Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Karakterisering af immuncelleafledte ekstracellulære vesikler og undersøgelse af funktionel indvirkning på cellemiljøet

Published: June 2, 2020 doi: 10.3791/60118
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1U1192-Laboratoire Protéomique, Réponse Inflammatoire et Spectrométrie de Masse (PRISM), Univ. Lille, INSERM

Summary

Denne rapport fremhæver kronologiske krav til ekstracellulær vesikelisode (EV) fra mikroglia eller blodmakrofager. Mikroglia-afledte elbiler blev evalueret som regulatorer af neurite udvækst, mens blod makrofag-afledte elbiler blev undersøgt i kontrol af C6 gliom celle invasion i in vitro assays. Målet er bedre at forstå disse EV funktioner som immun mæglere i specifikke mikromiljøer.

Abstract

Den neuroinflammatoriske tilstand af centralnervesystemet (CNS) spiller en central rolle i fysiologiske og patologiske tilstand. Microglia, de hjemmehørende immunceller i hjernen, og nogle gange infiltrerende knoglemarv-afledte makrofager (BMDMs), regulere den inflammatoriske profil af deres mikromiljø i CNS. Det er nu accepteret, at den ekstracellulære vesikel (EV) populationer fra immunceller fungerer som immun mæglere. Deres indsamling og isolation er således vigtige for at identificere deres indhold, men også vurdere deres biologiske virkninger på recipientceller. De nuværende data fremhæver kronologiske krav til EV-isolering fra mikrogliaceller eller blodmakrofager, herunder trinnene ultracentrifugering og størrelsesundfadelseskromatografi (SEC). En ikke-målrettet proteomisk analyse gjorde det muligt at validere proteinsignaturer som EV-markører og karakteriserede det biologisk aktive EV-indhold. Mikroglia-afledte eldrevne køretøjer blev også funktionelt brugt på primær kultur af neuroner til at vurdere deres betydning som immun mæglere i neurite udvækst. Resultaterne viste, at mikroglia-afledte elbiler bidrager til at lette neurite udvækst in vitro. Sideløbende, blod makrofag-afledte elbiler blev funktionelt brugt som immun mæglere i sfæroide kulturer af C6 gliom celler, resultaterne viser, at disse eldrevne kontrol gliom celle invasion in vitro. Denne rapport fremhæver muligheden for at evaluere de EV-medieret immuncellefunktioner, men også forstå de molekylære baser for en sådan kommunikation. Denne dechifrering kunne fremme brugen af naturlige vesikler og/ eller in vitro forberedelse af terapeutiske vesikler med henblik på at efterligne immunegenskaber i mikromiljø af CNS patologier.

Introduction

Mange neuropatologier er relateret til neuro-inflammatorisk tilstand, som er en kompleks mekanisme, der i stigende grad betragtes, men stadig dårligt forstået, fordi immunprocesser er forskellige og afhænger af cellemiljøet. CNS-lidelserne involverer ikke systematisk de samme aktiveringssignaler og immuncellepopulationer, og derfor er de pro- eller antiinflammatoriske reaktioner vanskelige at vurdere som årsager eller konsekvenser af patologier. Hjernen hjemmehørende makrofager kaldet "microglia" synes at være på grænsefladen mellem nerve og immunforsvar1. Microglia har en myeloid oprindelse og er afledt af blommesækken under primitive hæmatopoiese at kolonisere hjernen, mens perifere makrofager er afledt af fosterleveren under endelige hæmatopoiese at blive periferemakrofager 2. Mikrogliacellerne kommunikerer med neuroner og neuron-afledte gliaceller såsom astrocytter og oligodendrocytter3. Flere nylige undersøgelser har vist, at mikroglia er involveret i neuronal plasticitet under CNS udvikling og voksne væv homøostase, og også i den inflammatoriske tilstand forbundet med neurodegenerative sygdomme4,5. Ellers, integriteten af blod-hjerne barrieren kan blive kompromitteret i andre CNS patologier. Immunresponset, især i glioblastoma multiforme kræft, understøttes ikke kun af mikroglia celler som blod-hjerne barrieren er reorganiseret gennem angiogene processer og tilstedeværelsen af lymfekar6,7. Derfor, en stor knoglemarvs-afledte makrofager (BMDMs) infiltration forekommer i hjernen tumor hele tumor-afhængige angiogenese mekanismer8. Kræftcellerne udøver en betydelig indflydelse på infiltrerede BMDM'er, der fører til immunsuppressive egenskaber og tumorvækst9. Kommunikationen mellem immuncellerne og deres mikromiljø i hjernen er således vanskelig at forstå , da celleoprindelsen og aktiveringssignalerne er forskellige10,11. Det er derfor interessant at pågribe funktionerne i immuncelle-associerede molekylære signaturer i fysiologiske tilstande. I denne forbindelse kan cellecellekommunikationen mellem immunceller og cellemikromiljø undersøges ved frigivelse af ekstracellulære vesikler.

Eldrevne køretøjer er ved at blive undersøgt mere og mere i reguleringen af immunfunktioner i sunde såvel som patologiske tilstande12,13. Der kan tages hensyn til to populationer, exosomer og mikrobønsikler. De præsenterer forskellige biogenese og størrelse intervaller. Exosomer er vesikler af ~30-150 nm diameter og genereres fra endosomalsystemet og udskilles under fusion af flervesiulære kroppe (MVBs) med plasmamembranen. Mikroblærerne er ca. 100-1.000 nm i diameter og genereres ved en udadgående spirende fra celleplasmamembranen14. Da forskelsbehandlingen af exosom versus mikrovesicle stadig er vanskelig at realisere i henhold til størrelse og molekylære mønstre, vil vi kun bruge udtrykket eldrevne køretøjer i denne rapport. Den EV-associerede kommunikation i CNS er en forfædresmekanisme,da undersøgelser viste, at de er involveret i hvirvelløse arter, herunder nematoder, insekter eller annelids15,16. Desuden viser resultaterne, der viser, at eldrevne køretøjer kan kommunikere med celler fra forskellige arter, at denne mekanisme er et nøglelåsesystem, der først er baseret på genkendelse af overflademolekyler mellem vesikler og recipientceller og derefter gør det muligt at tage mediatorer16,17. Eldrevne køretøjer indeholder mange molekyler som proteiner (f.eks. enzymer, signaltransduktion, biogenesefaktor), lipider (f.eks. ceramid, kolesterol) eller nukleinsyrer (f.eks. DNA, mRNA eller miRNAs), der fungerer som direkte eller indirekte regulatorer af modtagercelleaktiviteterne14. Derfor blev der også udført metodologiske undersøgelser af immunceller for at isolere eldrevne køretøjer og fuldt ud karakterisere deres proteinsignaturer18,19.

De tidligste undersøgelser viste frigivelsen af exosomer fra primær dyrket rottemikroglia som en inducerende mekanisme efter en Wnt3a- eller serotonin-afhængig aktivering20,21. Funktionelt i CNS, microglia-afledte elbiler regulere synaptiske vesikel frigivelse af præsynaptiske terminaler i neuroner bidrager til kontrol af neuronal ophidselse22,23. Mikroglia-afledte eldrevne køretøjer kan også udbrede cytokiner-medieret inflammatorisk respons i store hjerneregioner24,25. Vigtigere er det, de forskellige ligander for vejafgift-lignende receptor familie kan aktivere specifikke produktioner af elbiler i microglia26. For eksempel viser in vitro-undersøgelser, at LPS-aktiverede mikroglia BV2-cellelinjer producerer differentiale ev-indhold, herunder proinflammatoriske cytokiner27. Derfor kan den funktionelle mangfoldighed af immuncelledepopulationer i CNS, mikroglia og infiltrerende BMDM'er evalueres gennem deres egne EV-populationer, herunder ev-indvirkningen på recipientceller og identifikation af ev-indhold.

Vi har tidligere beskrevet metoder til at evaluere de funktionelle egenskaber af mikroglia- og BMDM-afledte elbiler efter deres isolation16,19. I denne rapport foreslår vi uafhængigt at evaluere virkningen af mikroglia-afledte eldrevne energileverandører på neuriteudvækst og virkningen af makrofagebaserede eldrevne på kontrollen af gliomcelleaggregater. Denne undersøgelse foreslår også en bred proteomisk analyse af EV-fraktionerne med henblik på at validere EV-isolationsproceduren samt identificere de biologisk aktive proteinsignaturer. De gavnlige virkninger og den molekylære dechifrering af EV indhold kunne hjælpe deres mulige manipulation og brug som terapeutiske midler i hjernesygdomme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Mikroglia/makrofagges primære kultur

  1. Mikroglias primære kultur
    1. Kultur kommerciel rotte primære mikroglia (2 x 106 celler) (se tabel over materialer) i Dulbecco modificerede Eagle medium (DMEM) suppleret med 10% exosome-fri serum, 100 U / ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, og 9,0 g / l glukose ved 37 C ° C ° og 5% CO2.
    2. Saml det konditionerede medium efter en 48 timers kultur og fortsæt til isolering af elbiler.
  2. Makrofagernes primære kultur
    1. Dyrkning kommercielle rotte primære makrofager (1 x 106 celler) i mediet fra fabrikanten (se tabel over materialer) ved 37 °C og 5% CO2, med exosom-fri serum.
    2. Saml det konditionerede medium efter en 24 timers kultur og fortsæt til isolering af elbiler.

2. Isolering af eldrevne køretøjer

  1. Forisolering af eldrevne køretøjer fra konditioneret medium
    1. Det konditionerede dyrkningsmedium overføres fra mikroglia- eller makrofagskulturer (trin 1.1.2 eller 1.2.2) til et konisk rør.
    2. Centrifuge ved 1.200 x g i 10 min ved stuetemperatur (RT) for at pellete cellerne.
    3. Overfør supernatanten til et nyt konisk rør. Centrifuge ved 1.200 x g i 20 min på RT for at fjerne apoptotiske organer.
    4. Supernatanten overføres til et 10,4 ml polycarbonatrør, og røret overføres til en 70,1 Ti rotor. Ultracentrifuge ved 100.000 x g i 90 min ved 4 °C til pellet eVs.
    5. Supernatanten genbesættes, og pelleten, der indeholder eldrevne køretøjer, genudsættes i 200 μL 0,20 μm filtreret fosfatbuffersal (PBS).
  2. Isolering af elbiler
    1. Forberedelse af den hjemmelavede størrelse udelukkelse kromatografi kolonne (SEC)
      1. Tøm en glaskromatografisøjle (længde: 26 cm; diameter: 0,6 cm) (se Tabel over Materialer), vask og steriliser den.
      2. Der anbringes et 60 μm-filter nederst på kolonnen.
      3. Stak kolonnen med tværbundet agarose gel filtrering base matrix til at skabe en stationær fase af en 0,6 cm diameter og en 20 cm højde.
      4. Skyl fasen med 50 ml 0,20 μm filtreret PBS. Opbevares ved 4 °C, som om nødvendigt skal anvendes senere.
    2. Den opslæmmede EV-pellet anbringes oven på den stationære fase af SEC-kolonnen.
    3. Der opsamles 20 sekventielle fraktioner på 250 μL, mens der fortsat tilsættes 0,20 μm filtreret PBS på toppen af den stationære fase for at forhindre tørring af kolonnen. Fraktionerne opbevares om nødvendigt ved -20 °C.
      BEMÆRK: En længere opbevaring end en uge kan udføres ved -80 °C for at opretholde EV integritet for molekylær analyse.
  3. Matrix assisteret laser desorption ionisering (MALDI) massespektrometri analyse af SEC fraktioner
    1. Fortsæt til ev-isolationen som beskrevet i punkt 2.2.
    2. Opslæmme EV-pellet'en med 200 μL peptidkalibreringsopløsning (se materialetabellen).
    3. Fortsæt til kollektionen af ev som beskrevet i punkt 2.2.1 til 2.2.3.
    4. Tør fraktionen helt med en vakuumkoncentrator.
    5. Fraktionerne rekonstitueres med 10 μL 0,1% trifluoraceticsyre (TFA).
    6. Der blandes 1 μL rekonstitueret fraktion med 1 μL α-cyano-4-hydroxycinnamic syre (HCCA) på en MALDI-poleret stålmålplade.
    7. Analysér alle fraktioner med et MALDI-massespektrometer.
    8. Analysér genereret spektre med dedikeret software (se Tabel over Materialer).

3. Karakterisering af elbiler

  1. Analyse af nanopartikelsporing (NTA)
    BEMÆRK:     NTA-analysen udføres med et nanopartikelsporingsanalyseinstrument (se materialetabellen)og en automatiseret sprøjtepumpe.
    1. Der forefindes en fortynding (interval fra 1:50 til 1:500) af hver SEK-fraktion fra trin 2.2.3 med 0,20 μm filtreret PBS.
    2. Vortex løsningen til at fjerne EV aggregater.
    3. Læg den fortyndede opløsning i en 1 ml sprøjte, og læg den i den automatiske sprøjtepumpe.
    4. Juster kameraindstillingen for at screene forstærkningsniveau (3) og kameraniveau (13).
    5. Klik på Kør og start følgende script.
      1. Prøven indlæss i analysekammeret (infusionshastighed: 1.000 for 15 s).
      2. Reducer og stabilisere hastighedsstrømmen til videooptagelse (infusionshastighed: 25 for 15 s). Optag tre på hinanden følgende 60 s videoer af partikelflowet.
      3. Juster kameraniveauet (13) og detektionstærsklen (3), før videoanalysen. Klik på Indstillinger| Ok at starte analysen og klik på Eksport, når analysen er færdig.
    6. Mellem hver fraktionsanalyse vaskes med 1 ml 0,20 μm filtreret PBS.
  2. Elektronmikroskopi (EM) analyse
    1. Isoler elbiler som beskrevet i afsnit 2.
      BEMÆRK: Sterile forhold er ikke påkrævet.
    2. Gentag afsnit 3.1 for at kvantificere elbiler.
      BEMÆRK: Der vil kun blive anvendt positive fraktioner til EM-analyse.
    3. Brug et 50 kDa centrifugalfilter (se Tabel over Materialer) til at koncentrere EV-holdige SEC-fraktioner.
    4. Resuspend koncentreret EL'er i 30 μL 2% paraformaldehyd (PFA).
    5. 10 μL af prøven anbringes på et kulbelagt kobbergitter.
    6. Inkuber i 20 minutter i et vådt miljø.
    7. Trin 3.2.5 og 3.2.6 gentages for at opnå en god absorption af prøven på nettet.
    8. Overfør gitteret til et fald på 1% glutaraldehyd i PBS i 5 min ved RT.
    9. Prøven vaskes med ultrarent vand flere gange.
    10. Prøven derimod i 10 min. på is med en blanding af 4% uranylacetat og 2% methylcellulose (1:9, v/v). Fjern overskydende af blandingen ved hjælp af et filterpapir.
    11. Prøven tørresog observeres under et elektronmikroskop til transmission ved 200 kV (se tabel over materialer ).
  3. Western blot analyse
    1. Proteinudvinding
      1. Trinene 3.2.1 til 3.2.3 gentages for at isolere og koncentrere eldrevne køretøjer.
      2. Der blandes 50 μL RIPA-buffer (150 mM natriumchlorid [NaCl], 50 mM Tris, 5 mM Ethylenglycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetasyre [EGTA], 2 mM Ethylenediamine-tetraacetic syre [EDTA], 100 mM natriumfluorid [NaF], 10 mM natriumpomosephosphat, 1% Nonidet P-40, 1 mM Phenylmethanesulfonyl fluorid [PMSF], 1x proteasehæmmer) med EV-prøven (25 μL som følge af EV-koncentrationen på filter) i 5 min. på is for at udtrække proteiner.
      3. Sonet for 5 s (amplitude: 500 W; frekvens: 20 kHz), 3 gange på is.
      4. Vesikulært snavs fjernes ved centrifugering ved 20.000 x g i 10 min. ved 4 °C.
      5. Saml supernatanten, og mål proteinkoncentrationen med Bradford-proteinanalysemetoden.
    2. Natriumdodecylsulfat polyacrylamide gel elektroforese (SDS-PAGE) og vestlig blotting
      1. Bland proteinekstrakter (30 μg) med 5c Laemmli-prøvebuffer (v/v).
      2. Læg proteinblandingen på en 12% polyacrylamide gel.
      3. Migrere proteiner i gelen med TGS buffer (25 mM Tris pH 8,5, 192 mM Glycine, og 0,1% SDS), ved 70 V i 15 min og 120 V i 45 min.
      4. Proteinerne overføres til nitrocellulosemembranen med halvtørret system ved 230 V i 30 min.
      5. Mættet membranen i 1 time ved RT med blokerende buffer (0,05% Tween 20 w/v, 5% mælkepulver m/v i 0,1 M PBS, pH 7.4).
      6. Membranen inkuberes natten over ved 4 °C med monoklonalt anti-humant varmechokprotein 90 (HSP90) fortyndet i blokerende buffer (1:100).
      7. Membranen vaskes tre gange med PBS-Tween (PBS, 0,05% Tween 20 w/v) i 15 min.
      8. Membranen inkuberes i 1 time ved RT med gedehesteradishperoxidase-konjugeret antimuse-IgG sekundært antistof fortyndet i blokerende buffer (1:10.000).
        BEMÆRK: En negativ kontrol udføres ved hjælp af sekundære antistof alene.
      9. Vasketrinet gentages (trin 3.3.2.7).
      10. Afslør membranen med forbedret chemiluminescens (ECL) western blotting substrat kit (se Tabel af Materialer).
  4. Proteomisk analyse
    1. Proteinudsugning og in-gel fordøjelse
      1. Trinene 3.2.1 til 3.2.3 gentages for at isolere og koncentrere eldrevne køretøjer. Trin 3.3.1 gentages for EV-proteinekstraktion.
      2. Udfør proteinmigration i stablingsgelen af en 12% polyacrylamide gel.
      3. Fastgør proteinerne i gelen med coomassie blå i 20 min på RT.
      4. Punktafgifter hver farvet gel stykke og skær det i små stykker på 1 mm3.
      5. Gelstykkerne vaskes successivt med 300 μL af hver opløsning: ultrarent vand i 15 min. 100% acetonitril (ACN) i 15 min, 100 mM ammoniumbikarbonat (NH4HCO3)i 15 min, ACN:100 mM NH4HCO3 (1:1, v/v) i 15 min og 100% ACN i 5 min med kontinuerlig omrøring.
      6. Tør helt gel stykker med vakuum koncentrator.
      7. Proteinreduktion udføres med 100 μL på 100 mM NH4HCO3 indeholdende 10 mM dithiothreitol i 1 time ved 56°C.
      8. Proteinalkylering udføres med 100 μL 100 mM NH4HCO3 indeholdende 50 mM iodoacetamid i 45 min. i mørke ved RT.
      9. Gelstykkerne vaskes successivt med 300 μL af hver opløsning: 100 mM NH4HCO3 i 15 min, ACN:20 mM NH4HCO3 (1:1, v/v) i 15 min og 100% ACN i 5 min. med kontinuerlig omrøring.
      10. Tør gelstykkerne helt med en vakuumkoncentrator.
      11. Proteinfordøjelse udføres med 50 μL trypsin (12,5 μg/ml) i 20 mM NH4HCO3 natten over ved 37 °C.
      12. De fordøjede proteiner udvindes af gelen med 50 μL 100% ACN i 30 min ved 37 °C og derefter 15 min ved RT under kontinuerlig omrøring.
      13. Følgende ekstraktionsprocedurer gentages to gange: 50 μL 5% TFA i 20 mM NH4HCO3 opløsning i 20 min. ved kontinuerlig omrøring.
      14. Der tilsættes 100 μL 100% ACN i 10 minutter under kontinuerlig omrøring.
      15. Tørrede fordøjede proteiner med vakuumkoncentrator og opslæmme i 20 μL 0,1% TFA.
      16. Prøven afsaltes med en 10 μL pipettespids med C18 omvendt fasemedie til afsaltning og koncentration af peptider (se materialetabellen)og eluteret peptider med ACN:0,1% myresyre (FA) (80:20, v/v).
      17. Prøven tørres fuldstændigt med en vakuumkoncentrator og opsættes i 20 μL ACN:0,1% FA (2:98, v/v) for flydende kromatografi tandem massespektrometri (LC-MS/MS).
    2. LC-MS/MS-analyse
      1. Det fordøjede peptid ind i LC-MS/MS-instrumentet indbetales, og prøve- og dataanalyse udføres efter parametre, der er beskrevet i detaljer andetsteds42.
    3. Analyse af rådata
      1. Udfør massespektrometridata for at identificere proteiner og sammenligne identificerede proteiner i hver prøve med en kvantitativ proteomics-softwarepakke ved hjælp af standardparametre.
      2. Eksporter ved hjælp af standardparametre listen over eksklusive og overrepræsenteret proteiner fra EV-positive prøver i en software, der forudsiger proteinnetværk og biologiske processer.
      3. Sammenlign listen over identificerede proteiner i fraktionerne med de øverste 100 EV-markører fra Exocarta open access-databasen (se materialetabellen).

4. Funktionel EVs Effekter Assay

  1. Neurite udvækst assay på PC-12 cellelinje
    1. Kultur PC12 cellelinje i komplet DMEM medium (2 mM L-glutamin, 10% føtal hest serum (FHS), 5% føtal kvæg serum (FBS), 100 UI/mL penicillin, 100 μg/ml streptomycin).
      BEMÆRK: Seraen er exosome fri i hele proceduren.
    2. Tilføj et dækglas (alle brønde) til en 24-brønd plade; pladen med poly-D-lysin (0,1 mg/ml) og frø 260.000 celler/brønd.
    3. Cellerne inkuberes ved 37 °C under 5 % CO2.
    4. Efter 24 timers inkubation ændres mediet til DMEM-differentieringsmediet (DMEM med 2 mM L-glutamin, 0,1 % FHS, 100 UI/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin) med 1 x10 6 mikrogliae(fra trin 1.1.2).
      BEMÆRK: Kontroltilstanden udføres uden mikroglia-eldrevne køretøjer i differentieringsmediet.
    5. På dag 4 efter såning indbelæsse alle brønde med 100 μL komplet DMEM-medium.
    6. På dag 7 efter såning fastgøres cellerne med 4% PFA i 20 min ved RT og skylles tre gange (10 min hver) med PBS.
    7. Cellerne plettes med rhodaminkonjugatet falloidin i 30 min ved 4 °C og skyl 3 gange (10 min hver) med PBS.
    8. Cellerne plettes med fortyndet Hoechst 33342 (1:10.000) i 30 min ved RT og skyl 3 gange (10 min hver) med PBS.
    9. Monter dækslet glas på en slide med fluorescerende montering medium (se Tabel af materialer).
    10. Analyser diaset med et konfokalt mikroskop, tag 5 tilfældige billeder af hvert dias.
    11. Neurite udvækst ved hjælp af en automatiseret kvantificering software (total neurite længde) som beskrevet i detaljer andetsteds43.
  2. Neurite udvækst på rotte primære neuroner
    1. Coat en 8-brønd glas dias med poly-D-lysin (0,1 mg/ml) og laminin (20 μg/ml).
    2. Kulturrottekommerciering i passende dyrkningsmedium (se Materialetabel)ved at plating 50.000 celler pr. brønd og inkubere cellerne ved 37 °C under 5% CO2 for 48 timer.
      BEMÆRK: Seraen er exosome-fri i hele proceduren.
    3. Der tilsættes 1 x10 6 mikrogliaetv'er til neuronkulturmedium og inkuberes ved 37 °C under 5% CO2 for 48 timer mere.
      BEMÆRK: Kontrol tilstand udføres uden microglia EL'er i neuron kultur medium.
    4. Følg trin 4.1.6 til 4.1.9 for at fikse og plette cellerne.
    5. Følg trin 4.1.10 og 4.1.11 for at analysere diaset.
  3. Gliom celle invasion
    1. Resuspend C6 rotte gliom celler i komplet DMEM medium (DMEM med 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 1x antibiotika) indeholder 5% kollagen ved en endelig koncentration af 8.000 celler i 20 μL.
      BEMÆRK: Seraen er exosome-fri i hele proceduren.
    2. Placer 5 ml PBS i bunden af en 60 mm vævskulturskål. Vend låget og aflejr dråber på 20 μL (8.000 celler) af cellesuspension på bunden af låget.
    3. Vend låget om på det PBS-fyldte bundkammer, og indpæs det indblyede pladen inkuberes ved 37 °C og 5% CO2 i 72 timer, indtil der dannes celle sfæroider.
    4. Der tilsættes 1 x10 8 makrofagee(fra trin 1.2.2) til en 2,2 mg/ml kollagenblanding (2 ml kvægkollagen type I-opløsning [3 mg/ml] med 250 μL 10x essentielt medium (MEM) og 500 μL 0,1 M natriumhydroxid).
      BEMÆRK: Kontrol betingelse udføres uden makrofag EVs i kollagen blandingen.
    5. Fordel kollagen blandingen indeholder elbiler i en 24-brønd plade til indlejring celle sfæroider.
    6. Implantat den nydannede celle sfæroider i midten af hver brønd.
    7. Hydrer pladen i 30 min ved 37°C og 5% CO2 for at størkne gelen.
    8. Derefter overlejres 400 μL komplet DMEM-medium på kollagenmatrixen i hver brønd.
    9. Det komplette system inkuberes i i alt 6 dage ved 37 °C og 5% CO2.
      BEMÆRK: Celle invasion ud af sfæroiden overvåges af digital fotografering ved hjælp af en omvendt lys mikroskop ved hjælp af en 4x/0.10 N.A. mål.
    10. Erhverve billeder af hver brønd hver dag.
    11. Behandl billeder og kvantificere invasion af celle sfæroide områder ved hjælp af softwaren som tidligere beskrevet i detaljer42.
      BEMÆRK: Invasion og sfæroide områder blev normaliseret for hver dag til invasionen og sfæroide områder målt på dag 0.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En af de største udfordringer ved at henføre biologiske virkninger til ekstracellulære vesikler (EL'er) er evnen til at isolere eldrevne køretøjer fra hele kulturmediet. I denne rapport præsenterer vi en metode, der anvender ultracentrifugering (UC) og størrelsesekluderingskromatografi (SEC), som er koblet til den storstilede analyse af proteinsignaturer for at validere EV-markører og identificere bioaktive forbindelser. De makrofag- eller mikrogliaafledte elbiler blev isoleret fra det konditionerede medium efter henholdsvis en dyrkning på 24 timer eller 48 timer (figur 1).

Figure 1
Figur 1: Ekstracellulære indsamlings- og isolationsstrategier for vesicle (EV). De apoptotiske kroppe og celleresterne blev adskilt fra det mikroglia- eller makrofag-betingede medium ved successive centrifugeringstrin. Fra supernatanten blev elbiler isoleret ved ultracentrifugering (UC). UC pellet indeholdende elbiler blev indlæst på kolonne og adskilt af størrelse-udelukkelse kromatografi (SEC) i 20 forskellige elueret fraktioner. Som det fremgår af de yderligere trin (elektronmikroskopi, nanopartikel tracking analyse og proteomisk analyse), SEC fraktioner blev samlet og organiseret i 1F-EV-, 2F-EV + og 3F-EV-. Klik her for at se en større version af dette tal.

Metoden fulgte successive centrifugering trin: den første til at fjerne cellerne og den anden til at fjerne cellulære snavs og apoptotiske organer. Derefter blev supernatanten overført til et nyt rør for at udføre en ultracentrifugering ved 100.000 x g i 90 min. Vesiklerne blev indsamlet sammen med proteinaggregaterne i den endelige UC-pellet. En SEK kolonne blev brugt til at adskille forbindelserne i henhold til deres størrelse og fjerne aggregater (Figur 1). For at bekræfte isolering af eldrevne køretøjer fulgte hver SEC-fraktion en nanopartikelsporingsanalyse (Figur 2A).

Figure 2
Figur 2: Analyse af SEC-fraktionerne. (A) Nanopartikel sporingsanalyse (NTA) af SEK fraktioner. Det samlede antal partikler i hver SEC-fraktion præsenteres med søjlediagrammer. De orange søjlediagrammer viser de tre på hinanden følgende EV+ brøker (F5-F7). ( B, C) Skærmbilleder af NTA kammer viser betydelige forskelle i partikelgennemstrømningen mellem SEC fraktioner. d) Supplerende MALDI-massespektrometrianalyse. Fra en anden UC pellet indeholder elbiler, en standard kontrol peptid sæt blev tilføjet før SEC adskillelse for at validere udførelsen af SEC strategi. Hver SEC fraktion blev analyseret med matrix assisteret laser desorption ionisering - flyvetid (MALDI-TOF) for at bestemme standard-positive fraktioner. I de ni første spektre (fraktion 1 til 9) blev der ikke observeret noget signal. Detektering af disse gratis standarder var mulig i de følgende fraktioner (fraktioner 10 til 20), hvilket bekræftede SEC-procedurens evne til at adskille elbiler (F5-F7) fra opløselige komponenter (F10-F20). (E) Western blot analyse af SEC fraktioner som en EV markør foreløbig analyse. EV+ fraktionerne (F5-F7) blev samlet som én prøve (2F-VE+), mens EV-fraktionerne (henholdsvis F1-F4 og F8-F20) blev samlet i to andre prøver kaldet 1F-EV- og 3F-EV-. Resultaterne viste tilstedeværelsen af et Heat-Shock Protein 90 (HSP90) (EV positiv markør) signal i 2F-EV +, og også i celle lysate som positiv kontrol, sammenlignet med de andre fraktioner (1F-EV- og 3F-EV-). (F, G) Elektronmikroskopianalyse af EV-positiv prøve (2F-EV+). Observationen under to på hinanden følgende forstørrelser afslørede tilstedeværelsen af elbiler i et størrelsesområde omkring 100 nm (hvide pile) og omkring 400 nm (pilespids). Klik her for at se en større version af dette tal.

Partikeltallet var signifikant højere i fraktionerne 5, 6 og 7 end i de foregående (F1-F4) og følgende (F8-F20). Det var muligt at se en partikelstrøm i disse fraktioner, selv om der blev observeret nogle få partikel i de følgende fraktioner (Figur 2B,C). Denne adskillelse forhindrer ikke muligheden for, at andre fraktioner end F5-F7 kan indeholde en lille mængde vesikler, eller endda at EV-rige fraktioner F5 til F7 kan indeholde molekylære forurenende stoffer. For i det mindste at sikre, at F5-F7 fraktioner er fri for forurenende co-eluering molekyler, var det nødvendigt at følge den tid-kursus eluering af de forskellige forbindelser i SEC procedure. For at gøre dette, kontrol peptid standarder blev tilføjet til en lignende UC pellet som tidligere anvendt. Denne forberedelse blev igen adskilt ved hjælp af SEC-proceduren. Derefter blev der udført en matrixassisteret laserdesorptionsidonisering — tidsflyvningsanalyse (MALDI) for at identificere de SEC-fraktioner, hvor standarderne blev elueret (figur 2D). På grund af massesortimentet blev kun ioniserede produkter fra peptidstandarder fulgt i denne analyse. Resultaterne viste, at disse produkter kunne påvises i fraktionerne 10 til 20, hvilket viser, at et opløseligt protein ikke kan elueres i de samme fraktioner som eldrevne køretøjer (F5-F7). Disse resultater bekræftede denne fremgangsmådes interesse i at adskille eldrevne køretøjer fra komponenter, der ikke er tale om en af de væsentlige heraf. Selv under forudsætning af, at F8-F20 fraktioner kunne indeholde en resterende brøkdel af elbiler, besluttede vi i følgende eksperimenter for at kombinere EV positive fraktioner (F5-F7) i en enkelt prøve kaldet 2F-EV +. Vi har også kombineret de andre SEK fraktioner i to prøver kaldet 1F-EV- (F1-F4) og 3F-EV-(F8-F20). Vi grupperet i tre prøver af flere grunde. For det første vil antallet af SEC fraktioner øge tidspunktet for molekylære analyser, men også funktionelle in vitro-undersøgelser. EV-positive SEC fraktioner separat udviser lavere partikeltal og også kompromittere påvisning af molekylære forbindelser. På samme måde blev det anset for mere velovervejet at gruppere fraktionerne F8-F20 for om nødvendigt at koncentrere de resterende vesikler og kontrollere deres tilstedeværelse ved en foreløbig western blot-analyse mod HSP90, en EV-markør. Det er interessant, at der blev påvist et positivt signal for HSP90 i fraktionen 2F-EV+, også i cellelytatet som positiv kontrol, men ikke i 1F-EV- og 3F-EV-prøver (figur 2E og supplerende figur S1 som kontrol). Denne analyse bekræfter kun 2F-EV+'s interesse og den korrekte forvaltning af de tidligere SEK-fraktioner. For at bekræfte EV isolation, et yderligere eksperiment ved hjælp af elektronmikroskopi analyserede kun 2F-EV + prøve og tillod observation af elbiler med en typisk morfologi og størrelse heterogenitet mellem 100 og 400 nm (Figur 2F, G).

Et andet vigtigt skridt i valideringen var proteomisk analyse (figur 3). Vi udviklede en hel massespektrometrianalyse med flere mål: (i) bekræfte isolering af elbiler med påvisning af et stort antal EV-markører i 2F-EV+, (ii) identificerer i sidste ende forurenende proteiner i EV-negative prøver (1F-EV- og 3F-EV-) og (iii) karakteriserer proteinindholdet i elbiler, der understøtter deres biologiske aktiviteter.

Figure 3
Figur 3: Proteomisk analyse af EV-positive og EV-negative prøver. (A) Efter tre uafhængige EV-isolationer fra lignende mikrogliacellepræparater blev prøverne 1F-EV-, 2F-EV+ og 3F-EV- indlæst for natriumdodecylsulfat polyacrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) og migreret indtil stablingsgelen til at koncentrere proteiner for at realisere deres in-gel fordøjelse. De resulterende peptider blev derefter analyseret ved flydende kromatografi tandem massespektrometri (LC-MS / MS) for at identificere de tilsvarende proteiner. (B) Sammenligning af identificerede proteiner mellem prøverne 1F-EV- og 2F-EV+ med almindelige proteiner i begge fraktioner (19) og proteiner, der udelukkende er påvist i 2F-EV+-fraktionen (522). Heatmap viser den relative repræsentation, hvor alle almindelige proteiner mellem 1F-EV- og 2F-EV+ tre eksemplarer var overrepræsenteret (rød) i 2F-EV+ prøverne. (C)Sammenligning af identificerede proteiner mellem fraktionerne 2F-EV+ og 3F-EV- med fælles proteiner mellem tre eksemplarer (113) og udelukkende repræsenterede proteiner (428 i 2F-EV+ og 11 i 3F-EV-). Heatmap viser den relative repræsentation i to klynger. En (klynge A) præsenterer 5 overrepræsenteret proteiner i 3F-EV-prøve og en anden (klynge B) præsenterer 108 overrepræsenteret proteiner i 2F-EV +. Klik her for at se en større version af dette tal.

Fra celle-betingede medier, UC og SEC procedure førte til tre prøver 1F-EV-, 2F-EV + og 3F-EV-. De tilsvarende proteiner blev ekstraheret og koncentreret ved natrium dodecyl sulfat polyacrylamide gel elektroforese (SDS-PAGE). Efter en kort vandring i stablingsgelen blev prøverne indsamlet af et båndekscision, der blev overført i særskilte rør for at være in-gel fordøjet. Produkterne blev adskilt af online-vendt fasekromatografi direkte koblet til et massespektrometer til analyse (Figur 3A).

Følgende resultater, som et eksempel på hele proceduren, blev opnået fra mikroglia-condition medium efter en 48 timers kultur. De rådata blev sendt til en Rat protein database. De identificerede proteiner blev sammenlignet mellem prøverne 1F-EV- og 2F-EV+ (figur 3B) og mellem prøverne 2F-EV+ og 3F-EV- (Figur 3C). I den første sammenligning viste Venn-diagrammet 19 almindelige proteiner i begge fraktioner og 522 proteiner, der udelukkende blev påvist i 2F-EV+-fraktionen. Analysen ved hjælp af en kvantitativ proteomics software gjorde det muligt at identificere den relative repræsentation af de fælles proteiner. Resultaterne viste et heatmap, hvor alle almindelige proteiner mellem 1F-EV- og 2F-EV+ tre eksemplarer var overrepræsenteret (rød) i 2F-EV+ prøverne. I den anden sammenligning mellem fraktionerne 2F-EV+ og 3F-EV-blev der identificeret 113 almindelige proteiner mellem tre eksemplarer. Desuden blev der udelukkende påvist 428 proteiner i 2F-EV+, og 11 proteiner blev udelukkende fundet i 3F-EV-. Efter den kvantitative analyse fremhævede heatmap-repræsentationen af de 113 almindelige proteiner to klynger, hvor klyngen A præsenterede fem overrepræsenteret proteiner i 3F-EV-prøve, og klyngen B præsenterede 108 overrepræsenteret proteiner i 2F-EV+.

De 428 proteiner, der udelukkende var repræsenteret, og de 108 proteiner, der var overrepræsenteret i 2F-EV+, blev indsendt til Exocarta open access-databasen for at detektere ev-tilknyttede molekyler. Analysen af de øverste 100 EV-markører i Exocarta fremhævede tilstedeværelsen af 86 EV-associerede proteiner i 2F-EV+ (figur 4A).

Figure 4
Figur 4: Analyse af proteiner fra 2F-EV+-prøven. (A) En pulje på 536 proteiner (428 eksklusive og 108 overrepræsenterede proteiner) blev forelagt Exocarta-databasen for at påvise ev-tilknyttede molekyler. Molekylesymboler af de 86 EV-associerede proteiner, der påvises i de øverste 100 EV-markører fra Exocarta-databasen. (B) Forudsigelsen af proteininteraktioner og deres tilknytning til udvalgte biologiske processer viste immun- og neuroprotektive veje i 2F-EV+-prøven. Klik her for at se en større version af dette tal.

Det er interessant, at analysen af de 5 almindelige proteiner i klyngen A og de 11 proteiner, der udelukkende var repræsenteret i 3F-EV- ikke var forbundet med nogen EV-markør (data viste ikke). Endelig viste forudsigelsen af proteininteraktioner og deres tilknytning til udvalgte biologiske processer tilstedeværelsen i 2F-EV+ fraktionen af immunpromatorer (21 %) undertiden involveret i kontrol af det inflammatoriske respons (4,1 %) (Figur 4B). EV-indholdet i 2F-EV+ var også forbundet med neuronal udvikling (16,8 %), neurondferentiering (5 %) og kontrol af neuronal død (3,8 %) som er i overensstemmelse med følgende neurite udvækst assay.

Således den strategi, som vi valgte gør det muligt adgang til alle data og giver mulighed for en forudsigelse af EV-medieret funktioner forud for de biologiske analyser, som vi derefter udført (Figur 5).

Figure 5
Figur 5: EV-afhængige f unctional assays. Virkningerne af mikroglia-afledte elbiler blev evalueret på neurite udvækst (øvre ramme), og virkningerne af makrofag-afledte elbiler blev evalueret på gliom celle invasion (lavere ramme). (A, B) Neuritlængden blev målt på PC-12-celler (Panel A blev ændret fra Raffo-Romero et al.16 med tilladelse) eller rotte primære neuroner (B). Resultaterne viste en betydelig udvækst stigning under elbiler (+ EVs) i forhold til kontrol (Ctrl). Skala bar = 20 μm. (C, D) Tidsforløb af C6 gliom spheroid invasion i kollagen i overværelse af rotte primære makrofag-afledte elbiler (C6 + EVs) eller køretøj (C6 kontrol). C6 sfæroid 3D invasion i kollagen blev overvåget og kvantificeret op til 6 dage. Kvantificering af tumorcelleinvasion er vist på 1, 2, 3 eller 6 dage (C) som observeret på repræsentative billeder (D). Vægtstang = 500 μm. For neurite outgrowth assays, blev betydningen beregnet ved ikke-udførtStudent's t-test (* p < 0,05, ** p < 0,01 og *** p < 0,001). For invasionsanalyse blev betydningen beregnet ved envejs ANOVA efterfulgt af Tukey's post hoc test. Fejllinjerne angiver en relativ standardfejl i tre uafhængige eksperimenter. Klik her for at se en større version af dette tal.

På denne måde blev de neurotrofiske funktioner af mikroglia-afledte elbiler undersøgt på PC-12 cellelinje og rotte primære neuroner. Resultaterne viste en positiv effekt på neuriteudvæksten (figur 5A,B). Tilstedeværelsen af elbiler steg henholdsvis omkring 6 og 1,5 gange neurite netværket i længde og / eller i antal i PC-12 og primære neuroner i forhold til en kontrol tilstand. I en anden sammenhæng, Vi har også undersøgt virkningerne af makrofag-afledte elbiler på en hjernetumor invasion (Figur 5C, D). Det blev vurderet ved hjælp af 3D tumor sfæroider indlejret i en matrix af kollagen. Sfæroider genereret med C6 rotte gliom celler blev dyrket i 6 dage i en kollagen matrix indeholder (eller ikke indeholder) EL renset fra rotte makrofager kulturmedium. Kollagen matrix giver en struktur, som tumorceller kan invadere og sprede sig ud af sfæroid. Den makrofag-afledte elbiler svækket vækst og invasion af gliom sfæroider. Efter en 6 dages kultur blev der observeret et fald på 50 % af invasionen i EV-behandlede sfæroider sammenlignet med kontrollen. Dette resultat viste, at makrofager kan producere elbiler med anti-tumoral og/ eller anti-invasive faktorer, der påvirker gliom vækst.

Supplementary Figure S1
Supplerende figur S1: Billeder af membran, der anvendes til vestlige blotting eksperiment. (A) Originalt billede af den vestlige blot fra figur 2E (mod HSP90 EV-markør). (B) Ponceau farvning billede af den samme membran viser den korrekte belastning af proteinekstrakter fra 1F-EV-, 2F-EV + og 3F-EV-prøver. Klik her for at downloade dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Centralnervesystemet (CNS) er et komplekst væv, hvor celle-til-celle kommunikation regulerer normale neuronale funktioner, der er nødvendige for homøostase30. Eldrevne køretøjer er nu meget undersøgt og beskrevet som vigtige molekylære laster til celle-til-celle kommunikation31. De leverer specifikt en cocktail af mæglere til modtagerceller og påvirker dermed deres funktioner under sunde og patologiske forhold32. Nylige undersøgelser tyder på , at eldrevne køretøjer spiller en afgørende rolle i CNS24,33,34 og især fra hjernens immunceller35,36. Balancen mellem pro- og anti-inflammatorisk immunrespons er afgørende og gør det muligt at opretholde hjernens integritet under den synaptiske udvikling og neuronale aktiviteter gennem hele livet. To forskellige situationer med immunrespons blev drøftet i denne undersøgelse: forholdet (i) mellem mikroglia og neuroner og (ii) mellem infiltrerende makrofager og gliomceller. For det første er mikroglia de hjemmehørende makrofager i hjernevævet, hvor de spiller en central immunrolle i forvaltningen af mikromiljøændringer for at sikre neuronale aktiviteter. Men overdreven pro-inflammatoriske mekanismer kan understøttes af over-aktiveret mikroglia og føre til neurodegenerative lidelser37,38. I modsætning hertil kræver den høje kvalitet gliomer anti-inflammatoriske profiler og involverer tumor-associerede makrofager (TAMs) rekrutteret i tumorstedet. De knoglemarvsafledte makrofager (BMDM' er) repræsenterer en stor population af disse TAC'er i tæt forhold til gliomceller. Under indflydelse af tumoren, BMDMs udviser in vivo anti-inflammatoriske og pro-tumorale profiler39. Hvordan disse BMDMs kunne kontrollere in vitro tumoral celle invasion er et afgørende spørgsmål i denne rapport. Det er derfor, den makrofag-afledte elbiler blev brugt alene i gliom spheroid invasion assay. Sammen i co-kultur, ville gliom celler har påvirket makrofager til at producere andre EV populationer med anti-inflammatoriske profiler. Den direkte brug af immun elbiler kunne være meget bedre som anti-tumoral middel. Immunceller opretholder derfor celle-til-celle kommunikation i specifikke mikromiljøer, hvor den inflammatoriske balance er stærkt påvirket af eksterne signaler40,41. Forståelsen af EV-medieret immunrespons udgør en stor udfordring at begrænse patogenesen af mange lidelser. Identifikation af biologisk aktivt indhold af ev er en nøgle til at forstå dysregulerede inflammatoriske processer og foreslå nye terapeutiske strategier42,43.

I denne undersøgelse præsenterer vi en metode, der består i en differential ultracentrifugeringsproces som det første skridt til at fjerne celleaffaldet, de apoptotiske kroppe og de opløselige molekyler kombineret med størrelsesekskluderingskromatografi for at isolere eldrevne køretøjer fra molekylære aggregater. Når populationerne af ev er vurderet i biologiske analyser, er det afgørende at diskriminere ev-indholdet fra andre samtidige isolerede materialer. Derfor har vi forbedret isolationen for at adskille EV- fra ikke EV-associerede forbindelser. Ved at tilføje standard proteiner i kontrolprøver indsendt til SEC procedure, var vi derefter i stand til at lokalisere deres elution fraktioner af Maliv-TOF. Fordi standarderne er frie molekyler, de globalt co-eluere med prøve-associerede molekylære aggregater relateret til ikke EV materialer. Ev-fraktionerne fra forsøgsprøver blev således valideret i en pålidelig isolationsprocedure. Derudover udviklede vi en dobbelt proteomisk analysestrategi. Bortset fra brugen af anti-HSP90 antistof ved western blotting som en EV markør foreløbig detektion, besluttede vi at validere den korrekte EV fraktionering ved en ikke-målrettet påvisning af EV-associerede protein signaturer. Den nuværende fremgangsmåde var ikke bevidst fokuseret på påvisning af flere kendte EV-markører på grund af visse antistoffers utilstrækkelige specificitet og følsomhed. Variabiliteten og overfloden af visse EV-markører på overfladen af ev-delpopulationer er stadig kontroversielle i isolationsprocedurerne. Desuden kan en antistofbaseret metode udgøre en grænse for et stort antal organismer på grund af mangel på kommercielle antistoffer, mens ev-undersøgelserne nu er et varmt emne i biologi. Denne ikke-målrettede analyse gjorde det muligt at identificere et højere antal molekyler, der allerede er beskrevet som EV-markører (86 proteiner i top 100 EV-markørerne fra Exocarta-databasen). Endelig kunne denne fremgangsmåde være virkelig nyttig til at validere ev isolation fra dårligt beskrevne organismer, forudsat at de fundne proteiner kan præsentere betydelige homologies til kendte EV markører. Som for nylig beskrevet, en storstilet proteomisk analyse kunne være et alternativ til kun at bruge et par vilkårlige markører43. Dette vil forbedre forskelsbehandlingen af EV+-fraktioner og identifikationen af deres aktive indhold, inden de anvendes i biologiske analyser.

Faktisk er det nødvendigt at knytte karakteriseringen af EV indhold til de virkninger, der blev observeret i biologiske analyser. Den biologiske virkning af eldrevne køretøjer på recipientceller antyder, at vesikulære mæglere eller effektorer er involveret. Igen, den samme ikke-målrettede analyse gør det muligt at identificere biologisk aktive molekyler. En mulig optimering i denne analyse vedrører de typer af molekyler, det er muligt at identificere. Vores strategi var baseret på den store analyse af proteinsignaturer og førte til prædiktive biologiske veje forbundet med immunrespons og neuronoverlevelse. Det er vigtigt at overveje de andre molekyle familier, herunder lipider, mRNA og microRNAs for eksempel. Vores nuværende undersøgelser knytter disse yderligere identifikationer til proteinsignaturerne for at få et globalt kendskab til denne EV-afhængige kommunikation.

Der er planlagt mange terapeutiske tilgange i de kommende år. I betragtning af at eldrevne køretøjer er i stand til nemt at krydse blod-hjerne barrieren og nå de patologiske væv, kan disse molekylære laster bruges på forskellige måder. Selv om denne undersøgelse ikke fremhævede EV overflade molekyler, deres identifikation er stadig nødvendig for bedre at forstå adressering processen mod målceller og væv. Den proteomiske analyse i vores metode giver adgang til disse data. Ellers præsenterede vi i denne betænkning in vitro-produktionen af eldrevne køretøjer som gavnlige cocktails. Vi optimerede ikke de bedste betingelser for at prime eller aktivere immuncellerne på forhånd. Dette punkt er afgørende, fordi mikromiljøet i vævene har en direkte indvirkning på immuncellerne og i sidste ende bidrager til at forme biogenesen i deres eldrevne køretøjer. I tilfælde af glioblastom for eksempel, Det er blevet konstateret, at kræftcellerne producerer deres egne elbiler, og dermed bidrage til at orientere de omkringliggende TAC'er mod anti-inflammatoriske profiler og deres lokale immunsuppression44,45. Dette er grunden til, at de makrofag-afledte elbiler i gliom miljøet er forskellige fra dem, der produceres i en enkelt makrofag kultur. Således brugte vi direkte makrofag-afledte elbiler, separat produceret fra en enkelt makrofag kultur, at kontrollere gliom spheroid invasion, fordi en makrofag-gliom co-kultur har ingen kontrol på tumorvækst. Yderligere terapeutiske strategier kunne forhindre denne in vivo immunsuppression ved hjælp af pro-inflammatoriske og anti-tumorale EVs produceret in vitro fra aktiverede makrofager. En lignende strategi kan anvendes i forbindelse med neurodegenerative sygdomme ved hjælp af elbiler stammer fra mikroglia korrekt advaret om at producere en neuroprotektive og anti-inflammatorisk respons favorisere neuronal overlevelse. Det kan konkluderes, at undersøgelserne af den EV-medierede kommunikation mellem immunceller og in vivo-mikromiljø er nøglen til at muliggøre en bedre forståelse af patogenese og designe innovative terapeutiske tilgange.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Det præsenterede værk blev støttet af Ministère de L'Education Nationale, de L'Enseignement Supérieur et de la Recherche og INSERM. Vi anerkender taknemmeligt BICeL- Campus Scientific City Facility for adgang til instrumenter og teknisk rådgivning. Vi anerkender taknemmeligt Jean-Pascal Gimeno, Soulaimane Aboulouard og Isabelle Fournier for massespektrometri bistand. Vi anerkender tanina arabere, Christelle van Camp, Francoise le Marrec-Croq, Jacopo Vizioli og Pierre-Eric Sautière for deres stærke bidrag til den videnskabelige og tekniske udvikling.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels Bio-rad 4561045EDU  
Acetonitrile Fisher Chemicals A955-1  
Amicon 50 kDa centrifugal filter Merck UFC505024  
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich 9830  
HSP90 α/β antibody (RRID: AB_675659) Santa-cruz sc-13119  
B27 Plus supplement Gibco A3582801  
BenchMixer V2 Vortex Mixer Benchmark Scientific BV1003  
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bradford) Bio-Rad 5000006  
C18 ZipTips Merck Millipore ZTC18S096  
C6 rat glioma cell ATCC ATCC CCL-107  
Canonical tubes Sarstedt 62.554.002  
Centrifuge Eppendorf 5804000010  
CO2 Incubator ThermoFisher    
Confocal microscope LSM880 Carl Zeiss LSM880  
Cover glass Marienfeld 111580  
Culture Dish (60 mm) Sarstedt 82.1473  
Dithiothreitol Sigma-Aldrich 43819  
DMEM Gibco 41966029  
EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph ThermoFisher    
Electron microscope JEM-2100 JEOL    
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid Sigma-Aldrich 03777-10G  
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich ED-100G  
Exo-FBS Ozyme EXO-FBS-50A-1 Exosome depleted FBS
ExoCarta database (top 100 proteins of Evs)     http://www.exocarta.org/
Fetal Bovine Serum Gibco 16140071  
Fetal Horse Serum Biowest S0960-500  
Filtropur S 0.2 Sarstedt 83.1826.001  
Fisherbrand Q500 Sonicator with Probe Fisherbrand 12893543  
FlexAnalysis Brucker    
Fluorescence mounting medium Agilent S3023  
Formic Acid Sigma-Aldrich 695076  
Formvar-carbon coated copper grids Agar scientific Ltd AGS162-3  
Glucose Sigma-Aldrich G8769  
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich 340855  
Hoechst 33342 Euromedex 17535-AAT  
Idoacetamide Sigma-Aldrich I1149  
InstantBlue Coomassie Protein Stain Expedeon ISB1L  
Invert light microscope CKX53 Olympus    
L-glutamine Gibco 25030-024  
LabTek II 8 wells  Nunc 154534  
Laemmli 2x Bio-Rad 1610737  
Laminin Corning 354232  
MaxQuant software (proteins identification software)     https://maxquant.net/maxquant/
MBT Polish stell Brucker 8268711  
MEM 10x Gibco 21090-022  
Methylcellulose Sigma-Aldrich M6385-100G  
MiliQ water Merck Millipore    
Milk Regilait REGILAIT300  
Mini PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell Bio-Rad 1658000FC  
MonoP FPLC column GE Healthcare   no longer available
Nanosight NS300 Malvern Panalytical NS300  
NanoSight NTA software v3.2 Malvern Panalytical    
NanoSight syringe pump Malvern Panalytical    
Neurobasal Gibco 21103-049  
Nitrocellulose membrane GE Healthcare 10600007  
Nonidet P-40 Fluka 56741  
Nunc multidish 24 wells ThermoFisher 82.1473  
Paraformaldehyde Electro microscopy Science 15713  
PC-12 cell line ATCC ATCC CRL-1721  
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122  
Peptide calibration mix LaserBio Labs C101  
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 115-035-003  
Perseus software (Processing of identified proteins)     https://maxquant.net/perseus/
Phalloidin-tetramethylrhodamine conjugate Santa-cruz sc-362065  
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich 78830  
Phosphate Buffer Saline Invitrogen 14190094 no calcium, no magnesium
pluriStrainer M/ 60 µm pluriSelect 43-50060  
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407  
Polycarbonate centrifuge tubes Beckman Coulter 355651  
Protease Inhibitor Sigma-Aldrich S8830-20TAB  
PureCol Cell Systems 5005  
Q-Exactive mass spectrometer ThermoFisher    
rapifleX mass spectrometer Brucker    
Rat cortical neurons Cell Applications R882N-20 Cell origin : Derived from cerebral cortices of day 18 embryonic Sprague Dawley rat brains
Rat Macrophage & Microglia Culture Medium Cell Applications R620K-100 Cell orgin : Normal healthy Rat bone marrow
Rat primary macrophages Cell Applications R8818-10a  
Rat primary microglia Lonza RG535  
Sepharose CL-2B GE Healthcare 17014001  
Sequencing Grade Modified Trypsin Promega V5111  
Slide Dustsher 100204  
Sodium Chloride Scharlau SO0227  
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich L3771  
Sodium Fluoride Sigma-Aldrich S7920-100G  
Sodium hydroxide Scharlab SO0420005P  
Sodium pyrophosphate Sigma-Aldrich S6422-100G  
SpeedVac Vacuum Concentrator ThermoFisher    
String software (functional protein association networks)     https://string-db.org/
SuperSignal West Dura extended Duration Substrate ThermoFisher 34075  
Syringe 1.0 mL Terumo 8SS01H1  
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer cell Bio-Rad 1703940  
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508  
Tris Interchim UP031657  
Tris-Glycine Euromedex EU0550  
Tween 20 Sigma-Aldrich P2287  
Ultracentrifuge Beckman Coulter A95765  
Ultracentrifuge Rotor 70.1 Ti Beckman Coulter 342184  
Uranyl acetate Agar Scientific Ltd AGR1260A  
Whatman filter paper Sigma-Aldrich WHA10347510  
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Sigma-Aldrich C2020-25G  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thion, M. S., Ginhoux, F., Garel, S. Microglia and early brain development: An intimate journey. Science. 362 (6411), 185-189 (2018).
  2. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), New York, N.Y. 841-845 (2010).
  3. Sankowski, R., Mader, S., Valdes-Ferrer, S. I. Systemic Inflammation and the Brain: Novel Roles of Genetic, Molecular, and Environmental Cues as Drivers of Neurodegeneration. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
  4. Chakrabarty, S., Kabekkodu, S. P., Singh, R. P., Thangaraj, K., Singh, K. K., Satyamoorthy, K. Microglia in health and disease. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 43 (3), 25-29 (2015).
  5. Sankowski, R., Mader, S., Valdés-Ferrer, S. I. Systemic inflammation and the brain: novel roles of genetic, molecular, and environmental cues as drivers of neurodegeneration. Frontiers in cellular neuroscience. 9, 28 (2015).
  6. Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
  7. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  8. Domingues, P., et al. Tumor infiltrating immune cells in gliomas and meningiomas. Brain, Behavior, and Immunity. 53, 1-15 (2016).
  9. Hambardzumyan, D., Gutmann, D. H., Kettenmann, H. The role of microglia and macrophages in glioma maintenance and progression. Nature Neuroscience. 19 (1), 20-27 (2016).
  10. Thion, M. S., et al. Microbiome Influences Prenatal and Adult Microglia in a Sex-Specific Manner. Cell. 172 (3), 500-516 (2018).
  11. Hammond, T. R., et al. Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes. Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).
  12. Rajendran, L., et al. Emerging Roles of Extracellular Vesicles in the Nervous System. The Journal of Neuroscience. 34 (46), 15482-15489 (2014).
  13. Gupta, A., Pulliam, L. Exosomes as mediators of neuroinflammation. Journal of Neuroinflammation. 11 (1), 68 (2014).
  14. van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
  15. Budnik, V., Ruiz-cañada, C., Wendler, F. Extracellular vesicles round off communication in the nervous system. Nature Reviews Neurosciences. 17, 160-172 (2016).
  16. Raffo-Romero, A., et al. Medicinal Leech CNS as a Model for Exosome Studies in the Crosstalk between Microglia and Neurons. International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), 4124 (2018).
  17. Zhou, Y., et al. Exosomes Transfer Among Different Species Cells and Mediating miRNAs Delivery. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (12), 4267-4274 (2017).
  18. Arab, T., et al. Proteomic characterisation of leech microglia extracellular vesicles (EVs): comparison between differential ultracentrifugation and OptiprepTM density gradient isolation. Journal of extracellular vesicles. 8 (1), 1603048 (2019).
  19. Murgoci, A. -N., et al. Brain-Cortex Microglia-Derived Exosomes: Nanoparticles for Glioma Therapy. ChemPhysChem. 19 (10), 1205-1214 (2018).
  20. Glebov, K., et al. Serotonin stimulates secretion of exosomes from microglia cells. Glia. 63 (4), 626-634 (2015).
  21. Hooper, C., et al. Wnt3a induces exosome secretion from primary cultured rat microglia. BMC Neuroscience. 13 (1), 144 (2012).
  22. Gabrielli, M., et al. Active endocannabinoids are secreted on extracellular membrane vesicles. EMBO reports. 16 (2), 213-220 (2015).
  23. Antonucci, F., et al. Microvesicles released from microglia stimulate synaptic activity via enhanced sphingolipid metabolism. The EMBO Journal. 31 (5), 1231-1240 (2012).
  24. Frühbeis, C., Fröhlich, D., Kuo, W. P., Krämer-Albers, E. -M. Extracellular vesicles as mediators of neuron-glia communication. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 182 (2013).
  25. Prada, I., et al. Glia-to-neuron transfer of miRNAs via extracellular vesicles: a new mechanism underlying inflammation-induced synaptic alterations. Acta neuropathologica. 135 (4), 529-550 (2018).
  26. Takenouchi, T., et al. Extracellular ATP induces unconventional release of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from microglial cells. Immunology Letters. 167 (2), 116-124 (2015).
  27. Yang, Y., Boza-Serrano, A., Dunning, C. J. R., Clausen, B. H., Lambertsen, K. L., Deierborg, T. Inflammation leads to distinct populations of extracellular vesicles from microglia. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 168 (2018).
  28. Duhamel, M., et al. Paclitaxel Treatment and Proprotein Convertase 1/3 (PC1/3) Knockdown in Macrophages is a Promising Antiglioma Strategy as Revealed by Proteomics and Cytotoxicity Studies. Molecular & Cellular Proteomics. 17 (6), 1126-1143 (2018).
  29. Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: A novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. Journal of Neuroscience Methods. 168 (1), 134-139 (2008).
  30. Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B. Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).
  31. Rashed, M. H., et al. Exosomes: From Garbage Bins to Promising Therapeutic Targets. Int. J. Mol. Sci. Int. J. Mol. Sci. 18 (18), (2017).
  32. Yuana, Y., Sturk, A., Nieuwland, R. Extracellular vesicles in physiological and pathological conditions. Blood Reviews. 27 (1), 31-39 (2013).
  33. Frohlich, D., et al. Multifaceted effects of oligodendroglial exosomes on neurons: impact on neuronal firing rate, signal transduction and gene regulation. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1652), (2014).
  34. Krämer-Albers, E. -M., et al. Oligodendrocytes secrete exosomes containing major myelin and stress-protective proteins: Trophic support for axons. Proteomics. Clinical applications. 1 (11), 1446-1461 (2007).
  35. Verderio, C., et al. Myeloid microvesicles are a marker and therapeutic target for neuroinflammation. Annals of Neurology. 72 (4), 610-624 (2012).
  36. Prada, I., Furlan, R., Matteoli, M., Verderio, C. Classical and Unconventional Pathways of Vesicular Release in Microglia. GLIA. 61, 1003-1017 (2013).
  37. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the CNS in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  38. Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. , (2017).
  39. Kennedy, B. C., et al. Tumor-Associated Macrophages in Glioma: Friend or Foe. Journal of Oncology. 2013, 1-11 (2013).
  40. Potolicchio, I., Carven, G. J., Xu, X., Stipp, C., Riese, R. J., Stern, L. J., Santambroggio, L. Proteomic Analysis of Microglia-Derived Exosomes: Metabolic Role of the Aminopeptidase CD13 in Neuropeptide Catabolism1. The Journal of Immunology. 175, 2237-2243 (2005).
  41. Turola, E., Furlan, R., Bianco, F., Matteoli, M., Verderio, C. Microglial microvesicle secretion and intercellular signaling. Frontiers in Physiology. 3, (2012).
  42. Cocucci, E., Meldolesi, J. Ectosomes and exosomes : shedding the confusion between extracellular vesicles. Trends in Cell Biology. 25 (6), 364-372 (2015).
  43. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  44. de Vrij, J., et al. Glioblastoma-derived extracellular vesicles modify the phenotype of monocytic cells. International Journal of Cancer. 137 (7), 1630-1642 (2015).
  45. van der Vos, K. E., et al. Directly visualized glioblastoma-derived extracellular vesicles transfer RNA to microglia/macrophages in the brain. Neuro-Oncology. 18 (1), 58-69 (2016).

Tags

Neurovidenskab Immunfunktioner mikroglia makrofager neuroner gliomceller ekstracellulære vesikler
Karakterisering af immuncelleafledte ekstracellulære vesikler og undersøgelse af funktionel indvirkning på cellemiljøet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lemaire, Q., Duhamel, M.,… More

Lemaire, Q., Duhamel, M., Raffo-Romero, A., Salzet, M., Lefebvre, C. Characterization of Immune Cell-derived Extracellular Vesicles and Studying Functional Impact on Cell Environment. J. Vis. Exp. (160), e60118, doi:10.3791/60118 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter