Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

İmmün Hücre Kaynaklı Hücre Dışı Veziküllerin Karakterizasyonu ve Hücre Çevresi Üzerindeki Fonksiyonel Etkisinin İncelenmesi

Published: June 2, 2020 doi: 10.3791/60118
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1U1192-Laboratoire Protéomique, Réponse Inflammatoire et Spectrométrie de Masse (PRISM), Univ. Lille, INSERM

Summary

Bu rapor, mikroglia veya kan makrofajlarından ekstrasellüler vezikül (EV) izolasyonu için kronolojik gereksinimleri vurgulamaktadır. Mikroglia kaynaklı EV'ler nötral büyümenin düzenleyicisi olarak değerlendirilirken, c6 glioma hücre invazyonunun kontrolünde in vitro tahlillerde kan makrofajlı eV'ler incelendi. Amaç, belirli mikroortamlarda bağışıklık arabulucusu olarak bu EV fonksiyonlarını daha iyi anlamaktır.

Abstract

Merkezi sinir sisteminin nöroinflamatuar durumu (CNS) fizyolojik ve patolojik koşullarda önemli bir rol oynar. Mikroglia, beyinde yerleşik bağışıklık hücreleri, ve bazen sızan kemik iliği kaynaklı makrofajlar (KBM), CNS kendi mikroortamının inflamatuar profilini düzenler. Bağışıklık hücrelerinden gelen hücre dışı vezikül (EV) popülasyonlarının immün arabulucu olarak hareket ettiği kabul edilir. Bu nedenle, bunların toplanması ve izolasyonu, içeriklerini tanımlamak için önemlidir, aynı zamanda alıcı hücreler üzerindeki biyolojik etkilerini de değerlendirirler. Bu veriler, ultrasantrifüj ve boyut dışlama kromatografisi (SEC) adımları da dahil olmak üzere mikroglia hücrelerinden veya kan makrofajlarından EV izolasyonu için kronolojik gereksinimleri vurgulamaktadır. Hedeflenmemiş bir proteomik analiz, protein imzalarının EV belirteçleri olarak doğrulanmasına izin verdi ve biyolojik olarak aktif EV içeriğini karakterize etti. Mikroglia kaynaklı EVs de işlevsel nöronların birincil kültür de nötrit büyüme bağışıklık mediatörler olarak önemini değerlendirmek için kullanılmıştır. Sonuçlar, mikroglia kaynaklı EV'lerin in vitro neurite büyümesini kolaylaştırmaya katkıda olduğunu göstermiştir. Buna paralel olarak, kan makrofaj kaynaklı EVs fonksiyonel C6 glioma hücrelerinin spheroid kültürlerde bağışıklık aracı olarak kullanılmıştır, bu eVs in vitro glioma hücre invazyonu kontrol gösteren sonuçlar. Bu rapor, EV aracılı bağışıklık hücresi fonksiyonlarını değerlendirme olasılığını vurgular ken, aynı zamanda böyle bir iletişimin moleküler temellerini de anlamaktadır. Bu deşifre doğal veziküllerin kullanımını teşvik edebilir ve / veya cns patolojilerin mikroortamda bağışıklık özelliklerini taklit etmek için terapötik veziküllerin in vitro hazırlanması.

Introduction

Birçok nöropatoloji giderek düşünülen karmaşık bir mekanizma dır nöro-inflamatuar devlet ile ilgilidir, ancak bağışıklık süreçleri çeşitli ve hücre ortamına bağlıdır, çünkü hala kötü anlaşılmaktadır. Gerçekten de, CNS bozuklukları sistematik olarak aynı aktivasyon sinyalleri ve bağışıklık hücre popülasyonları içermez ve bu nedenle pro-veya anti-inflamatuar yanıtları patolojilerin nedenleri veya sonuçları olarak değerlendirmek zordur. "Microglia" adı verilen beyin yerleşik makrofajlar sinir ve bağışıklık sistemleri arasındaki arayüz de gibi görünüyor1. Mikroglia bir miyeloid kökenli ve ilkel hematopoiesis sırasında beyin kolonize yumurta kesesi türetilmiştir, periferik makrofajlar periferik makrofajlar olmak için kesin hematopoezis sırasında fetal karaciğertülen türetilmiştir ise2. Mikroglia hücreleri nöronlar ve astrositler ve oligodendrocytes33 gibi nöron kaynaklı glial hücreleri ile iletişim . Birkaç yeni çalışmalar mikroglia CNS gelişimi ve yetişkin doku homeostaz sırasında nöronal plastisite dahil olduğunu göstermiştir, ve aynı zamanda nörodejeneratif hastalıklar ile ilişkili inflamatuar devlet4,5. Aksi takdirde, kan beyin bariyerinin bütünlüğü diğer CNS patolojilerinde tehlikeye olabilir. Bağışıklık yanıtları, özellikle glioblastoma multiforme kanser, kan beyin bariyeri anjiyojenik süreçler ve lenfatik damarların varlığı ile yeniden düzenlenir gibi mikroglia hücreleri tarafından desteklenmez6,7. Bu nedenle tümöre bağlı anjiyogenez mekanizmaları boyunca beyin tümöründe büyük kemik iliği kaynaklı makrofajlar (MBM) infiltrasyonu meydana gelir8. Kanser hücreleri immünsupresif özellikleri ve tümör büyümesi ne kadar opresif özellikleri ve tümör büyümesi ne kadar infiltrasyon lu KBM'ler üzerinde önemli bir etki uygular9. Böylece bağışıklık hücreleri ve beyin mikroçevre arasındaki iletişim hücre kökeni ve aktivasyon sinyalleri çeşitli olduğu gibi anlamak zordur10,11. Bu nedenle fizyolojik koşullarda bağışıklık hücresi ile ilişkili moleküler imzaların işlevlerini yakalamak ilginçtir. Bu bağlamda, bağışıklık hücreleri ve hücre mikroçevre arasındaki hücre-hücre iletişimi ekstrasellüler serbest bırakılması ile incelenebilir (EVs).

EVs sağlıklı yanı sıra patolojik koşullarda bağışıklık fonksiyonlarının düzenlenmesinde daha fazla çalışılmaktadır12,13. İki popülasyon, ekzozomlar ve mikroveziküller dikkate alınabilir. Farklı biyogenez ve boyut aralıkları sunarlar. Ekzozomlar ~30-150 nm çapında veziküllerdir ve endozomal sistemden üretilir ve plazma zarı ile multiveziküler cisimlerin (MVB) füzyonu sırasında salgılanır. Mikroveziküller çapı yaklaşık 100-1.000 nm ve hücre plazmamembran14bir dış tomurcuklanma tarafından oluşturulur. Ekzozom ve mikrovezilem ayrımcılığının boyutuna ve moleküler kalıplarına göre fark etmesi hala zor olduğundan, bu raporda sadece EVs terimini kullanacağız. Çalışmalar nematodlar, böcekler veya annelidler15,16dahil omurgasız türlerde rol lerini gösterdi beri CNS EV ilişkili iletişim atalarının bir mekanizma temsil eder. Ayrıca, EVs farklı türlerden hücrelerle iletişim kurabilir gösteren sonuçlar, ilk veziküller ve alıcı hücreler arasında yüzey molekülü tanıma dayalı ve daha sonra arabulucuların alımı na izin bir anahtar kilit sistemi olarak bu mekanizma göstermek16,17. Gerçekten de, EVs proteinler (örneğin, enzimler, sinyal transdüksiyonu, biyogenez faktörü), lipidler (örneğin, ceramid, kolesterol) veya nükleik asitler (örneğin, DNA, mRNA veya miRNA veya miRNA veya miRNA) gibi birçok molekül içeren alıcı hücre faaliyetlerinin doğrudan veya dolaylı düzenleyicileri olarak hareket14. Bu nedenle evs izole etmek ve tam olarak protein imzaları karakterize bağışıklık hücreleri üzerinde metodolojik çalışmalar yapıldı18,19.

İlk çalışmalar bir Wnt3a aşağıdaki indükedilemez bir mekanizma olarak birincil kültürlü sıçan mikroglia ekzozomların serbest olduğunu gösterdi- veya serotonine bağlı aktivasyon20,21. Fonksiyonel CNS, mikroglia türetilmiş EVs nöronlarda presinaptik terminalleri tarafından nöronal eksitilat kontrolüne katkıda bulunan sinaptik vezikül salınımını düzenleyen22,23. Mikroglia kaynaklı EVs de büyük beyin bölgelerinde sitokinler aracılı inflamatuar yanıt yaymak olabilir24,25. Daha da önemlisi, toll benzeri reseptör ailesi için çeşitli ligands microglia26EVs belirli üretimleri etkinleştirmek olabilir. Örneğin, in vitro çalışmalar LPS aktive mikroglia BV2 hücre hatları pro-inflamatuar sitokinler27dahil diferansiyel EV içeriği üretmek olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, CNS bağışıklık hücresi alt popülasyonlarının fonksiyonel çeşitliliği, mikroglia ve bmdm'ler infiltrasyon, alıcı hücreler ve EV içeriğinin belirlenmesi üzerinde EV etkisi de dahil olmak üzere kendi EV popülasyonları ile değerlendirilebilir.

Daha önce mikroglia ve BMDM kaynaklı EVs onların izolasyon16,19sonra fonksiyonel özelliklerini değerlendirmek için yöntemler açıklanmıştır. Bu raporda, mikroglia kaynaklı EV'lerin nörit büyüme üzerindeki etkisini ve makrofaj kaynaklı EV'lerin glioma hücre agregalarının kontrolü üzerindeki etkisini bağımsız olarak değerlendirmeyi öneriyoruz. Bu çalışma aynı zamanda EV izolasyon prosedürünü doğrulamak ve biyolojik olarak aktif protein imzalarını belirlemek için EV fraksiyonlarının geniş bir proteomik analizini önermektedir. Yararlı etkileri ve EV içeriğinin moleküler deşifre onların olası manipülasyon yardımcı olabilir ve beyin bozukluklarında terapötik ajanlar olarak kullanmak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Mikroglia/Makrofajların Birincil Kültürü

  1. Mikroglia birincil kültür
    1. Kültür ticari sıçan birincil mikroglia (2 x 106 hücreleri) (Malzemeler Tablosubakınız) Dulbecco modifiye Kartal orta (DMEM) ile takviye 10% ekzozozomiçermeyen serum, 100 U/ mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin, ve 9.0 g/L glikoz at 37 °C ve% 5 CO2.
    2. 48 saatlik bir kültürden sonra şartlandırılmış ortamı toplayın ve EVs'lerin izolasyonuna devam edin.
  2. Makrofajların birincil kültürü
    1. Kültür ticari sıçan birincil makrofajlar (1 x 106 hücreleri) üretici tarafından sağlanan ortamda (Malzemeler Tablosubakınız) 37 °C ve% 5 CO2, ekzozomsuz serum ile.
    2. 24 saatlik bir kültürden sonra şartlandırılmış ortamı toplayın ve EVs'lerin izolasyonuna devam edin.

2. EV'lerin İzolasyon

  1. EVs'nin klimalı ortamdan önceden izolasyonu
    1. Koşullu kültür ortamını mikroglia veya makrofaj kültürlerinden (adım 1.1.2 veya 1.2.2) konik bir tüpe aktarın.
    2. Hücre peletiçin oda sıcaklığında 10 dakika (RT) için 1.200 x g santrifüj.
    3. Supernatant'ı yeni bir konik tüpe aktarın. Apoptotik organları ortadan kaldırmak için RT 20 dakika için 1.200 x g santrifüj.
    4. Supernatant'ı 10,4 mL'lik polikarbonat tüpe aktarın ve tüpü 70,1 Ti rotora aktarın. Ultracentrifuge 100.000 x g için 90 dk 4 °C'de EVs pelet.
    5. Supernatant atın ve 0.20 μm filtrelenmiş fosfat tampon salin (PBS) 200 μL içinde EVs içeren pelet resuspend.
  2. EV'lerin İzolasyon
    1. Ev yapımı boyut dışlama kromatografisi sütununun (SEC) hazırlanması
      1. Bir cam kromatografi sütunu boşaltın (uzunluk: 26 cm; çap: 0,6 cm) (Malzeme Tablosunabakın), yıkayın ve sterilize edin.
      2. Sütunun altına 60 μm filtre yerleştirin.
      3. 0,6 cm çapında ve 20 cm yüksekliğinde sabit bir faz oluşturmak için çapraz bağlı agarose jel filtrasyon taban matris ile sütun yığını.
      4. 0,20 m filtrelenmiş PBS 50 mL ile faz duruleyin. Gerekirse daha sonra kullanılmak üzere 4 °C'de saklayabilirsiniz.
    2. Yeniden askıya alınan EV peletini SEC sütununun sabit fazının üzerine yerleştirin.
    3. Sütunun kurumasını önlemek için sabit fazın üstüne 0,20 m filtrelenmiş PBS eklemeye devam ederken 250 μL'lik 20 ardışık kesir toplayın. Kesirleri gerekirse -20 °C'de saklayın.
      NOT: Moleküler analiz için EV bütünlüğünü korumak için -80 °C'de bir haftadan uzun bir depolama yapılabilir.
  3. SEC fraksiyonlarının matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyonu (MALDI) kütle spektrometresi analizi
    1. Bölüm 2.2'de açıklandığı gibi EV yalıtımına devam edin.
    2. 200 μL peptit kalibrasyon karışımı çözeltisi ile EV peletini yeniden askıya alın (Malzeme Tablosu'nabakın).
    3. Bölüm 2.2.1 ile 2.2.3 bölümlerinde açıklandığı gibi EV koleksiyonuna devam edin.
    4. Tamamen bir vakum konsantratörü ile fraksiyonu kuru.
    5. Kesirleri %0,1 trifloroasetik asit (TFA) ile 10 μL ile yeniden oluşturur.
    6. Maldi cilalı çelik hedef plaka üzerinde 1 μL α-siyano-4-hidroksinnamik asit (HCCA) matrisi ile yeniden oluşturulmuş fraksiyonun 1 μL'sini karıştırın.
    7. Maldi kütle spektrometresi ile tüm kesirleri analiz edin.
    8. Özel yazılımla oluşturulan spektrumları analiz edin (bkz. Malzeme Tablosu).

3. EV'lerin karakterizasyonu

  1. Nanopartikül izleme analizi (NTA)
    NOT:     NTA analizi bir nanopartikül izleme analiz cihazı (Malzeme Tablosunabakınız) ve otomatik şırınga pompası ile gerçekleştirilir.
    1. 0,20 μm filtrelenmiş PBS ile adım 2.2.3 her SEC fraksiyonu bir seyreltme (1:50-1:500 aralığı) olun.
    2. Vortex ev agregaları ortadan kaldırmak için çözüm.
    3. Seyreltilmiş çözeltiyi 1 mL şırıngaya koyun ve otomatik şırınga pompasına yerleştirin.
    4. Kamera ayarını ekran kazanç düzeyi (3) ve kamera düzeyine (13) ayarlayın.
    5. Çalıştır'a tıklayın ve aşağıdaki komut dosyasını başlatın.
      1. Numuneyi analiz odasına yükleyin (infüzyon hızı: 15 s için 1.000).
      2. Video kaydı için hız akışını azaltın ve stabilize edin (infüzyon hızı: 15 s için 25). Parçacık akışının art arda üç 60 s video yakalayın.
      3. Video analizinden önce kamera düzeyini (13) ve algılama eşiğini (3) ayarlayın. Ayarlar' a tıklayın| Analizi başlatmak için tamam ve analiz yapıldığında Dışa Aktar'a tıklayın.
    6. Her kesir analizi arasında, 0,20 μm filtrelenmiş PBS 1 mL ile yıkayın.
  2. Elektron mikroskobu (EM) analizi
    1. Bölüm 2'de açıklandığı gibi EVs'leri yalıtın.
      NOT: Steril koşullar gerekli değildir.
    2. EVs ölçmek için bölüm 3.1 tekrarlayın.
      NOT: EM analizi için sadece pozitif kesirler kullanılacaktır.
    3. EV içeren SEC fraksiyonlarını yoğunlaştırmak için 50 kDa santrifüj filtre (Bkz. Malzeme Tablosu)kullanın.
    4. Konsantre EV'leri %2 paraformaldehitin (PFA) 30 μL'sinde yeniden askıya alın.
    5. Numunenin 10 μL'sini karbon kaplı bakır ızgaraya yükleyin.
    6. Islı bir ortamda 20 dakika kuluçka.
    7. Izgara üzerindeki numunenin iyi bir emilimi için 3.2.5 ve 3.2.6 adımlarını tekrarlayın.
    8. RT 5 dakika için PBS% 1 glutaraldehit bir damla içine ızgara aktarın.
    9. Numuneyi ultra saf suyla birkaç kez yıkayın.
    10. %4 uranyl asetat ve %2 metilselüloz (1:9, v/v) karışımı yla 10 dk buz üzerinde numuneyi kontrast. Bir filtre kağıdı kullanarak karışımın fazlalıkkaldırın.
    11. Numuneyi kurulayın ve 200 kV'da bir iletim elektron mikroskobu altında gözlemleyin (Bkz. Malzemeler Tablosu).
  3. Batı leke analizi
    1. Protein ekstraksiyonu
      1. EVs izole etmek ve konsantre 3.2.1 için 3.2.3 adımları tekrarlayın.
      2. Mix 50 μL RIPA tampon (150 mM sodyum klorür [NaCl], 50 mM Tris, 5 mM Etilen glikol-bis(2-aminoetitillether)-N,N,N′,-tetraasetik asit [EGTA], 2 mM Etilenedanin-tetraasetik asit [EDTA], 100 mM sodyum florür [NaF], 10 mM sodyum pirofosfat, %1 Nonidet P-40, 1 mM Feniltansülsülfonil florür [PMSF], 1x proteaz inhibitörü) ev numunesi (filtredeki EV konsantrasyonundan kaynaklanan 25 μL) ile proteinleri ayıklamak için 5 dk.
      3. Sonicate için 5 s (genlik: 500 W; frekans: 20 kHz), buz üzerinde 3 kez.
      4. 4 °C'de, 10 dakika boyunca 20.000 x g'de vesiküler enkazları santrifüj ile çıkarın.
      5. Supernatant toplamak ve Bradford protein analiz yöntemi ile protein konsantrasyonu ölçmek.
    2. Sodyum dodecyl sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ve batı lekeleme
      1. Protein ekstrelerini (30 μg) 5c Laemmli örnek tampon (v/v) ile karıştırın.
      2. Protein karışımını %12 poliakrilamid jelüzerine yükleyin.
      3. Jeldeki proteinleri TGS tamponu (25 m Tris pH 8.5, 192 mM Glisin ve %0.1 SDS), 70 V'de 15 dakika ve 120 V 45 dakika ile geçirin.
      4. Proteinleri 30 dk boyunca 230 V'de yarı kuru sistemle nitroselüloz membrana aktarın.
      5. Membranı RT'de 1 saat boyunca bloke edici tamponile doygunlaştırın (%0.05 Ara 20 w/v, 0.1 M PBS içinde %5 süt tozu w/v, pH 7.4).
      6. Membranı bir gecede 4 °C'de fare monoklonal insan şoku önleyici protein 90 (HSP90) antikor bloke tamponu (1:100) ile inkübe edin.
      7. Membranı PBS-Tween (PBS, %0,05 Ara 20 w/v) ile 15 dakika boyunca üç kez yıkayın.
      8. Membranı RT'de 1 saat boyunca keçi horseradish peroksidaz-konjuge anti-fare IgG ikincil antikor bloke tampon (1:10,000) seyreltilmiş ile inkübe.
        NOT: Negatif kontrol tek başına ikincil antikor kullanılarak yapılır.
      9. Yıkama adımını tekrarlayın (adım 3.3.2.7).
      10. Gelişmiş kemilüminesans (ECL) batı lekealt tabaka kiti ile membran ortaya (Malzemeler Tablosubakınız).
  4. Proteomik analiz
    1. Protein ekstraksiyonu ve jel içi sindirim
      1. EVs izole etmek ve konsantre 3.2.1 için 3.2.3 adımları tekrarlayın. EV protein ekstraksiyonu için adım 3.3.1'i tekrarlayın.
      2. %12 poliakrilamid jelin istifleme jelinde protein göçü yapın.
      3. RT 20 dakika için coomassie mavi ile jel proteinleri düzeltin.
      4. Her renkli jel parça excise ve 1 mm3küçük parçalar halinde kesilmiş.
      5. Jel parçalarını her çözeltiden 300 μL ile art arda yıkayın: 15 dk ultra saf su, 15 dakika için %100 asetonnitil (ACN), 15 dakika için 100 mM amonyum bikarbonat (NH4HCO3),ACN:100 mM NH4HCO3 (1:1, v/v) 15 dakika boyunca 100% ACN ve 5 dakika boyunca sürekli karıştırma ile %100 ACN.
      6. Vakum konsantratörü ile tamamen jel parçaları kurulayın.
      7. 100 μL 100 mM NH4HCO3 içeren 100 mM dithiothreitol ile 56°C'de 1 saat protein azaltımı yapın.
      8. RT'de karanlıkta 45 dakika boyunca 50 mM iodoacetamide içeren 100 mM NH4HCO3 ile protein alkiliyasyonu yapın.
      9. Jel parçalarını her çözeltiden 300 μL ile art arda yıkayın: 100 mM NH4HCO3 15 dakika, ACN:20 mM NH4HCO3 (1:1, v/v) 15 dakika boyunca ve %100 ACN 5 dakika boyunca sürekli karıştırma ile.
      10. Tamamen bir vakum konsantratörü ile jel parçaları kuru.
      11. Protein sindirimini 20 mM NH4HCO3 gecede 37 °C'de 50 μL tripsin (12,5 g/mL) ile gerçekleştirin.
      12. 37 °C'de 30 dakika boyunca %100 ACN 50 000 ACN ve rt'de 15 dk sürekli karıştırarak sindirilmiş proteinleri jelden çıkarın.
      13. Aşağıdaki ekstraksiyon prosedürlerini iki kez tekrarlayın: 20 mM NH4HCO3 çözeltisinde %5'lik TFA'nın 50 μL'si 20 dk sürekli karıştırma ile.
      14. 10 dakika boyunca %100 ACN 100 μL'lik sürekli karıştırarak ekleyin.
      15. Bir vakum konsantratörü ile kuru sindirilmiş proteinler ve 20 μL% 0.1 TFA resuspend.
      16. Tatsuzlaştırma ve konsantre peptidler için C18 ters faz ortamına sahip 10 μL pipet ucu kullanarak numuneyi tuzdan arındırın (Malzeme Tablosunabakın) ve ACN:0.1% formik asit (FA) (80:20, v/v) ile elute peptidler.
      17. Sıvı kromatografi tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) için numuneyi vakum konsantratörü ile tamamen kurutun ve %20'lik ACN:0.1% FA (2:98, v/v) oranında yeniden askıya alın.
    2. LC-MS/MS Analizi
      1. Sindirilmiş peptidi LC-MS/MS aletine yükleyin ve başka bir yerde ayrıntılı olarak açıklanan parametrelere göre numune ve veri analizi yapın42.
    3. Ham veri analizi
      1. Proteinleri tanımlamak ve her numunenin tanımlanmış proteinlerini standart parametreleri kullanarak nicel proteomik yazılım paketiyle karşılaştırmak için kütle spektrometresi verilerini işleyin.
      2. İhracat, standart parametreleri kullanarak, protein ağları ve biyolojik süreçleri tahmin eden bir yazılım EV pozitif örneklerden özel ve aşırı temsil proteinlerin listesi.
      3. Kesirlerde tanımlanan proteinlerin listesini Exocarta açık erişim veritabanındaki en iyi 100 EV belirteçleriyle karşılaştırın (Bkz. Malzemeler Tablosu).

4. Fonksiyonel EVs Etkileri Tsası

  1. PC-12 hücre hattında neurite outgrowth tsay
    1. Tam DMEM orta kültür PC12 hücre hattı (2 mM L-glutamin, 10% fetal at serumu (FHS), 5% fetal sığır serumu (FBS), 100 UI/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin).
      NOT: Sera tüm prosedürde exosome ücretsizdir.
    2. 24 kuyulu bir tabağa bir kapak camı (tüm kuyular) ekleyin; poli-D-lizin (0.1 mg/mL) ve tohum 260.000 hücreleri / iyi ile plaka kat.
    3. Hücreleri %5 CO2'ninaltında 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
    4. 24 saat kuluçkadan sonra orta yı DMEM farklılaştırma ortamına (DMEM ile 2 mM L-glutamin, %0.1 FHS, 100 UI/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin) 1 x 106 mikroglia EV (adım 1.1.2) değiştirin.
      NOT: Kontrol durumu diferansiyasyon ortasında mikroglia EVs olmadan yapılır.
    5. Tohumlamadan sonra 4.
    6. Tohumlamadan sonra 7.
    7. 4 °C'de 30 dakika rodamin konjuge phalloidin ile hücreleri lekelayın ve PBS ile 3 kez (her biri 10 dakika) durulayın.
    8. Hücreleri seyreltilmiş Hoechst 33342 (1:10,000) ile RT'de 30 dakika boyunca lekelendirin ve PBS ile 3 kez (her biri 10 dakika) durulayın.
    9. Kapak camı floresan montaj ortamına sahip bir slaytüzerine monte edin (bkz. Malzemeler Tablosu).
    10. Bir konfokal mikroskop ile slayt analiz, her slayt 5 rasgele görüntü almak.
    11. Başka bir yerde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi otomatik bir niceliklendirme yazılımı (toplam neurite uzunluğu) kullanarak ölçü nötrit outgrowth43.
  2. Sıçan primer nöronlar üzerinde neurite outgrowth
    1. Poli-D-lizin (0.1 mg/mL) ve laminin (20 μg/mL) içeren 8 kuyulu cam kaydırağı katlayın.
    2. Uygun kültür ortamındaki kültür sıçanı ticari birincil nöronlar (bkz.2
      NOT: Sera tüm prosedürde ekzozomiçermez.
    3. Nöron kültürü ortamına 1 x 106 mikroglia EVs ekleyin ve 37 °C'de %5 CO2 altında 48 saat daha fazla kuluçkaya yatırın.
      NOT: Kontrol durumu nöron kültür orta mikroglia EVs olmadan yapılır.
    4. Hücreleri düzeltmek ve lekelemek için 4.1.6 ile 4.1.9 adımlarını izleyin.
    5. Slaytı analiz etmek için 4.1.10 ve 4.1.11 adımlarını izleyin.
  3. Glioma hücre istilası
    1. Tam DMEM ortamda C6 sıçan glioma hücreleri resuspend (DMEM ile 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 1x antibiyotikler) içeren 5% kollajen içeren 8,000 hücrelerin son konsantrasyonda 20 μL.
      NOT: Sera tüm prosedürde ekzozomiçermez.
    2. 60 mm'lik doku kültürü kabının dibine 5 mL PBS yerleştirin. 20 μL (8.000 hücre) hücre süspansiyonunun kapağının kapağını ve tortu damlalarını kapağın altına ters çevirin.
    3. Kapağı PBS dolu alt haznesine ters çevirin ve hücre küreselleri oluşana kadar plakayı 37 °C ve %5 CO2'de 72 saat inkübüne çevirin.
    4. 2.2 mg/mL kollajen karışımına (2 mL büyükbaş kollajen tip I çözeltisi [3 mg/mL] 250 μL 10x minimum esansiyel ortam (MEM) ve 0,1 M sodyum hidroksit 500 μL) ile 1 x 108 makrofaj EVs (adım 1.2.2) ekleyin.
      NOT: Kontrol durumu kollajen karışımında makrofaj EV'ler olmadan gerçekleştirilir.
    5. Hücre küresellerini gömmek için 24 kuyuluk bir plaka içinde EVs içeren kollajen karışımı dağıtın.
    6. Her kuyunun ortasına yeni oluşan hücre spheroidlerini yerleştirin.
    7. Jeli katılaştırmak için 37°C'de 30 dakika ve %5 CO2'de plakayı kuluçkaya yatırın.
    8. Daha sonra, her kuyudaki kollajen matrisinüzerine 400 μL'lik tam DMEM ortamı nı kaplayın.
    9. 37 °C ve %5 CO2'detoplam 6 gün boyunca komple sistemi kuluçkaya yatırın.
      NOT: Küresel hücre istilası 4x/0.10 N.A. hedefi kullanılarak ters ışık mikroskobu kullanılarak dijital fotoğrafçılık tarafından izlenir.
    10. Her kuyunun her gün görüntülerini edinin.
    11. Görüntüleri işlemek ve daha önce ayrıntılı olarak açıklandığı gibi yazılım kullanarak hücre küresel alanların işgali ölçmek42.
      NOT: İstila ve küresel alanlar her gün invazyon ve 0.gün ölçülen küresel bölgelere normalleştirildi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Biyolojik etkilerin hücre dışı veziküllere (EVs) atflanmasının önündeki en büyük zorluklardan biri, EV'leri tüm kültür ortamından izole edebilme yeteneğidir. Bu raporda, EV belirteçlerini doğrulamak ve biyoaktif bileşikleri tanımlamak için protein imzalarının büyük ölçekli analizine bağlı olarak ultracentrifugation (UC) ve boyut dışlama kromatografisi (SEC) kullanılarak bir yöntem salıyoruz. Makrofaj veya mikroglia kaynaklı EV'ler sırasıyla 24 saat veya 48 h kültüründen sonra şartlı ortamdan izole edilmiştir(Şekil 1).

Figure 1
Şekil 1: Hücre dışı Vezikül (EV) toplama ve izolasyon stratejileri. Apoptotik cisimler ve hücre enkazı art arda santrifüj basamakları ile mikroglia veya makrofaj klimalı ortamdan ayrılmıştır. Supernatant itibaren, EVs ultracentrifugation (UC) tarafından izole edildi. EVs içeren UC pelet sütunüzerine yüklendi ve 20 farklı eluted fraksiyonları boyut dışlama kromatografisi (SEC) ile ayrıldı. Daha ileri basamaklarda (elektron mikroskobu, nanopartikül izleme analizi ve proteomik analiz) ortaya konan gibi, SEC fraksiyonları 1F-EV-, 2F-EV+ ve 3F-EV-olarak birleştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yöntem art arda santrifüj adımları izledi: hücreleri kaldırmak için ilk ve hücresel enkaz ve apoptotik organları kaldırmak için ikinci. Daha sonra, supernatant 90 dk için 100.000 x g ultracentrifugation gerçekleştirmek için yeni bir tüp transfer edildi. Veziküller son UC peletprotein agregaları ile birlikte toplandı. Bileşikleri boyutlarına göre ayırmak ve agregaları çıkarmak için bir SEC sütunu kullanılmıştır(Şekil 1). EVs izolasyon onaylamak için, her SEC fraksiyonu bir nanopartikül izleme analizi izledi(Şekil 2A).

Figure 2
Şekil 2: Sec fraksiyonlarının analizi. (A) Sec fraksiyonlarının nanopartikül izleme analizi (NTA). Her SEC fraksiyonundaki parçacıkların toplam sayısı çubuk grafiklerle sunulur. Turuncu çubuk grafikler art arda üç EV + fraksiyonları (F5-F7) gösterir. (B, C) NTA odasının ekran görüntüleri, SEC fraksiyonları arasındaki parçacık akışında önemli farklılıklar göstermektedir. (D) Tamamlayıcı MALDI kütle spektrometresi analizi. EVs içeren başka bir UC pelet, standart bir kontrol peptid seti SEC stratejisinin performansını doğrulamak için SEC ayırma önce eklendi. Her SEC fraksiyonu matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyonu ile analiz edildi - uçuş süresi (MALDI-TOF) standart-pozitif kesirleri belirlemek için. İlk dokuz spektrumda (1'den 9'a kadar kesirler) sinyal gözlenmedi. Bu serbest standartların saptanması, SEC yordamının evs'i (F5-F7) çözünür bileşenlerden (F10-F20) ayırma yeteneğini doğrulayan aşağıdaki kesirlerde (10-20 kesirler) mümkündür. (E) BIR EV marker ön analizi olarak SEC fraksiyonlarının Batı leke analizi. EV+ fraksiyonları (F5-F7) tek bir örnek (2F-VE+) olarak, EV-fraksiyonları (sırasıyla F1-F4 ve F8-F20) 1F-EV- ve 3F-EV- adı verilen iki örnekte biraraya getirildi. Sonuçlar, 2F-EV+'da ve hücre lysate'sinde diğer fraksiyonlara göre (1F-EV- ve 3F-EV-) Bir Isı-Şok Protein 90 (HSP90) (EV pozitif marker) sinyalinin varlığını gösterdi. (F, G) EV pozitif numunesinin elektron mikroskobu analizi (2F-EV+). Birbirini izleyen iki büyütme altında gözlem 100 nm (beyaz ok) ve yaklaşık 400 nm (ok başı) bir boyut aralığında EV'lerin varlığını ortaya koymuştur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Parçacık sayısı 5, 6 ve 7 kesirlerinde bir önceki (F1-F4) ve sonrakiklerden (F8-F20) anlamlı olarak daha yüksekti. Aşağıdaki kesirlerde birkaç parçacık gözlenmiş olsa bile bu kesirlerde bir parçacık akımı görmek mümkündür(Şekil 2B,C). Bu ayrım, F5-F7 dışındaki kesirlerin az miktarda vezikül içerebileceği, hatta EV açısından zengin fraksiyonların F5 ile F7 arasında moleküler kirletici madde içerebileceği olasılığını engellemez. En azından F5-F7 fraksiyonlarının eş-eluting moleküllerini kirletmediğinden emin olmak için, SEC prosedüründeki farklı bileşiklerin zaman-rotasını takip etmek gerekiyordu. Bunu yapmak için, kontrol peptid standartları daha önce kullanılan benzer bir UC pelet eklendi. Bu hazırlık yine SEC yordamı kullanılarak ayrıldı. Daha sonra, bir matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyonu — uçuş süresi (MALDI) kütle spektrometresi analizi, standartların eluted olduğu SEC fraksiyonları belirlemek için yapılmıştır(Şekil 2D). Bu analizde kitle aralığı nedeniyle sadece peptid standartlarından iyonize ürünler takip edilmiştir. Sonuçlar, bu ürünlerin 10-20 kesirlerde tespit edilebildiğini göstererek, çözünen proteinlerin EV'lerle (F5-F7) aynı kesirlerde eluted edilemeyeceğini göstermiştir. Bu sonuçlar, EV'lerin EV olmayan bileşenlerden ayrılmasında bu yaklaşımın ilgisini doğrulamıştır. F8-F20 fraksiyonlarının ev'lerin bir kalıntısı içerebileceğini varsayarsak bile, aşağıdaki deneylerde EV pozitif fraksiyonlarını (F5-F7) 2F-EV+ adı verilen tek bir örnekte birleştirmeye karar verdik. Ayrıca diğer SEC fraksiyonlarını 1F-EV- (F1-F4) ve 3F-EV- (F8-F20) adlı iki örnekte birleştirdik. Çeşitli nedenlerden dolayı üç örnek halinde gruplandık. İlk olarak, SEC fraksiyonlarının sayısı moleküler analizlerin süresini artıracak, aynı zamanda fonksiyonel in vitro çalışmalarda da. EV-pozitif SEC fraksiyonları ayrı ayrı daha düşük parçacık numaraları sergiler ve aynı zamanda moleküler bileşiklerin tespiti tehlikeye. Aynı şekilde, f8-F20 fraksiyonlarının, gerekirse kalıntı veziküllere konsantre olması ve ev belirteci olan HSP90'a karşı bir ön batı leke analizi ile varlığını kontrol etmesi daha akıllıca kabul edildi. İlginçtir ki, HSP90 için pozitif bir sinyal fraksiyonu 2F-EV+'da, hücre lysate'sinde de pozitif kontrol olarak saptandı, ancak 1F-EV- ve 3F-EV- örneklerinde(Şekil 2E ve Ek Şekil S1 kontrol olarak) saptandı. Bu analiz, yalnızca 2F-EV+ ilgisini ve önceki SEC fraksiyonlarının doğru yönetimini doğrular. EV izolasyonu doğrulamak için, elektron mikroskobu kullanılarak yapılan ek bir deney sadece 2F-EV+ örneğini analiz etmiş ve tipik bir morfolojive boyut heterojenliği ile 100 ile 400 nm arasında(Şekil 2F,G)eV gözlemine olanak sağlamıştır.

Doğrulamada bir diğer önemli adım da proteomik analizdir (Şekil 3). Birden fazla amaç içeren bir kütle spektrometresi analizi geliştirdik: (i) 2F-EV+'da yüksek sayıda EV belirteci nin saptanmasıyla EV'lerin izolasyonunu doğrular, (ii) sonunda EV negatif örneklerindeki kirletici proteinleri (1F-EV- ve 3F-EV-) ve (iii) biyolojik aktivitelerini destekleyen EV'lerin protein içeriğini karakterize eder.

Figure 3
Şekil 3: EV-pozitif ve EV-negatif örneklerin proteomik analizi. (A) Benzer mikroglia hücre preparatlarından üç bağımsız EV izolasyonundan sonra, 1F-EV-, 2F-EV+ ve 3F-EV- örnekleri sodyum dodecyl sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) için yüklendi ve jel sindirimini gerçekleştirmek için istifleme jeline kadar protein konsantrelerine geçirildi. Elde edilen peptidler daha sonra sıvı kromatografi tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) ile ilgili proteinleri belirlemek için analiz edildi. (B) Tanımlanan proteinlerin her iki fraksiyonda (19) ortak proteinleri gösteren 1F-EV- ve 2F-EV+ örnekleri ile 2F-EV+ fraksiyonunda özel olarak saptanan proteinler arasında karşılaştırılması (522). Isı haritası, 1F-EV- ve 2F-EV+ triplicateleri arasındaki tüm ortak proteinlerin 2F-EV+ örneklerinde aşırı temsil edildiği (kırmızı) göreceli temsili gösterir. (C) Tanımlanan proteinlerin trilikatlar (113) ve sadece temsil proteinleri (2F-EV+'da 428 ve 3F-EV-'de 11) arasında ortak proteinleri gösteren 2F-EV+ ve 3F-EV-kesirleri arasında karşılaştırılması. Isı haritası iki kümedeki göreli temsili gösterir. Bir (A kümesi) 3F-EV örneğinde 5 fazla temsil edilen protein, ikincisi (B kümesi) 2F-EV+'da 108 fazla temsil edilen protein sunar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Hücre klimalı ortamdan UC ve SEC prosedürü üç örnek 1F-EV-, 2F-EV+ ve 3F-EV-'e yol açtı. Buna karşılık gelen proteinler sodyum dodecyl sülfat poliakrilamid jel elektroforez (SDS-PAGE) ile çıkarıldı ve yoğunlaştı. Istifleme jelkısa bir göç ten sonra, örnekler bir bant eksizyonu ile toplandı, in-jel sindirilir olmak için farklı tüpler transfer. Ürünler online ters faz kromatografi simulografi ile doğrudan analiz için bir kütle spektrometresi ile birleştiğinde ayrılmıştır(Şekil 3A).

Aşağıdaki sonuçlar, tüm prosedüre örnek olarak, 48 saatlik bir kültürden sonra mikroglia klimalı ortamdan elde edilmiştir. Ham veriler Rat protein veritabanına gönderildi. Tanımlanan proteinler 1F-EV- ve 2F-EV+ (Şekil 3B)örnekleri ile 2F-EV+ ve 3F-EV- (Şekil 3C)örnekleri arasında karşılaştırıldı. İlk karşılaştırmada, Venn diyagramı her iki fraksiyonda 19 ortak protein ve sadece 2F-EV+ fraksiyonunda tespit edilen 522 protein gösterdi. Kantitatif proteomik yazılım kullanılarak yapılan analiz, ortak proteinlerin göreceli temsilinin tanımlanmasına olanak sağladı. Sonuçlar, 1F-EV- ve 2F-EV+ triplitleri arasındaki tüm ortak proteinlerin 2F-EV+ örneklerinde aşırı temsil edildiği (kırmızı) bir ısı haritası gösterdi. Kesirler arasında ikinci karşılaştırmada 2F-EV+ ve 3F-EV-, trilikatlar arasında 113 ortak protein saptandı. Ayrıca 2F-EV+'da 428 protein saptandı ve 3F-EV-'de 11 protein bulundu. Kantitatif analizden sonra, 113 ortak proteinin ısı haritası gösterimi, A kümesinin 3F-EV-numunesinde aşırı temsil edilen beş protein imiş ve B kümesi 2F-EV+'da 108 fazla temsil edilen proteini sunmuştur.

Sadece temsil edilen 428 protein ve 2F-EV+'da aşırı temsil edilen 108 protein, EV ile ilişkili molekülleri tespit etmek için Exocarta açık erişim veritabanına gönderildi. Exocarta'daki en iyi 100 EV belirteci analizinde 2F-EV+'da 86 EV ilişkili protein in varlığı vurgulanmıştır(Şekil 4A).

Figure 4
Şekil 4: 2F-EV+ örneğinden proteinlerin analizi. (A) EV ile ilişkili molekülleri tespit etmek için Exocarta veritabanına 536 protein (428 özel ve 108 aşırı temsil protein) havuzu gönderildi. Exocarta veritabanından ilk 100 EV belirteçlerinde tespit edilen 86 EV ilişkili proteinin molekül sembolleri. (B) Protein etkileşimlerinin tahmini ve seçilen biyolojik süreçlerle ilişkisi 2F-EV+ örneğinde immün ve nöroprotektif yollar gösterdi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

İlginçtir ki, A kümesindeki 5 ortak proteinin ve sadece 3F-EV'de temsil edilen 11 proteinin analizi herhangi bir EV belirteciyle ilişkilendirilmemiştir (veriler gösterilmemiştir). Son olarak, protein etkileşimlerinin tahmini ve seçilen biyolojik süreçlerle ilişkisi, immün mediatörlerin 2F-EV+ fraksiyonunda varlığını gösterdi (%21). bazen inflamatuar yanıtın kontrolünde yer alan (%4.1) (Şekil 4B). 2F-EV+'daki EV içeriği de nöronal gelişim (%16.8), nöron farklılaşması (%5) ile ilişkiliydi. ve nöronal ölüm kontrolü (%3.8) aşağıdaki nötral outgrowth tsay uyarınca.

Böylece, seçtiğimiz strateji tüm verilere erişimi mümkün kılar ve daha sonra gerçekleştirdiğimiz biyolojik tahlillerden önce EV aracılı işlevlerin tahmin inmesine olanak sağlar(Şekil 5).

Figure 5
Şekil 5: EV bağımlı f unctional tahlilleri. Mikroglia kaynaklı EV'lerin etkileri neurite büyüme (üst çerçeve) ve makrofaj kaynaklı EV'lerin etkileri glioma hücre invazyonu (alt çerçeve) üzerinde değerlendirildi. (A, B) Neurit uzunluğu PC-12 hücrelerinde ölçüldü (Panel A Raffo-Romero ve ark.16'dan izinle değiştirildi) veya sıçan primer nöronlarında (B). Sonuçlar, kontrole (Ctrl) kıyasla EVs (+ EVs) altında önemli bir büyüme artışı gösterdi. Ölçek çubuğu = 20 μm. (C, D) Sıçan primer makrofaj türetilmiş EVs (C6 + EVs) veya araç (C6 kontrolü) varlığında kollajen içine C6 glioma spheroid invazyonu zaman ders. Kollajen içine C6 spheroid 3D invazyonu izlendi ve 6 güne kadar ölçüldü. Tümör hücre invazyonunun nicelifikasyonu temsili görüntülerde (D) gözlendiği gibi 1, 2, 3 veya 6 gün (C) olarak gösterilmiştir. Ölçek çubuğu = 500 μm. Neurite outgrowth tahlilleri için, önemi eşleşmemiş Öğrencinin t-testi (* p < 0.05, ** p < 0.01 ve *** p < 0.001) ile hesaplanmıştır. İstila testi için önemi tek yönlü ANOVA tarafından hesaplandı ve ardından Tukey'in post hoc testi yapıldı. Hata çubukları üç bağımsız denemenin göreli standart hatasını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu şekilde, mikroglia kaynaklı EVs nörotrofik fonksiyonları PC-12 hücre hattı ve sıçan primer nöronlar üzerinde çalışıldı. Sonuçlar nötrit büyüme üzerinde olumlu bir etki gösterdi(Şekil 5A,B). EVs varlığı yaklaşık 6 ve 1.5 uzunluğu ve / veya pc-12 ve primer nöronlar sayısı bir kontrol durumuna göre niurite ağ kat arttı. Başka bir bağlamda, makrofaj kaynaklı EVs'in beyin tümörü invazyonu üzerindeki etkilerini de inceledik (Şekil 5C,D). Kollajen matrisine gömülü 3Boyutlu tümör spheroidleri kullanılarak değerlendirildi. C6 sıçan glioma hücreleri ile oluşturulan spheroidler sıçan makrofajlar kültür ortamı saflaştırılmış (veya içermeyen) eVs içeren bir kollajen matris 6 gün boyunca kültüredildi. Kollajen matris tümör hücrelerinin istila ve spheroid dışına yayılabilir bir yapı sağlar. Makrofaj kaynaklı EVs glioma spheroids büyüme ve invazyonu bozulmuştur. 6 günlük bir kültürden sonra EV ile tedavi edilen küresel lerde kontrole göre %50 oranında invazyon azalışı gözlendi. Bu sonuç, makrofajların glioma büyümesini etkileyen anti-tümöral ve/veya anti-invaziv faktörlere sahip EV'ler üretebildiği ortaya çıktı.

Supplementary Figure S1
Ek Şekil S1: Batı lekeleme deneyi için kullanılan membran görüntüleri. (A) Şekil 2E'deki batı lekesinin orijinal görüntüsü (HSP90 EV işaretçisi karşı). (B) 1F-EV-, 2F-EV+ ve 3F-EV- örneklerinden protein ekstrelerinin doğru yüklendiğini gösteren aynı zarın ponceau boyama görüntüsü. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Merkezi sinir sistemi (CNS) hücre-hücre iletişimi homeostaz için gerekli normal nöronal fonksiyonları düzenleyen karmaşık birdokudur 30. EVs şimdi yaygın olarak incelenmiş ve hücre-hücre iletişimi için önemli moleküler kargolar olarak tanımlanan31. Özellikle alıcı hücrelere aracıbir kokteyl teslim ederek sağlıklı ve patolojik koşullarda işlevlerini etkileyen32. Son çalışmalar EVs CNS önemli bir rol oynadığını göstermektedir24,33,34 ve özellikle bu beyin bağışıklık hücrelerinden35,36. Pro- ve anti-inflamatuar bağışıklık yanıtları arasındaki denge çok önemlidir ve sinaptik gelişim ve yaşam boyunca nöronal faaliyetleri sırasında beyin bütünlüğünü korumaya olanak sağlar. Bu çalışmada iki farklı immün yanıt durumu tartışılmıştır: (i) mikroglia ve nöronlar arasındaki ilişki ve (ii) infiltrasyon makrofajlar ve glioma hücreleri arasındaki ilişki. İlk olarak, mikroglia nöronal faaliyetleri sağlamak için mikroçevre değişikliklerinin yönetiminde önemli bir bağışıklık rol oynamaktadır beyin dokusunda yerleşik makrofajlar vardır. Ama aşırı pro-inflamatuar mekanizmalar aşırı aktive mikroglia tarafından desteklenebilir ve nörodejeneratif bozukluklara yolaçabilir 37,38. Buna karşılık, yüksek dereceli gliomlar anti-inflamatuar profiller gerektirir ve tümör ilişkili makrofajlar içerir (TAM) tümör bölgesinde işe. Kemik iliği kaynaklı makrofajlar (MBM' ler) glioma hücreleri ile yakın ilişki içinde bu TAM'ların büyük bir popülasyonunu temsil eder. Tümörün etkisi altında, KBM'ler in vivo anti-inflamatuar ve pro-tümöral profiller sergiler39. Bu BmDM'lerin in vitro tümöral hücre invazyonunu nasıl kontrol edebildiği bu raporda çok önemli bir sorudur. Bu nedenle glioma spheroid invazyon istifinde makrofaj türetilmiş EV'ler tek başına kullanılmıştır. Birlikte kültür, glioma hücreleri anti-inflamatuar profilleri ile diğer EV popülasyonları üretmek için makrofajlar etkilemiş olurdu. Bağışıklık EVs doğrudan kullanımı anti-tümöral ajan olarak çok daha iyi olabilir. Sonuç olarak, bağışıklık hücreleri inflamatuar denge güçlü dış sinyaller40,41etkilenir belirli mikroortamlarda hücre-hücre iletişimi korumak . EV aracılı bağışıklık yanıtlarının anlaşılması birçok bozukluğun patogenezini sınırlamak için büyük bir meydan okumayı temsil etmektedir. Biyolojik olarak aktif EV içeriğinin belirlenmesi disregulated inflamatuar süreçleri anlamak ve yeni tedavi stratejileri önermek için bir anahtardır42,43.

Bu çalışmada hücre enkazını, apoptotik cisimleri ve çözünür molekülleri ortadan kaldırmak için ilk adım olarak diferansiyel ultrasantrifüj sürecinden oluşan bir metodoloji yi, eVs'i moleküler agregalardan izole etmek için boyut dışlama kromatografisi ile birleştirdik. EV popülasyonları biyolojik tahlillerde değerlendirildiğinde, EV içeriğini diğer birlikte izole edilmiş malzemelerden ayırt etmek çok önemlidir. Bu nedenle EV-'i EV ile ilişkili olmayan bileşiklerden ayırmak için izolasyonu geliştirdik. SEC prosedürüne gönderilen kontrol örneklerine standart proteinler ekleyerek, bunların elüsyon fraksiyonlarını MALDI-TOF ile lokalize edebildik. Standartlar serbest moleküller olduğundan, ev olmayan malzemelerle ilgili numuneyle ilişkili moleküler agregalarla küresel olarak bir araya gelebiliyorlar. Böylece, deneysel örneklerden EV fraksiyonları güvenilir bir izolasyon prosedürü nde doğrulanmış oldu. Buna ek olarak, çift proteomik analiz stratejisi geliştirdik. Bir EV marker ön algılama olarak batı blotting tarafından anti-HSP90 antikor kullanımı dışında, ev ilişkili protein imzaları hedefsiz bir algılama ile doğru EV fraksiyonu doğrulamak için karar verdi. Nitekim, mevcut yaklaşım kasıtlı olarak bazı antikorların yeterli özgüllüğü ve duyarlılığı nedeniyle bilinen birden fazla EV belirteçlerinin saptanması üzerinde durulmiyordu. Ev alt popülasyonlarının yüzeyindeki bazı EV belirteçlerinin değişkenliği ve bolluğu izolasyon işlemlerinde hala tartışmalıdır. Ayrıca, bir antikor tabanlı metodoloji ticari antikor eksikliği nedeniyle organizmaların yüksek sayıda bir sınır temsil edebilir EV çalışmaları artık biyoloji de sıcak bir konu iken. Bu hedefsiz analiz, ev belirteçleri (Exocarta veritabanından en iyi 100 EV belirtecindeki 86 protein) olarak tanımlanan daha yüksek sayıda molekülün tanımlanmasına olanak sağladı. Son olarak, bu yaklaşım, tespit edilen proteinlerin bilinen EV belirteçlerine önemli homologlar sunabilmesi koşuluyla, kötü tanımlanmış organizmalardan EV izolasyonuna doğrulanması için gerçekten yararlı olabilir. Son zamanlarda açıklandığı gibi, büyük ölçekli bir proteomik analiz sadece birkaç rasgele işaretleri kullanarak bir alternatif olabilir43. Bu EV + fraksiyonları ayrımcılığı ve biyolojik tahliller kullanmadan önce aktif içeriğinin belirlenmesi ni geliştirecek.

Gerçekten de, EV içeriğinin karakterizasyonu biyolojik tahlillerde gözlenen etkilerle ilişkilendirmek gereklidir. Gerçekten de, alıcı hücrelere EVs biyolojik etkisi veziküler aracılar veya efektörler dahil olmak göstermektedir. Yine, aynı hedefsiz analiz biyolojik olarak aktif moleküllerin tanımlanmasını sağlar. Bu analizde olası bir optimizasyon, tespit edilmesi mümkün olan molekül türleri ile ilgilidir. Stratejimiz protein izlerinin büyük ölçekli analizine dayanıyordu ve immün yanıt ve nöron sağkalım ile ilişkili tahmine dayalı biyolojik yollara yol açtı. Örneğin lipidler, mRNA ve mikroRNA'lar dahil olmak üzere diğer molekül ailelerini göz önünde bulundurmak esastır. Mevcut çalışmalarımız, ev bağımlı iletişim hakkında küresel bir bilgi sahibi olmak için bu ek tanımlamaları protein imzalarına bağlar.

Birçok terapötik yaklaşımlar önümüzdeki yıllarda öngörülmektedir. EVs kolayca kan beyin bariyerini geçmek ve patolojik dokulara ulaşmak mümkün olduğu göz önüne alındığında, bu moleküler kargolar farklı şekillerde kullanılabilir. Bu çalışma EV yüzey molekülleri vurgulamak olmasa da, hedef hücreler ve dokulara yönelik adresleme sürecini daha iyi anlamak için bunların belirlenmesi hala gereklidir. Metodolojimizdeki proteomik analiz bu verilere erişim sağlar. Aksi takdirde, bu raporda, biz yararlı kokteyller olarak EVs in vitro üretim sundu. Bağışıklık hücrelerini önceden harekete geçirmek veya harekete geçirmek için en iyi koşulları optimize etmedik. Bu nokta çok önemlidir, çünkü dokularda mikroçevre bağışıklık hücreleri üzerinde doğrudan bir etkiye sahiptir ve sonuçta ev'lerinin biyogenezinin şekillenmesine katkıda bulunur. Örneğin glioblastoma durumunda, bu kanser hücrelerinin kendi EVs üretmek bulundu, böylece anti-inflamatuar profiller ve lokal immünsupresyon doğru komşu TAMs yönlendirmek için katkıda44,45. Bu nedenle glioma ortamındamakrofaj kaynaklı EV'ler tek bir makrofaj kültüründe üretilenlerden farklıdır. Bu nedenle, glioma-glioma co-kültürünün tümör büyümesi üzerinde hiçbir kontrolü olmadığı için glioma küresel oid invazyonunu kontrol etmek için, tek bir makrofaj kültüründen ayrı olarak üretilen makrofaj kaynaklı EV'leri doğrudan kullandık. Daha ileri terapötik stratejiler, in vitro olarak üretilen pro-inflamatuar ve anti-tümöral EV'ler kullanılarak in vivo immünsupresyonu önleyebilir. Benzer bir strateji nörojeneratif hastalıklar bağlamında mikroglia türetilen EVs kullanımı yoluyla düzgün nöroprotektif ve anti-inflamatuar yanıt nöronal sağkalım lehine üretmek için uyarılmış kullanılabilir. Sonuç olarak, bağışıklık hücreleri ve in vivo mikroçevre arasındaki EV aracılı iletişim çalışmaları patogenezin daha iyi anlaşılmasını ve yenilikçi tedavi yaklaşımlarının tasarlanmasında anahtar dır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Sunulan çalışma Ministère de L'Education Nationale, de L'Enseignement Supérieur et de la Recherche ve INSERM tarafından desteklendi. BiCeL-Campus Scientific City Facility'i enstrümanlara ve teknik tavsiyelere erişim için takdir ediyoruz. Jean-Pascal Gimeno, Soulaimane Aboulouard ve Isabelle Fournier'i Kitle spektrometresi yardımı için minnetle kabul ediyoruz. Tanina Arab, Christelle van Camp, Francoise le Marrec-Croq, Jacopo Vizioli ve Pierre-Eric Sautière'i bilimsel ve teknik gelişmelere olan güçlü katkılarından dolayı minnetle kabul ediyoruz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels Bio-rad 4561045EDU  
Acetonitrile Fisher Chemicals A955-1  
Amicon 50 kDa centrifugal filter Merck UFC505024  
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich 9830  
HSP90 α/β antibody (RRID: AB_675659) Santa-cruz sc-13119  
B27 Plus supplement Gibco A3582801  
BenchMixer V2 Vortex Mixer Benchmark Scientific BV1003  
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bradford) Bio-Rad 5000006  
C18 ZipTips Merck Millipore ZTC18S096  
C6 rat glioma cell ATCC ATCC CCL-107  
Canonical tubes Sarstedt 62.554.002  
Centrifuge Eppendorf 5804000010  
CO2 Incubator ThermoFisher    
Confocal microscope LSM880 Carl Zeiss LSM880  
Cover glass Marienfeld 111580  
Culture Dish (60 mm) Sarstedt 82.1473  
Dithiothreitol Sigma-Aldrich 43819  
DMEM Gibco 41966029  
EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph ThermoFisher    
Electron microscope JEM-2100 JEOL    
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid Sigma-Aldrich 03777-10G  
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich ED-100G  
Exo-FBS Ozyme EXO-FBS-50A-1 Exosome depleted FBS
ExoCarta database (top 100 proteins of Evs)     http://www.exocarta.org/
Fetal Bovine Serum Gibco 16140071  
Fetal Horse Serum Biowest S0960-500  
Filtropur S 0.2 Sarstedt 83.1826.001  
Fisherbrand Q500 Sonicator with Probe Fisherbrand 12893543  
FlexAnalysis Brucker    
Fluorescence mounting medium Agilent S3023  
Formic Acid Sigma-Aldrich 695076  
Formvar-carbon coated copper grids Agar scientific Ltd AGS162-3  
Glucose Sigma-Aldrich G8769  
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich 340855  
Hoechst 33342 Euromedex 17535-AAT  
Idoacetamide Sigma-Aldrich I1149  
InstantBlue Coomassie Protein Stain Expedeon ISB1L  
Invert light microscope CKX53 Olympus    
L-glutamine Gibco 25030-024  
LabTek II 8 wells  Nunc 154534  
Laemmli 2x Bio-Rad 1610737  
Laminin Corning 354232  
MaxQuant software (proteins identification software)     https://maxquant.net/maxquant/
MBT Polish stell Brucker 8268711  
MEM 10x Gibco 21090-022  
Methylcellulose Sigma-Aldrich M6385-100G  
MiliQ water Merck Millipore    
Milk Regilait REGILAIT300  
Mini PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell Bio-Rad 1658000FC  
MonoP FPLC column GE Healthcare   no longer available
Nanosight NS300 Malvern Panalytical NS300  
NanoSight NTA software v3.2 Malvern Panalytical    
NanoSight syringe pump Malvern Panalytical    
Neurobasal Gibco 21103-049  
Nitrocellulose membrane GE Healthcare 10600007  
Nonidet P-40 Fluka 56741  
Nunc multidish 24 wells ThermoFisher 82.1473  
Paraformaldehyde Electro microscopy Science 15713  
PC-12 cell line ATCC ATCC CRL-1721  
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122  
Peptide calibration mix LaserBio Labs C101  
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 115-035-003  
Perseus software (Processing of identified proteins)     https://maxquant.net/perseus/
Phalloidin-tetramethylrhodamine conjugate Santa-cruz sc-362065  
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich 78830  
Phosphate Buffer Saline Invitrogen 14190094 no calcium, no magnesium
pluriStrainer M/ 60 µm pluriSelect 43-50060  
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407  
Polycarbonate centrifuge tubes Beckman Coulter 355651  
Protease Inhibitor Sigma-Aldrich S8830-20TAB  
PureCol Cell Systems 5005  
Q-Exactive mass spectrometer ThermoFisher    
rapifleX mass spectrometer Brucker    
Rat cortical neurons Cell Applications R882N-20 Cell origin : Derived from cerebral cortices of day 18 embryonic Sprague Dawley rat brains
Rat Macrophage & Microglia Culture Medium Cell Applications R620K-100 Cell orgin : Normal healthy Rat bone marrow
Rat primary macrophages Cell Applications R8818-10a  
Rat primary microglia Lonza RG535  
Sepharose CL-2B GE Healthcare 17014001  
Sequencing Grade Modified Trypsin Promega V5111  
Slide Dustsher 100204  
Sodium Chloride Scharlau SO0227  
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich L3771  
Sodium Fluoride Sigma-Aldrich S7920-100G  
Sodium hydroxide Scharlab SO0420005P  
Sodium pyrophosphate Sigma-Aldrich S6422-100G  
SpeedVac Vacuum Concentrator ThermoFisher    
String software (functional protein association networks)     https://string-db.org/
SuperSignal West Dura extended Duration Substrate ThermoFisher 34075  
Syringe 1.0 mL Terumo 8SS01H1  
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer cell Bio-Rad 1703940  
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508  
Tris Interchim UP031657  
Tris-Glycine Euromedex EU0550  
Tween 20 Sigma-Aldrich P2287  
Ultracentrifuge Beckman Coulter A95765  
Ultracentrifuge Rotor 70.1 Ti Beckman Coulter 342184  
Uranyl acetate Agar Scientific Ltd AGR1260A  
Whatman filter paper Sigma-Aldrich WHA10347510  
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Sigma-Aldrich C2020-25G  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thion, M. S., Ginhoux, F., Garel, S. Microglia and early brain development: An intimate journey. Science. 362 (6411), 185-189 (2018).
  2. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), New York, N.Y. 841-845 (2010).
  3. Sankowski, R., Mader, S., Valdes-Ferrer, S. I. Systemic Inflammation and the Brain: Novel Roles of Genetic, Molecular, and Environmental Cues as Drivers of Neurodegeneration. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
  4. Chakrabarty, S., Kabekkodu, S. P., Singh, R. P., Thangaraj, K., Singh, K. K., Satyamoorthy, K. Microglia in health and disease. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 43 (3), 25-29 (2015).
  5. Sankowski, R., Mader, S., Valdés-Ferrer, S. I. Systemic inflammation and the brain: novel roles of genetic, molecular, and environmental cues as drivers of neurodegeneration. Frontiers in cellular neuroscience. 9, 28 (2015).
  6. Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
  7. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  8. Domingues, P., et al. Tumor infiltrating immune cells in gliomas and meningiomas. Brain, Behavior, and Immunity. 53, 1-15 (2016).
  9. Hambardzumyan, D., Gutmann, D. H., Kettenmann, H. The role of microglia and macrophages in glioma maintenance and progression. Nature Neuroscience. 19 (1), 20-27 (2016).
  10. Thion, M. S., et al. Microbiome Influences Prenatal and Adult Microglia in a Sex-Specific Manner. Cell. 172 (3), 500-516 (2018).
  11. Hammond, T. R., et al. Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes. Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).
  12. Rajendran, L., et al. Emerging Roles of Extracellular Vesicles in the Nervous System. The Journal of Neuroscience. 34 (46), 15482-15489 (2014).
  13. Gupta, A., Pulliam, L. Exosomes as mediators of neuroinflammation. Journal of Neuroinflammation. 11 (1), 68 (2014).
  14. van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
  15. Budnik, V., Ruiz-cañada, C., Wendler, F. Extracellular vesicles round off communication in the nervous system. Nature Reviews Neurosciences. 17, 160-172 (2016).
  16. Raffo-Romero, A., et al. Medicinal Leech CNS as a Model for Exosome Studies in the Crosstalk between Microglia and Neurons. International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), 4124 (2018).
  17. Zhou, Y., et al. Exosomes Transfer Among Different Species Cells and Mediating miRNAs Delivery. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (12), 4267-4274 (2017).
  18. Arab, T., et al. Proteomic characterisation of leech microglia extracellular vesicles (EVs): comparison between differential ultracentrifugation and OptiprepTM density gradient isolation. Journal of extracellular vesicles. 8 (1), 1603048 (2019).
  19. Murgoci, A. -N., et al. Brain-Cortex Microglia-Derived Exosomes: Nanoparticles for Glioma Therapy. ChemPhysChem. 19 (10), 1205-1214 (2018).
  20. Glebov, K., et al. Serotonin stimulates secretion of exosomes from microglia cells. Glia. 63 (4), 626-634 (2015).
  21. Hooper, C., et al. Wnt3a induces exosome secretion from primary cultured rat microglia. BMC Neuroscience. 13 (1), 144 (2012).
  22. Gabrielli, M., et al. Active endocannabinoids are secreted on extracellular membrane vesicles. EMBO reports. 16 (2), 213-220 (2015).
  23. Antonucci, F., et al. Microvesicles released from microglia stimulate synaptic activity via enhanced sphingolipid metabolism. The EMBO Journal. 31 (5), 1231-1240 (2012).
  24. Frühbeis, C., Fröhlich, D., Kuo, W. P., Krämer-Albers, E. -M. Extracellular vesicles as mediators of neuron-glia communication. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 182 (2013).
  25. Prada, I., et al. Glia-to-neuron transfer of miRNAs via extracellular vesicles: a new mechanism underlying inflammation-induced synaptic alterations. Acta neuropathologica. 135 (4), 529-550 (2018).
  26. Takenouchi, T., et al. Extracellular ATP induces unconventional release of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from microglial cells. Immunology Letters. 167 (2), 116-124 (2015).
  27. Yang, Y., Boza-Serrano, A., Dunning, C. J. R., Clausen, B. H., Lambertsen, K. L., Deierborg, T. Inflammation leads to distinct populations of extracellular vesicles from microglia. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 168 (2018).
  28. Duhamel, M., et al. Paclitaxel Treatment and Proprotein Convertase 1/3 (PC1/3) Knockdown in Macrophages is a Promising Antiglioma Strategy as Revealed by Proteomics and Cytotoxicity Studies. Molecular & Cellular Proteomics. 17 (6), 1126-1143 (2018).
  29. Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: A novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. Journal of Neuroscience Methods. 168 (1), 134-139 (2008).
  30. Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B. Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).
  31. Rashed, M. H., et al. Exosomes: From Garbage Bins to Promising Therapeutic Targets. Int. J. Mol. Sci. Int. J. Mol. Sci. 18 (18), (2017).
  32. Yuana, Y., Sturk, A., Nieuwland, R. Extracellular vesicles in physiological and pathological conditions. Blood Reviews. 27 (1), 31-39 (2013).
  33. Frohlich, D., et al. Multifaceted effects of oligodendroglial exosomes on neurons: impact on neuronal firing rate, signal transduction and gene regulation. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1652), (2014).
  34. Krämer-Albers, E. -M., et al. Oligodendrocytes secrete exosomes containing major myelin and stress-protective proteins: Trophic support for axons. Proteomics. Clinical applications. 1 (11), 1446-1461 (2007).
  35. Verderio, C., et al. Myeloid microvesicles are a marker and therapeutic target for neuroinflammation. Annals of Neurology. 72 (4), 610-624 (2012).
  36. Prada, I., Furlan, R., Matteoli, M., Verderio, C. Classical and Unconventional Pathways of Vesicular Release in Microglia. GLIA. 61, 1003-1017 (2013).
  37. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the CNS in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  38. Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. , (2017).
  39. Kennedy, B. C., et al. Tumor-Associated Macrophages in Glioma: Friend or Foe. Journal of Oncology. 2013, 1-11 (2013).
  40. Potolicchio, I., Carven, G. J., Xu, X., Stipp, C., Riese, R. J., Stern, L. J., Santambroggio, L. Proteomic Analysis of Microglia-Derived Exosomes: Metabolic Role of the Aminopeptidase CD13 in Neuropeptide Catabolism1. The Journal of Immunology. 175, 2237-2243 (2005).
  41. Turola, E., Furlan, R., Bianco, F., Matteoli, M., Verderio, C. Microglial microvesicle secretion and intercellular signaling. Frontiers in Physiology. 3, (2012).
  42. Cocucci, E., Meldolesi, J. Ectosomes and exosomes : shedding the confusion between extracellular vesicles. Trends in Cell Biology. 25 (6), 364-372 (2015).
  43. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  44. de Vrij, J., et al. Glioblastoma-derived extracellular vesicles modify the phenotype of monocytic cells. International Journal of Cancer. 137 (7), 1630-1642 (2015).
  45. van der Vos, K. E., et al. Directly visualized glioblastoma-derived extracellular vesicles transfer RNA to microglia/macrophages in the brain. Neuro-Oncology. 18 (1), 58-69 (2016).

Tags

Nörobilim Sayı 160 İmmün fonksiyonlar mikroglia makrofajlar nöronlar glioma hücreleri hücre dışı veziküller
İmmün Hücre Kaynaklı Hücre Dışı Veziküllerin Karakterizasyonu ve Hücre Çevresi Üzerindeki Fonksiyonel Etkisinin İncelenmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lemaire, Q., Duhamel, M.,… More

Lemaire, Q., Duhamel, M., Raffo-Romero, A., Salzet, M., Lefebvre, C. Characterization of Immune Cell-derived Extracellular Vesicles and Studying Functional Impact on Cell Environment. J. Vis. Exp. (160), e60118, doi:10.3791/60118 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter