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Neuroscience

Caracterização de vesículas extracelulares derivadas de células imunes e estudo do impacto funcional no ambiente celular

Published: June 2, 2020 doi: 10.3791/60118
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1U1192-Laboratoire Protéomique, Réponse Inflammatoire et Spectrométrie de Masse (PRISM), Univ. Lille, INSERM

Summary

O presente relatório destaca os requisitos cronológicos para o isolamento da vesícula extracelular (EV) de microglia ou macrófagos sanguíneos. Os EVs derivados de microglia foram avaliados como reguladores do crescimento do neurite, enquanto os EVs derivados do macrófago sanguíneo foram estudados no controle da invasão celular C6 glioma em ensaios in vitro. O objetivo é entender melhor essas funções de EV como mediadores imunológicos em microambientes específicos.

Abstract

O estado neuroinflamatório do sistema nervoso central (SNC) desempenha um papel fundamental nas condições fisiológicas e patológicas. Microglia, as células imunes residentes no cérebro, e às vezes os macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs), regulam o perfil inflamatório de seu microambiente no CNS. Aceita-se agora que as populações de vesícula extracelular (EV) de células imunes agem como mediadores imunológicos. Assim, sua coleta e isolamento são importantes para identificar seus conteúdos, mas também avaliar seus efeitos biológicos sobre as células receptoras. Os dados atuais destacam os requisitos cronológicos para o isolamento de EV de células microglia ou macrófagos sanguíneos, incluindo as etapas de ultracentrugação e exclusão de tamanho (SEC). Uma análise proteômica não direcionada permitiu a validação de assinaturas proteicas como marcadores EV e caracterizou o conteúdo de EV biologicamente ativo. Os EVs derivados de microglia também foram usados funcionalmente na cultura primária dos neurônios para avaliar sua importância como mediadores imunológicos no crescimento de neurite. Os resultados mostraram que os EVs derivados de microglia contribuem para facilitar o crescimento do neurite in vitro. Em paralelo, os EVs derivados do macrófago sanguíneo foram usados funcionalmente como mediadores imunológicos em culturas eferóides de células glioma C6, os resultados mostrando que esses EVs controlam a invasão celular glioma in vitro. Este relatório destaca a possibilidade de avaliar as funções de células imunes mediadas pelo EV, mas também entender as bases moleculares de tal comunicação. Essa decifração poderia promover o uso de vesículas naturais e/ou a preparação in vitro de vesículas terapêuticas, a fim de imitar propriedades imunes no microambiente das patologias do SNC.

Introduction

Muitas neuropatologias estão relacionadas ao estado neuro-inflamatório, que é um mecanismo complexo que é cada vez mais considerado, mas ainda mal compreendido porque os processos imunológicos são diversos e dependem do ambiente celular. De fato, os transtornos do SNC não envolvem sistematicamente os mesmos sinais de ativação e populações de células imunes e, portanto, as respostas pró ou anti-inflamatórias são difíceis de avaliar como causas ou consequências das patologias. Os macrófagos residentes no cérebro chamados "microglia" parecem estar na interface entre o sistema nervoso e imunológico1. A microglia tem origem mielóide e é derivada do saco de gema durante hematopeiese primitiva para colonizar o cérebro, enquanto macrófagos periféricos são derivados do fígado fetal durante hematopoiese definitiva para se tornarem macrófagos periféricos2. As células microglia se comunicam com neurônios e células gliais derivadas de neurônios, como astrócitos e oligodendrócitos3. Vários estudos recentes demonstraram que a microglia está envolvida na plasticidade neuronal durante o desenvolvimento do CNS e na homeostase do tecido adulto, e também no estado inflamatório associado às doenças neurodegenerativas4,,5. Caso contrário, a integridade da barreira cerebral sanguínea pode ser comprometida em outras patologias do CNS. As respostas imunes, especialmente no câncer multiforme glioblastoma, não são suportadas apenas por células microglia, pois a barreira cerebral sanguínea é reorganizada através de processos angiogênicos e a presença de vasos linfáticos6,,7. Portanto, uma grande infiltração de macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) ocorre no tumor cerebral ao longo de mecanismos de angiogênese dependentes do tumor8. As células cancerígenas exercem uma influência significativa sobre os BMDMs infiltrados que levam a propriedades imunossupressores e crescimento do tumor9. Assim, a comunicação entre as células imunes e seu microambiente cerebral é difícil de entender, pois a origem celular e os sinais de ativação são diversos10,11. É, portanto, interessante apreender as funções de assinaturas moleculares associadas às células imunes em condições fisiológicas. Nesse sentido, a comunicação celular-celular entre células imunes e microambiente celular pode ser estudada através da liberação de vesículas extracelulares (EVs).

Os EVs estão sendo estudados cada vez mais na regulação das funções imunológicas em condições saudáveis e patológicas12,13. Duas populações, exosóis e microvesículos, podem ser levadas em conta. Eles apresentam diferentes biogêneses e faixas de tamanho. Os exossomos são vesículas de ~30-150 nm de diâmetro e são gerados a partir do sistema endosomal e secretados durante a fusão de corpos multivesiculares (MVBs) com a membrana plasmática. Os microvesículos têm cerca de 100-1.000 nm de diâmetro e são gerados por um brotamento externo da membrana plasmáticacelular 14. Como a discriminação exósia versus microvesícula ainda é difícil de perceber de acordo com o tamanho e os padrões moleculares, usaremos apenas o termo EVs no presente relatório. A comunicação associada ao EV no CNS representa um mecanismo ancestral, uma vez que estudos mostraram seu envolvimento em espécies invertebradas, incluindo nematoides, insetos ou annelids15,16. Além disso, os resultados que mostram que os EVs podem se comunicar com células de diferentes espécies demonstram que esse mecanismo é um sistema de bloqueio de chaves, baseado primeiro no reconhecimento de moléculas superficiais entre vesículas e células receptoras e, em seguida, permitindo a absorção de mediadores16,,17. De fato, os EVs contêm muitas moléculas como proteínas (por exemplo, enzimas, transdução de sinais, fator biogênese), lipídios (por exemplo, ceramida, colesterol) ou ácidos nucleicos (por exemplo, DNA, mRNA ou miRNAs) agindo como reguladores diretos ou indiretos das atividades celulares receptoras14. É por isso que estudos metodológicos também foram realizados em células imunes para isolar EVs e caracterizar plenamente suas assinaturas proteicas18,19.

Os primeiros estudos demonstraram a liberação de exosóis da microglia primária cultivada como um mecanismo indutor após uma ativação Wnt3a ou dependente de serotonina20,21. Funcionalmente no CNS, os EVs derivados de microglia regulam a liberação de vesícula sináptica por terminais pré-sinápticos em neurônios que contribuem para o controle da excitabilidade neuronal22,23. EVs derivados de microglia também poderiam propagar a resposta inflamatória mediada por citocinas em grandes regiões cerebrais24,25. É importante ressaltar que os diversos ligantes para a família receptora de pedágio podem ativar produções específicas de EVs na microglia26. Por exemplo, estudos in vitro mostram que as linhas celulares Microglia BV2 ativadas pelo LPS produzem conteúdoes diferenciados de EV, incluindo citocinas pró-inflamatórias27. Portanto, a diversidade funcional de subpopulações de células imunes no CNS, microglia e BMDMs infiltrados, pode ser avaliada através de suas próprias populações de EV, incluindo o impacto do EV nas células receptoras e a identificação de conteúdos de EV.

Descrevemos anteriormente métodos para avaliar as propriedades funcionais dos EVs derivados de microglia e BMDM após seu isolamento16,19. No presente relatório, propomos avaliar independentemente o efeito dos EVs derivados de microglia no crescimento do neurite e o efeito dos EVs derivados do macrófago no controle de agregados celulares glioma. Este estudo também propõe uma ampla análise proteômica das frações de EV, a fim de validar o procedimento de isolamento do EV, bem como identificar as assinaturas proteicas biologicamente ativas. Os efeitos benéficos e a decifração molecular do conteúdo de EV poderiam ajudar sua possível manipulação e uso como agentes terapêuticos em distúrbios cerebrais.

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Protocol

1. Cultura Primária de Microglia/Macrófagos

  1. Cultura primária da microglia
    1. Microglia primária de rato comercial de cultura (2 x 106 células) (ver a Tabela de Materiais) no meio de Águia modificada (DMEM) modificado de Dulbecco, complementado com soro 10% livre de exosome, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL streptomicina e 9,0 g/L de glicose a 37 °C e 5% DE CO2.
    2. Colete o meio condicionado após uma cultura de 48h e prossiga para o isolamento dos EVs.
  2. Cultura primária dos macrófagos
    1. Macrófagos primários de ratos comerciais de cultura (1 x 106 células) no meio fornecido pelo fabricante (ver a Tabela de Materiais) a 37 °C e 5% de CO2,com soro exossomo livre.
    2. Colete o meio condicionado após uma cultura de 24h e prossiga para o isolamento dos EVs.

2. Isolamento de EVs

  1. Pré-isolamento de EVs de meios condicionados
    1. Transfira o meio de cultura condicionada de culturas microglia ou macrófago (passos 1.1.2 ou 1.2.2) para um tubo cônico.
    2. Centrifugar a 1.200 x g por 10 min a temperatura ambiente (RT) para pelotar as células.
    3. Transfira o supernatante para um novo tubo cônico. Centrifugar a 1.200 x g por 20 min no RT para eliminar corpos apoptóticos.
    4. Transfira o supernatante para um tubo de policarbonato de 10,4 mL e transfira o tubo para um rotor Ti de 70,1. Ultracentrifuuge a 100.000 x g por 90 min a 4 °C para pelotar os EVs.
    5. Descarte o supernascimento e resuspenque a pelota contendo EVs em 200 μL de 0,20 μm de tampão de fosfato filtrado (PBS).
  2. Isolamento de EVs
    1. Elaboração da coluna de cromatografia de exclusão de tamanho caseiro (SEC)
      1. Esvazie uma coluna de cromatografia de vidro (comprimento: 26 cm; diâmetro: 0,6 cm) (ver a Tabela dos Materiais),lave e esterilize-a.
      2. Coloque um filtro de 60 μm na parte inferior da coluna.
      3. Empilhe a coluna com matriz de base de filtragem de gel de agarose cruzada para criar uma fase estacionária de 0,6 cm de diâmetro e uma altura de 20 cm.
      4. Enxágüe a fase com 50 mL de PBS filtrado de 0,20 μm. Armazene a 4 °C para ser usado mais tarde, se necessário.
    2. Coloque a pelota EV resuspended em cima da fase estacionária da coluna SEC.
    3. Colete 20 frações sequenciais de 250 μL enquanto continua adicionando PBS filtrado de 0,20 μm na parte superior da fase estacionária para evitar a secagem da coluna. Armazene as frações a -20 °C, se necessário.
      NOTA: Um armazenamento maior do que uma semana pode ser realizado a -80 °C para manter a integridade do EV para análise molecular.
  3. A análise de espectrometria de massa da ionização de massa de desorpção a laser assistida por matriz (MALDI) das frações SEC
    1. Prossiga para o isolamento EV conforme descrito na seção 2.2.
    2. Resuspene a pelota EV com 200 μL de solução de mistura de calibração de peptídeo (ver a Tabela de Materiais).
    3. Prossiga para a coleta de EV conforme descrito nas seções 2.2.1 a 2.2.3.
    4. Seque completamente a fração com um concentrador de vácuo.
    5. Reconstituir as frações com 10 μL de ácido trifluoroacético (TFA).
    6. Misture 1 μL de fração reconstituída com 1 μL de matriz de ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico (HCCA) em uma placa de aço polida MALDI.
    7. Analise todas as frações com um espectrômetro de massa MALDI.
    8. Analisar espectros gerados com software dedicado (ver Tabela de Materiais).

3. Caracterização de EVs

  1. Análise de rastreamento de nanopartículas (NTA)
    NOTA:     A análise NTA é realizada com um instrumento de análise de rastreamento de nanopartículas (ver a Tabela de Materiais) e uma bomba de seringa automatizada.
    1. Faça uma diluição (intervalo de 1:50 a 1:500) de cada fração SEC a partir da etapa 2.2.3 com PBS filtrado de 0,20 μm.
    2. Vórtice a solução para eliminar agregados EV.
    3. Coloque a solução diluída em uma seringa de 1 mL e coloque-a na bomba de seringa automatizada.
    4. Ajuste a configuração da câmera para o nível de ganho de tela (3) e o nível da câmera (13).
    5. Clique em Executar e inicie o script a seguir.
      1. Carregar a amostra na câmara de análise (taxa de infusão: 1.000 para 15 s).
      2. Diminuir e estabilizar o fluxo de velocidade para gravação de vídeo (taxa de infusão: 25 para 15 s). Capture três vídeos consecutivos de 60 s do fluxo de partículas.
      3. Ajuste o nível da câmera (13) e o limiar de detecção (3) antes da análise dos vídeos. Clique em Configurações| Ok para iniciar a análise e clique em Exportar quando a análise for feita.
    6. Entre cada análise de fração, lave com 1 mL de PBS filtrado de 0,20 μm.
  2. Análise de microscopia eletrônica (EM)
    1. Isole os EVs descritos na seção 2.
      NOTA: Condições estéreis não são necessárias.
    2. Repita a seção 3.1 para quantificar os EVs.
      NOTA: Apenas frações positivas serão usadas para análise EM.
    3. Use um filtro centrífugo de 50 kDa (ver Tabela de Materiais) para concentrar frações SEC contendo EV.
    4. Resuspend EVs concentrados em 30 μL de 2% paraformaldeído (PFA).
    5. Carregue 10 μL da amostra em uma rede de cobre revestida de carbono.
    6. Incubar por 20 minutos em um ambiente molhado.
    7. Repita as etapas 3.2.5 e 3.2.6 para uma boa absorção da amostra na grade.
    8. Transfira a rede para uma queda de 1% de glutaraldeído na PBS por 5 min na RT.
    9. Lave a amostra com água ultrauso várias vezes.
    10. Contraste a amostra por 10 minutos no gelo com uma mistura de acetato de 4% de urilo e 2% de metilcelulose (1:9, v/v). Remova o excesso da mistura usando um papel filtro.
    11. Seque a amostra e observe-a sob um microscópio eletrônico de transmissão a 200 kV (ver a Tabela de Materiais).
  3. Análise de manchas ocidentais
    1. Extração de proteínas
      1. Repita as etapas 3.2.1 a 3.2.3 para isolar e concentrar EVs.
      2. Misture 50 μL de tampão RIPA (cloreto de sódio de 150 mM [NaCl], 50 mM Tris, 5 mM Ethylene glycol-bis (2-aminoetil)-N,N′,N′,N′-tetraacetic acid [EGTA], 2 mM Ethylenediamina-tetraacético ácido [EDTA], Flúor de sódio de 100 mM [NaF], pirofosfato de sódio de 10 mM, 1% Não-ide P-40, 1 mM De físride de fenilmetanossulfonil [PMSF], 1x inibidor de protease) com a amostra de EV (25 μL resultante da concentração de EV no filtro) para 5 min no gelo para extrair proteínas.
      3. Sonicate para 5 s (amplitude: 500 W; frequência: 20 kHz), 3 vezes no gelo.
      4. Remova os detritos vesiculares por centrifugação a 20.000 x g por 10 minutos, a 4 °C.
      5. Colete o supernante e meça a concentração de proteínas com o método de ensaio proteico de Bradford.
    2. Sulfato de sulfato de sódio eletroforese de gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e mancha ocidental
      1. Misture extratos de proteína (30 μg) com tampão amostral de Laemmli 5c (v/v).
      2. Carregue a mistura de proteína em um gel de poliacrilamida de 12%.
      3. Migrem as proteínas no gel com tampão TGS (25 mM Tris pH 8,5, 192 mM Glycine e 0,1% SDS), a 70 V para 15 min e 120 V por 45 min.
      4. Transfira as proteínas para a membrana nitrocelulose com sistema semi-seco a 230 V por 30 minutos.
      5. Saturar a membrana por 1h em RT com tampão de bloqueio (0,05% Tween 20 w/v, 5% leite em pó em pó em 0,1 M PBS, pH 7.4).
      6. Incubar a membrana durante a noite a 4 °C com anticorpo anti-choque térmico monoclonal do rato 90 (HSP90) anticorpo diluído no tampão de bloqueio (1:100).
      7. Lave a membrana três vezes com PBS-Tween (PBS, 0,05% Tween 20 w/v) por 15 min.
      8. Incubar a membrana por 1 h no RT com rabanete de rabanete de rabanete conjugado anticorpo secundário IgG diluído em tampão de bloqueio (1:10.000).
        NOTA: Um controle negativo é realizado usando anticorpos secundários sozinho.
      9. Repita a etapa de lavagem (passo 3.3.2.7).
      10. Revele a membrana com chemiluminescence aprimorada (ECL) kit de substrato ocidental (ver Tabela de Materiais).
  4. Análise proteômica
    1. Extração de proteínas e digestão em gel
      1. Repita as etapas 3.2.1 a 3.2.3 para isolar e concentrar os EVs. Repita o passo 3.3.1 para extração de proteína EV.
      2. Realize a migração de proteínas no gel de empilhamento de um gel de poliacrilamida de 12%.
      3. Fixar as proteínas no gel com azul coomassie por 20 minutos na RT.
      4. Extire cada peça de gel colorida e corte-a em pequenos pedaços de 1 mm3.
      5. Lave as peças de gel sucessivamente com 300 μL de cada solução: água ultrauso por 15 min, 100% acetonitrila (ACN) para 15 min, 100 mM de bicarbonato de amônio (NH4HCO3) por 15 min, ACN:100 mM NH4HCO3 (1:1, v/v) por 15 min, e 100% ACN para 5 min com agitação contínua.
      6. Seque peças completamente em gel com concentrador de vácuo.
      7. Realize a redução da proteína com 100 μL de 100 mM NH4HCO3 contendo 10 mM dithiothreitol para 1 h a 56°C.
      8. Realize a alquilação proteica com 100 μL de 100 mM NH4HCO3 contendo iodoacetamida de 50 mM por 45 min no escuro em RT.
      9. Lave as peças de gel sucessivamente com 300 μL de cada solução: 100 mM de NH4HCO3 por 15 min, ACN:20 mM NH4HCO3 (1:1, v/v) por 15 min, e 100% ACN por 5 min com agitação contínua.
      10. Seque completamente as peças de gel com um concentrador de vácuo.
      11. Realize a digestão proteica com 50 μL de trippsina (12,5 μg/mL) em 20 mM NH4HCO3 durante a 37 °C.
      12. Extrair as proteínas digeridas do gel com 50 μL de 100% ACN por 30 min a 37 °C e depois 15 min na RT com agitação contínua.
      13. Repita os seguintes procedimentos de extração duas vezes: 50 μL de 5% TFA em 20 mM NH4HCO3 solução para 20 min com agitação contínua.
      14. Adicione 100 μL de 100% ACN por 10 minutos com agitação contínua.
      15. Proteínas digeridas secas com concentrador de vácuo e resuspend em 20 μL de 0,1% TFA.
      16. Desaltar a amostra utilizando uma ponta de pipeta de 10 μL com mídia de fase inversa C18 para dessel e concentrar peptídeos (ver a Tabela de Materiais) e peptídeos elutos com ácido fórmico ACN:0,1% (FA) (80:20, v/v).
      17. Seque completamente a amostra com um concentrador de vácuo e resuspend em 20 μL de ACN:0.1% FA (2:98, v/v) para espectrometria de massa cromatografia líquida tandem (LC-MS/MS).
    2. Análise LC-MS/MS
      1. Carregue o peptídeo digerido no instrumento LC-MS/MS e realize a análise de amostras e dados de acordo com parâmetros descritos em detalhes em outros lugares42.
    3. Análise de dados brutos
      1. Processe dados de espectrometria de massa para identificar proteínas e comparar proteínas identificadas de cada amostra com um pacote de software de proteômica quantitativa usando parâmetros padrão.
      2. Exportar, utilizando parâmetros padrão, a lista de proteínas exclusivas e super-representadas de amostras positivas de EV em um software que prevê redes proteicas e processos biológicos.
      3. Compare a lista de proteínas identificadas nas frações com os 100 principais marcadores EV do banco de dados de acesso aberto Exocarta (ver tabela de materiais).

4. Ensaio de efeitos funcionais dos EVs

  1. Ensaio de crescimento de Neurite na linha celular PC-12
    1. Cultura linha celular PC12 em meio DMEM completo (2 mM L-glutamina, 10% soro de cavalo fetal (ESF), 5% de soro bovino fetal (FBS), 100 UI/mL penicilina, 100 μg/mL estreptomicina).
      NOTA: Os soros estão livres em todo o procedimento.
    2. Adicione um copo de tampa (todos os poços) a uma placa de 24 poços; cubra a placa com poli-D-lysine (0,1 mg/mL) e sementes 260.000 células/bem.
    3. Incubar as células a 37 °C abaixo de 5% de CO2.
    4. Após 24h de incubação, altere o meio de diferenciação médio para DMEM (DMEM com 2 mM L-glutamina, 0,1% ESF, 100 UI/mL penicilina, 100 μg/mL streptomicina) com 1 x 106 EVs de microglia (da etapa 1.1.2).
      NOTA: A condição de controle é realizada sem EVs de microglia no meio de diferenciação.
    5. No dia 4 após a semeadura, carregue todos os poços com 100 μL de meio DMEM completo.
    6. No 7º dia após a semeadura, fixe as células com 4% de PFA por 20 min no RT e enxágue três vezes (10 min cada) com PBS.
    7. Colorigue as células com falooidina conjugada por 30 minutos a 4 °C e enxágue 3 vezes (10 min cada) com PBS.
    8. Manche as células com Hoechst diluído 33342 (1:10.000) por 30 minutos em RT e enxágue 3 vezes (10 min cada) com PBS.
    9. Monte o vidro de cobertura em um slide com meio de montagem fluorescente (ver Tabela de Materiais).
    10. Analise o slide com um microscópio confocal, tire 5 imagens aleatórias de cada slide.
    11. Meça o crescimento do neurite usando um software de quantificação automatizado (comprimento total de neurite) conforme descrito em detalhes em outros lugares43.
  2. Neurite supera o crescimento em neurônios primários de ratos
    1. Cubra uma lâmina de vidro de 8 poços com poli-D-lysine (0,1 mg/mL) e laminina (20 μg/mL).
    2. Cultura ratos neurônios primários comerciais em meio de cultura apropriada (ver Tabela de Materiais) emplacando 50.000 células por poço e incubando as células a 37 °C sob 5% de CO2 por 48 h.
      NOTA: Os soros estão livres de exosome em todo o procedimento.
    3. Adicione 1 x 106 EVs de microglia ao meio da cultura dos neurônios e incubar a 37 °C abaixo de 5% de CO2 para 48 h a mais.
      NOTA: A condição de controle é realizada sem EVs de microglia no meio da cultura dos neurônios.
    4. Siga os passos 4.1.6 a 4.1.9 para corrigir e manchar as células.
    5. Siga os passos 4.1.10 e 4.1.11 para analisar o slide.
  3. Invasão celular glioma
    1. Células de glioma de rato C6 resuspend em meio DMEM completo (DMEM com 10% FBS, 2 mM L-glutamina, 1x antibióticos) contendo 5% de colágeno em uma concentração final de 8.000 células em 20 μL.
      NOTA: Os soros estão livres de exosome em todo o procedimento.
    2. Coloque 5 mL de PBS NO fundo de um prato de cultura de tecido de 60 mm. Inverta a tampa e as gotas de depósito de 20 μL (8.000 células) de suspensão celular na parte inferior da tampa.
    3. Inverta a tampa na câmara inferior cheia de PBS e incubar a placa a 37 °C e 5% de CO2 por 72 h até formar esferoides celulares.
    4. Adicione 1 x 108 EVs de macrófago (da etapa 1.2.2) a uma mistura de colágeno de 2,2 mg/mL (2 mL de solução de colágeno bovino tipo I [3 mg/mL] com 250 μL de 10x mínimo essencial médio (MEM) e 500 μL de hidróxido de sódio de 0,1 M).
      NOTA: A condição de controle é realizada sem EVs de macrófago na mistura de colágeno.
    5. Distribua a mistura de colágeno contendo EVs em uma placa de 24 poços para incorporar esferoides celulares.
    6. Implante os esferoides de células recém-formados no centro de cada poço.
    7. Incubar a placa por 30 min a 37°C e 5% de CO2 para solidificar o gel.
    8. Depois disso, sobreponha 400 μL de meio DMEM completo na matriz de colágeno em cada poço.
    9. Incubar o sistema completo por um total de 6 dias a 37 °C e 5% de CO2.
      NOTA: A invasão celular fora do esferoide é monitorada pela fotografia digital usando um microscópio de luz invertido usando um objetivo de 4x/0.10 N.A.
    10. Adquira imagens de cada poço todos os dias.
    11. Processar imagens e quantificar a invasão de áreas esferoides celulares usando o software como descrito anteriormente no detalhe42.
      NOTA: Áreas de invasão e esferoides foram normalizadas para cada dia para a invasão e áreas esferoides medidas no dia 0.

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Representative Results

Um dos principais desafios para atribuir efeitos biológicos a vesículas extracelulares (EVs) é a capacidade de isolar os EVs de todo o meio da cultura. Neste relatório, apresentamos um método utilizando a ultrassom (UC) e a cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) que está acoplado à análise em larga escala de assinaturas proteicas para validar marcadores EV e identificar compostos bioativos. Os EVs derivados de macrófago ou microglia foram isolados do meio condicionado após uma cultura de 24 h ou 48h, respectivamente(Figura 1).

Figure 1
Figura 1: Estratégias de coleta e isolamento da Vesícula Extracelular (EV). Os corpos apoptóticos e os detritos celulares foram separados do meio microglia ou macrófago por sucessivas etapas de centrifugação. Do supernatante, os EVs foram isolados por ultracentrifugação (UC). A pelota UC contendo EVs foi carregada na coluna e separada por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) em 20 frações elucidadas diferentes. Conforme revelado nas etapas adicionais (microscopia eletrônica, análise de rastreamento de nanopartículas e análise proteômica), as frações sec foram agrupadas e organizadas em 1F-EV-, 2F-EV+ e 3F-EV-. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O método seguiu sucessivas etapas de centrifugação: a primeira a remover as células e a segunda para remover detritos celulares e corpos apoptóticos. Em seguida, o supernante foi transferido para um novo tubo para realizar uma ultracentrifugação a 100.000 x g por 90 min. As vesículas foram coletadas juntamente com os agregados proteicos na última pelota da UC. Uma coluna SEC foi usada para separar os compostos de acordo com seu tamanho e remover os agregados(Figura 1). Para confirmar o isolamento dos EVs, cada fração SEC seguiu uma análise de rastreamento de nanopartículas(Figura 2A).

Figure 2
Figura 2: Análise das frações sec. (A) Análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) de frações SEC. O número total de partículas em cada fração SEC é apresentado com gráficos de barras. Os gráficos de barras laranjas mostram as três frações EV+ consecutivas (F5-F7). (B, C) Capturas de tela da câmara NTA mostram diferenças significativas no fluxo de partículas entre frações SEC. (D) Análise complementar da espectrometria de massa MALDI. A partir de outra pelota uc contendo EVs, um conjunto de peptídeo de controle padrão foi adicionado antes da separação da SEC, a fim de validar o desempenho da estratégia SEC. Cada fração SEC foi analisada com ionização de desorção a laser assistida por matriz - tempo de voo (MALDI-TOF) para determinar frações padrão-positivas. Nos nove primeiros espectros (frações 1 a 9), nenhum sinal foi observado. A detecção desses padrões livres foi possível nas seguintes frações (frações 10 a 20) confirmando a capacidade do procedimento SEC de separar EVs (F5-F7) de componentes solúveis (F10-F20). (E) Análise de manchas ocidentais das frações SEC como uma análise preliminar do marcador EV. As frações EV+ (F5-F7) foram agrupadas como uma amostra (2F-VE+) enquanto as frações EV (F1-F4 e F8-F20, respectivamente) foram agrupadas em duas outras amostras chamadas 1F-EV- e 3F-EV-. Os resultados mostraram a presença de um sinal de Proteína de Choque térmico 90 (HSP90) (marcador positivo EV) em 2F-EV+, e também em células lysate como controle positivo, em comparação com as outras frações (1F-EV- e 3F-EV-). (F, G) Análise de microscopia eletrônica da amostra positiva EV (2F-EV+). A observação sob duas ampliações sucessivas revelou a presença de EVs em uma faixa de tamanho em torno de 100 nm (setas brancas) e cerca de 400 nm (ponta de flecha). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O número de partículas foi significativamente maior nas frações 5, 6 e 7 do que nas anteriores (F1-F4) e seguintes (F8-F20). Foi possível ver um fluxo de partículas nessas frações mesmo que algumas partículas fossem observadas nas seguintes frações(Figura 2B,C). Essa separação não impede a possibilidade de que frações diferentes do F5-F7 possam conter uma pequena quantidade de vesículas, ou mesmo que as frações ricas em EV F5 a F7 possam conter contaminantes moleculares. Para pelo menos garantir que as frações F5-F7 estejam livres de contaminar moléculas de co-eluição, foi necessário acompanhar a elução do curso de tempo dos diferentes compostos no procedimento SEC. Para isso, os padrões de peptídeo de controle foram adicionados a uma pelota uc semelhante à usada anteriormente. Esta preparação foi novamente separada usando o procedimento SEC. Em seguida, foi realizada uma ionização de desormetria de a laser assistida por matriz — a análise de espectrometria de massa do Tempo de Voo (MALDI) para identificar as frações sec nas quais as normas foram elucidadas(Figura 2D). Devido à faixa de massa, apenas produtos ionizados a partir de padrões de peptídeos foram seguidos nesta análise. Os resultados mostraram que esses produtos foram detectáveis nas frações 10 a 20, demonstrando que qualquer proteína solúvel não pode ser elucidada nas mesmas frações que os EVs (F5-F7). Esses resultados confirmaram o interesse dessa abordagem na separação de EVs de componentes não EV. Mesmo assumindo que as frações F8-F20 poderiam conter uma fração residual de EVs, decidimos nos seguintes experimentos combinar as frações positivas EV (F5-F7) em uma única amostra chamada 2F-EV+. Também combinamos as outras frações da SEC em duas amostras chamadas 1F-EV- (F1-F4) e 3F-EV- (F8-F20). Agrupamos em três amostras por várias razões. Em primeiro lugar, o número de frações sec aumentaria o tempo de análises moleculares, mas também estudos in vitro funcionais. As frações SEC positivas do EV apresentam separadamente números de partículas mais baixos e também comprometem a detecção de compostos moleculares. Da mesma forma, foi considerado mais criterioso agrupar as frações F8-F20 para concentrar, se necessário, as vesículas residuais e verificar sua presença por uma análise preliminar de manchas ocidentais contra HSP90, um marcador EV. Curiosamente, foi detectado um sinal positivo para HSP90 na fração 2F-EV+, também no lysate celular como controle positivo, mas não em amostras de 1F-EV e 3F-EV(Figura 2E e Figura Suplementar S1 como controle). Esta análise confirma o interesse apenas do 2F-EV+ e a gestão correta das frações anteriores da SEC. Para afirmar o isolamento do EV, um experimento adicional com microscopia eletrônica analisou apenas a amostra 2F-EV+ e permitiu a observação de EVs com uma heterogeneidade típica de 100 a 400 nm(Figura 2F,G).

Outro passo fundamental na validação foi a análise proteômica(Figura 3). Desenvolvemos toda uma análise de espectrometria de massa com múltiplos objetivos: (i) confirmar o isolamento de EVs com a detecção de um alto número de marcadores EV em 2F-EV+, (ii) eventualmente identificar proteínas contaminantes nas amostras negativas de EV (1F-EV- e 3F-EV-) e (iii) caracterizar o conteúdo proteico dos EVs que suportam suas atividades biológicas.

Figure 3
Figura 3: Análise proteômica de amostras EV positivos e EV-negativos. (A) Após três isolamentos independentes de EV de preparações de células microglia semelhantes, as amostras 1F-EV-, 2F-EV+ e 3F-EV foram carregadas para a eletroforese de gel de sulfato de sódio dodecyl polyacrilamida (SDS-PAGE) e migraram até o gel de empilhamento para concentrar proteínas a fim de realizar sua digestão em gel. Os peptídeos resultantes foram então analisados pela espectrometria de massa cromatografia líquida tandem (LC-MS/MS) para identificar as proteínas correspondentes. (B) Comparação de proteínas identificadas entre as amostras 1F-EV- e 2F-EV+ mostrando proteínas comuns em ambas as frações (19) e proteínas detectadas exclusivamente na fração 2F-EV+ (522). O mapa de calor mostra a representação relativa onde todas as proteínas comuns entre os triplicados 1F-EV e 2F-EV+ foram super-representadas (vermelhas) nas amostras 2F-EV+. (C) Comparação de proteínas identificadas entre as frações 2F-EV+ e 3F-EV- mostrando proteínas comuns entre triplicados (113) e proteínas exclusivamente representadas (428 em 2F-EV+ e 11 em 3F-EV-). O mapa de calor mostra a representação relativa em dois aglomerados. Um (cluster A) apresenta 5 proteínas super-representadas na amostra 3F-EV e um segundo (cluster B) apresenta 108 proteínas super-representadas em 2F-EV+. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A partir de mídias condicionadas por células, o procedimento UC e SEC levou a três amostras 1F-EV-, 2F-EV+ e 3F-EV-. As proteínas correspondentes foram extraídas e concentradas por eletroforese de gel de poliacrilamida de sulfato de sódio (SDS-PAGE). Após uma curta migração no gel de empilhamento, as amostras foram coletadas por uma excisão de banda, transferidas em tubos distintos para serem digeridas em gel. Os produtos foram separados por cromatografia de fase inversa on-line diretamente acoplado a um espectrômetro de massa para análise(Figura 3A).

Os seguintes resultados, como exemplo de todo o procedimento, foram obtidos de meios condicionados a microglia após uma cultura de 48h. Os dados brutos foram submetidos a um banco de dados de proteínas rat. As proteínas identificadas foram comparadas entre as amostras 1F-EV- e 2F-EV+ (Figura 3B) e entre as amostras 2F-EV+ e 3F-EV- (Figura 3C). Na primeira comparação, o diagrama de Venn mostrou 19 proteínas comuns em ambas as frações e 522 proteínas detectadas exclusivamente na fração 2F-EV+. A análise por meio de um software de proteômica quantitativa permitiu a identificação da representação relativa das proteínas comuns. Os resultados mostraram um mapa de calor onde todas as proteínas comuns entre os triplicados 1F-EV e 2F-EV+ foram super-representadas (vermelhas) nas amostras 2F-EV+. Na segunda comparação entre as frações 2F-EV+ e 3F-EV-, foram identificadas 113 proteínas comuns entre os triplicados. Além disso, 428 proteínas foram detectadas exclusivamente em 2F-EV+ e 11 proteínas foram encontradas exclusivamente em 3F-EV-. Após a análise quantitativa, a representação do mapa de calor das 113 proteínas comuns destacou dois aglomerados onde o cluster A apresentou cinco proteínas super-representadas na amostra 3F-EV e o grupo B apresentou 108 proteínas super-representadas em 2F-EV+.

As 428 proteínas representadas exclusivamente e as 108 proteínas super-representadas no 2F-EV+ foram submetidas ao banco de dados de acesso aberto Exocarta, a fim de detectar moléculas associadas ao EV. A análise dos 100 principais marcadores EV da Exocarta destacou a presença de 86 proteínas associadas ao EV em 2F-EV+ (Figura 4A).

Figure 4
Figura 4: Análise das proteínas da amostra 2F-EV+. (A) Um pool de 536 proteínas (428 proteínas exclusivas e 108 super-representadas) foi submetido ao banco de dados Exocarta, a fim de detectar moléculas associadas ao EV. Símbolos de moléculas das 86 proteínas associadas ao EV detectadas nos 100 principais marcadores EV do banco de dados Exocarta. (B) A previsão das interações proteicas e sua associação aos processos biológicos selecionados mostraram vias imunes e neuroprotetoras na amostra 2F-EV+. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Curiosamente, a análise das 5 proteínas comuns no cluster A e das 11 proteínas exclusivamente representadas no 3F-EV não foram associadas a nenhum marcador EV (dados não apresentados). Finalmente, a previsão das interações proteicas e sua associação com processos biológicos selecionados mostraram presença na fração 2F-EV+ de mediadores imunológicos (21%) às vezes envolvido no controle da resposta inflamatória (4,1%) (Figura 4B). Os conteúdos de EV em 2F-EV+ também estiveram associados ao desenvolvimento neuronal (16,8%), à diferenciação dos neurônios (5%) e o controle da morte neuronal (3,8%) que está de acordo com o seguinte ensaio de crescimento neurite.

Assim, a estratégia que selecionamos possibilita o acesso de todos os dados e permite uma previsão das funções mediadas pelo EV antes dos ensaios biológicos que realizamos então(Figura 5).

Figure 5
Figura 5: Ensaios não-estácto dependentes de EV. Os efeitos dos EVs derivados de microglia foram avaliados no crescimento de neurite (quadro superior) e os efeitos dos EVs derivados do macrófago foram avaliados na invasão celular glioma (quadro inferior). (A, B) O comprimento de neurite foi medido em células PC-12 (o painel A foi modificado de Raffo-Romero et al.16 com permissão) ou neurônios primários de ratos (B). Os resultados mostraram um aumento significativo de crescimento em EVs (+ EVs) em comparação com o controle (Ctrl). Barra de escala = 20 μm. (C, D) Curso de tempo de invasão eferóide C6 glioma em colágeno na presença de EVs derivados de macrófago primário de rato (C6 + EVs) ou veículo (controle C6). A invasão 3D do C6 no colágeno foi monitorada e quantificada em até 6 dias. A quantificação da invasão celular tumoral é mostrada em 1, 2, 3 ou 6 dias (C) como observado em imagens representativas (D). Barra de escala = 500 μm. Para ensaios de crescimento de neurite, a significância foi calculada pelo teste t-testnão remunerado do estudante (* p < 0,05, ** p < 0,01 e *** p < 0,001). Para o ensaio de invasão, o significado foi calculado pela ANOVA unidirecional, seguido pelo teste pós-hoc de Tukey. As barras de erro indicam erro padrão relativo de três experimentos independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Dessa forma, as funções neurotróficas de EVs derivados de microglia foram estudadas na linha celular PC-12 e neurônios primários de ratos. Os resultados mostraram efeito positivo no crescimento do neurite(Figura 5A,B). A presença de EVs aumentou cerca de 6 e 1,5 vezes a rede neurita em comprimento e/ou em número em PC-12 e neurônios primários em comparação com uma condição de controle. Em outro contexto, também estudamos os efeitos dos EVs derivados do macrófago em uma invasão de tumor cerebral(Figura 5C,D). Foi avaliado usando esferoides tumorais 3D embutidos em uma matriz de colágeno. Esferoides gerados com células de glioma de rato C6 foram cultivados por 6 dias em uma matriz de colágeno contendo (ou não contendo) EVs purificados do meio de cultura de macrófagos de ratos. A matriz de colágeno fornece uma estrutura na qual as células tumorais podem invadir e se espalhar para fora do esferoide. Os EVs derivados do macrófago prejudicaram o crescimento e a invasão dos glioma spheroids. Após 6 dias de cultura, observou-se uma redução de 50% da invasão em esferoides tratados com EV em comparação com o controle. Este resultado mostrou que os macrófagos podem produzir EVs com fatores anti-tumorais e/ou anti-invasivos que afetam o crescimento do glioma.

Supplementary Figure S1
Figura suplementar S1: Imagens da membrana usada para o experimento de manchas ocidentais. (A) Imagem original da mancha ocidental da Figura 2E (contra o marcador EV HSP90). (B) Imagem de coloração ponceau da mesma membrana mostrando o carregamento correto de extratos de proteínas de amostras de 1F-EV-, 2F-EV+ e 3F-EV. Clique aqui para baixar este número.

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Discussion

O sistema nervoso central (SNC) é um tecido complexo no qual a comunicação célula-celular regula as funções neuronais normais necessárias para a homeostase30. Os EVs são agora amplamente estudados e descritos como importantes cargas moleculares para a comunicação célula-celular31. Eles fornecem especificamente um coquetel de mediadores para células receptoras, afetando assim suas funções em condições saudáveis e patológicas32. Estudos recentes indicam que os EVs desempenham um papel crucial no CNS24,33,34 e especialmente aqueles de células imunes cerebrais35,36. O equilíbrio entre respostas imunes pró e anti-inflamatórias é crucial e permite manter a integridade cerebral durante o desenvolvimento sináptico e as atividades neuronais ao longo da vida. Duas situações distintas de respostas imunes foram discutidas neste estudo: a relação (i) entre microglia e neurônios e (ii) entre macrófagos infiltrados e células glioma. Primeiro, microglia são os macrófagos residentes no tecido cerebral onde desempenham um papel imunológico fundamental no gerenciamento das alterações do microambiente, a fim de garantir as atividades neuronais. Mas mecanismos pró-inflamatórios excessivos podem ser suportados por microglia superativada e levar a distúrbios neurodegenerativos37,38. Em contraste, os gliomas de alto grau requerem perfis anti-inflamatórios e envolvem macrófagos associados ao tumor (TAMs) recrutados no local do tumor. Os macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) representam uma grande população desses TAMs em estreita relação com as células de glioma. Sob a influência do tumor, os BMDMs exibem perfis anti-inflamatórios e pró-tumorais in vivo39. Como esses BMDMs poderiam controlar a invasão de células tumorais in vitro é uma questão crucial neste relatório. É por isso que os EVs derivados do macrófago foram usados sozinhos no ensaio de invasão glioma spheroid. Juntas na cocultura, as células de glioma teriam influenciado os macrófagos a produzir outras populações de EV com perfis anti-inflamatórios. O uso direto de EVs imunes poderia ser muito melhor como agente anti-tumoral. Consequentemente, as células imunes mantêm a comunicação célula-celular em microambientes específicos onde o equilíbrio inflamatório é fortemente influenciado por sinais externos40,41. A compreensão das respostas imunes mediadas pelo EV representa um grande desafio para limitar a patogênese de muitos distúrbios. A identificação de conteúdos de EV biologicamente ativos é uma das chaves para compreender os processos inflamatórios desregulados e propor novas estratégias terapêuticas42,43.

Neste estudo apresentamos uma metodologia que consiste em um processo de ultracentrifugação diferencial como o primeiro passo para eliminar os detritos celulares, os corpos apoptóticos e as moléculas solúveis, combinados com a cromatografia de exclusão de tamanho para isolar EVs de agregados moleculares. Quando as populações de EV são avaliadas em ensaios biológicos, é crucial discriminar os conteúdos de EV de outros materiais co-isolados. É por isso que melhoramos o isolamento para separar o EV dos compostos não associados ao EV. Adicionando proteínas padrão em amostras de controle submetidas ao procedimento SEC, fomos então capazes de localizar suas frações de elução pelo MALDI-TOF. Como os padrões são moléculas livres, eles globalmente co-elute com agregados moleculares associados à amostra relacionados a materiais não EV. Assim, as frações de EV de amostras experimentais foram validadas em um procedimento de isolamento confiável. Além disso, desenvolvemos uma estratégia de análise proteômica dupla. Exceto o uso do anticorpo anti-HSP90 por manchas ocidentais como um marcador EV detecção preliminar, decidimos validar o fracionamento EV correto por uma detecção não direcionada de assinaturas de proteínas associadas ao EV. De fato, a abordagem atual não foi deliberadamente focada na detecção de múltiplos marcadores EV conhecidos devido à especificidade e sensibilidade insuficientes de certos anticorpos. A variabilidade e a abundância de alguns marcadores EV na superfície das subpopulações EV ainda são controversas nos procedimentos de isolamento. Além disso, uma metodologia baseada em anticorpos poderia representar um limite em um alto número de organismos devido à falta de anticorpos comerciais, enquanto os estudos de EV são agora um tema quente na biologia. Essa análise não direcionada permitiu a identificação de um maior número de moléculas que já são descritas como marcadores EV (86 proteínas nos 100 principais marcadores EV do banco de dados Exocarta). Finalmente, essa abordagem poderia ser realmente útil para validar o isolamento de EV de organismos mal descritos, desde que as proteínas detectadas pudessem apresentar homólogos significativos aos marcadores EV conhecidos. Como descrito recentemente, uma análise proteômica em larga escala pode ser uma alternativa para usar apenas alguns marcadores arbitrários43. Isso melhoraria a discriminação das frações EV+ e a identificação de seus conteúdos ativos antes de serem utilizados em ensaios biológicos.

De fato, é necessário associar a caracterização dos conteúdos de EV aos efeitos observados em ensaios biológicos. De fato, o impacto biológico dos EVs para as células receptoras sugere que mediadores vesiculares ou efeitos estejam envolvidos. Mais uma vez, a mesma análise não direcionada permite a identificação de moléculas biologicamente ativas. Uma possível otimização nesta análise diz respeito aos tipos de moléculas que é possível identificar. Nossa estratégia foi baseada na análise em larga escala das assinaturas proteicas e levou a vias biológicas preditivas associadas à resposta imune e à sobrevivência dos neurônios. É essencial considerar as outras moléculas, incluindo lipídios, mRNA e microRNAs, por exemplo. Nossos estudos atuais associam essas identificações adicionais às assinaturas proteicas, a fim de obter um conhecimento global desta comunicação dependente de EV.

Muitas abordagens terapêuticas estão previstas nos próximos anos. Dado que os EVs são capazes de cruzar facilmente a barreira cerebral do sangue e alcançar os tecidos patológicos, essas cargas moleculares podem ser usadas de diferentes maneiras. Embora este estudo não tenha destacado as moléculas de superfície EV, sua identificação ainda é necessária para entender melhor o processo de abordagem em relação às células e tecidos-alvo. A análise proteômica em nossa metodologia dá acesso a esses dados. Caso contrário, neste relatório, apresentamos a produção in vitro de EVs como coquetéis benéficos. Não otimizamos as melhores condições para prime ou ativar as células imunes de antemão. Este ponto é crucial porque, nos tecidos, o microambiente tem um impacto direto sobre as células imunes e, em última instância, contribui para a formação da biogênese de seus EVs. No caso do glioblastoma, por exemplo, verificou-se que as células cancerígenas produzem seus próprios EVs, contribuindo assim para orientar os TAMs vizinhos para perfis anti-inflamatórios e sua imunossupressão local44,45. Esta é a razão pela qual os EVs derivados do macrófago no ambiente glioma são diferentes daqueles produzidos em uma única cultura macrófago. Assim, usamos diretamente EVs derivados do macrófago, produzidos separadamente a partir de uma única cultura macrófago, para controlar a invasão glioma spheroid porque uma co-cultura de macrófago-glioma não tem controle sobre o crescimento do tumor. Outras estratégias terapêuticas poderiam prevenir essa imunossupressão in vivo usando EVs pró-inflamatórios e anti-tumorais produzidos in vitro a partir de macrófagos ativados. Uma estratégia semelhante poderia ser usada no contexto de doenças neurodegenerativas através do uso de EVs derivados de microglia devidamente alertadas para produzir uma resposta neuroprotetora e anti-inflamatória favorecendo a sobrevivência neuronal. Em conclusão, os estudos da comunicação mediada por EV entre células imunes e o microambiente in vivo são fundamentais para permitir uma melhor compreensão da patogênese e projetar abordagens terapêuticas inovadoras.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

O trabalho apresentado contou com o apoio da Ministère de L'Education Nationale, de L'Enseignement Supérieur et de la Recherche e INSERM. Agradecemos o BICeL- Campus Scientific City Facility pelo acesso a instrumentos e conselhos técnicos. Agradecemos a Jean-Pascal Gimeno, Soulaimane Aboulouard e Isabelle Fournier pela assistência de espectrometria de massa. Agradecemos tanina árabe, Christelle van Camp, Françoise le Marrec-Croq, Jacopo Vizioli e Pierre-Eric Sautière por sua forte contribuição para os desenvolvimentos científicos e técnicos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels Bio-rad 4561045EDU  
Acetonitrile Fisher Chemicals A955-1  
Amicon 50 kDa centrifugal filter Merck UFC505024  
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich 9830  
HSP90 α/β antibody (RRID: AB_675659) Santa-cruz sc-13119  
B27 Plus supplement Gibco A3582801  
BenchMixer V2 Vortex Mixer Benchmark Scientific BV1003  
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bradford) Bio-Rad 5000006  
C18 ZipTips Merck Millipore ZTC18S096  
C6 rat glioma cell ATCC ATCC CCL-107  
Canonical tubes Sarstedt 62.554.002  
Centrifuge Eppendorf 5804000010  
CO2 Incubator ThermoFisher    
Confocal microscope LSM880 Carl Zeiss LSM880  
Cover glass Marienfeld 111580  
Culture Dish (60 mm) Sarstedt 82.1473  
Dithiothreitol Sigma-Aldrich 43819  
DMEM Gibco 41966029  
EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph ThermoFisher    
Electron microscope JEM-2100 JEOL    
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid Sigma-Aldrich 03777-10G  
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich ED-100G  
Exo-FBS Ozyme EXO-FBS-50A-1 Exosome depleted FBS
ExoCarta database (top 100 proteins of Evs)     http://www.exocarta.org/
Fetal Bovine Serum Gibco 16140071  
Fetal Horse Serum Biowest S0960-500  
Filtropur S 0.2 Sarstedt 83.1826.001  
Fisherbrand Q500 Sonicator with Probe Fisherbrand 12893543  
FlexAnalysis Brucker    
Fluorescence mounting medium Agilent S3023  
Formic Acid Sigma-Aldrich 695076  
Formvar-carbon coated copper grids Agar scientific Ltd AGS162-3  
Glucose Sigma-Aldrich G8769  
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich 340855  
Hoechst 33342 Euromedex 17535-AAT  
Idoacetamide Sigma-Aldrich I1149  
InstantBlue Coomassie Protein Stain Expedeon ISB1L  
Invert light microscope CKX53 Olympus    
L-glutamine Gibco 25030-024  
LabTek II 8 wells  Nunc 154534  
Laemmli 2x Bio-Rad 1610737  
Laminin Corning 354232  
MaxQuant software (proteins identification software)     https://maxquant.net/maxquant/
MBT Polish stell Brucker 8268711  
MEM 10x Gibco 21090-022  
Methylcellulose Sigma-Aldrich M6385-100G  
MiliQ water Merck Millipore    
Milk Regilait REGILAIT300  
Mini PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell Bio-Rad 1658000FC  
MonoP FPLC column GE Healthcare   no longer available
Nanosight NS300 Malvern Panalytical NS300  
NanoSight NTA software v3.2 Malvern Panalytical    
NanoSight syringe pump Malvern Panalytical    
Neurobasal Gibco 21103-049  
Nitrocellulose membrane GE Healthcare 10600007  
Nonidet P-40 Fluka 56741  
Nunc multidish 24 wells ThermoFisher 82.1473  
Paraformaldehyde Electro microscopy Science 15713  
PC-12 cell line ATCC ATCC CRL-1721  
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122  
Peptide calibration mix LaserBio Labs C101  
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 115-035-003  
Perseus software (Processing of identified proteins)     https://maxquant.net/perseus/
Phalloidin-tetramethylrhodamine conjugate Santa-cruz sc-362065  
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich 78830  
Phosphate Buffer Saline Invitrogen 14190094 no calcium, no magnesium
pluriStrainer M/ 60 µm pluriSelect 43-50060  
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407  
Polycarbonate centrifuge tubes Beckman Coulter 355651  
Protease Inhibitor Sigma-Aldrich S8830-20TAB  
PureCol Cell Systems 5005  
Q-Exactive mass spectrometer ThermoFisher    
rapifleX mass spectrometer Brucker    
Rat cortical neurons Cell Applications R882N-20 Cell origin : Derived from cerebral cortices of day 18 embryonic Sprague Dawley rat brains
Rat Macrophage & Microglia Culture Medium Cell Applications R620K-100 Cell orgin : Normal healthy Rat bone marrow
Rat primary macrophages Cell Applications R8818-10a  
Rat primary microglia Lonza RG535  
Sepharose CL-2B GE Healthcare 17014001  
Sequencing Grade Modified Trypsin Promega V5111  
Slide Dustsher 100204  
Sodium Chloride Scharlau SO0227  
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich L3771  
Sodium Fluoride Sigma-Aldrich S7920-100G  
Sodium hydroxide Scharlab SO0420005P  
Sodium pyrophosphate Sigma-Aldrich S6422-100G  
SpeedVac Vacuum Concentrator ThermoFisher    
String software (functional protein association networks)     https://string-db.org/
SuperSignal West Dura extended Duration Substrate ThermoFisher 34075  
Syringe 1.0 mL Terumo 8SS01H1  
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer cell Bio-Rad 1703940  
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508  
Tris Interchim UP031657  
Tris-Glycine Euromedex EU0550  
Tween 20 Sigma-Aldrich P2287  
Ultracentrifuge Beckman Coulter A95765  
Ultracentrifuge Rotor 70.1 Ti Beckman Coulter 342184  
Uranyl acetate Agar Scientific Ltd AGR1260A  
Whatman filter paper Sigma-Aldrich WHA10347510  
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Sigma-Aldrich C2020-25G  

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References

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Caracterização de vesículas extracelulares derivadas de células imunes e estudo do impacto funcional no ambiente celular
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Lemaire, Q., Duhamel, M., Raffo-Romero, A., Salzet, M., Lefebvre, C. Characterization of Immune Cell-derived Extracellular Vesicles and Studying Functional Impact on Cell Environment. J. Vis. Exp. (160), e60118, doi:10.3791/60118 (2020).

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