Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Karakterisering av immuncell-härledda extracellulära blåsor och studera funktionell påverkan på cellmiljön

Published: June 2, 2020 doi: 10.3791/60118
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1U1192-Laboratoire Protéomique, Réponse Inflammatoire et Spectrométrie de Masse (PRISM), Univ. Lille, INSERM

Summary

Denna rapport belyser kronologiska krav för extracellulära vesikel (EV) isolering från mikroglia eller blod makrofager. Microglia-härledda EVs utvärderades som regulatorer av neurite utväxt medan blod makrofag-härledda EVs studerades i kontrollen av C6 gliom cell invasion i in vitro-analyser. Målet är att bättre förstå dessa EV-funktioner som immunmedlare i specifika mikromiljöer.

Abstract

Neuroinflammatoriska tillståndet i centrala nervsystemet (CNS) spelar en nyckelroll i fysiologiska och patologiska tillstånd. Microglia, de bosatta immuncellerna i hjärnan, och ibland infiltrera benmärg-härledda makrofager (BMDMs), reglera den inflammatoriska profilen för deras mikromiljö i CNS. Det är nu accepterat att de extracellulära vesikel (EV) populationerna från immunceller fungerar som immunmedlare. Således är deras insamling och isolering viktiga för att identifiera deras innehåll men också utvärdera deras biologiska effekter på mottagarceller. De nuvarande data belysa kronologiska krav för EV isolering från mikroglia celler eller makrofager blod inklusive ultracentrifugering och storlek-exkludering kromatografi (SEC) steg. En icke-riktad proteomisk analys tillät validering av proteinsignaturer som EV-markörer och karakteriserade det biologiskt aktiva EV-innehållet. Microglia-härledda EVs användes också funktionellt på primär kultur av nervceller för att bedöma deras betydelse som immun medlare i neurite utväxt. Resultaten visade att microglia-härledda EVs bidrar till att underlätta neurite utväxt in vitro. Parallellt, blod makrofag-härledda EVs användes funktionellt som immun medlare i sfäroidkulturer av C6 gliom celler, resultaten visar att dessa EVs kontrollera glioma cell invasion in vitro. Denna rapport belyser möjligheten att utvärdera EV-medierad immuncell funktioner men också förstå de molekylära grunderna för en sådan kommunikation. Denna dechiffrera kan främja användningen av naturliga blåsor och/eller in vitro-beredning av terapeutiska blåsor för att efterlikna immunegenskaper i mikromiljön av CNS-patologier.

Introduction

Många neuropatologier är relaterade till det neuroinflammatoriska tillståndet som är en komplex mekanism som alltmer övervägs, men fortfarande dåligt förstådda eftersom immunprocesserna är olika och är beroende av cellmiljön. Faktum är att CNS-störningarna inte systematiskt involverar samma aktiveringssignaler och immuncellpopulationer och därför är de pro- eller antiinflammatoriska reaktionerna svåra att utvärdera som orsaker eller konsekvenser av patologier. Hjärnan bosatt makrofager kallas "microglia" verkar vara på gränssnittet mellan nervsystemet och immunsystemet1. Microglia har ett myeloiskt ursprung och kommer från gulesäcken under primitiva hematopoiesis att kolonisera hjärnan, medan perifera makrofager härrör från fostrets lever under definitiva hematopoiesis att bli perifera makrofager2. Mikrogliacellerna kommunicerar med nervceller och neuron-härledda gliaceller såsom astrocyter och oligodendrocyter3. Flera nyligen genomförda studier har visat att mikroglia är involverade i neuronal plasticitet under CNS utveckling och vuxen vävnad homeostas, och även i det inflammatoriska tillstånd som är associerad med neurodegenerativa sjukdomar4,5. Annars kan blod- hjärnbarriärens integritet äventyras i andra CNS-patologier. Immunsvaren, särskilt i glioblastoma multiforme cancer, stöds inte bara av mikroglia celler som blod-hjärnbarriären omorganiseras genom angiogeniska processer och förekomsten av lymfkärl6,7. Därför förekommer en stor benmärgs-härledda makrofager (BMDMs) infiltration i hjärntumören i hela tumör-beroende angiogenes mekanismer8. Cancercellerna utövar ett betydande inflytande på infiltrerade BMDMs leder till immunsuppressiva egenskaper och tumörtillväxt9. Således är kommunikationen mellan immuncellerna och deras hjärnmikromiljö svår att förstå eftersom cellens ursprung och aktiveringssignaler är olika10,11. Det är därför intressant att gripa funktionerna hos immuncellsassocierade molekylära signaturer under fysiologiska tillstånd. I detta avseende kan cellcellskommunikationen mellan immunceller och cellmikromiljön studeras genom frisättning av extracellulära blåsor (EVs).

Elbilarna studeras mer och mer i regleringen av immunfunktioner i friska såväl som patologiska tillstånd12,13. Två populationer, exosomer och mikrovesmier, kan beaktas. De presenterar olika biogenes och storleksintervall. Exosomer är blåsor av ~30–150 nm diameter och genereras från det endosamala systemet och utsöndras under fusion av multiveskulära kroppar (MVBs) med plasmamembranet. Mikrovesiklarna är ca 100–1 000 nm i diameter och genereras av en utåtgående spirande från cellplasmamembranet14. Eftersom exosom kontra mikrovesicle diskriminering är fortfarande svårt att inse beroende på storlek och molekylära mönster, kommer vi bara använda termen EL I denna rapport. Ev-associerade kommunikation i CNS utgör en uråldriga mekanism eftersom studier visade att de var inblandade i ryggradslösa arter inklusive nematoder, insekter eller annelider15,16. Dessutom visar resultaten att elbilar kan kommunicera med celler från olika arter att denna mekanism är ett nyckellåssystem, som först bygger på ytmolekylerkännande mellan vesicles och mottagarceller och sedan möjliggör upptag av medlare16,17. EVs innehåller många molekyler som proteiner (t.ex. enzymer, signaltransduktion, biogenesfaktor), lipider (t.ex. ceramid, kolesterol) eller nukleinsyror (t.ex. DNA, mRNA eller miRNAs) som fungerar som direkta eller indirekta regulatorer av mottagarcellverksamheten14. Det är därför metodologiska studier utfördes också på immunceller för att isolera EL-apparater och helt karakterisera deras protein signaturer18,19.

De tidigaste studierna visade att exosomer frisläpps från primärkolsten råttmikroglia som en inducible mekanism efter en Wnt3a- eller serotonin-beroendeaktivering 20,21. Funktionellt i CNS, microglia-härledda EVs reglera synaptiska blåsor release av presynaptiska terminaler i nervceller som bidrar till kontroll av neuronal retbarhet22,23. Microglia-härledda EVs kan också propagera cytokiner-medierad inflammatorisk reaktion i stora hjärnregioner24,25. Viktigt, de olika ligands för avgiftsbelagda receptor familj kan aktivera specifika produktioner av elbilar i microglia26. Till exempel, in vitro-studier visar att LPS-aktiverade microglia BV2 cellinjer producerar differentiell EV innehåll inklusive proinflammatoriska cytokiner27. Därför kan den funktionella mångfalden av immuncellsubpopulationer i CNS, mikroglia och infiltrera BMDMs utvärderas genom sina egna EV-populationer, inklusive EV-påverkan på mottagarceller och identifiering av EV-innehåll.

Vi har tidigare beskrivit metoder för att utvärdera de funktionella egenskaperna hos microglia- och BMDM-härledda EVs efter deras isolering16,19. I denna rapport föreslår vi att självständigt utvärdera effekten av microglia-härledda EVs på neurite utväxt, och effekten av makrofag-härledda EVs på kontroll av glioma cell aggregat. Denna studie föreslår också en bred proteomisk analys av EV fraktioner för att validera EV isolering förfarande samt identifiera biologiskt aktiva protein signaturer. De positiva effekterna och den molekylära dechiffrera av EV innehåll kan hjälpa deras eventuella manipulation och användning som terapeutiska medel i hjärnsjukdomar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Primärkultur av mikroglia/makrofager

  1. Primär kultur av mikroglia
    1. Odling kommersiella råtta primära mikroglia (2 x 106 celler) (se tabell över material)i Dulbecco modifierade Eagle medium (DMEM) kompletteras med 10% exosome-fri serum, 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, och 9,0 g / L glukos vid 37 ° C och 5% CO2.
    2. Samla det konditionerade mediet efter en 48 h kultur och fortsätt till isolering av elbilar.
  2. Makrofagers primära kultur
    1. Odlingskommersiell råtta primära makrofager (1 x 106 celler) i det medium som tillhandahålls av tillverkaren (se tabellen över material)vid 37 °C och 5% CO2, med exosomefritt serum.
    2. Samla det konditionerade mediet efter en 24 h kultur och fortsätt till isolering av elbilar.

2. Isolering av elbilar

  1. Förissolerad elbilar från konditionerat medium
    1. Överför det konditionerade odlingsmediet från mikroglia- eller makrofagkulturer (steg 1.1.2 eller 1.2.2) till ett koniskt rör.
    2. Centrifugera vid 1 200 x g i 10 min vid rumstemperatur (RT) för att pelleta cellerna.
    3. Överför supernatanten till ett nytt koniskt rör. Centrifug vid 1200 x g i 20 min vid RT för att eliminera apoptotiska kroppar.
    4. Överför supernatanten till ett 10,4 ml polykarbonatrör och överför röret till en 70,1 Ti-rotor. Ultracentrifug vid 100 000 x g i 90 min vid 4 °C för att pelletera elbilarna.
    5. Kasta supernatanten och återsuspend pelleten som innehåller EVs i 200 μL av 0,20 μm filtrerad fosfatbuffert koksaltlösning (PBS).
  2. Isolering av elbilar
    1. Beredning av den hemgjorda storleksbestängningskromatografikolonnen (SEC)
      1. Töm en glaskromatografikolonn (längd: 26 cm; diameter: 0,6 cm) (se materialbordet),tvätta och sterilisera den.
      2. Placera ett 60 μm filter längst ned i kolumnen.
      3. Stapla kolonnen med tvärbunden agaros gelfiltrering basmatris för att skapa en stationär fas med en diameter på 0,6 cm och en 20 cm höjd.
      4. Skölj fasen med 50 ml 0,20 μm filtrerad PBS. Förvaras vid 4 °C för användning senare om det behövs.
    2. Placera den återsuspenderade EV-pelleten ovanpå SEC-kolonnens stationära fas.
    3. Samla upp 20 sekventiella fraktioner på 250 μL samtidigt som du fortsätter att lägga till 0,20 μm filtrerad PBS på toppen av stillastående fas för att förhindra torkning av kolonnen. Förvara fraktionerna vid -20 °C om det behövs.
      OBS: En längre förvaring än en vecka kan utföras vid -80 °C för att bibehålla EV-integriteten för molekylär analys.
  3. Matrix assisterad laserdesorption jonisering (MALDI) masspektrometri analys av SEC fraktioner
    1. Fortsätt till EV-isolering enligt beskrivningen i avsnitt 2.2.
    2. Resuspend EV pelleten med 200 μL peptidkalibreringsblandningslösning (se tabellen över material).
    3. Fortsätt till EV-samlingen enligt beskrivningen i avsnitten 2.2.1-2.2.3.
    4. Torka fraktionen helt med en vakuumkoncentrator.
    5. Rekonstruera fraktionerna med 10 μL av 0,1% trifluoracetisk syra (TFA).
    6. Blanda 1 μl rekonstituerad fraktion med 1 μl α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (HCCA) matris på en MALDI polerad stål målplåt.
    7. Analysera alla fraktioner med en MALDI-masspektrometer.
    8. Analysera genererade spektra med dedikerad programvara (se Tabell över material).

3. Karakterisering av elbilar

  1. Analys av spårning av nanopartiklar (NTA)
    OBS:     NTA-analysen utförs med ett analysinstrument för nanopartikelspårning (se materialförteckningen)och en automatiserad sprutpump.
    1. Spädning (intervall på 1:50 till 1:500) av varje SEK-fraktion från steg 2.2.3 med 0,20 μm filtrerad PBS.
    2. Vortex lösningen för att eliminera EV aggregat.
    3. Lägg den utspädda lösningen i en 1 ml-spruta och placera den i den automatiska sprutpumpen.
    4. Justera kamerainställningen till skärmökningsnivå (3) och kameranivå (13).
    5. Klicka på Kör och starta följande skript.
      1. Fyll på provet i analyskammaren (infusionshastighet: 1 000 för 15 s).
      2. Minska och stabilisera hastighetsflödet för videoinspelning (infusionshastighet: 25 för 15 s). Fånga tre på varandra följande 60 s videor av partikelflödet.
      3. Justera kameranivån (13) och detektionströskeln (3) innan videoanalys. Klicka på Inställningar| Ok att starta analysen och klicka på Exportera när analysen är klar.
    6. Mellan varje fraktionsanalys, tvätta med 1 ml 0,20 μm filtrerad PBS.
  2. Elektronmikroskopi (EM) analys
    1. Isolera elbilar enligt beskrivningen i avsnitt 2.
      OBS: Sterila förhållanden krävs inte.
    2. Upprepa avsnitt 3.1 för att kvantifiera elbilar.
      OBS: Endast positiva fraktioner kommer att användas för EM-analys.
    3. Använd ett 50 kDa centrifugalfilter (se Tabell över material)för att koncentrera EV-innehållande SEC-fraktioner.
    4. Resuspend koncentrerade EVs i 30 μL av 2% paraformaldehyd (PFA).
    5. Fyll på 10 μL av provet på ett kolbelagt koppargaller.
    6. Inkubera i 20 min i våt miljö.
    7. Upprepa steg 3.2.5 och 3.2.6 för en god absorption av provet på gallret.
    8. Överför nätet till en droppe 1% glutaraldehyd i PBS i 5 min vid RT.
    9. Tvätta provet med ultrarent vatten flera gånger.
    10. Jämför provet i 10 min på is med en blandning av 4 % uranylacetat och 2 % metylcellulosa (1:9, v/v). Ta bort överskottet av blandningen med hjälp av ett filterpapper.
    11. Torka provet och observera det under ett transmissionselektronmikroskop vid 200 kV (se materialtabellen).
  3. Västra blot analys
    1. Proteinutvinning
      1. Upprepa stegen 3.2.1 till 3.2.3 för att isolera och koncentrera elbilar.
      2. Blanda 50 μl RIPA-buffert (150 mM natriumklorid [NaCl], 50 mM Tris, 5 mM Etylenglykol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid [EGTA], 2 mM Ethylenediamine-tetraacetic acid [EDTA], 100 mM natriumfluorid [NaF], 10 mM natriumpyfosfat, 1% Nonidet P-40, 1 mM Fenylmetansulfonylfluorid [PMSF], 1x proteashämmare) med EV-provet (25 μL till följd av EV-koncentrationen på filtret) i 5 min på is för att extrahera proteiner.
      3. Sonikerat för 5 s (amplitud: 500 W; frekvens: 20 kHz), 3 gånger på is.
      4. Avlägsna vesikulärt skräp genom centrifugering vid 20 000 x g i 10 min, vid 4 °C.
      5. Samla supernatant och mäta proteinkoncentrationen med Bradford proteinanalysmetod.
    2. Natriumdymidsulfat polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) och västra blotting
      1. Blanda proteinextrakt (30 μg) med 5c Laemmli provbuffert (v/v).
      2. Ladda proteinblandningen på en 12% polyakrylamidgel.
      3. Migrera proteinerna i gelen med TGS-buffert (25 mM Tris pH 8,5, 192 mM Glycin och 0,1% SDS), vid 70 V i 15 min och 120 V i 45 min.
      4. Överför proteinerna till nitrocellulosamembranet med halvtorrt system vid 230 V i 30 min.
      5. Mätta membranet i 1 h vid RT med blockerande buffert (0,05% Tween 20 w/v, 5% mjölkpulver w/v i 0,1 M PBS, pH 7.4).
      6. Inkubera membranet över natten vid 4 °C med mus monoklonal anti-mänskliga värme-chock protein 90 (HSP90) antikroppar utspädd i blockerande buffert (1:100).
      7. Tvätta membranet tre gånger med PBS-Tween (PBS, 0,05% Tween 20 w/v) i 15 min.
      8. Inkubera membranet i 1 h vid RT med getpetalrotperoxidaskonjugerad antimus IgG sekundär antikropp utspädd i blockerande buffert (1:10,000).
        OBS: En negativ kontroll utförs enbart med sekundär antikropp.
      9. Upprepa tvättsteget (steg 3.3.2.7).
      10. Avslöja membranet med förbättrad chemiluminescence (ECL) västra blotting substrat kit (se Tabell över material).
  4. Proteomisk analys
    1. Proteinutvinning och matsmältning i gel
      1. Upprepa stegen 3.2.1 till 3.2.3 för att isolera och koncentrera elbilarna. Upprepa steg 3.3.1 för EV-proteinextraktion.
      2. Utför proteinmigration i staplingsgelen hos en 12% polyakristallidgel.
      3. Fixera proteinerna i gelen med coomassieblått i 20 min på RT.
      4. Punktskatt varje färgad gel bit och skär den i små bitar av 1 mm3.
      5. Tvätta gelbitarna successivt med 300 μl av varje lösning: ultravatten i 15 min, 100% acetonitril (ACN) i 15 min, 100 mM ammoniumbikarbonat (NH4HCO3) i 15 min, ACN:100 mM NH4HCO3 (1:1, v/v) i 15 min och 100% ACN i 5 min med kontinuerlig omrörning.
      6. Torka helt gelbitar med vakuumkoncentrator.
      7. Utför proteinreduktion med 100 μL av 100 mM NH4HCO3 som innehåller 10 mM dithiothreitol i 1 h vid 56°C.
      8. Utför proteinalkylering med 100 μL av 100 mM NH4HCO3 som innehåller 50 mM iodoacetamid i 45 min i mörker vid RT.
      9. Tvätta gelbitarna successivt med 300 μl av varje lösning: 100 mM NH4HCO3 i 15 min, ACN:20 mM NH4HCO3 (1:1, v/v) i 15 min och 100% ACN i 5 min med kontinuerlig omrörning.
      10. Torka gelbitarna helt med en vakuumkoncentrator.
      11. Utför proteinrötning med 50 μL trypsin (12,5 μg/ml) i 20 mM NH4HCO3 över natten vid 37 °C.
      12. Extrahera de smälta proteinerna från gelen med 50 μL 100% ACN i 30 min vid 37 °C och sedan 15 min vid RT med kontinuerlig omrörning.
      13. Upprepa följande extraktionsprocedurer två gånger: 50 μL 5% TFA i 20 mM NH4HCO3 lösning i 20 min vid kontinuerlig omrörning.
      14. Tillsätt 100 μl 100% ACN i 10 min vid kontinuerlig omrörning.
      15. Torrsmält proteiner med vakuumkoncentrator och återsuspend i 20 μL av 0,1% TFA.
      16. Avsalta provet med en 10 μL pipettspets med C18 omvänd fas media för avsaltning och koncentration av peptider (se tabellen över material)och elute peptider med ACN:0.1% myrsyra (FA) (80:20, v/v).
      17. Torka provet helt med vakuumkoncentrator och återsuspend i 20 μl ACN:0,1% FA (2:98, v/v) för flytande kromatografimassaspektrometri (LC-MS/MS).
    2. LC-MS/MS-analys
      1. Fyll den smälta peptiden i LC-MS/MS-instrumentet och utför prov- och dataanalys enligt parametrar som beskrivs i detalj någon annanstans42.
    3. Analys av rådata
      1. Bearbeta masspektrometridata för att identifiera proteiner och jämföra identifierade proteiner i varje prov med ett kvantitativt proteomikprogrampaket med hjälp av standardparametrar.
      2. Exportera, med hjälp av standardparametrar, listan över exklusiva och överrepresenterade proteiner från EV-positiva prover i en programvara som förutsäger proteinnätverk och biologiska processer.
      3. Jämför listan över identifierade proteiner i fraktionerna med de översta 100 EV-markörerna från Exocarta open access-databasen (se tabellen över material).

4. Fungerande EVs Effekter Analys

  1. Neurite utväxt analys på PC-12 cellinje
    1. Kultur PC12 cellinje i komplett DMEM medium (2 mM L-glutamin, 10% fetala häst serum (FHS), 5% fetala nötkreatur serum (FBS), 100 UI/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin).
      OBS: Serumet är exosome gratis i hela förfarandet.
    2. Tillsätt ett täckglas (alla brunnar) till en 24-brunnsplatta; skikta plattan med poly-D-lysin (0,1 mg/ml) och utsäde 260 000 celler/brunn.
    3. Inkubera cellerna vid 37 °C under 5 % CO2.
    4. Efter 24 timmars inkubation, ändra medium till DMEM differentiering medium (DMEM med 2 mM L-glutamin, 0,1% FHS, 100 UI/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin) med 1 x 106 mikroglia EVs (från steg 1.1.2).
      OBS: Kontrolltillståndet utförs utan mikroglia EVs i differentieringsmediet.
    5. På dag 4 efter sådd, ladda alla brunnar med 100 μL komplett DMEM medium.
    6. Vid dag 7 efter sådd, fixera cellerna med 4% PFA i 20 min vid RT och skölj tre gånger (10 min vardera) med PBS.
    7. Färga cellerna med rodaminkonjugerad falloidin i 30 min vid 4 °C och skölj 3 gånger (10 min vardera) med PBS.
    8. Färga cellerna med utspädd Hoechst 33342 (1:10 000) i 30 min vid RT och skölj 3 gånger (10 min vardera) med PBS.
    9. Montera täckglaset på en rutschkana med fluorescerande monteringsmedium (se Tabell över material).
    10. Analysera bilden med ett konfokalmikroskop, ta 5 slumpmässiga bilder av varje bild.
    11. Mät utväxten av neurit med hjälp av en automatiserad kvantifieringsprogramvara (total neuritlängd) enligt beskrivningen i detalj någon annanstans43.
  2. Neurite utväxt på råtta primära nervceller
    1. Täck en 8-brunns glasskiva med poly-D-lysin (0,1 mg/ml) och laminin (20 μg/ml).
    2. Odlingsråtta kommersiella primära nervceller i lämplig odling medium (se Tabell över material) genom plätering 50.000 celler per brunn och ruva cellerna vid 37 °C under 5% CO2 för 48 h.
      OBS: Serumet är exosome-fria i hela förfarandet.
    3. Tillsätt 1 x 106 mikroglia elbilar till neuron odling medium och inkubera vid 37 °C under 5% CO2 för 48 h mer.
      OBS: Kontroll tillstånd utförs utan microglia EL Iv i neuron odling medium.
    4. Följ steg 4.1.6 till 4.1.9 för att fixa och färga cellerna.
    5. Följ stegen 4.1.10 och 4.1.11 för att analysera bilden.
  3. Glioma cell invasion
    1. Resuspend C6 råtta gliom celler i komplett DMEM medium (DMEM med 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 1x antibiotika) som innehåller 5% kollagen vid en slutlig koncentration av 8.000 celler i 20 μL.
      OBS: Serumet är exosome-fria i hela förfarandet.
    2. Placera 5 ml PBS på botten av en 60 mm vävnadsodlingsskål. Vänd locket och deponering droppar av 20 μL (8.000 celler) av cellfjädring på botten av locket.
    3. Vänd locket på den PBS-fyllda bottenkammaren och inkubera plattan vid 37 °C och 5 % CO2 i 72 timmar tills cellspheroider bildas.
    4. Tillsätt 1 x8 makrofag-EVs (från steg 1.2.2) till en 2,2 mg/ml kollagenblandning (2 ml bovin kollagentyp I-lösning [3 mg/ml] med 250 μL 10x minsta väsentliga medium (MEM) och 500 μL natriumhydroxid).
      OBS: Kontrolltillstånd utförs utan makrofag EVs i kollagen blandningen.
    5. Fördela kollagen blandningen som innehåller EVs i en 24-väl platta för inbäddning cell sfäroider.
    6. Implantera de nybildade cellspheroiderna i mitten av varje brunn.
    7. Inkubera plattan i 30 min vid 37°C och 5% CO2 för att stelna gelen.
    8. Därefter överlägg 400 μL komplett DMEM-medium på kollagenmatrisen i varje brunn.
    9. Inkubera hela systemet under totalt 6 dagar vid 37 °C och 5 % CO2.
      OBS: Cell invasion ur sfäroiden övervakas av digital fotografering med hjälp av ett inverterat ljus mikroskop med hjälp av en 4x/0.10 N.A. mål.
    10. Skaffa bilder av varje brunn varje dag.
    11. Bearbeta bilder och kvantifiera invasionen av cell sfäroid områden med hjälp av programvaran som tidigare beskrivits i detalj42.
      OBS: Invasion och sfäroid områden normaliserades för varje dag till invasionen och sfäroid områden mätt på dag 0.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En av de största utmaningarna med att tillskriva biologiska effekter till extracellulära vesiklar (EVs) är förmågan att isolera elbilar från hela odlingsmediet. I denna rapport presenterar vi en metod som använder ultracentrifugering (UC) och storlek-uteslutning kromatografi (SEC) som är kopplad till storskalig analys av protein signaturer för att validera EV markörer och identifiera bioaktiva föreningar. De makrofag- eller mikroglia-härledda EVs isolerades från det konditionerade mediet efter en 24 h respektive 48 h -odling (figur 1).

Figure 1
Figur 1: Ev-strategier (Extracellular Vesicle) och isoleringsstrategier. Den apoptotiska organ och cell skräp separerades från mikroglia- eller makrofag-konditionerade medium genom successiva centrifugering steg. Från supernatanten isolerades EVs av ultracentrifugering (UC). UC pelleten som innehåller EVs laddades på kolonnen och separerades av storleksuteslutning kromatografi (SEC) i 20 olika eluerade fraktioner. Som framgår av de ytterligare stegen (elektronmikroskopi, nanopartikel spårning analys och proteomisk analys), SEC fraktionerna var poolade och organiserade i 1F-EV-, 2F-EV + och 3F-EV-. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Metoden följde successiva centrifugeringssteg: den första att ta bort cellerna och den andra för att ta bort cellulära skräp och apoptotiska kroppar. Sedan överfördes supernatanten till ett nytt rör för att utföra en ultracentrifugering vid 100.000 x g i 90 min. Blåsorna samlades in tillsammans med proteinaggregaten i den slutliga UC-pelleten. En SEC-kolumn användes för att separera föreningarna efter storlek och ta bort aggregaten (figur 1). För att bekräfta isoleringen av elfordon följde varje SEK-fraktion en analys av spårning av nanopartiklar (figur 2A).

Figure 2
Figur 2: Analys av SEC-fraktionerna. (A)Analys av nanopartikelspårning (NTA) av SEK-fraktioner. Det totala antalet partiklar i varje SEK-fraktion presenteras med stapeldiagram. De orangea stapeldiagrammen visar de tre på varandra följande EV+-fraktionerna (F5–F7). (B, C) Skärmbilder av NTA-kammaren visar betydande skillnader i partikelflödet mellan SEC-fraktioner. D)Kompletterande MALDI-masspektrometrianalys. Från en annan UC pellet som innehåller EVs, en standard kontroll peptid set lades till före SEC separation för att validera prestanda sec strategi. Varje SEK-fraktion analyserades med matrisassisterad laserdesorptionjonisering - flygtid (MALDI-TOF) för att bestämma standardpositiva fraktioner. I de nio första spektra (fraktioner 1 till 9), observerades ingen signal. Detektion av dessa fria standarder var möjlig i följande fraktioner (fraktionerna 10 till 20) som bekräftade SEC-förfarandets förmåga att separera EVs (F5–F7) från lösliga komponenter (F10–F20). E)Western blot analys av SEC fraktioner som en EV markör preliminär analys. Ev+-fraktionerna (F5–F7) samlades som ett prov (2F-VE+) medan EV-fraktionerna (F1–F4 respektive F8–F20) samlades i två andra prover som kallades 1F-EV- och 3F-EV-. Resultaten visade förekomsten av en Heat-Shock Protein 90 (HSP90) (EV positiv markör) signal i 2F-EV +, och även i cell lysate som positiv kontroll, jämfört med de andra fraktionerna (1F-EV- och 3F-EV-). (F, G) Elektronmikroskopianalys av EV-positiva provet (2F-EV+). Observationen under två på varandra följande förstoringar visade förekomsten av elbilar i ett storleksintervall runt 100 nm (vita pilar) och runt 400 nm (pilspets). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Partikeltalet var signifikant högre i fraktionerna 5, 6 och 7 än i föregående (F1–F4) och följande (F8–F20). Det var möjligt att se ett partikelflöde i dessa fraktioner även om några partiklar observerades i följande fraktioner (figur 2B,C). Denna separation hindrar inte möjligheten att andra fraktioner än F5–F7 kan innehålla en liten mängd blåsor, eller ens att EV-rika fraktionerna F5–F7 kan innehålla molekylära föroreningar. För att åtminstone säkerställa att F5-F7 fraktionerna är fria från förorenande kouaterande molekyler, var det nödvändigt att följa tids-kurs eluering av de olika föreningarna i SEC förfarandet. För att göra detta, kontroll peptid standarder lades till en liknande UC pellet som tidigare använts. Denna beredning var återigen separeras med sec-förfarandet. Sedan utfördes en matrisassisterad laserdesorption jonisering – tid för flygning (MALDI) masspektrometrianalys för att identifiera SEC-fraktionerna där standarder eluerades (figur 2D). På grund av massan intervallet, endast joniserade produkter från peptid standarder följdes i denna analys. Resultaten visade att dessa produkter kunde detekteras i fraktionerna 10 till 20, vilket visade att något lösligt protein inte kan elueras i samma fraktioner som elbilarna (F5–F7). Dessa resultat bekräftade intresset av denna metod för att skilja elbilar från komponenter som inte är ev. Även om vi antar att F8–F20-fraktionerna kunde innehålla en restfraktion av elbilar, beslutade vi i följande experiment att kombinera EV-positiva fraktioner (F5–F7) i ett enda prov som kallas 2F-EV+. Vi kombinerade också de andra SEC-fraktionerna i två prover som kallas 1F-EV- (F1–F4) och 3F-EV- (F8–F20). Vi grupperade i tre prover av flera skäl. För det första skulle antalet SEC-fraktioner öka tiden för molekylära analyser men också funktionella in vitro-studier. De EV-positiva SEC-fraktionerna uppvisar separat lägre partikeltal och äventyrar även detektionen av molekylära föreningar. På samma sätt ansågs det klokare att gruppera fraktionerna F8–F20 för att vid behov koncentrera de kvarvarande blåsorna och kontrollera deras närvaro genom en preliminär västerländsk blot-analys mot HSP90, en EV-markör. Intressant nog upptäcktes en positiv signal för HSP90 i fraktionen 2F-EV+, även i cellen lysate som positiv kontroll, men inte i 1F-EV- och 3F-EV-prover (figur 2E och kompletterande figur S1 som kontroll). Denna analys bekräftar intresset för 2F-EV + endast och korrekt hantering av tidigare SEC fraktioner. För att bekräfta EV isolering, ett ytterligare experiment med elektronmikroskopi analyseras endast 2F-EV + provet och tillät observation av elfordon med en typisk morfologi och storlek heterogenitet mellan 100 och 400 nm(Figur 2F, G).

Ett annat viktigt steg i valideringen var proteomisk analys (figur 3). Vi utvecklade en hel masspektrometri analys med flera mål: (i) bekräfta isolering av elbilar med detektion av ett stort antal EV markörer i 2F-EV +, (ii) så småningom identifiera förorenande proteiner i EV negativa prover (1F-EV- och 3F-EV-) och (iii) karakterisera proteininnehållet i EVs stödja deras biologiska verksamhet.

Figure 3
Figur 3: Proteomisk analys av EV-positiva och EV-negativa prover. (A)Efter tre oberoende EV-isoleringar från liknande mikrogliacellpreparat lastades proverna 1F-EV-, 2F-EV+ och 3F-EV- för natriumdylfylsulfatpolyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) och migrerades till staplingsgelen för att koncentrera proteiner för att förverkliga sin matsmältning i gel. De resulterande peptiderna analyserades sedan av flytande kromatografi tandem masspektrometri (LC-MS/MS) för att identifiera motsvarande proteiner. b)Jämförelse av identifierade proteiner mellan proverna 1F-EV- och 2F-EV+ som visar vanliga proteiner i båda fraktionerna (19) och proteiner som uteslutande detekteras i 2F-EV+-fraktionen (522). Värmekartan visar den relativa representationen där alla vanliga proteiner mellan 1F-EV- och 2F-EV+ triplicates var överrepresenterade (röda) i 2F-EV+-proverna. ( C)Jämförelse av identifierade proteiner mellan fraktionerna 2F-EV+ och 3F-EV- som visar gemensamma proteiner mellan tre exemplar (113) och uteslutande representerade proteiner (428 i 2F-EV+ och 11 i 3F-EV-). Värmekartan visar den relativa representationen i två kluster. En (kluster A) presenterar 5 överrepresenterade proteiner i 3F-EV-provet och en andra (kluster B) presenterar 108 överrepresenterade proteiner i 2F-EV+. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Från cell-konditionerade media, UC och SEC förfarandet ledde till tre prover 1F-EV-, 2F-EV + och 3F-EV-. Motsvarande proteiner extraherades och koncentrerades genom natrium dodecylsulfat polyarylamid gel elektrofores (SDS-PAGE). Efter en kort migration i stapling gel, proverna samlades in av ett band excision, överförs i olika rör som skall i-gel smält. Produkterna separerades genom omvänd kromatografi i omvänd fas online som var direkt kopplad till en masspektrometer för analys (figur 3A).

Följande resultat, som ett exempel på hela förfarandet, erhölls från mikroglia-konditionerade medium efter en 48 h kultur. Rådata lämnades in till en Råttproteindatabas. De identifierade proteinerna jämfördes mellan proverna 1F-EV- och 2F-EV+(figur 3B)och mellan proverna 2F-EV+ och 3F-EV- (figur 3C). I den första jämförelsen visade Venn diagrammet 19 vanliga proteiner i både fraktioner och 522 proteiner uteslutande upptäcks i 2F-EV + fraktionen. Analysen med hjälp av en kvantitativ proteomik programvara gjorde det möjligt att identifiera den relativa representationen av de gemensamma proteinerna. Resultaten visade en heatmap där alla vanliga proteiner mellan 1F-EV- och 2F-EV+ triplicates var överrepresenterade (röda) i 2F-EV+-proverna. I den andra jämförelsen mellan fraktionerna 2F-EV+ och 3F-EV-, identifierades 113 vanliga proteiner mellan tre exemplar. Dessutom upptäcktes 428 proteiner uteslutande i 2F-EV+ och 11 proteiner hittades uteslutande i 3F-EV-. Efter den kvantitativa analysen lyfte heatmaprepresentationen av de 113 gemensamma proteinerna fram två kluster där klustret A presenterade fem överrepresenterade proteiner i 3F-EV-provet och klustret B presenterade 108 överrepresenterade proteiner i 2F-EV+.

De 428 proteiner som uteslutande representerades och de 108 proteiner som överrepresenterades i 2F-EV+ lämnades in till Exocarta open access-databasen för att upptäcka EV-associerade molekyler. Analysen av de översta 100 EV-markrarna i Exocarta belyste förekomsten av 86 EV-associerade proteiner i 2F-EV+ (figur 4A).

Figure 4
Figur 4: Analys av proteiner från provet 2F-EV+. (A)En pool med 536 proteiner (428 exklusiva och 108 överrepresenterade proteiner) överlämnades till Exocarta-databasen för att upptäcka EV-associerade molekyler. Molekylsymboler av de 86 EV-associerade proteiner som detekteras i topp 100 EV-markörer från Exocarta-databasen. ( B)Förutsägelsen av proteininteraktioner och deras association till utvalda biologiska processer visade immun- och nervskyddande vägar i 2F-EV+-provet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Intressant nog var analysen av de 5 vanliga proteinerna i klustret A och de 11 proteiner som uteslutande representerade i 3F-EV- inte associerade till någon EV-markör (data visas inte). Slutligen visade förutsägelsen av proteininteraktioner och deras samband med utvalda biologiska processer närvaron i 2F-EV+-fraktionen av immunmedlare (21%) ibland involverade i kontrollen av det inflammatoriska svaret (4,1%) (Figur 4B). EV-innehållet i 2F-EV+ var också associerade med neuronal utveckling (16,8%), neuron differentiering (5%) och kontroll av neuronal död (3.8%) som är i enlighet med följande neurite utväxt analys.

Således gör den strategi som vi valt möjligt att få tillgång till alla data och möjliggör en förutsägelse av EV-medierade funktioner före de biologiska analyser som vi sedan utförde (figur 5).

Figure 5
Figur 5: EV-beroende f unctional analyser. Effekterna av microglia-härledda EVs utvärderades på neurite utväxt (övre ram) och effekterna av makrofag-härledda EVs utvärderades på glioma cell invasion (nedre ramen). (A, B) Neuritlängden mättes på PC-12-celler (panel A ändrades från Raffo-Romero et al.16 med tillstånd) eller råtta primära nervceller (B). Resultaten visade en betydande ökning av utväxten under elbilar (+ EVs) jämfört med kontroll (Ctrl). Skalan = 20 μm.(C, D)Tidsförlopp för C6 gliom sfäroidinvasion i kollagen i närvaro av råtta primära makrofag-härledda EVs (C6 + EVs) eller fordon (C6 kontroll). C6 sfäroid 3D invasionen i kollagen övervakades och kvantifierades upp till 6 dagar. Kvantifiering av tumörcellinvasion visas vid 1, 2, 3 eller 6 dagar (C) som observerats på representativa bilder (D). Skalstång = 500 μm. För neurite utväxt analyser, betydelsen beräknades genom oparade Students t-test (* p < 0,05, ** p < 0,01 och *** p < 0,001). För invasionsanalys beräknades betydelsen av enkelriktad ANOVA följt av Tukeys post hoc-test. Felstaplarna anger relativa standardfel för tre oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

På detta sätt studerades de neurotrofa funktionerna hos microglia-härledda EVs på PC-12 cellinje och råtta primära nervceller. Resultaten visade en positiv effekt på utväxten av neurit (figur 5A,B). Förekomsten av elbilar ökade ca 6 och 1,5 vika neurite nätverket i längd och/eller i antal i PC-12 och primära nervceller jämfört med ett kontrolltillstånd. I ett annat sammanhang studerade vi också effekterna av makrofag-härledda elbilar på en invasion av hjärntumör (figur 5C,D). det bedömdes med hjälp av 3D tumör sfäroider inbäddade i en matris av kollagen. Sfäroider som genereras med C6 råtta gliom celler odlades i 6 dagar i ett kollagen matris som innehåller (eller inte innehåller) EVs renas från råtta makrofager odlingssubstrat. Kollagenmatrisen ger en struktur där tumörceller kan invadera och spridas ut ur sfäroiden. Makrofag-härledda EVs försämrat tillväxten och invasionen av glioma sfäroider. Efter en 6 dagars kultur observerades en 50% minskning av invasionen i EV-behandlade sfäroider jämfört med kontrollen. Detta resultat visade att makrofager kan producera elfordon med anti-tumoral och/eller anti-invasiva faktorer som påverkar gliom tillväxt.

Supplementary Figure S1
Kompletterande figur S1: Bilder av membran som används för western-blotting experiment. (A)Originalbild av den västra blot från figur 2E (mot HSP90 EV markör). ( B)Ponceau färgning bild av samma membran som visar korrekt belastning av proteinextrakt från 1F-EV-, 2F-EV + och 3F-EV- prover. Klicka här för att ladda ner denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det centrala nervsystemet (CNS) är en komplex vävnad där cell-till-cell kommunikation reglerar normala neuronala funktioner som krävs för homeostas30. Elfordon studeras nu i stor utsträckning och beskrivs som viktiga molekylära laster för cell-till-cell-kommunikation31. De levererar specifikt en cocktail av medlare till mottagarceller och påverkar därmed deras funktioner under friska och patologiska tillstånd32. Nyligen genomförda studier visar att elbilar spelar en avgörande roll i CNS24,33,,34 och särskilt de från hjärnans immunceller35,36. Balansen mellan pro- och antiinflammatoriska immunsvar är avgörande och gör det möjligt att upprätthålla hjärnans integritet under den synaptiska utvecklingen och de neuronala aktiviteterna under hela livet. Två olika situationer av immunsvar diskuterades i denna studie: förhållandet (i) mellan mikroglia och nervceller och (ii) mellan infiltrera makrofager och gliom celler. För det första är mikroglia de inhemska makrofager i hjärnvävnaden där de spelar en viktig immun roll i förvaltningen av mikromiljön förändringar för att säkerställa neuronala aktiviteter. Men överdriven proinflammatoriska mekanismer kan stödjas av överaktiverad mikroglia och leda till neurodegenerativa sjukdomar37,38. Däremot kräver högvärdiga gliomas antiinflammatoriska profiler och involvera tumör-associerade makrofager (TAMs) rekryteras i tumör platsen. Benmärgsbaserade makrofager (BMDMs) representerar en stor population av dessa TAMs i nära relation med gliomceller. Under påverkan av tumören uppvisar BMDMs in vivo antiinflammatoriska och pro-tumoral profiler39. Hur dessa BMDMs kunde kontrollera in vitro tumoral cell invasion är en avgörande fråga i denna rapport. Det är därför, makrofag-härledda EVs användes ensam i glioma sfäroid invasionen analysen. Tillsammans i samkultur, gliom cellerna skulle ha påverkat makrofager att producera andra EV populationer med antiinflammatoriska profiler. Den direkta användningen av immun EL kan vara mycket bättre som anti-tumoral agent. Följaktligen upprätthåller immunceller cell-till-cell-kommunikation i specifika mikromiljöer där den inflammatoriska balansen starkt påverkas av externa signaler40,41. Förståelsen av EV-medierad immunsvar utgör en stor utmaning att begränsa patogenesen vid många sjukdomar. Identifiering av biologiskt aktiva EV innehåll är en nyckel för att förstå dysregulated inflammatoriska processer och föreslå nya terapeutiska strategier42,43.

I denna studie presenterar vi en metod som består av en differentiell ultracentrifugering process som det första steget för att eliminera cell skräp, apoptotiska organ och lösliga molekyler, i kombination med storlek uteslutning kromatografi att isolera ELVs från molekylära aggregat. När EV-populationerna utvärderas i biologiska analyser är det viktigt att diskriminera EV-innehållet från andra samsolerade material. Det är därför vi förbättrade isoleringen för att skilja EV- från icke EV-associerade föreningar. Genom att lägga till standardproteiner i kontrollprover som lämnats in till SEC-förfarandet kunde vi sedan lokalisera deras elueringsfraktioner av MALDI-TOF. Eftersom standarderna är fria molekyler, de globalt sam eluera med prov-associerade molekylära aggregat relaterade till icke EV material. Ev-fraktionerna från experimentella prover validerades således i ett tillförlitligt isoleringsförfarande. Dessutom utvecklade vi en dubbel proteomisk analysstrategi. Förutom användning av anti-HSP90 antikroppar genom västra blotting som en EV markör preliminära upptäckt, beslutade vi att validera rätt EV fraktionering genom en icke-riktade upptäckt av EV-associerade protein signaturer. Det nuvarande tillvägagångssättet var faktiskt inte avsiktligt inriktat på att upptäcka flera kända EV-markörer på grund av att vissa antikroppar var otillräckliga specificitet och känslighet. Variationen och överflödet av vissa EV markörer på ytan av EV subpopulations är fortfarande kontroversiella i isoleringsförfaranden. Dessutom kan en antikroppsbaserad metod utgöra en gräns i ett stort antal organismer på grund av brist på kommersiella antikroppar medan EV-studierna nu är ett hett ämne inom biologin. Denna icke-riktade analys gjorde det möjligt att identifiera ett högre antal molekyler som redan beskrivs som EV-markörer (86 proteiner i de 100 ev-markörer från Exocarta-databasen). Slutligen kan detta tillvägagångssätt vara riktigt användbart för att validera EV isolering från dåligt beskrivna organismer förutsatt att de upptäckta proteinerna kan presentera betydande homologier till kända EV markörer. Som nyligen beskrivits kan en storskalig proteomisk analys vara ett alternativ till att bara använda ett fåtal godtyckliga markörer43. Detta skulle förbättra diskrimineringen av EV+ fraktioner och identifieringen av deras aktiva innehåll före användning i biologiska analyser.

I själva verket är det nödvändigt att associera karakterisering av EV innehåll till de effekter som observerades i biologiska analyser. Den biologiska effekten av elbilar på mottagarceller tyder på att vesikulära medlare eller effektorer involveras. Återigen, samma icke-riktade analys gör det möjligt att identifiera biologiskt aktiva molekyler. En möjlig optimering i denna analys gäller vilka typer av molekyler det är möjligt att identifiera. Vår strategi baserades på storskalig analys av proteinsignaturer och ledde till prediktiva biologiska vägar som är associerade med immunsvar och neuronöverlevnad. Det är viktigt att överväga andra molekylfamiljer inklusive lipider, mRNA och microRNAs till exempel. Våra aktuella studier associerar dessa ytterligare identifieringar till proteinsignaturerna för att få en global kunskap om denna EV-beroende kommunikation.

Många terapeutiska tillvägagångssätt planeras under de kommande åren. Med tanke på att elbilarna enkelt kan korsa blodhjärnbarriären och nå de patologiska vävnaderna kan dessa molekylära laster användas på olika sätt. Även om denna studie inte belyste EV ytmolekyler, är deras identifiering fortfarande nödvändigt för att bättre förstå adresseringsprocessen mot målceller och vävnader. Den proteomiska analysen i vår metod ger tillgång till dessa data. I detta betänkande presenterade vi i detta betänkande in vitro-produktionen av elbilar som nyttiga cocktails. Vi optimerade inte de bästa förutsättningarna för att prime eller aktivera immuncellerna i förväg. Denna punkt är avgörande eftersom mikromiljön i vävnaderna har en direkt inverkan på immuncellerna och i slutändan bidrar till att forma biogenesen hos deras elbilar. När det till exempel gäller glioblastom har det visat sig att cancercellerna producerar sina egna elbilar, vilket bidrar till att orientera de närliggande TAM mot antiinflammatoriska profiler och deras lokala immunsuppression44,45. Detta är anledningen till att makrofag-härledda elbilar i gliom miljön skiljer sig från dem som produceras i en enda makrofag kultur. Således använde vi direkt makrofag-härledda EVs, separat produceras från en enda makrofag kultur, att kontrollera glioma sfäroid invasionen eftersom en makrofag-glioma co-kultur har ingen kontroll på tumörtillväxt. Ytterligare terapeutiska strategier kan förhindra denna in vivo immunsuppression med hjälp av pro-inflammatoriska och anti-tumoral EVs produceras in vitro från aktiverade makrofager. En liknande strategi skulle kunna användas i samband med neurodegenerativa sjukdomar genom användning av el som härrör från microglia ordentligt varnas för att producera en nervskyddande och antiinflammatoriska svar gynnar neuronal överlevnad. Sammanfattningsvis är studierna av ev-medierad kommunikation mellan immunceller och in vivo-mikromiljön nyckeln till att möjliggöra en bättre förståelse av patogenes och utforma innovativa terapeutiska metoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Det presenterade arbetet stöddes av Ministère de L'Education Nationale, de L'Enseignement Supérieur et de la Recherche och INSERM. Vi bekräftar tacksamt BICeL- Campus Scientific City Facility för tillgång till instrument och teknisk rådgivning. Vi erkänner tacksamt Jean-Pascal Gimeno, Soulaimane Aboulouard och Isabelle Fournier för masspektrometri hjälp. Vi erkänner tacksamt Tanina Arab, Christelle van Camp, Francoise le Marrec-Croq, Jacopo Vizioli och Pierre-Eric Sautière för deras starka bidrag till den vetenskapliga och tekniska utvecklingen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels Bio-rad 4561045EDU  
Acetonitrile Fisher Chemicals A955-1  
Amicon 50 kDa centrifugal filter Merck UFC505024  
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich 9830  
HSP90 α/β antibody (RRID: AB_675659) Santa-cruz sc-13119  
B27 Plus supplement Gibco A3582801  
BenchMixer V2 Vortex Mixer Benchmark Scientific BV1003  
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bradford) Bio-Rad 5000006  
C18 ZipTips Merck Millipore ZTC18S096  
C6 rat glioma cell ATCC ATCC CCL-107  
Canonical tubes Sarstedt 62.554.002  
Centrifuge Eppendorf 5804000010  
CO2 Incubator ThermoFisher    
Confocal microscope LSM880 Carl Zeiss LSM880  
Cover glass Marienfeld 111580  
Culture Dish (60 mm) Sarstedt 82.1473  
Dithiothreitol Sigma-Aldrich 43819  
DMEM Gibco 41966029  
EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph ThermoFisher    
Electron microscope JEM-2100 JEOL    
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid Sigma-Aldrich 03777-10G  
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich ED-100G  
Exo-FBS Ozyme EXO-FBS-50A-1 Exosome depleted FBS
ExoCarta database (top 100 proteins of Evs)     http://www.exocarta.org/
Fetal Bovine Serum Gibco 16140071  
Fetal Horse Serum Biowest S0960-500  
Filtropur S 0.2 Sarstedt 83.1826.001  
Fisherbrand Q500 Sonicator with Probe Fisherbrand 12893543  
FlexAnalysis Brucker    
Fluorescence mounting medium Agilent S3023  
Formic Acid Sigma-Aldrich 695076  
Formvar-carbon coated copper grids Agar scientific Ltd AGS162-3  
Glucose Sigma-Aldrich G8769  
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich 340855  
Hoechst 33342 Euromedex 17535-AAT  
Idoacetamide Sigma-Aldrich I1149  
InstantBlue Coomassie Protein Stain Expedeon ISB1L  
Invert light microscope CKX53 Olympus    
L-glutamine Gibco 25030-024  
LabTek II 8 wells  Nunc 154534  
Laemmli 2x Bio-Rad 1610737  
Laminin Corning 354232  
MaxQuant software (proteins identification software)     https://maxquant.net/maxquant/
MBT Polish stell Brucker 8268711  
MEM 10x Gibco 21090-022  
Methylcellulose Sigma-Aldrich M6385-100G  
MiliQ water Merck Millipore    
Milk Regilait REGILAIT300  
Mini PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell Bio-Rad 1658000FC  
MonoP FPLC column GE Healthcare   no longer available
Nanosight NS300 Malvern Panalytical NS300  
NanoSight NTA software v3.2 Malvern Panalytical    
NanoSight syringe pump Malvern Panalytical    
Neurobasal Gibco 21103-049  
Nitrocellulose membrane GE Healthcare 10600007  
Nonidet P-40 Fluka 56741  
Nunc multidish 24 wells ThermoFisher 82.1473  
Paraformaldehyde Electro microscopy Science 15713  
PC-12 cell line ATCC ATCC CRL-1721  
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122  
Peptide calibration mix LaserBio Labs C101  
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 115-035-003  
Perseus software (Processing of identified proteins)     https://maxquant.net/perseus/
Phalloidin-tetramethylrhodamine conjugate Santa-cruz sc-362065  
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich 78830  
Phosphate Buffer Saline Invitrogen 14190094 no calcium, no magnesium
pluriStrainer M/ 60 µm pluriSelect 43-50060  
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407  
Polycarbonate centrifuge tubes Beckman Coulter 355651  
Protease Inhibitor Sigma-Aldrich S8830-20TAB  
PureCol Cell Systems 5005  
Q-Exactive mass spectrometer ThermoFisher    
rapifleX mass spectrometer Brucker    
Rat cortical neurons Cell Applications R882N-20 Cell origin : Derived from cerebral cortices of day 18 embryonic Sprague Dawley rat brains
Rat Macrophage & Microglia Culture Medium Cell Applications R620K-100 Cell orgin : Normal healthy Rat bone marrow
Rat primary macrophages Cell Applications R8818-10a  
Rat primary microglia Lonza RG535  
Sepharose CL-2B GE Healthcare 17014001  
Sequencing Grade Modified Trypsin Promega V5111  
Slide Dustsher 100204  
Sodium Chloride Scharlau SO0227  
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich L3771  
Sodium Fluoride Sigma-Aldrich S7920-100G  
Sodium hydroxide Scharlab SO0420005P  
Sodium pyrophosphate Sigma-Aldrich S6422-100G  
SpeedVac Vacuum Concentrator ThermoFisher    
String software (functional protein association networks)     https://string-db.org/
SuperSignal West Dura extended Duration Substrate ThermoFisher 34075  
Syringe 1.0 mL Terumo 8SS01H1  
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer cell Bio-Rad 1703940  
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508  
Tris Interchim UP031657  
Tris-Glycine Euromedex EU0550  
Tween 20 Sigma-Aldrich P2287  
Ultracentrifuge Beckman Coulter A95765  
Ultracentrifuge Rotor 70.1 Ti Beckman Coulter 342184  
Uranyl acetate Agar Scientific Ltd AGR1260A  
Whatman filter paper Sigma-Aldrich WHA10347510  
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Sigma-Aldrich C2020-25G  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thion, M. S., Ginhoux, F., Garel, S. Microglia and early brain development: An intimate journey. Science. 362 (6411), 185-189 (2018).
  2. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), New York, N.Y. 841-845 (2010).
  3. Sankowski, R., Mader, S., Valdes-Ferrer, S. I. Systemic Inflammation and the Brain: Novel Roles of Genetic, Molecular, and Environmental Cues as Drivers of Neurodegeneration. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
  4. Chakrabarty, S., Kabekkodu, S. P., Singh, R. P., Thangaraj, K., Singh, K. K., Satyamoorthy, K. Microglia in health and disease. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 43 (3), 25-29 (2015).
  5. Sankowski, R., Mader, S., Valdés-Ferrer, S. I. Systemic inflammation and the brain: novel roles of genetic, molecular, and environmental cues as drivers of neurodegeneration. Frontiers in cellular neuroscience. 9, 28 (2015).
  6. Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
  7. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  8. Domingues, P., et al. Tumor infiltrating immune cells in gliomas and meningiomas. Brain, Behavior, and Immunity. 53, 1-15 (2016).
  9. Hambardzumyan, D., Gutmann, D. H., Kettenmann, H. The role of microglia and macrophages in glioma maintenance and progression. Nature Neuroscience. 19 (1), 20-27 (2016).
  10. Thion, M. S., et al. Microbiome Influences Prenatal and Adult Microglia in a Sex-Specific Manner. Cell. 172 (3), 500-516 (2018).
  11. Hammond, T. R., et al. Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes. Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).
  12. Rajendran, L., et al. Emerging Roles of Extracellular Vesicles in the Nervous System. The Journal of Neuroscience. 34 (46), 15482-15489 (2014).
  13. Gupta, A., Pulliam, L. Exosomes as mediators of neuroinflammation. Journal of Neuroinflammation. 11 (1), 68 (2014).
  14. van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
  15. Budnik, V., Ruiz-cañada, C., Wendler, F. Extracellular vesicles round off communication in the nervous system. Nature Reviews Neurosciences. 17, 160-172 (2016).
  16. Raffo-Romero, A., et al. Medicinal Leech CNS as a Model for Exosome Studies in the Crosstalk between Microglia and Neurons. International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), 4124 (2018).
  17. Zhou, Y., et al. Exosomes Transfer Among Different Species Cells and Mediating miRNAs Delivery. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (12), 4267-4274 (2017).
  18. Arab, T., et al. Proteomic characterisation of leech microglia extracellular vesicles (EVs): comparison between differential ultracentrifugation and OptiprepTM density gradient isolation. Journal of extracellular vesicles. 8 (1), 1603048 (2019).
  19. Murgoci, A. -N., et al. Brain-Cortex Microglia-Derived Exosomes: Nanoparticles for Glioma Therapy. ChemPhysChem. 19 (10), 1205-1214 (2018).
  20. Glebov, K., et al. Serotonin stimulates secretion of exosomes from microglia cells. Glia. 63 (4), 626-634 (2015).
  21. Hooper, C., et al. Wnt3a induces exosome secretion from primary cultured rat microglia. BMC Neuroscience. 13 (1), 144 (2012).
  22. Gabrielli, M., et al. Active endocannabinoids are secreted on extracellular membrane vesicles. EMBO reports. 16 (2), 213-220 (2015).
  23. Antonucci, F., et al. Microvesicles released from microglia stimulate synaptic activity via enhanced sphingolipid metabolism. The EMBO Journal. 31 (5), 1231-1240 (2012).
  24. Frühbeis, C., Fröhlich, D., Kuo, W. P., Krämer-Albers, E. -M. Extracellular vesicles as mediators of neuron-glia communication. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 182 (2013).
  25. Prada, I., et al. Glia-to-neuron transfer of miRNAs via extracellular vesicles: a new mechanism underlying inflammation-induced synaptic alterations. Acta neuropathologica. 135 (4), 529-550 (2018).
  26. Takenouchi, T., et al. Extracellular ATP induces unconventional release of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from microglial cells. Immunology Letters. 167 (2), 116-124 (2015).
  27. Yang, Y., Boza-Serrano, A., Dunning, C. J. R., Clausen, B. H., Lambertsen, K. L., Deierborg, T. Inflammation leads to distinct populations of extracellular vesicles from microglia. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 168 (2018).
  28. Duhamel, M., et al. Paclitaxel Treatment and Proprotein Convertase 1/3 (PC1/3) Knockdown in Macrophages is a Promising Antiglioma Strategy as Revealed by Proteomics and Cytotoxicity Studies. Molecular & Cellular Proteomics. 17 (6), 1126-1143 (2018).
  29. Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: A novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. Journal of Neuroscience Methods. 168 (1), 134-139 (2008).
  30. Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B. Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).
  31. Rashed, M. H., et al. Exosomes: From Garbage Bins to Promising Therapeutic Targets. Int. J. Mol. Sci. Int. J. Mol. Sci. 18 (18), (2017).
  32. Yuana, Y., Sturk, A., Nieuwland, R. Extracellular vesicles in physiological and pathological conditions. Blood Reviews. 27 (1), 31-39 (2013).
  33. Frohlich, D., et al. Multifaceted effects of oligodendroglial exosomes on neurons: impact on neuronal firing rate, signal transduction and gene regulation. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1652), (2014).
  34. Krämer-Albers, E. -M., et al. Oligodendrocytes secrete exosomes containing major myelin and stress-protective proteins: Trophic support for axons. Proteomics. Clinical applications. 1 (11), 1446-1461 (2007).
  35. Verderio, C., et al. Myeloid microvesicles are a marker and therapeutic target for neuroinflammation. Annals of Neurology. 72 (4), 610-624 (2012).
  36. Prada, I., Furlan, R., Matteoli, M., Verderio, C. Classical and Unconventional Pathways of Vesicular Release in Microglia. GLIA. 61, 1003-1017 (2013).
  37. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the CNS in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  38. Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. , (2017).
  39. Kennedy, B. C., et al. Tumor-Associated Macrophages in Glioma: Friend or Foe. Journal of Oncology. 2013, 1-11 (2013).
  40. Potolicchio, I., Carven, G. J., Xu, X., Stipp, C., Riese, R. J., Stern, L. J., Santambroggio, L. Proteomic Analysis of Microglia-Derived Exosomes: Metabolic Role of the Aminopeptidase CD13 in Neuropeptide Catabolism1. The Journal of Immunology. 175, 2237-2243 (2005).
  41. Turola, E., Furlan, R., Bianco, F., Matteoli, M., Verderio, C. Microglial microvesicle secretion and intercellular signaling. Frontiers in Physiology. 3, (2012).
  42. Cocucci, E., Meldolesi, J. Ectosomes and exosomes : shedding the confusion between extracellular vesicles. Trends in Cell Biology. 25 (6), 364-372 (2015).
  43. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  44. de Vrij, J., et al. Glioblastoma-derived extracellular vesicles modify the phenotype of monocytic cells. International Journal of Cancer. 137 (7), 1630-1642 (2015).
  45. van der Vos, K. E., et al. Directly visualized glioblastoma-derived extracellular vesicles transfer RNA to microglia/macrophages in the brain. Neuro-Oncology. 18 (1), 58-69 (2016).

Tags

Neurovetenskap Immunfunktioner mikroglia makrofager nervceller gliomceller extracellulära blåsor
Karakterisering av immuncell-härledda extracellulära blåsor och studera funktionell påverkan på cellmiljön
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lemaire, Q., Duhamel, M.,… More

Lemaire, Q., Duhamel, M., Raffo-Romero, A., Salzet, M., Lefebvre, C. Characterization of Immune Cell-derived Extracellular Vesicles and Studying Functional Impact on Cell Environment. J. Vis. Exp. (160), e60118, doi:10.3791/60118 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter