokus på cantilever og klikk på neste.
  6. I popup-vinduet klikker du på Ja Hvis fokuset er på cantilever.
  7. Plasser laserstrålen på enden av cantilever ved hjelp av knottene som kontrollerer posisjonen til deteksjons laseren. Maksimer det totale signalet som måles av de fire kvadrant PHOTODIODE til minst > 1 V ved hjelp av knottene som kontrollerer posisjonen til den forandret retning laserstrålen på posisjons følsom PHOTODIODE (PSPD). I probe endre vindu Klikk på neste og så på nært hold.
  8. Vent 15 min for at cantilever skal nå termisk stabilitet. Juster om nødvendig posisjonen til den forandret retning laserstrålen på PSPD.
  9. Klikk på NCM feie, Velg ønsket amplitude av bevegelse, klikk på Bruk fase, klikk på Auto og tune cantilever nær den maksimale av sin første frie resonans for pendling, som er på ca 300 kHz for en cantilever med en fjær konstant på 40 N m-1.
    Merk: tuning av cantilever ut av den maksimale av sin gratis resonans sikrer høyere stabilitet av målingene14.
  10. Sett prøven på prøveholderen. Velg egnede bilde parametre. Vanlig skannehastighet er 0,3 − 1,0 Hz for et skanneområde på 1 x 1 μm2 til 5 x 5 μm2. Typisk oppløsning trengs er mellom 256 x 256 og 1024 x 1024 piksler. Klikk på skanneområdet for å velge skannestørrelse og piksel nummer.
  11. Fokuser den optiske visningen på prøven. Klikk på tilnærming for å nærme prøven overflaten. Når tilnærmingen er fullført klikker du på Lift 100 μm å stige AFM spissen 100 μm over overflaten av prøven. Klikk Utvid på det optiske bildet av prøven. Klikk på fokus fase linjen for å fokusere visningen på overflaten av prøven.
  12. Bruk pilene til å flytte i området for utvalget av interesse. Engasjer overflaten ved å trykke på Approach knappen. Falle i staver opp på line avsøke knapp, og sjekk hvis drikkepengene er fulgte overflaten frisk, dersom det er nødvendig, innstille det sette punkt.
  13. Start bilde av prøveoverflaten ved å trykke på Skann -knappen. Under bildebehandling, for å unngå store bilde gjengivelses kraft og holde konsistens innenfor uavhengige prøver, opprettholde en konstant regime av fase endring ikke overstiger Δ20 °42.
  14. Skriv inn filnavnet og velg base katalogen der ervervet bildet vil bli lagret.

4. infrarød nanospectroscopy målinger av protein aggregater

  1. Slå på AFM-IR-systemet og infrarød (IR) laser60 30 − 60 min før målinger for termisk stabilisering. Typiske lasere for AFM-IR instrumenter er optisk parameter oscillatorer (OPO) og Quantum Cascade lasere (QCL).
  2. Åpne den innebygde programvaren for å styre instrumentet. Klikk på fil og deretter på ny å åpne en ny nanoIR fil. Trykk på knappen initialisere for å starte AFM-IR-systemet.
  3. Åpne instrumentdekselet og Monter på AFM-IR system en silisium gull belagt sonde med en nominell radius på 30 NM og en fjær konstant på 0,2 N/m for å måle prøven i kontakt modus.
  4. Klikk på Load i seksjonen AFM sonde og deretter neste. I fokus på sonde seksjon Klikk på pilene for å fokusere kameraet på cantilever. I seksjonen eksempel XY-bevegelsebruker du pilene til å plassere luften på slutten av cantilever.
  5. Drei knottene som kontrollerer posisjonen til deteksjons laseren for å plassere laseren på slutten av cantilever. Drei laser knottene for å oppdage og maksimere summen som måles av PHOTODIODE med fire kvadrant, til en verdi ≫ 3 v. Drei på bryteren for å justere cantilever til-1 V, og klikk deretter på neste. Lukk dekselet på instrumentet.
  6. I seksjonen fokus på prøven bruke pilene til å fokusere kameraet på prøven. Deretter, i seksjonen sample XY bevegelse bruke pilene til å flytte i regionen av interesse av prøven og klikk på tilnærming og engasjere.
  7. I mikroskop vinduet velger du som innganger for å kartlegge de Biofysiske egenskapene til prøven. Spesielt velger høyde for morfologi, AMPLITUDE 2 for IR absorpsjon og PLL frekvens til kart spissen-sample kontakt resonans.
  8. I AFM skanning delen av Controls -vinduet, bruk lignende parametre som i del 3 (dvs. skannehastighet 0,1 − 1,0 Hz, mellom 256 x 256 og 1024 x 1024 piksler). Velg verdien av gevinsten i henhold til prøve grovhet: Integral I = 1 − 10 og proporsjonal P = 10 − 30. Deretter klikker du på Scan for å få en morfologi kart.
    Merk: morfologi kan være tilsvarende målt i dynamisk tappe modus, men AFM-IR målinger er utført her i kontakt modus for å ha høyere signal til støy prosenter.
  9. Etter at tilordningen av morfologi er ferdig, i mikroskop vinduet, klikk på høyde kartet for å posisjonere sonden på toppen av en aggregat. Deretter klikker du på Start IR i nanoIR -delen i Kontroller -vinduet for å belyse prøven med IR-laseren.
  10. For å fokusere den infrarøde laseren på cantilever, klikk på optimalisering. I dette vinduet skriver du en wavenumber der prøven skal ha høy absorbansen og klikker Legg til. For protein, en typisk verdi er 1655 cm-1. Falle i staver opp på avsøke å finner det IR laser holdning og falle i staver opp på oppdatere å oppstille i linje dens holdning med det cantilever. Lukk vinduet.
  11. I delen Generelt i nanoIR -innstillingen skriver du en wavenumber der høy absorbansen i det relative feltet er forventet. Deretter deaktivere bandet pass filter alternativet og se på måleren lesing og ved den raske Fourier Transform (FFT) av cantilever respons. I FFT-vinduet flytter du den grønne markøren for å lese resonans frekvensen til cantilever. En typisk verdi av FFT for resonans av utkragning er rundt 300 kHz. Skriv denne Frekvensverdien for resonans i delen Generelt i feltet freq. Center og bruk et freq.-vindu på 50 kHz.
    Merk: Velg en laser effekt som er lav nok til å ikke mette måler avlesningen og å ha forvrengning i cantilever respons og ikke overopphetes prøven.
  12. Klikk på laser puls tune vindu for å bruke resonans utvidet modus. Velg et frekvens senter på 300 kHz, et tune-område på 50 kHz og en driftssyklus på laseren på 5%. Klikk på erverve å feie pulsen hastigheten på laseren. Ved å bruke markøren i grafen, tune laser pulsen til frekvensen av den mekaniske responsen av termisk ekspansjon av prøven absorbere IR lys. Deretter velger du alternativet PLL for å overvåke kontakt resonans mellom prøven og spissen. Trykk på Zero -knappen i PLL-vinduet og tick Aktiver for å spore prøve spissen kontakt resonans. Velg en integrert gevinst I = 0,5 og proporsjonal forsterkning P = 10. Lukk vinduet.
  13. Åpne igjen optimaliserings vinduet og Finn POSISJONEN til IR-laseren i minst 3 wavenumbers som tilsvarer de store absorbansen bandene i prøven (amid-bandet i-II-III), og for minst én wavenumber for hver enkelt chip av laseren.
  14. Klikk på verktøy | IR bakgrunns kalibrering | Ny. I vinduet velger du spektroskopiske regionen (1800 − 1200 cm-1 for å studere protein prøver); velge samme puls som bestemmes i trinn 4,12 og en driftssyklus på 5%; Klikk på rask oppkjøp og velg laser hastighet, typisk utvalg for en Quantum Cascade laser er mellom 20 − 500 cm-1. Klikk på Hent for å måle IR-laser bakgrunnen. Denne bakgrunnen spekteret vil bli brukt til normalisering av målte nanoskala lokaliserte Spectra. Lukk vinduet.
    Merk: Hvis en rask laser og resonans forbedret modus ikke er tilgjengelig, hopp over trinn 4,12 og velg trappet Spectra stedet for rask i både bakgrunnen og IR Spectra Acquisition Windows. Enkelt aggregat følsomhet vil imidlertid ikke bli nådd.
  15. I IR Spectra Settings, Velg en IR spektrum oppløsning mellom 1 − 4 cm-1 og en rekke co-gjennomsnitt på minst 64x. Klikk på Hent for å måle et NANOSKALA lokalisert IR-spektrum i protein området (1800 − 1200 cm-1).
  16. Å erverve en nanoskala løst kjemisk kart, velg IR Imaging alternativ, Velg en wavenumber av interesse (f. eks 1655 cm-1 for amid band i) og klikk på Scan i AFM Scan vinduet.
  17. Når tilordningen er fullført, går du til fil og Lagre målingene. For å analysere ervervet kart av morfologi, kontakt-resonans og kjemi, samt nanoskala lokaliserte Spectra, bruke den innebygde AFM bildebehandling programvare. Spectra og bilder kan lagres som. CSV eller. axz filer for videre detaljert analyse med kommersiell programvare.

5. bilde prosessering og analyse av tverrsnitt dimensjoner

  1. Flate RAW-bilder14,17,19,41,42,59 ved hjelp av innebygd AFM bildebehandling programvare eller kommersiell programvare.
    Merk: aggregater skal være maskert fra beregningen for å unngå artefakter av analyse og undervurdering av deres målte høyde.
  2. Flat bildet med 0 bestille flyet passer subtraksjon.
  3. Slå sammen bildet med fly og deretter linje for linje ved en 1St regresjon rekkefølge, det andre trinnet gjentas til den flate grunnlinjen i linje profilen for bildet er nådd.
  4. Hvis prøven er svært overfylt, inneholder eksepsjonelt store aggregater eller gjenstand for skanner baug, kan du slå sammen bildet med 2nd regresjon rekkefølge.
  5. Mål samlet høyde og bredde fra en linje profil tatt vinkelrett på fibril akse14,17,19,41,42,59.
  6. Mål fibril lengde parallelt med fibril akse14,17,19,41,42,59.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En representativ tid løpet av Aβ 42 aggregering, målt ved ThT fluorescens analysen, er vist i figur 1. Aggregering prosessen er vanligvis preget av en sigmoidal kurve, der en lag fase er i utgangspunktet observert, og etterfølges av en bratt vekstfase, før kurven når et platå når en likevekt steady state er nådd6,7 , 58. det er viktig å sikre at en optimalisert aggregering protokollen brukes til å generere høykvalitets data for å studere den molekylære detaljer knyttet til aggregering prosesser58.

Høy oppløsning på AFM gjør det mulig å undersøke morfologi og heterogenitet av aggregerte arter på ulike tidspunkt poeng av prosessen. Under aggregering, overvåkes av ThT analysen, alikvoter av prøven i platene er utarbeidet for enkelt aggregat undersøkelse av AFM og nano-IR (figur 1). Den typiske prosessflyten for manuell prøveklargjøring vises i figur 2. Ved fullføring av målingen av 3D morfologi av prøven ved høy oppløsning og fase-kontrollerte AFM, kartene er flatet ut for å fjerne ikke-linearitet av Piezoelektriske skanneren og redusere feilkilder i post-prosessering analyse av Sample morfologi (Figur 3). Deretter kan en nøyaktig og følsom enkelt molekyl statistisk analyse utføres, som vist i Figur 4. Fra en 3D morfologi kart, er det mulig å trekke ut samlet tverrsnitt høyde, bredde og lengde (eller diameter i tilfelle av spheroidal partikler), som gjør det mulig å skille og karakterisere forskjellige arter av aggregater til stede under aggregering tid kurs23,38. Typisk tid interessepunkter for å undersøke prosessen med aggregering er lag fasen, vekstfasen og platå fasen (figur 1). Under lag fasen er monomere og oligomer arter av Aβ 42 hovedsakelig til stede. Når det vises ved AFM, vil monomere og oligomer arter av aβ 42 vanligvis fremstå som spheroidal partikler 1 − 15 NM i diameter og 0,3 − 2 NM i høyde (figur 1, nederst til venstre)38,39. Dannelse av langstrakt protofilaments, protofibrils og fibrils er synlig i vekstfasen av aβ 42 aggregering tid kurs (figur 1, Bottom Middle)38,39. Vanligvis vises protofilaments som langstrakte funksjoner hundrevis av nanometer i lengde og 0,5 − 2 NM i høyden, mens protofibrils vises som langstrakte lineære eller krumlinjet aggregater 1 − 5 NM i høyde og hundrevis av nanometer i lengde38, i 39. Under platå fasen er fibrils de dominerende artene av Aβ 42-aggregater. Aβ 42 fibrils opptrer vanligvis som rette, tråd-lignende strukturer, med en tverrsnitt diameter på 6 − 10 NM og lengde i rekkefølgen hvis mikrometer (Figur 3, nederst til høyre)38,39. Bemerkelsesverdig, denne skjematisk representasjon av morfologiske egenskaper av aggregater er en generell funksjon av de fleste samles proteiner og peptider13,14.

Etter etterforskningen av prøven morfologi, Nano-IR kan brukes til å undersøke de kjemiske egenskapene til den enkelte protein aggregat arter til stede under prosessen med aggregering, ved å anskaffe nanoskala-løst IR kart og Spectra både i luft og Native flytende miljø24,26,38,4249,50,51,52,. Figur 5 viser en skjematisk illustrasjon av AFM-IR oppsett. En IR-kilde brukes til å belyse prøven fra bunnen i total intern refleksjon eller direkte fra toppen som i figur 5a. Hvis IR lyset absorberes av prøven, vil det opphisse den tilsvarende molekylære vibrasjonen energi overgangen nivåer av arten stede. Den vibrasjonen energien er utsvevende inne i prøven i form av termisk oppvarming, noe som fører til termisk ekspansjon av prøven. Denne utvidelsen måles ved nanoskala av AFM spissen i kontakt med prøven med en oppløsning i rekkefølgen av 10 NM. Ved hver puls oppdager cantilever termisk ekspansjon. Spesielt spark den raske utvidelsen av prøven ut cantilever fra kontakt med prøven, og etter sparke ut cantilever ringene ned på sin naturlige frekvenser. For å forbedre følsomheten til AFM-IR, er det mulig å stille inn laser pulsfrekvensen på samme frekvens av pendling i cantilever54. For å arbeide i denne modusen med resonans forbedret er det nødvendig å ha IR-kilder som kan være pulserende i et bredt spekter av frekvenser, for eksempel Quantum Cascade lasere som opererer typisk i et område mellom 1 − 1000 kHz. Topp-til-topp amplitude og den raske Fourier-transformasjonen av ringdown signalet, kalt IR amplitude, av rå cantilever utslag er proporsjonal med IR lyset absorbert. Disse signalene oppdages i sanntid ved å måle utslag av en rød laser fokusert på toppen av cantilever. For å tilegne seg kjemiske kart, er laser wavenumber fast ved en viss wavenumber og IR amplitude signalet er samlet på hvert punkt av kartet, mens, for å erverve IR Spectra, plasseringen av cantilever er fast i en posisjon av interesse og laser bølgelengde er feid langs spektroskopiske spekter av interesse. Den ultimate oppløsningen på AFM-IR gjør det mulig å måle de kjemiske egenskapene til protein aggregater med en tverrsnitt høyde på ca 5 NM, som representert i figur 6.

Figure 1
Figur 1: overvåking av aggregering tid kurs in vitro via ThT fluorescens og AFM.
Prøver tatt under lag fasen, vekstfase, og platå fase av aggregering prosessen som oppdages av ThT fluorescens ble avbildet via høyoppløselig AFM. Dette tallet er tilpasset fra Ruggeri et al.38. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: skjematisk fremstilling av underlaget forberedelse og prøven avsetning for AFM målinger.
(A, B) Glimmer etsing ved hjelp av teip. (C) prøve deponering. (D) prøve inkubasjons. (E) prøve skylling med ultrarent vann. (F) prøve tørking under skånsom strøm av nitrogen. (G) sample Imaging bruker microfabricated AFM cantilever med skarpe spissen på enden. (H) behandlet bilde av amyloid fibrils. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: AFM bildebehandling prosedyre42.
Toppen av hvert panel viser en profil linje av prøven overflaten (rød linje) illustrert av tilsvarende AFM bildet, mens den nedre delen viser et histogram av høyden på alle piksler i bildet. (a) RAW AFM bilde før bilde sammenslåing prosedyre. (b) AFM bilde etter behandlingen prosedyren ved hjelp av hele flyet flatere. Fibrillær strukturer (rosa farge) var maskert fra flatere prosedyre. (c) bilde behandlet ved sammenslåing av linje for linje. (d) endelig bilde etter bildebehandlings prosedyren. Dette tallet er tilpasset fra Ruggeri et al.42.

Figure 4
Figur 4: single samlet statistisk analyse av AFM bilder.
(a) eksempel på sporing av høyder og lengder av fibrillær strukturer, indikert med 1 og 2. (b) graf med deler av sporet fibrils og deres gjennomsnittlige høyde. (c) eksempel på et histogram som viser gjennomsnittlig høyde på fibrillær strukturer. (d) graf med normalisert profil av spores fibrils 1 og 2. (e) histogram distribusjon av høydepunktene normalisert profil. Dette tallet er tilpasset fra Ruggeri et al.42. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: prinsippet om funksjonen til AFM-IR-metoden.
(a) absorbert IR lys forårsaker termisk ekspansjon av prøven, spennende den mekaniske RESONANSER av AFM cantilever i kontakt med prøven. Amplituden til cantilever-svingninger er proporsjonal med IR-opptaket. (b) IR absorpsjon kart er innhentet skanning cantilever på prøven mens innfesting av laser bølgelengde. (c) Tips og sample i kontakt oppfører seg som et system av sammenkoblede fjærer som resonans frekvens øker monotont med den iboende stivhet av prøven50. (d) lokaliserte Spectra oppnås ved å feie laser bølgelengde mens fikse plasseringen av AFM cantilever. (e) IR spektrum av protein. (f) i sammendraget, AFM-IR muliggjør samtidig studie av morfologiske, mekaniske og kjemiske egenskaper ved nanoskala26. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: infrarød nanospectroscopy (nano-IR) av en enkelt amyloid aggregat.
(a) AFM morfologi kart. (b) IR absorpsjon kart ved laser resonans peak på 1658 cm-1. (c) tverr Seksjons dimensjoner av fibril høyde. (d) IR Spectra på ulike posisjoner i fibrillær struktur (merket i panel b med blå sirkler) og underlaget (merket i panel b med grønne sirkler). Gjennomsnittlig netto signal avledet fra den samlede strukturen (solid svart linje) ble oppnådd ved å trekke gjennomsnittlig bakgrunns signal (fast grønn linje) fra gjennomsnittlig fibril signal (solid blå linje). Dette tallet er tilpasset fra Ruggeri et al.42.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det første kritiske trinnet i denne protokollen er utarbeidelse av monomere proteiner, slik som i tilfelle av Aβ 42 løsning beskrevet i trinn 1,1 og 1,2. Det er viktig å starte aggregering prosessen fra en svært ren, monomere løsning, som tilstedeværelsen av oligomer eller aggregerte arter kan føre til dårlig reproduserbarhet av aggregering Kinetics58, og indusere gjenstander i AFM målinger (f. eks, fibrillær arter vil være tydelig på de innledende stadier av aggregering), som kan føre til feil tolkning av dataene. Svært reproduserbar Kinetics data av amyloid formasjon basert på ThT fluorescens analysen, i samarbeid med Master ligningen formalisme av kjemisk Kinetics5,6,7, har lov til å definere aβ 42 aggregering mekanisme i form av sine underliggende molekylære hendelser. Kjemisk Kinetics knytter de mikroskopiske trinnene til underliggende amyloid formasjon med sine makroskopisk manifestasjoner ved å vurdere de forskjellige måtene nye aggregater kan danne og vokse på, som for eksempel forlengelse ved de samlede endene eller sekundære kjernedannelse på den samlede overflaten. Kjemiske Kinetics i seg selv gir imidlertid ikke direkte effekt av de mulige kjerne fenomener på nanoskala som krever deres kombinasjon med enkle molekyl metoder.

Det andre kritiske trinnet i denne protokollen er underlaget forberedelse og prøve deponering prosedyrene som er beskrevet i trinn 2,2 og 2.6 − 2.8. For å unngå artefakter må prøven deponeres på et rent, atomically flatt underlag. Riktig etsing av glimmer er avgjørende for å oppnå gjenstand-fri, høy oppløsning i AFM målinger. Prøven deponering tid er også svært viktig, som lengre inkubasjonstid gir bedre absorpsjon på underlaget overflaten. Det kan imidlertid også indusere kunstig selvorganisering og selv montering25, som kan indusere gjenstander (for eksempel overflate-indusert aggregat arter) som kan føre til data feil tolkning. I tillegg er glimmer overflaten negativt ladet, noe som betyr at bare positivt ladet molekyler lett absorberer på den. Hvis netto ladning av prøven er negativ, kan overflaten av glimmer være positivt funksjonalisert ved hjelp av APTES for en bedre phisisorption23. Mikrovæskebasert sprøyte deponering25 kan utnyttes for å unngå disse effektene og gjenstander og sette prøven i et enkelt trinn og uten gjenstand.

Den tredje kritiske trinnet er riktig oppsett og valg av Imaging parametre for sample Imaging via AFM og AFM-IR beskrevet i avsnitt 3. Den AFM tips som brukes for prøven Imaging bør være skarp nok (Apex radier av 2-8 NM) for å oppnå høy oppløsning og minimere convolution effekter (utvidelse av prøven funksjoner av spissen)14, som kan indusere usikkerhet i bildet av prøven. Valget av tenkelig modus, kontakt eller dynamisk, er også viktig. For sample Imaging via konvensjonelle AFM, er den dynamiske modus foretrukket over kontakten modus som sistnevnte modus induserer store lateral spissen-sample friksjons krefter som kan forårsake prøveskade og innføre gjenstander i målingene (f. eks, reduksjon i prøve høyde på grunn av nanoindentation)14,61,62. Derimot foretrekkes kontakt modusen for målingene via nano-IR for å forbedre AFM-IR-signalet. For målinger i dynamisk modus, bør cantilever være innstilt bare litt under (tappe modus) eller over (ikke-kontakt modus) maksimalt av sin første frie resonans av pendling for å sikre høyere stabilitet av målingene14. Bildeoppløsningen, som avhenger av piksel nummeret og skanneområdet, bør være høy nok til å fange opp den minste detalj graden som finnes i en prøve (f.eks. 1024 x 1024 piksler for et 4 x 4 μm2 -område)14,63. Lav tenkelig oppløsning kan indusere forvrengninger og usikkerhet i bildet av prøven på grunn av tap av vertikal og lateral informasjon ved digitalisering av signalet14. Skanningen rate, som brukes for Imaging, bør være lav nok til at spissen for å kunne følge overflaten funksjoner riktig, så vel som å ha nok tid til å skaffe seg kjemisk informasjon14. En av de viktigste Imaging parametrene er tenkelig kraft. I kontakt modus er det grunnleggende å bruke en lav samhandlings styrke for å bevare strukturen i prøven. I dynamisk modus, bør energi spredning på prøvene holdes konstant for å konsekvent sammenligne morfologi av forskjellige prøver; konsistent bildebehandling av uavhengige prøver kan fås ved å opprettholde et konstant regime av en fase endring som ikke overstiger Δ20 °14,42. Store bilde gjengivelses krefter bør unngås, da de kan indusere forvrengninger og usikkerhet i prøve bildene.

Termisk drift forårsaket av ekspansjon og sammentrekning av AFM deler på grunn av termiske svingninger kan indusere forvrengninger og gjenstander i bildet av prøven64,65. Drifts i vertikal retning kan føre til at cantilever mister oversikten over overflaten så vel som å krasje inn i overflaten, mens driver i lateral retning vanligvis resulterer i forlengelse av overflaten funksjoner og bildeforvrengning, som gjør det vanskelig å oppnå nøyaktige målinger av prøve funksjonene. Effekten av disse termiske drifts kan minimeres ved nøyaktig temperaturkontroll av laboratoriet, samt å gi nok tid (rundt 30 min) for at systemet skal bli stabilt eller ved å utføre raske skanninger66,67,68 , 69 for alle , i 70.

Kvaliteten på nano-IR Imaging og Spectra samling av AFM-IR kan påvirkes av flere faktorer, hvorav de viktigste er: (i) en feil delingen av IR-signalet på prøven av IR bakgrunn, (II) en stor variasjon av nanomekanikk kontakt mellom spissen og prøven, og (III) en overdreven oppvarming av prøven forårsaker dens mykgjørende. Til riktig dele IR spekteret av prøven ved den innsamlede bakgrunnen, er det avgjørende at de er samlet på samme laser kraft. Faktisk er Spectral linje form av IR laser bakgrunnen avhengig av kraften i laseren. Deretter, for å unngå påvirkning av de mekaniske egenskapene til prøven i den målte kjemiske informasjonen, er det avgjørende å overvåke og spore kontakt resonans mellom prøven og spissen under Spectra og bildeoppkjøp. For Spectra oppkjøp, ideelt sett, er det tilstrekkelig å puls laseren ved en fast kontakt resonans. Men hvis spekteret er ervervet på en stor spektroskopiske rekkevidde, kan høy intensitet topper føre til sterk oppvarming av prøven og dens mykgjørende, og dermed endre spissen-prøven kontakt resonans og kunstig redusere IR topp amplitude. Av denne grunn er det viktig å spore kontakt resonans under Spectra oppkjøp for å verifisere at spekteret ikke påvirkes av overdreven oppvarming av prøven.

I konklusjonen, konvensjonelle AFM og nano-IR er i stand til å undersøke med høy oppløsning på morfologiske, strukturelle og kjemiske egenskaper av de enkelte artene danner under protein aggregering24,38. De mangler imidlertid evnen til kjemisk Kinetics for å følge deres raske Kinetics av dannelse i de innfødte bulk forholdene. For å avdekke de conformational endringene som proteinet gjennomgår under deres aggregering og misfolding, er det nødvendig å utvikle og anvende romanen Biofysiske metoder som kan bringe sammen evnene til bulk Biofysiske metoder med undersøkelse av heterogenitet og ultrastructural egenskaper av protein aggregering ved nanoskala. Denne tilnærmingen representerer en fruktbar aveny for å møte utfordringen med å forstå problemet med protein selv montering og dens rolle i helse og sykdom. Faktisk, enkelt aggregat tilnærminger er i stand til å avdekke og belyse den molekylære mekanismer av protein aggregering polymorfisme og formasjon. Denne informasjonen er sentral for å møte utfordringen med å forstå protein aggregering og dens rolle i utbruddet og progresjon av menneskelige sykdommer, samt forstå deres Biofysiske egenskaper for bioteknologi-applikasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Swiss National Foundation for Science (SNF) for økonomisk støtte (Grant nummer P2ELP2_162116 og P300P2_171219), Darwin College, Erasmus +-programmet for den økonomiske støtten (Grant nummer 2018-1-LT01-KA103-046719 -15400-P3) og forskning som fører til disse resultatene har fått støtte fra European Research Council under EUs syvende rammeprogram (FP7/2007-2013) gjennom ERC gi PhysProt (avtalenummer 337969), Newman Foundation (T.P.J.K.) og The Cambridge Centre for Misfolding sykdommer (C.G., M.V., og T.P.J.K.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AFM-IR system Anasys Instruments nanoIR 2 or 3 Systems to measure thermal expansion in contact and resonance mode
Corning 96-well Half Area Black/Clear Bottom Polystyrene NBS Microplate Corning 3881
Corning Microplate Aluminium Sealing Tape Corning 6570
Double Sided Adhesive Discs AGAR Scientific AGG3347N
FLUOstar Omega BMG Labtech 415-101 Platereader
Mica Disc 10mm V1 AGAR Scientific AGF7013
Park NX10 AFM system Park Systems N/A Atomic Force Microscope
Platypus Ultra-Flat Gold Chips Platypus Technologies AU.1000.SWTSG
PPP-NCHR-10 cantilevers Park Systems PPP-NCHR-10
Protein LowBind Tubes, 2.0mL Eppendorf 30108132
Silicon gold coated cantilevers Anasys Instruments PR-EX-nIR2
SPM Specimen Discs 12mm AGAR Scientific AGF7001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease at 25 years. EMBO Molecular Medicine. 8, 595-608 (2016).
  2. Poewe, W., et al. Parkinson disease. Nature Reviews Disease Primers. 3, 1-21 (2017).
  3. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annual Review of Biochemistry. 75, 333-366 (2006).
  4. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, amyloid formation, and human disease: A summary of progress over the last decade. Annual Review of Biochemistry. 86, 27-68 (2017).
  5. Knowles, T. P. J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, 384-396 (2014).
  6. Meisl, G., et al. Molecular mechanisms of protein aggregation from global fitting of kinetic models. Nature Protocols. 11, 252-272 (2016).
  7. Knowles, T. P. J., et al. An analytical solution to the kinetics of breakable filament assembly. Science. 326, 1533-1537 (2009).
  8. Barth, A. Infrared spectroscopy of proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1767, 1073-1101 (2007).
  9. Fitzpatrick, A. W. P., et al. Atomic structure and hierarchical assembly of a cross- amyloid fibril. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 5468-5473 (2013).
  10. Cohen, S. I. A., et al. Proliferation of amyloid-β42 aggregates occurs through a secondary nucleation mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 9758-9763 (2013).
  11. Michaels, T. C. T., Lazell, H. W., Arosio, P., Knowles, T. P. J. Dynamics of protein aggregation and oligomer formation governed by secondary nucleation. Journal of Chemical Physics. 143, (2015).
  12. Šarić, A., Michaels, T. C. T., Zaccone, A., Knowles, T. P. J., Frenkel, D. Kinetics of spontaneous filament nucleation via oligomers: Insights from theory and simulation. The Journal of Chemical Physics. 145, 211926 (2016).
  13. Ruggeri, F. S., Habchi, J., Cerreta, A., Dietler, G. AFM-based single molecule techniques: Unraveling the amyloid pathogenic species. Current Pharmaceutical Design. 22, 3950-3970 (2016).
  14. Ruggeri, F. S., Šneideris, T., Vendruscolo, M., Knowles, T. P. J. Atomic force microscopy for single molecule characterisation of protein aggregation. Archives of Biochemistry and Biophysics. 664, 134-138 (2019).
  15. Iljina, M., et al. Nanobodies raised against monomeric α-synuclein inhibit fibril formation and destabilize toxic oligomeric species. BMC Biology. 15, 1-14 (2017).
  16. Schilling, C., et al. Sequence-Optimized Peptide Nanofibers as Growth Stimulators for Regeneration of Peripheral Neurons. Advanced Functional Materials. 1809112, 1-15 (2019).
  17. Chiki, A., et al. Mutant exon1 huntingtin aggregation is regulated by T3 phosphorylation-induced structural changes and crosstalk between T3 phosphorylation and acetylation at K6. Angewandte Chemie - International Edition. 56, 5202-5207 (2017).
  18. Sieste, S., et al. Water-dispersible polydopamine-coated nanofibers for stimulation of neuronal growth and adhesion. Advanced Healthcare Materials. 7, 1-11 (2018).
  19. De, S., et al. Different soluble aggregates of Aβ42 can give rise to cellular toxicity through different mechanisms. Nature Communications. 10, 1541 (2019).
  20. Chang, K. C., Chiang, Y. W., Yang, C. H., Liou, J. W. Atomic force microscopy in biology and biomedicine. Tzu Chi Medical Journal. 24, 162-169 (2012).
  21. Variola, F. Atomic force microscopy in biomaterials surface science. Physical Chemistry Chemical Physics. 17, 2950-2959 (2015).
  22. Drolle, E., Hane, F., Lee, B., Leonenko, Z. Atomic force microscopy to study molecular mechanisms of amyloid fibril formation and toxicity in Alzheimer’s disease. Drug Metabolism Reviews. 46, 207-223 (2014).
  23. Ruggeri, F. S., et al. Identification and nanomechanical characterization of the fundamental single-strand protofilaments of amyloid α-synuclein fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (28), 7230-7235 (2018).
  24. Ruggeri, F. S., et al. Infrared nanospectroscopy characterization of oligomeric and fibrillar aggregates during amyloid formation. Nature Communications. 6, 1-9 (2015).
  25. Ruggeri, F. S., et al. Microfluidic deposition for resolving single-molecule protein architecture and heterogeneity. Nature Communications. 9, (2018).
  26. Qamar, S., et al. FUS phase peparation is modulated by a molecular chaperone and methylation of arginine cation-π interactions. Cell. 173, 720-734 (2018).
  27. Habchi, J., et al. Cholesterol catalyses Aβ42 aggregation through a heterogeneous nucleation pathway in the presence of lipid membranes. Nature Chemistry. 10, 673-683 (2018).
  28. Sweers, K. K. M., Stöckl, M., Bennink, M. L., Subramaniam, V. Characterizing nanoscale morphologic and mechanical properties of α-Synuclein amyloid fibrils with atomic force microscopy. Bio-nanoimaging: Protein Misfolding & Aggregation. Uversky, V. N., Lyubchenko, Y. L. , London, UK. 309-322 (2014).
  29. Goldsbury, C., et al. Amyloid structure and assembly Insights from scanning transmission electron microscopy. Journal of Structural Biology. 173, 1-13 (2011).
  30. Knowles, T. P. J., Smith, J. F., Devlin, G. L., Dobson, C. M., Welland, M. E. Analysis of structural order in amyloid fibrils. Nanotechnology. 18, (2007).
  31. Knowles, T. P. J., Mezzenga, R. Amyloid fibrils as building blocks for natural and artificial functional materials. Advanced Materials. , 6546-6561 (2016).
  32. Knowles, T. P. J., Oppenheim, T. W., Buell, A. K., Chirgadze, D. Y., Welland, M. E. Nanostructured films from hierarchical self-assembly of amyloidogenic proteins. Nature Nanotechnology. 5, 204-207 (2010).
  33. Knowles, T. P. J., Smith, J. F., Craig, A., Dobson, C. M., Welland, M. E. Spatial persistence of angular correlations in amyloid fibrils. Physical Review Letters. 96, 1-4 (2006).
  34. Knowles, T. P. J., et al. Twisting transition between crystalline and fibrillar phases of aggregated peptides. Physical Review Letters. 109, 158101 (2012).
  35. Knowles, T. P., et al. Role of intermolecular forces in defining material properties of protein nanofibrils. Science. 318, 1900-1903 (2007).
  36. Smith, J. F., Knowles, T. P. J., Dobson, C. M., MacPhee, C. E., Welland, M. E. Characterization of the nanoscale properties of individual amyloid fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 15806-15811 (2006).
  37. Sokolov, D. V. Atomic force microscopy for protein nanotechnology. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 300, 323-367 (2013).
  38. Ruggeri, F. S., et al. Influence of the β-sheet content on the mechanical properties of aggregates during amyloid fibrillization. Angewandte Chemie - International Edition. 54, 2462-2466 (2015).
  39. Jeong, J. S., Ansaloni, A., Mezzenga, R., Lashuel, H. A., Dietler, G. Novel mechanistic insight into the molecular basis of amyloid polymorphism and secondary nucleation during amyloid formation. Journal of Molecular Biology. 425, 1765-1781 (2013).
  40. Adamcik, J., Mezzenga, R. Study of amyloid fibrils via atomic force microscopy. Current Opinion in Colloid and Interface Science. 17, 369-376 (2012).
  41. Deguire, S. M., et al. N-terminal huntingtin (Htt) phosphorylation is a molecular switch regulating Htt aggregation, helical conformation, internalization, and nuclear targeting. Journal of Biological Chemistry. , (2018).
  42. Ruggeri, F. S., et al. Nanoscale studies link amyloid maturity with polyglutamine diseases onset. Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).
  43. Adamcik, J., et al. Understanding amyloid aggregation by statistical analysis of atomic force microscopy images. Nature Nanotechnology. 5, 423-428 (2010).
  44. Lin, Y. C., Komatsu, H., Ma, J., Axelsen, P. H., Fakhraai, Z. Quantitative analysis of amyloid polymorphism using height histograms to correct for tip convolution effects in atomic force microscopy imaging. RSC Advances. 6, 114286-114295 (2016).
  45. Mannini, B., et al. Stabilization and characterization of cytotoxic Aβ40 oligomers isolated from an aggregation reaction in the presence of zinc ions. ACS Chemical Neuroscience. , (2018).
  46. Medalsy, I., Hensen, U., Muller, D. J. Imaging and quantifying chemical and physical properties of native proteins at molecular resolution by force-volume AFM. Angewandte Chemie - International Edition. 50, 12103-12108 (2011).
  47. Dufrêne, Y. F., Martínez-Martín, D., Medalsy, I., Alsteens, D., Müller, D. J. Multiparametric imaging of biological systems by force-distance curve–based AFM. Nature Methods. 10, 847-854 (2013).
  48. Takai, E., et al. Scanning electron microscope imaging of amyloid fibrils. American Journal of Biochemistry and Biotechnology. 10, 31-39 (2014).
  49. Dazzi, A., et al. AFM-IR: Combining atomic force microscopy and infrared spectroscopy for nanoscale chemical characterization. Applied Spectroscopy. 66, 1365-1384 (2012).
  50. Volpatti, L. R., et al. Micro- and nanoscale hierarchical structure of core-shell protein microgels. Journal of Materials Chemistry B. 4, 7989-7999 (2016).
  51. Galante, D., et al. A critical concentration of N-terminal pyroglutamylated amyloid beta drives the misfolding of Ab1-42 into more toxic aggregates. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 79, 261-270 (2016).
  52. Ruggeri, F. S., et al. Identification of oxidative stress in red blood cells with nanoscale chemical resolution by infrared nanospectroscopy. International Journal of Molecular Sciences. 19, 1-14 (2018).
  53. Ramer, G., Ruggeri, F. S., Levin, A., Knowles, T. P. J., Centrone, A. Determination of polypeptide conformation with nanoscale resolution in water. ACS Nano. 12 (7), 6612-6619 (2018).
  54. Dazzi, A., Prater, C. B. AFM-IR: Technology and applications in nanoscale infrared spectroscopy and chemical imaging. Chemical Reviews. 117, 5146-5173 (2017).
  55. Lahiri, B., Holland, G., Centrone, A. Chemical imaging beyond the diffraction limit: experimental validation of the PTIR technique. Small. 9 (3), 439-445 (2013).
  56. Ansaloni, A., et al. One-pot semisynthesis of exon 1 of the huntingtin protein: New tools for elucidating the role of posttranslational modifications in the pathogenesis of Huntington’s disease. Angewandte Chemie - International Edition. 53 (7), 1928-1933 (2014).
  57. Khalaf, O., et al. The H50Q mutation enhances α-synuclein aggregation, secretion, and toxicity. Journal of Biological Chemistry. 289, 21856-21876 (2014).
  58. Hellstrand, E., Boland, B., Walsh, D. M., Linse, S. Amyloid β-protein aggregation produces highly reproducible kinetic data and occurs by a two-phase process. ACS Chemical Neuroscience. 1, 13-18 (2010).
  59. Limbocker, R., et al. Trodusquemine enhances Aβ42 aggregation but suppresses its toxicity by displacing oligomers from cell membranes. Nature Communications. 10 (1), 225 (2019).
  60. Lu, F., Belkin, M. A. Infrared absorption nano-spectroscopy using sample photoexpansion induced by tunable quantum cascade lasers. Optics Express. 19, 1902-1904 (2011).
  61. Jiao, Y., Schäffer, T. E. Accurate height and volume measurements on soft samples with the atomic force microscope. Langmuir. 20, 10038-10045 (2004).
  62. Müller, D. J., Engel, A. The height of biomolecules measured with the atomic force microscope depends on electrostatic interactions. Biophysical Journal. 73, 1633-1644 (1997).
  63. Heymann, J. B., Moller, C., Muller, D. J. Sampling effects influence heights measured with atomic force microscopy. Journal Of Microscopy-Oxford. 207, 43-51 (2002).
  64. Marinello, F., Balcon, M., Schiavuta, P., Carmignato, S., Savio, E. Thermal drift study on different commercial scanning probe microscopes during the initial warming-up phase. Measurement Science and Technology. 22, 9 (2011).
  65. Marinello, F., Bariani, P., De Chiffre, L., Savio, E. Fast technique for AFM vertical drift compensation. Measurement Science and Technology. 18, 689-696 (2007).
  66. Ricci, D., Braga, P. C. Recognizing and avoiding artifacts in AFM imaging (Clifton, N.J.). Methods in Molecular Biology. 242, 25-27 (2004).
  67. Canale, C., Torre, B., Ricci, D., Braga, P. C. Recognizing and avoiding artifacts in atomic force microscopy imaging. Atomic Force Microscopy in Biomedical Research. Braga, P. C., Ricci, D. 736, Humana Press. New York, NY. 31-43 (2011).
  68. Marinello, F., Carmignato, S., Voltan, A., Savio, E., De Chiffre, L. Error Sources in Atomic Force Microscopy for Dimensional Measurements: Taxonomy and Modeling. Journal of Manufacturing Science and Engineering. 132, 030903 (2010).
  69. Ukraintsev, E., Kromka, A., Kozak, H., Reme, Z., Rezek, B. Artifacts in Atomic Force Microscopy of Biological Samples. Atomic Force Microscopy Investigations into Biology - From Cell to Protein. Frewin, C. L. , (2012).
  70. Tsukruk, V. V., Singamaneni, S. Scanning Probe Microscopy of Soft Matter: Fundamentals and Practices. , Wiley-VCH Verlag GmbH. Weinheim, Germany. (2011).

Tags

Biokjemi amyloid neurodegeneration protein aggregering Atomic Force mikroskopi infrarød nanospectroscopy enkelt molekyl analyse spektroskopi
Karakteriserer individuelle protein aggregater av infrarød Nanospectroscopy og Atomic Force mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ruggeri, F. S., Šneideris, T.,… More

Ruggeri, F. S., Šneideris, T., Chia, S., Vendruscolo, M., Knowles, T. P. J. Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (151), e60108, doi:10.3791/60108 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter