Summary
本報告書は、ミクログリアまたは血液マクロファージからの細胞外小胞(EV)単離に関する時系列的要件を強調している。ミクログリア由来EVは神経突起の伸長因子として評価され、血液マクロファージ由来EVはインビトロアッセイにおけるC6グリオーマ細胞浸潤の制御で研究された。目標は、これらのEV機能を特定の微小環境における免疫メディエーターとして理解することです。
Abstract
中枢神経系(CNS)の神経炎症状態は、生理学的および病理学的状態において重要な役割を果たす。ミクログリアは、脳内に存在する免疫細胞、および時には浸潤した骨髄由来マクロファージ(Bmdm)を、CNSにおけるそれらの微小環境の炎症プロファイルを調節する。免疫細胞からの細胞外小胞(EV)集団が免疫メディエーターとして機能することが受け入れられています。したがって、その収集と分離は、その内容を特定するだけでなく、レシピエント細胞に対する生物学的影響を評価するために重要である。本データは、超遠心分離およびサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)ステップを含む、ミクログリア細胞または血液マクロファージからのEV分離に関する時系列的要件を強調している。非標的プロテオミクス解析により、EVマーカーとしてのタンパク質シグネチャの検証が可能になり、生物学的に活性なEVコンテンツが特徴付けされました。ミクログリア由来のEVは、神経突起の成長における免疫メディエーターとしての重要性を評価するために、ニューロンの一次培養にも機能的に使用された。その結果、ミクログリア由来のEVが、インビトロでの神経突起の成長を促進する作用を示した。並行して、血液マクロファージ由来のEVは、C6グリオーマ細胞のスフェロイド培養において免疫メディエーターとして機能的に使用され、これらのEVがインビトロでグリオーマ細胞の浸潤を制御することを示す結果である。このレポートでは、EV媒介免疫細胞機能を評価する可能性を強調する一方で、そのような通信の分子基盤を理解する。この解読は、CNS病理の微小環境における免疫特性を模倣するために、自然小胞および/または治療小胞のインビトロ調製を促進することができる。
Introduction
多くの神経病理学は、ますます考慮されている複雑なメカニズムである神経炎症状態に関連していますが、免疫プロセスは多様であり、細胞環境に依存しているため、まだ十分に理解されていません。実際、CNS障害は体系的に同じ活性化シグナルおよび免疫細胞集団を含まないため、炎症促進反応または抗炎症反応は病理学の原因または結果として評価することは困難である。「ミクログリア」と呼ばれる脳内マクロファージは、神経系と免疫系の間の界面にあるように見える。ミクログリアは骨髄由来を有し、脳を植民地化する原始造形中の黄身嚢に由来するが、末梢マクロファージは末梢マクロファージ2となる決定的な造形中の胎児肝臓に由来する。ミクログリア細胞は、アストロサイトやオリゴデンドロサイト3などのニューロンおよびニューロン由来のグリア細胞と通信する。最近のいくつかの研究では、ミクログリアがCNSの発達および成人組織恒常性の間に神経可塑性に関与していること、また神経変性疾患44,55に関連する炎症性状態で関与することが示されている。さもなければ、血液脳関門の完全性は、他のCNS病理において損なわれる可能性がある。免疫応答は、特に多形性神経膠芽腫において、血管形成過程およびリンパ管の存在を介して血液脳関門が再編成される6、77のミクログリア細胞のみでは支持されない。したがって、大骨髄由来マクロファージ(BMDM)浸潤は、腫瘍依存性血管新生機構全体にわたって脳腫瘍に起こる8。癌細胞は、免疫抑制性および腫瘍増殖につながる浸潤性BMに大きな影響を及ぼす9.このように免疫細胞とそれらの脳微小環境との間の通信は、細胞起源及び活性化シグナルが多様である10,11,11として理解し難い。このように、生理学的条件下で免疫細胞関連の分子シグネチャの機能を理解することは興味深い。この点に関して、細胞外小胞(EV)の放出を通して、免疫細胞と細胞微小環境との間の細胞間のコミュニケーションを研究することができる。
EVは、健康での免疫機能の調節、および病理学的状態12,13,13においてますます研究されている。エキソソームとミクロシクルの2つの集団を考慮することができる。それらは異なった生物発生およびサイズ範囲を提示する。エキソソームは、直径30~150nmの小胞で、内膜系から生成され、多面体(MVB)と血漿膜との融合時に分泌される。マイクロベシクルは直径約100〜1,000nmで、細胞形質膜14から外へ出芽することによって生成される。エキソソームとミクロベシクルの差別は、サイズや分子パターンに応じて実現することは困難であるため、本レポートではEVという用語のみを使用します。CNSにおけるEV関連通信は、線虫、昆虫またはアンネリド15、16を含む無脊椎動物種への関与を示した研究以来、16祖先のメカニズムを表す。さらに、EVが異種の細胞と通信できることを示す結果は、このメカニズムがキーロックシステムであることを示し、まず小胞とレシピエント細胞間の表面分子認識に基づいて、メディエーター16、17,17の取り込みを可能にする。実際、EVは、タンパク質(例えば、酵素、シグナル伝達、生物新生因子)、脂質(例えば、セラミド、コレステロール)または核酸(例えば、DNA、mRNAまたはmiRNA)がレシピエント細胞活動の直接的または間接的な調節因子として作用するタンパク質のような多くの分子を含んでいる。そのため、免疫細胞に対しても方法論的研究が行われ、EVを単離し、タンパク質シグネチャ18,19,19を完全に特徴付けた。
最も初期の研究では、Wnt3a-またはセロトニン依存活性化20,21,21に続く誘導機構として、一次培養ラットミクログリアからのエキソソームの放出を実証した。CNSにおいて機能的には、ミクログリア由来のEVは、神経興奮性22,23,23の制御に寄与するニューロンにおけるシナプス前末端によるシナプスベシクル放出を調節する。ミクログリア由来のEVは、大きな脳領域24,25,25においてサイトカイン媒介性炎症反応を伝播することもできる。重要なことに、トール様受容体ファミリーのための多様なリガンドは、ミクログリア26のEVの特定の生産を活性化するかもしれない。例えば、インビトロ研究は、LPS活性化ミクログリアBV2細胞株が炎症促進サイトカイン27を含む微分EV内容物を産生することを示している。したがって、CNSにおける免疫細胞亜集団の機能的多様性、ミクログリアおよび浸潤BMDMは、レシピエント細胞へのEVの影響およびEV内容物の同定を含む独自のEV集団を通じて評価され得る。
我々は、マイクログリアおよびBMDM由来EVの機能特性を、16,19,19の分離後に評価する方法を説明した。本報告では、ミクログリア由来EVが神経突起の伸長に及ぼす影響と、グリオーマ細胞凝集体の制御に及ぼすマクロファージ由来EVの効果を独自に評価することを提案する。また、EV単離手順を検証し、生物学的に活性なタンパク質シグネチャを同定するために、EV画分の広いプロテオミクス解析を提案する。EV内容物の有益な効果と分子解読は、脳障害における治療剤としての可能な操作および使用に役立つ可能性がある。
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Protocol
1. ミクログリア/マクロファージの主要文化
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ミクログリアの主要文化
- 培養市販ラット一次ミクログリア(2 x 106細胞)(材料表を参照)は、10%エキソソームフリー血清、100 U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、および9.0 g/Lグルコースを37°CおよびCO%で補ったダルベックの改変イーグル培地(DMEM)で表した。
- 48時間培養後にコンディションされた培地を収集し、EVの分離に進みます。
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マクロファージの主要文化
- 培養市販ラット一次マクロファージ(1 x 10 6細胞)を37°C及Table of Materialsび5%CO2で製造業者が提供する培地中の2(1 x106細胞)エキソソームフリー血清を用いた。
- 24時間培養後にコンディションされた培地を収集し、EVの分離に進みます。
2. EV の分離
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条件付きメディアからのEVの事前分離
- ミクログリアまたはマクロファージ培養物(ステップ1.1.2または1.2.2)から円錐管にコンディション培養液を移す。
- 遠心分離機を室温(RT)で10分間1,200xgで細胞をペレット化する。 g
- 上清を新しい円錐形の管に移す。遠心分離機は、アポトーシス体を排除するためにRTで20分間1,200 x gで。
- 上清を10.4 mLのポリカーボネートチューブに移し、チューブを70.1 Tiローターに移します。4°Cで90分間100,000xgの超遠心分離機をEVにペレット化する。 g
- 上清を捨て、0.20 μmの濾過リン酸緩衝液生理食塩(PBS)の200 μLでEVを含むペレットを再中断します。
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EV の分離
- 自家製サイズ除外クロマトグラフィーカラム(SEC)の作成
- ガラスクロマトグラフィーカラム(長さ:26cm;直径:0.6cm)を空にし(材料表を参照)、洗浄して滅菌します。
- 60 μm のフィルターをカラムの下部に配置します。
- 架橋されたアガロースゲルろ過ベースマトリックスを使用してカラムを積み重ね、直径0.6cm、高さ20cmの静止相を作成します。
- 0.20 μmのろ過PBSの50 mLでフェーズをすすい。必要に応じて後で使用するために4°Cで保管してください。
- 再懸濁したEVペレットをSECカラムの静止段階の上に置きます。
- 250 μLの連続分を20個収集しながら、固定フェーズの上部に0.20 μmのフィルターを加え、カラムの乾燥を防ぎます。必要に応じて-20°Cで分数を保存してください。
注:1週間より長い貯蔵は、分子分析のためのEV完全性を維持するために-80°Cで行うことができる。
- 自家製サイズ除外クロマトグラフィーカラム(SEC)の作成
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SEC画分のマトリックスアシストレーザー脱離イオン化(MALDI)質量分析
- セクション 2.2 で説明されているように EV 分離に進みます。
- 200 μL のペプチド校正ミックス溶液で EV ペレットを再懸濁します(材料表を参照)。
- セクション 2.2.1 から 2.2.3 に説明されているように EV コレクションに進みます。
- 真空濃縮器で分画を完全に乾燥させます。
- 0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)の10 μLで分画を再構成してください。
- MALDI研磨鋼ターゲットプレート上に1μLのα-シアノ-4-ヒドロキシシンナミン酸(HCCA)マトリックスと再構成された分率を混合します。
- MALDI質量分析計を使用して、すべての分画を分析します。
- 生成されたスペクトルを専用ソフトウェアで分析します(資料一覧を参照)。
3. EVの特徴付け
- ナノ粒子追跡解析(NTA)
メモ:NTA解析は、ナノ粒子追跡解析装置(材料表を参照)と自動シリンジポンプで行います。- 0.20 μm のフィルター処理された PBS で、ステップ 2.2.3 の各 SEC 分数の希釈 (1:50 ~ 1:500 の範囲) を作成します。
- EV凝集を排除する溶液をボルテックス。
- 希釈した溶液を1mLのシリンジに入れ、自動シリンジポンプに入れます。
- 画面ゲインレベル(3)とカメラレベル(13)にカメラ設定を調整します。
- [実行] をクリックし、次のスクリプトを起動します。
- 分析チャンバにサンプルをロードします(注入率:15sの場合は1,000)。
- ビデオ録画の速度流量を減少させ、安定させます(注入速度:15秒間25)。パーティクル フローの連続した 60 s ビデオを 3 つキャプチャします。
- ビデオ分析の前に、カメラレベル(13)と検出しきい値(3)を調整します。[設定] をクリックします。[OK]をクリックして解析を開始し、解析が完了したら[エクスポート]をクリックします。
- 各分画分析の間に、0.20 μmの濾過されたPBSの1 mLで洗浄する。
- 電子顕微鏡(EM)解析
- セクション 2 で説明されているように、EV を分離します。
注:滅菌状態は必要ありません。 - セクション 3.1 を繰り返して、EV を定量化します。
注:EM 分析には正の分数のみが使用されます。 - 50 kDa 遠心フィルター (材料表を参照) を使用して、EV 含有 SEC の分数を集中します。
- 濃縮EVを2%パラホルムアルデヒド(PFA)の30 μLに再懸濁します。
- サンプルの10 μLをカーボンコーティングされた銅グリッドに積み込みます。
- 湿潤環境で20分間インキュベートします。
- グリッド上のサンプルの吸収が良好な場合は、ステップ 3.2.5 と 3.2.6 を繰り返します。
- グリッドを、RTで5分間PBSで1%グルタルアルデヒドの低下に移します。
- 超純水でサンプルを数回洗います。
- 氷上で10分間サンプルを4%の酢酸ウラニルと2%メチルセルロース(1:9、v/v)の混合物と対照的にします。濾紙を使用して混合物の過剰を除去します。
- 試料を乾燥させて、200kVの透過型電子顕微鏡で観察します(材料表を参照)。
- セクション 2 で説明されているように、EV を分離します。
- ウェスタンブロット分析
- タンパク質抽出
- 手順 3.2.1 ~ 3.2.3 を繰り返して、EV を分離して集中します。
- 50 μLのリパバッファー(150 mM 塩化ナトリウム[NaCl]、50 mMトリス、5 mM エチレングリコールビス(2-アミノエチルルター)-N,N,N',N'テトラ酢酸[EGTA]、 2 mM エチレンアミン-テトラ酢酸 [EDTA], 100 mM フッ化ナトリウム [NaF] , 10 mM ピロリン酸ナトリウム, 1% ノニデクト P-40, 1 mM フェニルメタンスルホニルフッ化物 [PMSF], 1x プロテアーゼ阻害剤) EVサンプル (EV濃度から得られる 25 μL)
- 5 s(振幅:500 W;周波数:20kHz)、氷の上で3回の超音波処理。
- 20,000 x gで10分間、4°Cで遠心分離により、静脈の破片を除去します。
- 上清を収集し、ブラッドフォードタンパク質アッセイ法でタンパク質濃度を測定します。
- ドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)およびウェスタンブロッティング
- タンパク質抽出物(30 μg)と5cレムリサンプルバッファー(v/v)を混合します。
- タンパク質ミックスを12%ポリアクリルアミドゲルにロードします。
- TGSバッファー(25 mM Tris pH 8.5、192 mMグリシン、および0.1%SDS)でゲル中のタンパク質を15分間70V、45分間120 Vで移行します。
- 230 Vで半乾燥系でニトロセルロース膜にタンパク質を30分間移動させます。
- ブロッキングバッファー(0.05%Tween 20 w/v、0.1 M PBSで/v、pH 7.4で5%粉ミルク)でRTで1時間膜を飽和させます。
- ブロック緩衝液に希釈したマウスモノクローナル抗ヒト熱ショックタンパク質90(HSP90)抗体(1:100)で4°Cで膜を一晩インキュベートする。
- 膜をPBS-Tween(PBS、0.05%トゥイーン20 w/v)で3回15分間洗浄します。
- ラットワサビペルオキシダーゼ共役抗マウス IgG 二次抗体をブロッキングバッファーに希釈して、RT で 1 時間膜をインキュベートします (1:10,000)。
注:陰性対照は、二次抗体を単独で使用して行われる。 - 洗浄手順を繰り返します(ステップ3.3.2.7)。
- 強化された化学発光(ECL)ウェスタンブロッティング基板キットを有する膜を明らかにする(材料表を参照)。
- タンパク質抽出
- プロテオミクス解析
- タンパク質抽出とインゲル消化
- 手順 3.2.1 ~ 3.2.3 を繰り返して、EV を分離して集中します。EVタンパク質抽出のためにステップ3.3.1を繰り返します。
- 12%ポリアクリルアミドゲルの積層ゲルでタンパク質の移行を行います。
- RTで20分間クーマシーブルーでゲル中のタンパク質を固定します。
- 各着色されたゲル片を物品化し、1mm3の小片に切ります。
- 各溶液の300 μLでゲル片を連続して洗浄:15分間の超純水、 100%アセトニトリル(ACN)100%15分間、100mM重炭酸アンモニウム(NH4HCO3)15分間、ACN:100 mM NH4HCO 3(1:1、v/v)15分間、100%ACNを5分間連続撹拌する。3
- 真空濃縮器付きの完全にゲル部分を乾燥させます。
- 100 mM NH4HCO3 100 μL の 100 μL を 56°Cで 10 mM ジチオスレイトール 1 時間含有して、タンパク質還元を行います。
- RTで50mMのヨードアセトアミドを含む100mMNH4HCO3の100 μLでタンパク質アルキル化を45分間実施します。
- 各溶液の300 μLでゲル片を連続して洗浄します:15分間NH4HCO3の100mM、15分間のACN:20mM NH4HCO 3(1:1、v/v)、および100%ACNを連続攪拌しながら5分間洗浄します。3
- 真空濃縮器でゲル片を完全に乾燥させます。
- 20 mM NH4HCO3で 50 μL のトリプシン (12.5 μg/mL) を 37 °C で一晩でタンパク質消化を行います。
- 37°Cで30分間、30分間、そして連続撹拌しながらRTで15分間、100%ACNの50 μLのゲルから消化したタンパク質を抽出します。
- 20 mM NH 4 HCO 3溶液で20 mM NH4HCO3溶液で2回、連続撹拌しながら抽出手順を2回繰り返します。
- 100%ACNの100 μLを10分間加え、連続撹拌します。
- 真空濃縮器を用いて乾燥したタンパク質を、0.1%TFAの20 μLで再懸濁します。
- 10 μL ピペットチップを使用して、ペプチドの脱塩と濃縮用の C18 逆相培地 (材料表を参照) と ACN:0.1% ギ酸 (FA) (80:20, v/v) を含むペプチドを溶出させます。
- 真空濃縮器でサンプルを完全に乾燥し、液体クロマトグラフィータンデム質量分析(LC-MS/MS)のためにACN:0.1%FA(2:98、v/v)の20 μLで再懸濁します。
- LC-MS/MS 分析
- 消化されたペプチドをLC-MS/MS装置にロードし、他の42の詳細に記載されているパラメータに従ってサンプルおよびデータ分析を行う。
- 生データ分析
- 質量分析データを処理してタンパク質を同定し、標準パラメータを使用して各サンプルの同定されたタンパク質を定量プロテオミクスソフトウェアパッケージと比較します。
- 標準的なパラメータを使用して、EV陽性サンプルからの排他的および過剰に表現されたタンパク質のリストを、タンパク質ネットワークおよび生物学的プロセスを予測するソフトウェアでエクスポートします。
- 分画中の同定されたタンパク質のリストを、Exocartaオープンアクセスデータベースの上位100個のEVマーカーと比較します(材料表を参照)。
- タンパク質抽出とインゲル消化
4. 機能性EV効果アッセイ
- PC-12細胞株の神経突起成長アッセイ
- 完全なDMEM培地(2mM L-グルタミン、10%胎児馬血清(FHS)、5%ウシ胎児血清(FBS)、100 UI/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシンの培養PC12細胞株。
注:セラは、全体の手順でエキソソームフリーです。 - 24ウェルプレートにカバーガラス(すべてのウェル)を追加します。ポリD-リジン(0.1 mg/mL)でプレートをコーティングし、260,000個の細胞/ウェルをシードします。
- 5%CO2の下で37°Cで細胞を2インキュベートする。
- 24時間のインキュベーションの後、培地をDMEM分化培地(2 mM L-グルタミン、0.1%FHS、100 UI/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシン)に1 x 106ミクログリアEV(ステップ1.1.2から)に変更します。
注:制御条件は、微小グリアEVを分化培地に入れずに行う。 - 播種後4日目に、完全なDMEM培地を100 μLですべてのウェルをロードします。
- 播種後7日目に、RTで20分間4%PFAで細胞を固定し、PBSで3回(それぞれ10分)すすいでください。
- 4°Cで30分間ローダミン共役ファロイジンを細胞に染色し、PBSで3回(それぞれ10分)すすいだ。
- 細胞を希釈したHoechst 33342(1:10,000)をRTで30分間染色し、PBSで3回(それぞれ10分)すすいだ。
- カバーガラスを蛍光実装媒体付きスライドに取り付けます(材料表を参照)。
- 共焦点顕微鏡でスライドを分析し、各スライドの5つのランダムな画像を撮ります。
- 他の場所で詳細に説明されているように、自動定量ソフトウェア(全神経突起長)を使用して、ニューライトの伸びを測定する。
- 完全なDMEM培地(2mM L-グルタミン、10%胎児馬血清(FHS)、5%ウシ胎児血清(FBS)、100 UI/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシンの培養PC12細胞株。
- ラットの一次ニューロンの神経突起成長
- ポリD-リジン(0.1 mg/mL)とラミニン(20 μg/mL)で8ウェルガラススライドをコーティングします。
- 適切な培養培地中の培養ラットの一次ニューロン(材料表を参照)は、1ウェルあたり50,000細胞をめっきし、37°Cで5%CO2下で細胞を48時間インキュベートした。2
注:セラは、全体の手順でエキソソームフリーです。 - ニューロン培養培地に1 x 106ミクログリアEVを加え、さらに48時間5%CO22以下の37°Cでインキュベートします。
注:制御条件は、ニューロン培養培地においてミクログリアEVなしで行われる。 - ステップ 4.1.6 ~ 4.1.9 に従って、セルを固定して染色します。
- スライドを分析するには、手順 4.1.10 および 4.1.11 に従います。
- 神経膠腫細胞の浸潤
- C6ラットグリオーマ細胞を完全なDMEM培地(10%FBS、2 mM L-グルタミン、1x抗生物質)で再懸濁し、20μLで8,000細胞の最終濃度で5%コラーゲンを含有する。
注:セラは、全体の手順でエキソソームフリーです。 - 60mmティッシュ培養皿の底部に5mLのPBSを置きます。蓋を反転させ、20 μL(8,000細胞)の細胞懸濁液を蓋の底に沈めます。
- 蓋をPBS充填底室に反転させ、細胞回転楕円体が形成されるまで37°Cでプレートをインキュベートし、72時間CO2で5%のCO2をインキュベートします。
- 1 x 108マクロファージEV(ステップ1.2.2から)を2.2mg/mLコラーゲン混合物(2mLのウシコラーゲンタイプI溶液[3mg/mL]、250 μLの最小必須培地(MEM)、0.1M水酸化ナトリウム500 μL)に加えます。
注:制御条件は、コラーゲン混合物中のマクロファージEVなしで行われる。 - 細胞のスフェロイドを埋め込むための24ウェルプレートにEVを含むコラーゲン混合物を配布します。
- 新たに形成された細胞スフェロイドを各ウェルの中心に埋め込む。
- 37°Cでプレートを30分間インキュベートし、5%CO2でゲルを固化させます。2
- その後、各ウェルのコラーゲンマトリックス上に400μLの完全なDMEM培地を重ね合わせた。
- 37 °Cおよび5%CO2で合計6日間、完全なシステムをインキュ2ベートします。
注:回転楕円体の細胞浸潤は、4x/0.10 N.A.の目的を用いた反転光顕微鏡を用いたデジタル写真によって監視される。 - 毎日各井戸の画像を取得します。
- 画像を処理し、先に説明したとおりのソフトウェアを用いて細胞回転楕円体領域の浸潤を定量化する42.
注:侵略領域およびスフェロイド領域は、0日目に測定された浸潤領域および回転楕円体領域に対して毎日正規化された。
- C6ラットグリオーマ細胞を完全なDMEM培地(10%FBS、2 mM L-グルタミン、1x抗生物質)で再懸濁し、20μLで8,000細胞の最終濃度で5%コラーゲンを含有する。
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Representative Results
細胞外小胞(EV)に生物学的影響を与える主な課題の1つは、培養培地全体からEVを分離する能力です。本報告では、超遠心(UC)とサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を用いた方法を、EVマーカーを検証し、生理活性化合物を同定するためのタンパク質シグネチャの大規模分析に結合する方法を紹介する。マクロファージまたはミクログリア由来のEVを、それぞれ24時間または48時間培養した後に、条件培地から分離した(図1)。
図1:細胞外小胞(EV)の収集および分離戦略。アポトーシス体と細胞デブリは、連続した遠心分離工程によってミクログリアまたはマクロファージ調整培地から分離した。上清から、EVは超遠心分離(UC)によって単離された。EVを含むUCペレットをカラムにロードし、20種類の溶出した分画でサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)で分離しました。さらなるステップ(電子顕微鏡、ナノ粒子追跡分析およびプロテオミクス分析)で明らかにされているように、SEC画分は1F-EV-、2F-EV+および3F-EV-にプールされ、組織化された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
この方法は、連続した遠心分離ステップに従った:最初の細胞を除去し、第二に細胞の破片およびアポトーシス体を除去する。次いで、上清を新しいチューブに移し、90分間10万xgで超遠心を行った。ベシクルを、最終的なUCペレット中のタンパク質凝集体と共に回収した。SEC カラムを使用して、化合物をサイズに応じて分離し、凝集体を除去します (図 1)。EVの単離を確認するために、各SECの分数はナノ粒子追跡分析に従った(図2A)。
図2:SECの分数の分析(Sec画分のナノ粒子追跡解析 (NTA)各 SEC 端数のパーティクルの総数は棒グラフで示されます。オレンジ色の棒グラフは、連続する 3 つの EV+ 端数を示します (F5 - F7)。(B, C)NTAチャンバのスクリーンキャプチャは、SEC画分間の粒子流量に有意な差を示す。(D)相補的MALDI質量分析。EVを含む別のUCペレットから、SEC戦略の性能を検証するために、SEC分離の前に標準制御ペプチドセットが追加された。各SEC画分を、標準正の画分を決定するために、マトリックスアシストレーザー脱離イオン化-飛行時間(MALDI-TOF)で分析した。9つの第1スペクトル(画数1〜9)では、シグナルは認められなかった。これらのフリースタンダードの検出は、以下の画分(画数10~20分)で可能で、可溶性成分(F10-F20)からEV(F5~F7)を分離するSEC手順の能力を確認しました。(E)EVマーカー予備分析としてのSEC画分のウェスタンブロット分析EV+ フラクション (F5- F7) は 1 つのサンプル (2F-VE+) としてプールされ、EV- フラクション (それぞれ F1- F4 と F8 - F20) は 1F-EV-と 3F-EV-と呼ばれる他の 2 つのサンプルにプールされました。結果は、ヒートショックタンパク質90(HSP90)(EV陽性マーカー)シグナルの存在を2F-EV+で示し、また細胞ライセートにおいても他の画分(1F-EV-および3F-EV-)と比較して陽性対照として細胞ライセートで存在することを示した。(F, G)EV陽性試料(2F-EV+)の電子顕微鏡分析2つの連続した拡大の下での観察は、約100 nm(白い矢印)と約400 nm(矢印)のサイズ範囲でのEVの存在を明らかにしました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
粒子数は、分数5、6、7において、前の(F1-F4)および次の粒子数(F8-F20)よりも有意に高かった。以下の画分で少数の粒子が観察されたとしても、これらの画分で粒子の流れを見ることができます(図2B,C)。この分離は、F5-F7以外の分画が少量の小胞を含む可能性や、EVが豊富な分画F5~F7が分子汚染物質を含む可能性を防ぐものではありません。少なくともF5-F7画分が共溶出分子を汚染しないようにするには、SEC手順における異なる化合物の経時溶出に従う必要があった。これを行うために、対照ペプチド標準は、以前に使用された同様のUCペレットに添加した。この準備は、SECの手順を使用して再び分離されました。次に、標準が溶出したSEC画分を特定するために、マトリックス支援レーザー脱離イオン化-飛行時間(MALDI)質量分析を行った(図2D)。質量範囲のため、ペプチド標準からのイオン化産物のみがこの分析に従った。結果は、これらの製品が10〜20の画分で検出可能であることを示し、可溶性タンパク質はEVと同じ分数で溶出できないことを実証した(F5-F7)。これらの結果は、EV以外のコンポーネントからのEVの分離において、このアプローチの関心を確認した。F8-F20の分数にEVの残存分数が含まれると仮定しても、EV正分(F5-F7)を2F-EV+という単一のサンプルに組み合わせることを次の実験で決定しました。また、SECの他の分数を1F-EV-(F1-F4)と3F-EV-(F8-F20)と呼ばれる2つのサンプルに組み合わせました。いくつかの理由で3つのサンプルに分けてグループ化しました。第一に、SEC画分の数は、分子分析の時間だけでなく、機能的なインビトロ研究の時間を増加させるだろう。EV陽性SEC画分は、別々に低い粒子数を示し、また分子化合物の検出を損なう。同様に、F8~F20の分数をグループ化して、必要に応じて残留小胞を濃縮し、EVマーカーであるHSP90に対する予備的なウェスタンブロット分析によってその存在を確認することは、より賢明であると考えられた。興味深いことに、HSP90に対する陽性シグナルは、画分2F-EV+において検出され、また細胞ライセートでは陽性対照として検出されたが、1F-EV-および3F-EV-サンプルでは検出されなかった(図2Eおよび補助図S1を対照として)。この分析は、2F-EV+ のみの関心と、以前の SEC の分数の正しい管理を確認します。EV単離を肯定するために、電子顕微鏡を用いた追加実験では、2F-EV+サンプルのみを分析し、100~400nmの間の典型的な形態およびサイズの不均一性を有するEVの観察を可能にした(図2F,G)。
検証のもう一つの重要なステップは、プロテオミクス解析でした(図3)。(i)2F-EV+のEVマーカーの検出でEVの単離を確認し、最終的にはEV陰性サンプル(1F-EV-EV-3F-EV-)中の汚染物質タンパク質を同定し(iii)、生物学的活動を支えるEVのタンパク質含量を特徴付けるなど、複数の目的を持つ質量分析分析を開発しました。
図3:EV陽性およびEV陰性サンプルのプロテオミクス解析(A)類似したミクログリア細胞製剤から3つの独立したEV分離の後、サンプル1F-EV-、2F-EV+および3F-EV-は、ドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)のためにロードされ、ゲル内消化を実現するためにタンパク質を濃縮するためにゲルを積み重ねるまで移動した。得られたペプチドを液体クロマトグラフィータンデム質量分析(LC-MS/MS)で分析し、対応するタンパク質を同定した。(B)サンプル1F-EV-および2F-EV+の間で同定されたタンパク質の比較は、2F-EV+画分(522)で排他的に検出されたタンパク質との両方の分画(19)の共通タンパク質を示す。ヒートマップは、2F-EV+サンプルで1F-EV-3次体と2F-EV+トリプライケートの間のすべての一般的なタンパク質が過剰に表現された(赤)相対的な表現を示しています。(C)分画2F-EV+と3F-EV-の間で同定されたタンパク質の比較-トリクリケート(113)と排他的に表されるタンパク質(2F-EV+の428および3F-EV-で11)との間の共通のタンパク質を示す。ヒートマップは、2 つのクラスタの相対表現を示します。1つの(クラスタA)は3F-EV-サンプルに5つの過剰表現タンパク質を提示し、2番目の(クラスタB)は2F-EV+で108の過剰表現タンパク質を提示する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
細胞条件の培地から、UCおよびSECの手順は3つのサンプル1F-EV-、2F-EV+および3F-EV-につながった。対応するタンパク質を、ドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(SDS-PAGE)により抽出および濃縮した。積層ゲルでの短い移行の後、サンプルをバンド切除によって収集し、ゲル内消化される別個のチューブに移した。製品は、分析のために質量分析計に直接結合されたオンライン逆転相クロマトグラフィーによって分離された(図3A)。
以下の結果は、全体の手順の一例として、48時間培養後のミクログリア調整培地から得られた。生データはラットタンパク質データベースに提出された。同定されたタンパク質を、サンプル1F-EV-および2F-EV+(図3B)とサンプル2F-EV+および3F-EV-(図3C)の間で比較した。最初の比較では、ベン図は、2F-EV+画分で排他的に検出された522個のタンパク質と両方の分画で19個の一般的なタンパク質を示した。定量的プロテオミクスソフトウェアを用いた分析により、共通タンパク質の相対表現の同定が可能となる。結果は、1F-EV-2F-EV+トリプリケート間のすべての一般的なタンパク質が2F-EV+サンプルで過剰に表現された(赤)ヒートマップを示した。2F-EV+と3F-EV-の画分の比較では、トリクリケート間で113個の一般的なタンパク質が同定された。さらに、2F-EV+では428個のタンパク質が排他的に検出され、3F-EV-では11個のタンパク質が排他的に検出されました。定量分析の後、113個の一般的なタンパク質のヒートマップ表現は、クラスターAが3F-EV-サンプルで5つの過剰表現タンパク質を提示し、クラスターBが2F-EV+で108の過剰表現タンパク質を提示した2つのクラスターを強調した。
2F-EV+で過剰に表現された428個のタンパク質と、EV関連分子を検出するためにExocartaオープンアクセスデータベースに提出されたタンパク質は108個でした。エキソカルタのトップ100 EVマーカーの分析は、2F-EV+における86個のEV関連タンパク質の存在を強調した(図4A)。
図4:2F-EV+サンプルからのタンパク質の分析(A) EV関連分子を検出するために、536個のタンパク質(428個の排他的タンパク質と108個の過剰表現タンパク質)のプールがExocartaデータベースに提出されました。エキソカルタデータベースから上位100EVマーカーで検出された86個のEV関連タンパク質の分子記号。(B)選択した生物学的プロセスに対するタンパク質相互作用とそれらの関連の予測は、2F-EV+サンプル中に免疫および神経保護経路を示した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
興味深いことに、クラスターA内の5つの一般的なタンパク質と3F-EVに排他的に表される11個のタンパク質の分析は、どのEVマーカーにも関連していなかった(データは示されていない)。最後に、タンパク質相互作用の予測と選択した生物学的プロセスとの関連は、2F-EV+免疫メディエーターの割合(21%)における存在を示した(21%)炎症反応の制御に関与することがある(4.1%)(図4B)。2F-EV+のEV内容もニューロンの発達(16.8%)、ニューロン分化(5%)と関連していた。神経死の制御(3.8%)これは、以下の神経突起伸長アッセイに従う。
したがって、我々が選択した戦略は、すべてのデータへのアクセスを可能にし、我々が実行した生物学的アッセイの前にEV媒介機能の予測を可能にする(図5)。
図5:EV依存性fアンクシオンアッセイ。ミクログリア由来EVの効果を神経突起の伸び(上枠)に対して評価し、マクロファージ由来のEVの影響をグリオーマ細胞浸潤(下枠)に評価した。(A, B)この神経突起長は、PC-12細胞(パネルAは許可を得てラフォ・ロメロら16個)またはラットの一次ニューロン(B)から測定した。その結果、制御(Ctrl)と比較してEV(+EV)の下で大幅な成長が見られました。スケールバー=20μm(C、D)ラットのマクロファージ由来のEV(C6+EV)または車両(C6制御)の存在下でのC6グリオーマスプフェロイド浸潤の時間経過。C DC6スフェロイド3Dコラーゲンへの浸潤を監視し、最大6日間定量した。腫瘍細胞浸潤の定量は、代表的な画像(D)で観察された1、2、3または6日(C)で示される。スケールバー= 500 μm神経突起の成長アッセイの場合、有意性は、ペアになっていない学生のt-検定(* p p<0.05、**p<0.01およびp***p<0.001)によって計算された。 p侵略アッセイの場合、有意性は一方向のANOVAによって計算され、続いてTukeyのポストホックテストが行われた。誤差範囲は、3つの独立した実験の相対的な標準誤差を示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
このようにして、ミクログリア由来EVの神経栄養機能を、PC-12細胞株およびラット一次ニューロンについて研究した。結果は、神経突起の成長にプラスの効果を示した(図5A,B)。EVの存在は、制御条件と比較して、PC-12およびプライマリニューロンの長さおよび/または数で、それぞれ約6および1.5倍に増加しました。別の文脈では、マクロファージ由来のEVが脳腫瘍の浸潤に及ぼす影響についても調べている(図5C,D)。コラーゲンのマトリックスに埋め込まれた3D腫瘍スフェロイドを用いて評価した。C6ラットグリオーマ細胞で生成されたスフェロイドは、ラットマクロファージ培地から精製された(または含まない)EVを含むコラーゲンマトリックスで6日間培養した。コラーゲンマトリックスは、腫瘍細胞がスフェロイドに侵入し、広がることができる構造を提供します。マクロファージ由来のEVは、グリオーマ回転楕円体の成長および侵入を損なった。6日間培養後、EV処理スフェロイドで制御と比較して浸潤の50%減少が認められた。この結果は、マクロファージがグリオーマの成長に影響を与える抗腫瘍および/または抗侵襲因子を有するEVを産生できることを示した。
補足図S1:ウェスタンブロッティング実験に用いられる膜の画像。(A)図2Eからのウェスタンブロットのオリジナル画像(HSP90 EVマーカーに対して)。(B)同膜のポンソー染色像は、1F-EV-2F-EV+および3F-EV-サンプルからのタンパク質抽出物の正しい負荷を示す。こちらをダウンロードしてください。
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Discussion
中枢神経系(CNS)は、細胞間通信がホメオスタシス30に必要な正常な神経機能を調節する複雑な組織である。EVは現在広く研究され、細胞間通信31のための重要な分子貨物として記述されている。彼らは特にレシピエント細胞にメディエーターのカクテルを提供し、それによって健康で病的な状態におけるそれらの機能に影響を与える32.最近の研究では、EVはCNS24、33、34、33,34特に脳免疫細胞35、36の脳免疫細胞の中で重要な役割を36果たしていることを示しています。24プロ炎症免疫応答と抗炎症免疫応答のバランスは非常に重要であり、シナプスの発達と生涯を通じて神経活動中に脳の完全性を維持することができます。この研究では、ミクログリアとニューロンの関係(i)と(ii)浸潤マクロファージとグリオーマ細胞の間の2つの異なる状況が議論された。第一に、ミクログリアは脳組織の中のマクロファージであり、ニューロン活動を確実にするために微小環境変化の管理において重要な免疫の役割を果たす。しかし、過剰な炎症促進機構は、過活性化されたミクログリアによって支持され、神経変性疾患37、38,38につながる。対照的に、高級神経膠腫は抗炎症プロファイルを必要とし、腫瘍部位で募集された腫瘍関連マクロファージ(TAM)を含む。骨髄由来のマクロファージ(BMDM)は、グリオーマ細胞と密接な関係にあるこれらのTAMの集団を表す。腫瘍の影響下で、BMDMは生体内で抗炎症および腫瘍性プロファイル39を示す。これらのBmdmが体外腫瘍細胞浸潤をどのように制御できるかは、この報告書の重要な問題である。そのため、マクロファージ由来のEVは、グリオーマ回転楕円体浸潤アッセイにおいて単独で使用された。共培養では、グリオーマ細胞はマクロファージに影響を与え、抗炎症プロファイルを有する他のEV集団を産生したであろう。免疫EVの直接使用は、抗腫瘍剤と同様に優れている可能性があります。その結果、免疫細胞は、炎症バランスが外部シグナル40,41によって強く影響される特定の微小環境において細胞間コミュニケーションを維持する。EV媒介免疫応答の理解は、多くの疾患の病因を制限する大きな課題を表しています。生物学的に活性なEV内容物の同定は、調節不調の炎症過程を理解し、新しい治療戦略42,43,43を提案する鍵の1つである。
本研究では、細胞デブリ、アポトーシス体、可溶性分子を排除する第一歩として、微分超遠心分離プロセスで構成される方法論を、サイズ排除クロマトグラフィーと組み合わせて分子集合体からEVを単離する方法論を提示する。EV集団を生物学的アッセイで評価する場合、EVの内容物を他の共分離材料から区別することが重要です。そのため、EVと非EV関連化合物を分離するために分離を改善しました。SEC手順に提出された対照サンプルに標準タンパク質を添加することで、MALDI-TOFによって溶出画分を局的に行うことができました。標準は自由な分子であるため、非EV材料に関連するサンプル関連分子集合体とグローバルに共溶性を持っています。したがって、実験サンプルからのEV画分は、信頼性の高い分離手順で検証された。また、ダブルプロテオミクス解析戦略も展開しました。エバンマーカー予備検出としてウェスタンブロッティングによる抗HSP90抗体の使用を除き、我々は、EV関連タンパク質シグネチャの非標的検出による正しいEV分画を検証することを決定した。実際、本アプローチは、特定の抗体の特異性および感受性が不十分なため、複数の既知のEVマーカーの検出に意図的に焦点を当てなかった。EV亜集団の表面におけるいくつかのEVマーカーの変動性と豊富さは、孤立手順において依然として議論の余地がある。さらに、抗体ベースの方法論は、市販の抗体の欠如のために多くの生物の限界を表す可能性があり、EV研究は現在生物学で話題になっています。この非標的分析により、既にEVマーカーとして記述されている分子の数が多い(Exocartaデータベースの上位100EVマーカーに86個のタンパク質)同定が可能になった。最後に、このアプローチは、検出されたタンパク質が既知のEVマーカーに重要なホモロジーを提示できる場合、十分に記述されていない生物からのEV分離を検証するのに本当に有用である可能性があります。最近述べたように、大規模なプロテオミクス解析は、少数の任意のマーカー43のみを使用する代わりとなる可能性がある。これにより、生物アッセイで使用する前に、EV+画分の識別と活性コンテンツの同定が改善される。
実際、生物アッセイで観察された効果に対して、EV内容物の特性評価を関連付ける必要がある。実際、EVがレシピエント細胞に及ぼす生物学的影響は、静脈メディエーターまたはエフェクターが関与することを示唆している。繰り返しますが、同じ非標的分析は生物学的に活性な分子の同定を可能にする。この分析で可能な最適化は、同定することが可能である分子の種類に関するものです。我々の戦略は、タンパク質シグネチャの大規模な分析に基づいており、免疫応答およびニューロン生存に関連する予測生物学的経路につながった。脂質、mRNA、マイクロRNAを含む他の分子ファミリーを考慮することが不可欠です。我々の現在の研究は、このEV依存的なコミュニケーションの世界的な知識を得るために、これらの追加同定をタンパク質シグネチャに関連付けています。
多くの治療アプローチは、今後数年間で想定されています。EVは血液脳関門を容易に横断し、病理学的組織に到達することができることを考えると、これらの分子貨物は異なる方法で使用することができる。この研究はEV表面分子を強調しなかったが、標的細胞および組織に対するアドレッシングプロセスをよりよく理解するためには、その同定が依然として必要である。私たちの方法論におけるプロテオミクス分析は、これらのデータへのアクセスを提供します。それ以外の場合は、このレポートでは、EVのインビトロ生産を有益なカクテルとして発表しました。私たちは、事前に免疫細胞をプライムまたは活性化するための最良の条件を最適化しませんでした。この点は、組織では、微小環境が免疫細胞に直接影響を与え、最終的にはEVの生物形成に寄与するため、非常に重要です。例えば神経膠芽腫の場合、がん細胞は独自のEVを産生し、従って、抗炎症プロファイル及びそれらの局所免疫抑制44,45,に向けて隣接するTAMを配向させる作用を有することが分かった。これが、グリオーマ環境におけるマクロファージ由来のEVが、単一のマクロファージ培養で生成されるものと異なる理由です。このように、マクロファージとグリオーマの共培養は腫瘍増殖を制御できないため、単一のマクロファージ培養物とは別に作製したマクロファージ由来のEVを直接用いて、グリオーマ・スピフェロイド浸潤を制御した。さらなる治療戦略は、活性化マクロファージからインビトロで産生される炎症促進および抗腫瘍性EVを使用することによって、この生体内免疫抑制を防ぐことができる。同様の戦略は、神経細胞の生存を支持する神経保護および抗炎症反応を生成するために適切に警告されたミクログリア由来のEVの使用を通じて神経変性疾患の文脈で使用することができる。結論として、免疫細胞と生体内微小環境との間のEV媒介性コミュニケーションの研究は、病因のより良い理解を可能にし、革新的な治療アプローチを設計するための鍵である。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
発表された作品は、ミニステール・ド・ラ・エデュケーション・ナショナル、ド・ランセニュエ・シュペリエール・エ・ド・ラ・レシェルシュ、インサームによって支えられました。私たちは、BICeL - キャンパスサイエンティフィックシティ施設が楽器や技術アドバイスにアクセスすることを感謝しています。ジャン=パスカル・ギメノ、スライマン・アブールアール、イザベル・フルニエの質量分析支援を心よりお見せします。私たちは、タニナ・アラブ、クリステル・ファン・キャンプ、フランソワーズ・ル・マレック・クロク、ヤコポ・ヴィツィオーリ、ピエール=エリック・ソティエールが科学技術開発に強く貢献してくれたことを感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-rad | 4561045EDU | |
| Acetonitrile | Fisher Chemicals | A955-1 | |
| Amicon 50 kDa centrifugal filter | Merck | UFC505024 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| HSP90 α/β antibody (RRID: AB_675659) | Santa-cruz | sc-13119 | |
| B27 Plus supplement | Gibco | A3582801 | |
| BenchMixer V2 Vortex Mixer | Benchmark Scientific | BV1003 | |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bradford) | Bio-Rad | 5000006 | |
| C18 ZipTips | Merck Millipore | ZTC18S096 | |
| C6 rat glioma cell | ATCC | ATCC CCL-107 | |
| Canonical tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804000010 | |
| CO2 Incubator | ThermoFisher | ||
| Confocal microscope LSM880 | Carl Zeiss | LSM880 | |
| Cover glass | Marienfeld | 111580 | |
| Culture Dish (60 mm) | Sarstedt | 82.1473 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph | ThermoFisher | ||
| Electron microscope JEM-2100 | JEOL | ||
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 03777-10G | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED-100G | |
| Exo-FBS | Ozyme | EXO-FBS-50A-1 | Exosome depleted FBS |
| ExoCarta database (top 100 proteins of Evs) | http://www.exocarta.org/ | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16140071 | |
| Fetal Horse Serum | Biowest | S0960-500 | |
| Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Fisherbrand Q500 Sonicator with Probe | Fisherbrand | 12893543 | |
| FlexAnalysis | Brucker | ||
| Fluorescence mounting medium | Agilent | S3023 | |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 695076 | |
| Formvar-carbon coated copper grids | Agar scientific Ltd | AGS162-3 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8769 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| Hoechst 33342 | Euromedex | 17535-AAT | |
| Idoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| InstantBlue Coomassie Protein Stain | Expedeon | ISB1L | |
| Invert light microscope CKX53 | Olympus | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| LabTek II 8 wells | Nunc | 154534 | |
| Laemmli 2x | Bio-Rad | 1610737 | |
| Laminin | Corning | 354232 | |
| MaxQuant software (proteins identification software) | https://maxquant.net/maxquant/ | ||
| MBT Polish stell | Brucker | 8268711 | |
| MEM 10x | Gibco | 21090-022 | |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M6385-100G | |
| MiliQ water | Merck Millipore | ||
| Milk | Regilait | REGILAIT300 | |
| Mini PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 1658000FC | |
| MonoP FPLC column | GE Healthcare | no longer available | |
| Nanosight NS300 | Malvern Panalytical | NS300 | |
| NanoSight NTA software v3.2 | Malvern Panalytical | ||
| NanoSight syringe pump | Malvern Panalytical | ||
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| Nitrocellulose membrane | GE Healthcare | 10600007 | |
| Nonidet P-40 | Fluka | 56741 | |
| Nunc multidish 24 wells | ThermoFisher | 82.1473 | |
| Paraformaldehyde | Electro microscopy Science | 15713 | |
| PC-12 cell line | ATCC | ATCC CRL-1721 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Peptide calibration mix | LaserBio Labs | C101 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-035-003 | |
| Perseus software (Processing of identified proteins) | https://maxquant.net/perseus/ | ||
| Phalloidin-tetramethylrhodamine conjugate | Santa-cruz | sc-362065 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | 78830 | |
| Phosphate Buffer Saline | Invitrogen | 14190094 | no calcium, no magnesium |
| pluriStrainer M/ 60 µm | pluriSelect | 43-50060 | |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Polycarbonate centrifuge tubes | Beckman Coulter | 355651 | |
| Protease Inhibitor | Sigma-Aldrich | S8830-20TAB | |
| PureCol | Cell Systems | 5005 | |
| Q-Exactive mass spectrometer | ThermoFisher | ||
| rapifleX mass spectrometer | Brucker | ||
| Rat cortical neurons | Cell Applications | R882N-20 | Cell origin : Derived from cerebral cortices of day 18 embryonic Sprague Dawley rat brains |
| Rat Macrophage & Microglia Culture Medium | Cell Applications | R620K-100 | Cell orgin : Normal healthy Rat bone marrow |
| Rat primary macrophages | Cell Applications | R8818-10a | |
| Rat primary microglia | Lonza | RG535 | |
| Sepharose CL-2B | GE Healthcare | 17014001 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| Slide | Dustsher | 100204 | |
| Sodium Chloride | Scharlau | SO0227 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | S7920-100G | |
| Sodium hydroxide | Scharlab | SO0420005P | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich | S6422-100G | |
| SpeedVac Vacuum Concentrator | ThermoFisher | ||
| String software (functional protein association networks) | https://string-db.org/ | ||
| SuperSignal West Dura extended Duration Substrate | ThermoFisher | 34075 | |
| Syringe 1.0 mL | Terumo | 8SS01H1 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Tris | Interchim | UP031657 | |
| Tris-Glycine | Euromedex | EU0550 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95765 | |
| Ultracentrifuge Rotor 70.1 Ti | Beckman Coulter | 342184 | |
| Uranyl acetate | Agar Scientific Ltd | AGR1260A | |
| Whatman filter paper | Sigma-Aldrich | WHA10347510 | |
| α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma-Aldrich | C2020-25G |
References
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