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Neuroscience

Charakterisierung von immunzellulären Vesikeln und Untersuchung der funktionellen Auswirkungen auf die Zellumgebung

Published: June 2, 2020 doi: 10.3791/60118
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1U1192-Laboratoire Protéomique, Réponse Inflammatoire et Spectrométrie de Masse (PRISM), Univ. Lille, INSERM

Summary

Der vorliegende Bericht hebt die chronologischen Anforderungen an die extrazelluläre Vesikel-Isolierung (EV) von Mikroglia oder Blutmakrophagen hervor. Mikroglia-abgeleitete Elektrofahrzeuge wurden als Regulatoren des Neuritenwachstums evaluiert, während von Blutmakrophagen abgeleitete Elektrofahrzeuge bei der Kontrolle der C6-Gliomzellinvasion in In-vitro-Assays untersucht wurden. Ziel ist es, diese EV-Funktionen als Immunvermittler in bestimmten Mikroumgebungen besser zu verstehen.

Abstract

Der neuroinflammatorische Zustand des Zentralnervensystems (ZNS) spielt bei physiologischen und pathologischen Erkrankungen eine Schlüsselrolle. Mikroglia, die ansässigen Immunzellen im Gehirn und manchmal die infiltrierenden Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen (BMDMs), regulieren das entzündungshemmende Profil ihrer Mikroumgebung im ZNS. Es wird nun akzeptiert, dass die extrazellulären Vesikelpopulationen (EV) aus Immunzellen als Immunmediatoren fungieren. Daher sind ihre Sammlung und Isolierung wichtig, um ihren Inhalt zu identifizieren, aber auch ihre biologischen Auswirkungen auf Empfängerzellen zu bewerten. Die vorliegenden Daten heben die chronologischen Anforderungen an die EV-Isolierung von Mikrogliazellen oder Blutmakrophagen hervor, einschließlich der Schritte zur Ultrazentrifugation und Größenausschlusschromatographie (SEC). Eine nicht zielgerichtete proteomische Analyse ermöglichte die Validierung von Proteinsignaturen als EV-Marker und charakterisierte den biologisch aktiven EV-Gehalt. Mikroglia-abgeleitete Elektrofahrzeuge wurden auch funktionell auf der Primärkultur von Neuronen verwendet, um ihre Bedeutung als Immunmediatoren im Neuritenwachstum zu bewerten. Die Ergebnisse zeigten, dass mikroglia-abgeleitete Elektrofahrzeuge dazu beitragen, das Neuritenwachstum in vitro zu erleichtern. Parallel dazu wurden von Blutmakrophagen abgeleitete Elektrofahrzeuge funktionell als Immunmediatoren in Sphäroidkulturen von C6-Gliomzellen eingesetzt, die Ergebnisse zeigten, dass diese EVs die Gliomzellinvasion in vitro kontrollieren. Dieser Bericht hebt die Möglichkeit hervor, die EV-vermittelten Immunzellfunktionen zu bewerten, aber auch die molekularen Grundlagen einer solchen Kommunikation zu verstehen. Diese Entschlüsselung könnte die Verwendung natürlicher Vesikel und/oder die In-vitro-Vorbereitung von therapeutischen Vesikeln fördern, um Immuneigenschaften in der Mikroumgebung von ZNS-Pathologien nachzuahmen.

Introduction

Viele Neuropathologien stehen im Zusammenhang mit dem neuro-inflammatorischen Zustand, der ein komplexer Mechanismus ist, der zunehmend in Betracht gezogen wird, aber immer noch schlecht verstanden wird, weil die Immunprozesse vielfältig sind und von der Zellumgebung abhängen. Tatsächlich beinhalten die ZNS-Erkrankungen nicht systematisch die gleichen Aktivierungssignale und Immunzellpopulationen, so dass die pro- oder entzündungshemmenden Reaktionen als Ursachen oder Folgen von Pathologien schwer zu bewerten sind. Die hirnresidenten Makrophagen, die als "Mikroglia" bezeichnet werden, scheinen an der Schnittstelle zwischen Nerven- und Immunsystem zu sein1. Mikroglia haben einen myeloischen Ursprung und werden aus dem Dottersack während der primitiven Hämatopoese abgeleitet, um das Gehirn zu kolonisieren, während periphere Makrophagen von der fetalen Leber während der definitiven Hämatopoese abgeleitet werden, um periphere Makrophagen zu werden2. Die Mikrogliazellen kommunizieren mit Neuronen und neuronabgeleiteten Gliazellen wie Astrozyten und Oligodendrozyten3. Mehrere neuere Studien haben gezeigt, dass Mikroglia an neuronaler Plastizität während der ZNS-Entwicklung und der Homöostase von Erwachsenengewebe beteiligt ist, und auch im entzündlichen Zustand, der mit neurodegenerativen Erkrankungen assoziiert ist4,5. Andernfalls kann die Integrität der Blut-Hirn-Schranke in anderen ZNS-Pathologien beeinträchtigt werden. Die Immunantworten, insbesondere bei Glioblastom-Multiforme-Krebs, werden nicht nur von Mikroglia-Zellen unterstützt, da die Blut-Hirn-Schranke durch angiogene Prozesse und das Vorhandensein von Lymphgefäßen6,7reorganisiert wird. Daher tritt eine große Knochenmark-abgeleitete Makrophagen (BMDMs) Infiltration im Hirntumor durch tumorabhängige Angiogenesemechanismen8auf. Die Krebszellen üben einen signifikanten Einfluss auf infiltrierte BMDMs aus, was zu immunsuppressiven Eigenschaften und Tumorwachstum9führt. So ist die Kommunikation zwischen den Immunzellen und ihrer Gehirnmikroumgebung schwer zu verstehen, da der Zellursprung und die Aktivierungssignale unterschiedlich sind10,11. Es ist daher interessant, die Funktionen immunzellassoziierter molekularer Signaturen unter physiologischen Bedingungen zu erfassen. In diesem Zusammenhang kann die Zell-Zell-Kommunikation zwischen Immunzellen und Zellmikroumgebung durch die Freisetzung von extrazellulären Vesikeln (EVs) untersucht werden.

Die Elektrofahrzeuge werden mehr und mehr in der Regulierung von Immunfunktionen unter gesunden sowie pathologischen Bedingungen untersucht12,13. Zwei Populationen, Exosomen und Mikrovesiken, können berücksichtigt werden. Sie präsentieren unterschiedliche Biogenese und Größenbereiche. Die Exosomen sind Vesikel von 30 bis 150 nm Durchmesser und werden aus dem endosomalen System erzeugt und bei der Fusion von multivesicularen Körpern (MVBs) mit der Plasmamembran abgesondert. Die Mikrovesiken haben einen Durchmesser von etwa 100–1.000 nm und werden durch einen nach außen gerichteten Aufblühen aus der Zellplasmamembran14erzeugt. Da die Exosome n.A.-Mikrovesik-Diskriminierung je nach Größe und molekularen Mustern immer noch schwer zu realisieren ist, werden wir im vorliegenden Bericht nur den Begriff Elektrofahrzeuge verwenden. Die EV-assoziierte Kommunikation im ZNS stellt einen Ahnenmechanismus dar, da Studien ihre Beteiligung an wirbellosen Arten wie Nematoden, Insekten oder Anneliden15,16zeigten. Darüber hinaus zeigen die Ergebnisse, die zeigen, dass Elektrofahrzeuge mit Zellen verschiedener Arten kommunizieren können, diesen Mechanismus als Schlüsselschlosssystem, das zunächst auf der Oberflächenmolekülerkennung zwischen Vesikeln und Empfängerzellen basiert und dann die Aufnahme von Mediatoren16,17ermöglicht. Tatsächlich enthalten die Elektrofahrzeuge viele Moleküle wie Proteine (z. B. Enzyme, Signaltransduktion, Biogenesefaktor), Lipide (z. B. Ceramid, Cholesterin) oder Nukleinsäuren (z. B. DNA, mRNA oder miRNAs), die als direkte oder indirekte Regulatoren der Empfängerzellaktivitäten14wirken. Deshalb wurden auch methodische Studien an Immunzellen durchgeführt, um Elektrofahrzeuge zu isolieren und ihre Proteinsignaturen vollständig zu charakterisieren18,19.

Die frühesten Studien zeigten die Freisetzung von Exosomen aus primär kultivierter Rattenmikroglia als induzierbaren Mechanismus nach einer Wnt3a- oder Serotonin-abhängigen Aktivierung20,21. Funktionell im ZNS regulieren mikroglia-abgeleitete Elektrofahrzeuge die synaptische Vesikelfreisetzung durch präsynaptische Terminals in Neuronen, die zur Kontrolle der neuronalen Erregbarkeit beitragen22,23. Mikroglia-abgeleitete Elektrofahrzeuge könnten auch Zytokine-vermittelte Entzündungsreaktionen in großen Hirnregionen24,25vermehren. Wichtig ist, dass die verschiedenen Liganden für die gebührenähnliche Rezeptorfamilie bestimmte Produktionen von Elektrofahrzeugen in der Mikroglia26aktivieren könnten. Beispielsweise zeigen In-vitro-Studien, dass LPS-aktivierte Mikroglia BV2-Zelllinien differenzielle EV-Gehalte einschließlich pro-inflammatorische Zytokineproduzieren 27. Daher könnte die funktionelle Vielfalt von Immunzellsubpopulationen in den ZNS-, Mikroglia- und infiltrierenden BMDMs durch ihre eigenen EV-Populationen bewertet werden, einschließlich der Auswirkungen von Elektrofahrzeugen auf Empfängerzellen und der Identifizierung von EV-Inhalten.

Wir haben zuvor Methoden beschrieben, um die funktionellen Eigenschaften von Mikroglia- und BMDM-abgeleiteten Elektrofahrzeugen nach deren Isolierung zu bewerten16,19. Im vorliegenden Bericht schlagen wir vor, die Wirkung von mikroglia-abgeleiteten Elektrofahrzeugen auf das Neuritenwachstum und die Wirkung von makrophageabgeleiteten Elektrofahrzeugen auf die Kontrolle von Gliomzellaggregaten unabhängig zu bewerten. Diese Studie schlägt auch eine breit angelegte proteomische Analyse der EV-Fraktionen vor, um das EV-Isolationsverfahren zu validieren und die biologisch aktiven Proteinsignaturen zu identifizieren. Die wohltuende Wirkung und die molekulare Entschlüsselung von EEV-Inhalten könnten ihnen helfen, sie zu manipulieren und als therapeutische Mittel bei Hirnerkrankungen zu verwenden.

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Protocol

1. Primärkultur von Mikroglia/Makrophagen

  1. Primärkultur der Mikroglia
    1. Kultur kommerzielle Ratte primäre Mikroglia (2 x 106 Zellen) (siehe Tabelle der Materialien) in Dulbecco modifizierte Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit 10% exosomenfreies Serum, 100 U/ml Penicillin, 100 g/ml Streptomycin und 9,0 g/L Glukose bei 37 °C und 5% CO2.
    2. Sammeln Sie das konditionierte Medium nach einer 48-Stunden-Kultur und gehen Sie zur Isolierung von Elektrofahrzeugen.
  2. Primärkultur von Makrophagen
    1. Kultur kommerzielle Rattenprimärmakrophagen (1 x 106 Zellen) im vom Hersteller zur Verfügung gestellten Medium (siehe Materialtabelle) bei 37 °C und 5%CO2mit exosomenfreiem Serum.
    2. Sammeln Sie das konditionierte Medium nach einer 24-Stunden-Kultur und gehen Sie zur Isolierung von Elektrofahrzeugen.

2. Isolierung von Elektrofahrzeugen

  1. Vorisolation von Elektrofahrzeugen von konditioniertem Medium
    1. Übertragen Sie das konditionierte Kulturmedium aus Mikroglia- oder Makrophagenkulturen (Schritte 1.1.2 oder 1.2.2) in ein konisches Rohr.
    2. Zentrifuge bei 1.200 x g für 10 min bei Raumtemperatur (RT), um die Zellen zu pellet.
    3. Übertragen Sie den Überstand in eine neue konische Röhre. Zentrifuge bei 1.200 x g für 20 min bei RT, um apoptotische Körper zu eliminieren.
    4. Übertragen Sie den Überstand in ein 10,4 ml Polycarbonatrohr und übertragen Sie das Rohr in einen 70,1 Ti Rotor. Ultrazentrifuge bei 100.000 x g für 90 min bei 4 °C, um die EVs zu pellet.
    5. Entsorgen Sie den Überstand, und setzen Sie das Pellet, das EVs enthält, in 200 l mit gefilterter Phosphatpuffer-Saline (PBS) um 200 l von 0,20 m aus.
  2. Isolierung von Elektrofahrzeugen
    1. Erstellung der hausgemachten Kolumne für Größenausschlusschromatographie (SEC)
      1. Entleeren Sie eine Glaschromatographiesäule (Länge: 26 cm; Durchmesser: 0,6 cm) (siehe Materialtisch),waschen und sterilisieren.
      2. Platzieren Sie einen 60-mm-Filter am unteren Rand der Säule.
      3. Stapeln Sie die Säule mit vernetzter Agarose-Gel-Filtrationsbasismatrix, um eine stationäre Phase mit einem Durchmesser von 0,6 cm und einer Höhe von 20 cm zu schaffen.
      4. Spülen Sie die Phase mit 50 ml von 0,20 m gefilterten PBS. Bei 4 °C aufbewahren, falls erforderlich, später verwendet werden.
    2. Legen Sie das resuspendierte EV-Pellet auf die stationäre Phase der SEC-Säule.
    3. Sammeln Sie 20 sequentielle Brüche von 250 l, während Sie weiterhin 0,20 m gefilterte PBS oben in der stationären Phase hinzufügen, um eine Trocknung der Säule zu verhindern. Bewahren Sie die Fraktionen bei Bedarf bei -20 °C auf.
      HINWEIS: Eine längere Lagerung als eine Woche kann bei -80 °C durchgeführt werden, um die EV-Integrität für die molekulare Analyse zu erhalten.
  3. Matrixunterstützte Laser-Desorptionsionisierung (MALDI) Massenspektrometrie-Analyse der SEC-Fraktionen
    1. Fahren Sie mit der EV-Isolierung fort, wie in Abschnitt 2.2 beschrieben.
    2. Setzen Sie das EV-Pellet mit einer Peptid-Kalibriermischlösung mit 200 l aus (siehe Tabelle der Materialien).
    3. Fahren Sie mit der EV-Sammlung fort, wie in den Abschnitten 2.2.1 bis 2.2.3 beschrieben.
    4. Die Fraktion mit einem Vakuumkonzentrator vollständig trocknen.
    5. Rekonstituieren Sie die Fraktionen mit 10 l 0,1% Trifluoressigsäure (TFA).
    6. Mischen Sie 1 l rekonstituierte Fraktion mit 1 l der Matrix von '-cyano-4-hydroxycinnamic acid (HCCA) auf einer MALDI polierten Stahl-Zielplatte.
    7. Analysieren Sie alle Fraktionen mit einem MALDI-Massenspektrometer.
    8. Analysieren Sie generierte Spektren mit dedizierter Software (siehe Tabelle der Materialien).

3. Charakterisierung von Elektrofahrzeugen

  1. Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA)
    HINWEIS:     Die NTA-Analyse wird mit einem Nanopartikel-Tracking-Analyseinstrument (siehe Materialtabelle)und einer automatisierten Spritzenpumpe durchgeführt.
    1. Machen Sie eine Verdünnung (Bereich von 1:50 bis 1:500) von jedem SEC-Anteil ab Schritt 2.2.3 mit 0,20 m gefilterten PBS.
    2. Vortex die Lösung, um EV-Aggregate zu eliminieren.
    3. Die verdünnte Lösung in eine 1 ml Spritze geben und in die automatische Spritzenpumpe geben.
    4. Passen Sie die Kameraeinstellung auf Bildschirmverstärkungsstufe (3) und Kameraebene (13) an.
    5. Klicken Sie auf Ausführen und starten Sie das folgende Skript.
      1. Laden Sie die Probe in die Analysekammer (Infusionsrate: 1.000 für 15 s).
      2. Verringern und stabilisieren Sie den Geschwindigkeitsfluss für Videoaufnahmen (Infusionsrate: 25 für 15 s). Erfassen Sie drei aufeinander folgende 60 s Videos des Partikelflusses.
      3. Passen Sie den Kamerapegel (13) und den Erkennungsschwellenwert (3) vor der Videoanalyse an. Klicken Sie auf Einstellungen| Ok, um die Analyse zu starten und klicken Sie auf Exportieren, wenn die Analyse abgeschlossen ist.
    6. Zwischen jeder Bruchanalyse mit 1 ml 0,20 m gefiltertem PBS waschen.
  2. Elektronenmikroskopische (EM) Analyse
    1. Isolieren Sie Elektrofahrzeuge, wie in Abschnitt 2 beschrieben.
      HINWEIS: Sterile Bedingungen sind nicht erforderlich.
    2. Wiederholen Sie Abschnitt 3.1, um Elektrofahrzeuge zu quantifizieren.
      HINWEIS: Für die EM-Analyse werden nur positive Fraktionen verwendet.
    3. Verwenden Sie einen 50 kDa Zentrifugalfilter (siehe Materialtabelle), um EV-haltige SEC-Fraktionen zu konzentrieren.
    4. Resuspend konzentrierte Elektrofahrzeuge in 30 l mit 2% Paraformaldehyd (PFA).
    5. Laden Sie 10 l der Probe auf ein kohlenstoffbeschichtetes Kupfergitter.
    6. Inkubieren Sie für 20 min in einer nassen Umgebung.
    7. Wiederholen Sie die Schritte 3.2.5 und 3.2.6 für eine gute Absorption der Probe auf dem Raster.
    8. Übertragen Sie das Netz in einen Tropfen von 1% Glutaraldehyd in PBS für 5 min bei RT.
    9. Waschen Sie die Probe mehrmals mit Reinstwasser.
    10. Die Probe 10 min auf Eis mit einer Mischung aus 4% Uranylacetat und 2% Methylcellulose (1:9, v/v) kontrastieren. Entfernen Sie die überschüssige Mischung mit einem Filterpapier.
    11. Trocknen Sie die Probe und beobachten Sie sie unter einem Transmissionselektronenmikroskop bei 200 kV (siehe Materialtabelle).
  3. Western Blot-Analyse
    1. Proteinextraktion
      1. Wiederholen Sie die Schritte 3.2.1 bis 3.2.3, um Elektrofahrzeuge zu isolieren und zu konzentrieren.
      2. Mischen Sie 50 l RIPA-Puffer (150 mM Natriumchlorid [NaCl], 50 mM Tris, 5 mM Ethylenglykol-bis(2-Aminoethylether)-N,N,N,N-Tetraessigsäure [EGTA], 2 mM Ethylendiamin-Tetraessigsäure [EDTA], 100 mM Natriumfluorid [NaF], 10 mM Natriumpyrophosphat, 1% Nonidet P-40, 1 mM Phenylmethansulfonylfluorid [PMSF], 1x Protease-Inhibitor) mit der EV-Probe (25 l aus der EV-Konzentration auf Filter) für 5 min auf Eis, um Proteine zu extrahieren.
      3. Beschallung für 5 s (Amplitude: 500 W; Frequenz: 20 kHz), 3 mal auf Eis.
      4. Entfernen Sie vesikuläre Ablagerungen durch Zentrifugation bei 20.000 x g für 10 min bei 4 °C.
      5. Sammeln Sie den Überstand und messen Sie die Proteinkonzentration mit der Bradford Protein-Assay-Methode.
    2. Natriumdodecylsulfat Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und Western Blotting
      1. Mischen Sie Proteinextrakte (30 g) mit 5c Laemmli Probenpuffer (v/v).
      2. Die Proteinmischung auf ein 12% Polyacrylamid-Gel auftragen.
      3. Migrieren Sie die Proteine im Gel mit TGS-Puffer (25 mM Tris pH 8,5, 192 mM Glycin und 0,1% SDS), bei 70 V für 15 min und 120 V für 45 min.
      4. Übertragen Sie die Proteine 30 min mit halbtrockenem System auf die Nitrozellulosemembran.
      5. Sättigen Sie die Membran für 1 h bei RT mit Sperrpuffer (0,05% Tween 20 w/v, 5% Milchpulver w/v in 0,1 M PBS, pH 7,4).
      6. Inkubieren Sie die Membran über Nacht bei 4 °C mit monoklonalen Anti-Human-Wärmeschockprotein 90 (HSP90) Antikörper, der im Blockierpuffer (1:100) verdünnt wird.
      7. Waschen Sie die Membran dreimal mit PBS-Tween (PBS, 0,05% Tween 20 w/v) für 15 min.
      8. Inkubieren Sie die Membran für 1 h bei RT mit Ziegenmeerrettich peroxidase-konjugierte Anti-Maus-IgG-Sekundärantikörper, der im Sperrpuffer verdünnt wird (1:10.000).
        HINWEIS: Eine negative Kontrolle wird allein mit sekundärem Antikörper durchgeführt.
      9. Wiederholen Sie den Waschschritt (Schritt 3.3.2.7).
      10. Enthüllen Sie die Membran mit verbessertem Chemilumineszenz (ECL) Western Blotting Substrat Kit (siehe Tabelle der Materialien).
  4. Proteomische Analyse
    1. Proteinextraktion und In-Gel-Verdauung
      1. Wiederholen Sie die Schritte 3.2.1 bis 3.2.3, um die Elektrofahrzeuge zu isolieren und zu konzentrieren. Wiederholen Sie Schritt 3.3.1 für die Extraktion von EV-Proteinen.
      2. Führen Sie die Proteinmigration im Stapelgel eines 12% Polyacrylamid-Gels durch.
      3. Fixieren Sie die Proteine im Gel mit Coomassie blau für 20 min bei RT.
      4. Verbrauchen Sie jedes farbige Gelstück und schneiden Sie es in kleine Stücke von 1 mm3.
      5. Waschen Sie die Gelstücke sukzessive mit 300 l jeder Lösung: Reinstwasser für 15 min, 100% Acetonitril (ACN) für 15 min, 100 mM Ammoniumbicarbonat (NH4HCO3) für 15 min, ACN:100 mM NH4HCO3 (1:1, v/v) für 15 min und 100% ACN für 5 min mit kontinuierlichem Rühren.
      6. Vollständig gelen mit Vakuumkonzentrator trocknen.
      7. Führen Sie eine Proteinreduktion mit 100 l von 100 mM NH4HCO3 mit 10 mM Dithiothreitol für 1 h bei 56°C durch.
      8. Führen Sie eine Proteinalkylieation mit 100 l von 100 mM NH4HCO3 mit 50 mM Iodoacetamid für 45 min im Dunkeln bei RT durch.
      9. Waschen Sie die Gelstücke sukzessive mit 300 l jeder Lösung: 100 mM NH4HCO3 für 15 min, ACN:20 mM NH4HCO3 (1:1, v/v) für 15 min und 100% ACN für 5 min mit einem kontinuierlichen Rühren.
      10. Die Gelstücke vollständig mit einem Vakuumkonzentrator trocknen.
      11. Führen Sie die Proteinverdauung mit 50 l Trypsin (12,5 g/ml) in 20 mM NH4HCO3 über Nacht bei 37 °C durch.
      12. Extrahieren Sie die verdauten Proteine aus dem Gel mit 50 l 100% ACN für 30 min bei 37 °C und dann 15 min bei RT mit kontinuierlichem Rühren.
      13. Wiederholen Sie die folgenden Extraktionsverfahren zweimal: 50 l von 5% TFA in 20 mM NH4HCO3 Lösung für 20 min mit kontinuierlichem Rühren.
      14. Fügen Sie 100 l von 100% ACN für 10 min mit kontinuierlichem Rühren hinzu.
      15. Trockene verdaute Proteine mit einem Vakuumkonzentrator und resuspendieren in 20 l von 0,1% TFA.
      16. Die Probe mit einer 10-L-Pipettenspitze mit C18-Reverse-Phasen-Medien zur Entsalzung und Konzentration von Peptiden (siehe Materialtabelle)und Elutepeptiden mit ACN:0,1% Ameisensäure (FA) (80:20, v/v) entsalzen.
      17. Die Probe mit einem Vakuumkonzentrator vollständig trocknen und in 20 l ACN:0,1% FA (2:98, v/v) für die flüssige Chromatographie-Tandemmassenspektrometrie (LC-MS/MS) wieder aufsetzen.
    2. LC-MS/MS-Analyse
      1. Laden Sie das verdautes Peptid in das LC-MS/MS-Instrument und führen Sie eine Proben- und Datenanalyse gemäß den an anderer Stelle beschriebenen Parametern durch42.
    3. Rohdatenanalyse
      1. Verarbeiten Sie Massenspektrometriedaten, um Proteine zu identifizieren und identifizierte Proteine jeder Probe mit einem quantitativen Proteomik-Softwarepaket unter Verwendung von Standardparametern zu vergleichen.
      2. Exportieren Sie mit Hilfe von Standardparametern die Liste der exklusiven und überrepräsentierten Proteine aus EV-positiven Proben in einer Software, die Proteinnetzwerke und biologische Prozesse vorhersagt.
      3. Vergleichen Sie die Liste der identifizierten Proteine in den Fraktionen mit den Top 100 EV-Markern aus der Exocarta Open Access Datenbank (siehe Materialtabelle).

4. Funktionelle EVs Effekte Assay

  1. Neuriten-Auswuchs-Assay auf PC-12-Zelllinie
    1. Kultur PC12 Zelllinie in komplettem DMEM-Medium (2 mM L-Glutamin, 10% fetales Pferdeserum (FHS), 5% fetales Rinderserum (FBS), 100 UI/ml Penicillin, 100 g/ml Streptomycin).
      HINWEIS: Die Seren sind im gesamten Verfahren exosomefrei.
    2. Fügen Sie ein Deckglas (alle Brunnen) zu einer 24-Well-Platte; beschichten Sie die Platte mit Poly-D-Lysin (0,1 mg/ml) und Samen 260.000 Zellen/well.
    3. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C unter 5%CO2.
    4. Nach 24 h Inkubation das Medium in DMEM-Differenzierungsmedium (DMEM mit 2 mM L-Glutamin, 0,1% FHS, 100 UI/ml Penicillin, 100 g/ml Streptomycin) mit 1 x 106 Mikroglia-EVs (ab Schritt 1.1.2) ändern.
      HINWEIS: Die Kontrollbedingung wird ohne Mikroglia-Elektrofahrzeuge im Differenzierungsmedium durchgeführt.
    5. Laden Sie an Tag 4 nach der Aussaat alle Brunnen mit 100 l komplettem DMEM-Medium.
    6. Fixieren Sie die Zellen an Tag 7 nach der Aussaat mit 4% PFA für 20 min bei RT und spülen Sie dreimal (jeweils 10 min) mit PBS.
    7. Die Zellen mit rhodeminkonjugiertem Phalloidin 30 min bei 4 °C beflecken und 3 Mal (jeweils 10 min) mit PBS abspülen.
    8. Die Zellen mit verdünntem Hoechst 33342 (1:10,000) 30 min bei RT färben und 3 mal (jeweils 10 min) mit PBS ausspülen.
    9. Montieren Sie das Deckglas auf einem Dia mit fluoreszierendem Montagemedium (siehe Materialtabelle).
    10. Analysieren Sie das Dia mit einem konfokalen Mikroskop, nehmen Sie 5 zufällige Bilder von jedem Dia.
    11. Messen Sie das Neuritenwachstum mit einer automatisierten Quantifizierungssoftware (Gesamtneuritenlänge), wie an anderer Stelle ausführlich beschrieben43.
  2. Neuritenwachstum auf Rattenprimärneuronen
    1. Beschichten Sie ein 8-Well-Glasschlitten mit Poly-D-Lysin (0,1 mg/ml) und Laminin (20 g/ml).
    2. Kultur ratten kommerzielle Primärneuronen in einem geeigneten Kulturmedium (siehe Tabelle der Materialien), indem sie 50.000 Zellen pro Brunnen plattieren und die Zellen bei 37 °C unter 5%CO2 für 48 h inkubieren.
      HINWEIS: Die seren sind im gesamten Verfahren exosome-frei.
    3. Fügen Sie 1 x 106 Mikroglia-EVs zu Neuronenkulturmedium hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C unter 5%CO2 für 48 h mehr.
      HINWEIS: Kontrollzustand wird ohne Mikroglia-EVs im Neuronenkulturmedium durchgeführt.
    4. Befolgen Sie die Schritte 4.1.6 bis 4.1.9, um die Zellen zu fixieren und zu färben.
    5. Führen Sie die Schritte 4.1.10 und 4.1.11 aus, um die Folie zu analysieren.
  3. Gliom-Zellinvasion
    1. Resuspend C6 Rattengliomzellen in vollständigem DMEM-Medium (DMEM mit 10% FBS, 2 mM L-Glutamin, 1x Antibiotika) mit 5% Kollagen in einer Endkonzentration von 8.000 Zellen in 20 l.
      HINWEIS: Die seren sind im gesamten Verfahren exosome-frei.
    2. Legen Sie 5 ml PBS AT an den Boden einer 60 mm Gewebekulturschale. Invertieren Sie den Deckel und legen Sie Tropfen von 20 l (8.000 Zellen) der Zellsuspension auf den Boden des Deckels ab.
    3. Invertieren Sie den Deckel auf die PBS-gefüllte Bodenkammer und inkubieren Sie die Platte bei 37 °C und 5%CO2 für 72 h, bis Zellsphäroide gebildet werden.
    4. Fügen Sie 1 x 108 Makrophagen-EVs (ab Schritt 1.2.2) zu einem 2,2 mg/ml Kollagengemisch hinzu (2 ml Rinderkollagen-Lösung Typ I [3 mg/ml] mit 250 l mit 10x minimalem essentiellen Medium (MEM) und 500 l 0,1 m Natriumhydroxid).
      HINWEIS: Die Kontrollbedingung wird ohne Makrophagen-EVs in der Kollagenmischung durchgeführt.
    5. Verteilen Sie die Kollagenmischung mit Elektrofahrzeugen in einer 24-Well-Platte zum Einbetten von Zellsphäroiden.
    6. Implantieren Sie die neu gebildeten Zellsphäroide in der Mitte jedes Brunnens.
    7. Inkubieren Sie die Platte für 30 min bei 37°C und 5%CO2, um das Gel zu erstarren.
    8. Danach überlagern Sie 400 l komplettes DMEM-Medium auf der Kollagenmatrix in jedem Brunnen.
    9. Inkubieren Sie das komplette System für insgesamt 6 Tage bei 37 °C und 5%CO2.
      HINWEIS: Die Zellinvasion aus dem Sphäroid wird durch digitale Fotografie mit einem invertierten Lichtmikroskop mit einem 4x/0.10 N.A.-Objektiv überwacht.
    10. Erfassen Sie jeden Tag Bilder von jedem Brunnen.
    11. Verarbeiten Sie Bilder und quantifizieren Invasion von Zellsphäroid-Bereiche mit der Software, wie zuvor im Detail beschrieben42.
      HINWEIS: Invasionundundsphäride Gebiete wurden für jeden Tag zu den Invasions- und Sphäroidbereichen normalisiert, die am Tag 0 gemessen wurden.

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Representative Results

Eine der größten Herausforderungen bei der Zuordnung von bioulären Vesikeln (EVs) ist die Fähigkeit, die Elektrofahrzeuge vom gesamten Kulturmedium zu isolieren. In diesem Bericht stellen wir eine Methode mit Ultrazentrifugation (UC) und Größenausschlusschromatographie (SEC) vor, die an die groß angelegte Analyse von Proteinsignaturen gekoppelt ist, um EV-Marker zu validieren und bioaktive Verbindungen zu identifizieren. Die makrophagen- oder mikroglia-abgeleiteten Elektrofahrzeuge wurden nach einer 24-h- bzw. 48-h-Kultur vom konditionierten Medium isoliert (Abbildung 1).

Figure 1
Abbildung 1: Extrazelluläre Vesikel (EV) Sammlungs- und Isolationsstrategien. Die apoptotischen Körper und die Zellablagerungen wurden durch aufeinanderfolgende Zentrifugationsschritte vom mikroglia- oder makrophagenkonditionierten Medium getrennt. Vom Überstand wurden Elektrofahrzeuge durch Ultrazentrifugation (UC) isoliert. Das UC-Pellet, das EVs enthielt, wurde auf die Säule geladen und durch Größenausschlusschromatographie (SEC) in 20 verschiedenen eluierten Fraktionen getrennt. Wie sich in den weiteren Schritten (Elektronenmikroskopie, Nanopartikel-Tracking-Analyse und proteomische Analyse) zeigt, wurden die SEC-Fraktionen gebündelt und in 1F-EV-, 2F-EV+ und 3F-EV- organisiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Methode folgte aufeinanderfolgenden Zentrifugationsschritten: die erste, um die Zellen zu entfernen und die zweite, um zelluläre Trümmer und apoptotische Körper zu entfernen. Dann wurde der Überstand auf ein neues Rohr übertragen, um eine Ultrazentrifugation bei 100.000 x g für 90 min durchzuführen. Die Vesikel wurden zusammen mit den Proteinaggregaten im endgültigen UC-Pellet gesammelt. Eine SEC-Säule wurde verwendet, um die Verbindungen nach ihrer Größe zu trennen und die Aggregate zu entfernen (Abbildung 1). Um die Isolierung von Elektrofahrzeugen zu bestätigen, folgte jede SEC-Fraktion einer Nanopartikel-Tracking-Analyse (Abbildung 2A).

Figure 2
Abbildung 2: Analyse der SEC-Fraktionen. (A) Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) von SEC-Fraktionen. Die Gesamtzahl der Partikel in jedem SEC-Teilwird mit Balkendiagrammen dargestellt. Die orangefarbenen Balkendiagramme zeigen die drei aufeinanderfolgenden EV+-Fraktionen (F5–F7). (B, C) Bildschirmaufnahmen von NTA-Kammern zeigen signifikante Unterschiede im Partikelfluss zwischen SEC-Fraktionen. (D) Ergänzende MALDI-Massenspektrometrieanalyse. Aus einem anderen UC-Pellet, das Elektrofahrzeuge enthält, wurde vor der SEC-Trennung ein Standard-Kontrollpeptid-Set hinzugefügt, um die Leistung der SEC-Strategie zu validieren. Jede SEC-Fraktion wurde mit matrixgestützter Laser-Desorptionsionisierung - Flugzeit (MALDI-TOF) zur Bestimmung von Standard-positiven Brüchen analysiert. In den neun ersten Spektren (Fraktionen 1 bis 9) wurde kein Signal beobachtet. Die Detektion dieser freien Standards war in den folgenden Fraktionen (Fraktionen 10 bis 20) möglich, was die Fähigkeit des SEC-Verfahrens bestätigt, Elektrofahrzeuge (F5–F7) von löslichen Komponenten (F10–F20) zu trennen. (E) Western Blot Analyse von SEC-Fraktionen als EV-Marker-Voranalyse. Die EV+-Fraktionen (F5–F7) wurden als eine Probe (2F-VE+) gepoolt, während die EV-Fraktionen (F1–F4 bzw. F8–F20) in zwei weiteren Proben, den Namen 1F-EV- und 3F-EV-, gepoolt wurden. Die Ergebnisse zeigten das Vorhandensein eines Heat-Shock Protein 90 (HSP90) (EV-Positivmarker) Signals in 2F-EV+, und auch in Zelllysat als Positivkontrolle, im Vergleich zu den anderen Fraktionen (1F-EV- und 3F-EV-). (F, G) Elektronenmikroskopische Analyse der EV-positiven Probe (2F-EV+). Die Beobachtung unter zwei aufeinanderfolgenden Vergrößerungen ergab das Vorhandensein von Elektrofahrzeugen in einem Größenbereich von etwa 100 nm (weiße Pfeile) und etwa 400 nm (Pfeilspitze). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Partikelzahl war in den Fraktionen 5, 6 und 7 deutlich höher als in den vorherigen (F1–F4) und folgenden (F8–F20). Es war möglich, einen Partikelstrom in diesen Fraktionen zu sehen, auch wenn in den folgenden Fraktionen einige Teilchen beobachtet wurden (Abbildung 2B,C). Diese Trennung verhindert nicht die Möglichkeit, dass andere Fraktionen als F5-F7 eine geringe Menge an Vesikeln enthalten können, oder sogar, dass EV-reiche Fraktionen F5 bis F7 molekulare Verunreinigungen enthalten können. Um zumindest sicherzustellen, dass die F5-F7-Fraktionen frei von kontaminierenden Ko-Eluing-Molekülen sind, war es notwendig, die Zeit-Kurs-Elution der verschiedenen Verbindungen im SEC-Verfahren zu verfolgen. Dazu wurden einem ähnlichen UC-Pellet, wie bisher verwendet, Kontrollpeptidstandards hinzugefügt. Diese Vorbereitung wurde erneut mit dem SEC-Verfahren getrennt. Anschließend wurde eine matrixgestützte Laser-Desorptionsionisierung – Zeit der Flucht (MALDI) Massenspektrometrieanalyse durchgeführt, um die SEC-Fraktionen zu identifizieren, in denen Standards eluiert wurden (Abbildung 2D). Aufgrund des Massensortiments wurden bei dieser Analyse nur ionisierte Produkte aus Peptidstandards befolgt. Die Ergebnisse zeigten, dass diese Produkte in den Fraktionen 10 bis 20 nachweisbar waren, was zeigt, dass ein lösliches Protein nicht in denselben Fraktionen wie die EVs (F5–F7) eluiert werden kann. Diese Ergebnisse bestätigten das Interesse dieses Ansatzes an der Trennung von Elektrofahrzeugen und Nicht-EV-Komponenten. Selbst wenn man davon ausgeht, dass die F8-F20-Fraktionen einen Restanteil an Elektrofahrzeugen enthalten könnten, haben wir in den folgenden Experimenten beschlossen, die EV-positiven Fraktionen (F5–F7) in einer einzigen Probe namens 2F-EV+ zu kombinieren. Wir haben auch die anderen SEC-Fraktionen in zwei Samples kombiniert, die 1F-EV- (F1–F4) und 3F-EV- (F8–F20) genannt werden. Wir haben aus mehreren Gründen drei Proben eingeteilt. Erstens würde die Anzahl der SEC-Fraktionen die Zeit molekularer Analysen, aber auch funktioneller In-vitro-Studien erhöhen. Die EV-positiven SEC-Fraktionen weisen separat niedrigere Partikelzahlen auf und gefährden auch den Nachweis molekularer Verbindungen. Ebenso wurde es als vernünftiger angesehen, die Fraktionen F8–F20 zu gruppieren, um die Restbläschen gegebenenfalls zu konzentrieren und ihre Anwesenheit durch eine vorläufige Western-Blot-Analyse gegen HSP90, einen EV-Marker, zu überprüfen. Interessanterweise wurde in der Fraktion 2F-EV+ ein positives Signal für HSP90, auch im Zelllysat als Positivkontrolle, nicht aber in 1F-EV- und 3F-EV-Proben(Abbildung 2E und Zusatzabbildung S1 als Steuerung) nachgewiesen. Diese Analyse bestätigt nur das Interesse von 2F-EV+ und das korrekte Management der bisherigen SEC-Fraktionen. Um die EV-Isolation zu bestätigen, analysierte ein zusätzliches Experiment mit Elektronenmikroskopie nur die 2F-EV+ Probe und ermöglichte die Beobachtung von Elektrofahrzeugen mit einer typischen Morphologie und Größenheterogenität zwischen 100 und 400 nm (Abbildung 2F,G).

Ein weiterer wichtiger Schritt bei der Validierung war die proteomische Analyse (Abbildung 3). Wir haben eine ganze Massenspektrometrieanalyse mit mehreren Zielen entwickelt: (i) bestätigen die Isolierung von Elektrofahrzeugen mit dem Nachweis einer hohen Anzahl von EV-Markern in 2F-EV+, (ii) schließlich kontaminierende Proteine in den EV-negativen Proben (1F-EV- und 3F-EV-) identifizieren und (iii) den Proteingehalt von Elektrofahrzeugen charakterisieren, die ihre biologischen Aktivitäten unterstützen.

Figure 3
Abbildung 3: Proteomische Analyse von EV-positiven und EV-negativen Proben. (A) Nach drei unabhängigen EV-Isolierungen aus ähnlichen Mikroglia-Zellpräparaten wurden die Proben 1F-EV-, 2F-EV+ und 3F-EV- zur Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) geladen und bis zum Stapelgel migriert, um Proteine zu konzentrieren, um deren In-Gel-Verdauung zu realisieren. Die resultierenden Peptide wurden dann mittels flüssiger chromatographischer Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) analysiert, um die entsprechenden Proteine zu identifizieren. (B) Vergleich der identifizierten Proteine zwischen den Proben 1F-EV- und 2F-EV+ mit gemeinsamen Proteinen in beiden Fraktionen (19) und Proteinen, die ausschließlich in der 2F-EV+-Fraktion (522) nachgewiesen wurden. Die Heatmap zeigt die relative Darstellung, bei der alle gängigen Proteine zwischen 1F-EV- und 2F-EV+ in den 2F-EV+-Proben überrepräsentiert (rot) waren. (C) Vergleich der identifizierten Proteine zwischen den Fraktionen 2F-EV+ und 3F-EV- mit gemeinsamen Proteinen zwischen Dreisprachigen (113) und ausschließlich dargestellten Proteinen (428 in 2F-EV+ und 11 in 3F-EV-). Die Heatmap zeigt die relative Darstellung in zwei Clustern. Eines (Cluster A) stellt 5 überrepräsentierte Proteine in der 3F-EV-Probe und ein zweites (Cluster B) 108 überrepräsentierte Proteine in 2F-EV+ dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Aus zellkonditionierten Medien führte das UC- und SEC-Verfahren zu drei Proben 1F-EV-, 2F-EV+ und 3F-EV-. Die entsprechenden Proteine wurden durch Natriumdodecylsulfat Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) extrahiert und konzentriert. Nach einer kurzen Migration im Stapelgel wurden die Proben durch eine Bandexzision gesammelt und in verschiedenen Schläuchen übertragen, um in-gel verdaut zu werden. Die Produkte wurden durch eine Online-Umkehrphasenchromatographie getrennt, die direkt an ein Massenspektrometer für die Analyse gekoppelt war (Abbildung 3A).

Die folgenden Ergebnisse, als Beispiel für das gesamte Verfahren, wurden aus mikroglia-konditioniertem Medium nach einer 48-stunden-Kultur gewonnen. Die Rohdaten wurden an eine Rat-Protein-Datenbank übermittelt. Die identifizierten Proteine wurden zwischen den Proben 1F-EV- und 2F-EV+ (Abbildung 3B) und zwischen den Proben 2F-EV+ und 3F-EV- (Abbildung 3C) verglichen. Im ersten Vergleich zeigte das Venn-Diagramm 19 gemeinsame Proteine in beiden Fraktionen und 522 Proteine, die ausschließlich in der 2F-EV+-Fraktion nachgewiesen wurden. Die Analyse mit einer quantitativen Proteomik-Software ermöglichte die Identifizierung der relativen Darstellung der gemeinsamen Proteine. Die Ergebnisse zeigten eine Heatmap, bei der alle gängigen Proteine zwischen 1F-EV- und 2F-EV+ In den 2F-EV+-Proben überrepräsentiert (rot) waren. Im zweiten Vergleich zwischen den Fraktionen 2F-EV+ und 3F-EV-wurden 113 gemeinsame Proteine zwischen Triplicaten identifiziert. Darüber hinaus wurden 428 Proteine ausschließlich in 2F-EV+ und 11 Proteine ausschließlich in 3F-EV- nachgewiesen. Im Anschluss an die quantitative Analyse zeigte die Heatmap-Darstellung der 113 gemeinsamen Proteine zwei Cluster auf, in denen der Cluster A fünf überrepräsentierte Proteine in 3F-EV-Proben und der Cluster B 108 überrepräsentierte Proteine in 2F-EV+ präsentierte.

Die 428 ausschließlich dargestellten Proteine und die 108 Proteine, die in 2F-EV+ überrepräsentiert sind, wurden der Exocarta Open Access Datenbank zum Nachweis von EV-assoziierten Molekülen vorgelegt. Die Analyse der Top 100 EV-Marker in Exocarta zeigte das Vorhandensein von 86 EV-assoziierten Proteinen in 2F-EV+ (Abbildung 4A).

Figure 4
Abbildung 4: Analyse von Proteinen aus der 2F-EV+-Probe. (A) Ein Pool von 536 Proteinen (428 exklusive und 108 überrepräsentierte Proteine) wurde der Exocarta-Datenbank vorgelegt, um EV-assoziierte Moleküle zu detektieren. Molekülsymbole der 86 EV-assoziierten Proteine, die in den Top 100 EV-Markern aus der Exocarta-Datenbank nachgewiesen wurden. (B) Die Vorhersage von Proteinwechselwirkungen und deren Zusammenhang mit ausgewählten biologischen Prozessen zeigte immun- und neuroprotektive Bahnen in der 2F-EV+-Probe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Interessanterweise wurde die Analyse der 5 gemeinsamen Proteine im Cluster A und der 11 Proteine, die ausschließlich in 3F-EV- dargestellt sind, keinem EV-Marker zugeordnet (Daten nicht dargestellt). Schließlich zeigte die Vorhersage von Proteinwechselwirkungen und deren Assoziation mit ausgewählten biologischen Prozessen das Vorhandensein von Immunmediatoren in der 2F-EV+-Fraktion (21%) manchmal an der Kontrolle der Entzündungsreaktion beteiligt (4,1%) (Abbildung 4B). Die EV-Inhalte in 2F-EV+ waren auch mit der neuronalen Entwicklung (16,8%), Neuronendifferenzierung (5%) und die Kontrolle des neuronalen Todes (3,8%) die dem folgenden Neuriten-Auswuchs-Assay entspricht.

Die von uns gewählte Strategie ermöglicht somit den Zugriff auf alle Daten und ermöglicht eine Vorhersage der EV-vermittelten Funktionen vor den biologischen Assays, die wir dann durchgeführt haben (Abbildung 5).

Figure 5
Abbildung 5: EV-abhängige f-unctionale Assays. Die Auswirkungen von mikroglia-abgeleiteten Elektrofahrzeugen wurden auf das Neuritenwachstum (oberer Rahmen) und die Auswirkungen von makrophagenabgeleiteten EVs auf die Gliomzellinvasion (unterer Rahmen) untersucht. (A, B) Die Neuritenlänge wurde an PC-12-Zellen (Panel A wurde von Raffo-Romero et al.16 mit Genehmigung modifiziert) oder Anrattenprimärneuronen (B) gemessen. Die Ergebnisse zeigten einen signifikanten Anstieg des Wachstums bei Elektrofahrzeugen (+ Elektrofahrzeugen) im Vergleich zur Kontrolle (Strg). Skala bar = 20 m . (C, D) Zeitverlauf der C6-Glioma-Sphäroid-Invasion in Kollagen in Gegenwart von primären Makrophagen-EVs (C6 + EVs) oder Fahrzeug (C6-Steuerung). Die C6 Sphäroid 3D Invasion in Kollagen wurde überwacht und bis zu 6 Tage quantifiziert. Die Quantifizierung der Tumorzellinvasion wird bei 1, 2, 3 oder 6 Tagen (C) gezeigt, wie auf repräsentativen Bildern (D) beobachtet. Skalenbalken = 500 m. Bei Neuriten-Auswuchs-Assays wurde die Signifikanz durch den ungepaarten Schüler-T-Testberechnet (* p < 0,05, ** p < 0,01 und *** p < 0,001). Für den Invasionstest wurde die Bedeutung durch eine einseitige ANOVA berechnet, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test. Die Fehlerbalken zeigen einen relativen Standardfehler von drei unabhängigen Experimenten an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Auf diese Weise wurden die neurotrophen Funktionen von mikroglia-abgeleiteten EVs auf PC-12-Zelllinie und Ratten-Primärneuronen untersucht. Die Ergebnisse zeigten einen positiven Effekt auf das Neuritenwachstum (Abbildung 5A,B). Das Vorhandensein von Elektrofahrzeugen erhöhte sich im Vergleich zu einer Kontrollbedingung etwa um das 6- bzw. 1,5-fache des Neuritennetzes in der Länge und/oder Anzahl in PC-12 und Primärneuronen. In einem anderen Kontext untersuchten wir auch die Auswirkungen von Makrophagen-abgeleiteten Elektrofahrzeugen auf eine Hirntumorinvasion (Abbildung 5C,D). Es wurde mit 3D-Tumorsphäroide in einer Matrix von Kollagen eingebettet bewertet. Sphäroide, die mit C6-Rattengliomzellen erzeugt wurden, wurden 6 Tage lang in einer Kollagenmatrix kultiviert, die EVs enthält (oder nicht enthält), die aus dem Kulturmedium der Rattenmakrophagen gereinigt wurden. Die Kollagenmatrix bietet eine Struktur, in die Tumorzellen eindringen und sich aus dem Sphäroid ausbreiten können. Die von Makrophagen abgeleiteten Elektrofahrzeuge beeinträchtigten das Wachstum und die Invasion der Gliomsphäride. Nach einer 6-Tage-Kultur wurde ein 50%iger Rückgang der Invasion bei EV-behandelten Sphäroiden im Vergleich zur Kontrolle beobachtet. Dieses Ergebnis zeigte, dass Makrophagen Elektrofahrzeuge mit antitumoralen und/oder antiinvasiven Faktoren erzeugen können, die das Gliomwachstum beeinflussen.

Supplementary Figure S1
Ergänzende Abbildung S1: Bilder der Membran, die für Daswest-Blotting-Experiment verwendet wird. (A) Originalbild des westlichen Blots aus Abbildung 2E (gegen HSP90 EV-Marker). (B) Ponceau-Färbungsbild derselben Membran, das die korrekte Belastung von Proteinextrakten aus 1F-EV-, 2F-EV+ und 3F-EV-Proben zeigt. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

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Discussion

Das zentralnervöse System (ZNS) ist ein komplexes Gewebe, in dem die Zell-zu-Zell-Kommunikation normale neuronale Funktionen reguliert, die für die Homöostase30notwendig sind. Elektrofahrzeuge werden heute weithin untersucht und als wichtige molekulare Ladungen für die Zell-zu-Zell-Kommunikation beschrieben31. Sie liefern speziell einen Cocktail von Mediatoren an Empfängerzellen und beeinflussen so ihre Funktionen unter gesunden und pathologischen Bedingungen32. Jüngste Studien zeigen, dass Elektrofahrzeuge eine entscheidende Rolle in der ZNS24,33,34 und vor allem diejenigen aus Gehirn-Immunzellen35,36. Das Gleichgewicht zwischen pro- und entzündungshemmenden Immunreaktionen ist entscheidend und ermöglicht die Aufrechterhaltung der Integrität des Gehirns während der synaptischen Entwicklung und der neuronalen Aktivitäten während des ganzen Lebens. In dieser Studie wurden zwei unterschiedliche Situationen von Immunantworten diskutiert: die Beziehung (i) zwischen Mikroglia und Neuronen und (ii) zwischen infiltrierenden Makrophagen und Gliomzellen. Erstens sind Mikroglia die ansässigen Makrophagen im Hirngewebe, wo sie eine wichtige Immunrolle bei der Bewältigung der Veränderungen der Mikroumgebung spielen, um die neuronalen Aktivitäten zu gewährleisten. Aber übermäßige pro-inflammatorische Mechanismen können durch überaktivierte Mikroglia unterstützt werden und zu neurodegenerativen Erkrankungen führen37,38. Im Gegensatz dazu erfordern die hochgradigen Gliome entzündungshemmende Profile und beinhalten tumorassoziierte Makrophagen (TAMs), die an der Tumorstelle rekrutiert werden. Die knochenmarkabgeleiteten Makrophagen (BMDMs) stellen eine große Population dieser TAMs in enger Beziehung zu Gliomzellen dar. Unter dem Einfluss des Tumors weisen BMDMs in vivo entzündungshemmende und pro-tumorale Profileauf 39. Wie diese BMDMs die Invasion von In-vitro-Tumorzellen kontrollieren könnten, ist eine entscheidende Frage in diesem Bericht. Aus diesem Grund wurden die makrophage-abgeleiteten Elektrofahrzeuge allein im Gliom-Sphäroid-Invasionstest verwendet. Zusammen in der Kokultur hätten die Gliomzellen die Makrophagen beeinflusst, um andere EV-Populationen mit entzündungshemmenden Profilen zu produzieren. Die direkte Verwendung von Immun-EVs könnte viel besser als Anti-Tumor-Agent sein. Folglich erhalten Immunzellen die Zell-zu-Zell-Kommunikation in bestimmten Mikroumgebungen, in denen das entzündungshemmende Gleichgewicht stark durch externe Signale40,41beeinflusst wird. Das Verständnis der EV-vermittelten Immunantworten stellt eine große Herausforderung dar, die Pathogenese vieler Erkrankungen zu begrenzen. Die Identifizierung biologisch aktiver EV-Inhalte ist ein Schlüssel, um dysregulierte Entzündungsprozesse zu verstehen und neue therapeutische Strategien vorzuschlagen42,43.

In dieser Studie stellen wir eine Methodik vor, die in einem differenziellen Ultrazentrifugationsprozess als ersten Schritt zur Beseitigung der Zellablagerungen, der apoptotischen Körper und der löslichen Moleküle besteht, kombiniert mit der Größenausschlusschromatographie, um Elektrofahrzeuge aus molekularen Aggregaten zu isolieren. Wenn die EV-Populationen in biologischen Assays bewertet werden, ist es entscheidend, die EV-Inhalte von anderen mitisolierten Materialien zu unterscheiden. Deshalb haben wir die Isolierung verbessert, um EV- von nicht EV-assoziierten Verbindungen zu trennen. Durch Zugabe von Standardproteinen in Kontrollproben, die dem SEC-Verfahren unterzogen wurden, konnten wir dann ihre Elutionsfraktionen durch MALDI-TOF lokalisieren. Da es sich bei den Standards um freie Moleküle handelt, ko-elute nativ mit probenassoziierten molekularen Aggregaten, die sich auf nicht-EV-Materialien beziehen. So wurden die EV-Fraktionen aus Versuchsproben in einem zuverlässigen Isolationsverfahren validiert. Darüber hinaus haben wir eine doppelproteomische Analysestrategie entwickelt. Mit Ausnahme der Verwendung des Anti-HSP90-Antikörpers durch Western Blotting als EV-Marker-Vorläufigerkennung haben wir beschlossen, die korrekte EV-Fraktionierung durch einen nicht zielgerichteten Nachweis von EV-assoziierten Proteinsignaturen zu validieren. Tatsächlich konzentrierte sich der gegenwärtige Ansatz nicht absichtlich auf den Nachweis mehrerer bekannter EV-Marker aufgrund der unzureichenden Spezifität und Empfindlichkeit bestimmter Antikörper. Die Variabilität und die Häufigkeit einiger EV-Marker an der Oberfläche von EV-Subpopulationen sind in den Isolationsverfahren noch umstritten. Darüber hinaus könnte eine Antikörper-basierte Methodik eine Grenze in einer hohen Anzahl von Organismen darstellen, da es an kommerziellen Antikörpern fehlt, während die EV-Studien jetzt ein heißes Thema in der Biologie sind. Diese nicht zielgerichtete Analyse ermöglichte die Identifizierung einer höheren Anzahl von Molekülen, die bereits als EV-Marker bezeichnet werden (86 Proteine in den Top 100 EV-Markern aus der Exocarta-Datenbank). Schließlich könnte dieser Ansatz wirklich nützlich sein, um die EV-Isolierung von schlecht beschriebenen Organismen zu validieren, vorausgesetzt, dass die nachgewiesenen Proteine signifikante Homologien zu bekannten EV-Markern darstellen könnten. Wie kürzlich beschrieben, könnte eine groß angelegte proteomische Analyse eine Alternative zur Verwendung nur einiger beliebiger Markersein 43. Dies würde die Diskriminierung von EV+-Fraktionen und die Identifizierung ihrer aktiven Inhalte vor der Verwendung in biologischen Assays verbessern.

In der Tat ist es notwendig, die Charakterisierung von EV-Inhalten mit den Wirkungen in Verbindung zu bringen, die in biologischen Assays beobachtet wurden. Tatsächlich deuten die biologischen Auswirkungen von Elektrofahrzeugen auf Empfängerzellen darauf hin, dass vesikuläre Mediatoren oder Effektoren beteiligt sind. Auch hier ermöglicht die gleiche nicht zielgerichtete Analyse die Identifizierung biologisch aktiver Moleküle. Eine mögliche Optimierung in dieser Analyse betrifft die Arten von Molekülen, die identifiziert werden können. Unsere Strategie basierte auf der groß angelegten Analyse von Proteinsignaturen und führte zu prädiktiven biologischen Pfaden, die mit der Immunantwort und dem Überleben von Neuronen verbunden sind. Es ist wichtig, die anderen Molekülfamilien einschließlich Lipide, mRNA und microRNAs zum Beispiel zu berücksichtigen. Unsere aktuellen Studien assoziieren diese zusätzlichen Identifikationen mit den Proteinsignaturen, um ein globales Wissen über diese EV-abhängige Kommunikation zu erhalten.

In den kommenden Jahren sind viele therapeutische Ansätze vorgesehen. Da die Elektrofahrzeuge in der Lage sind, die Blut-Hirn-Schranke leicht zu überqueren und das pathologische Gewebe zu erreichen, können diese molekularen Ladungen auf unterschiedliche Weise verwendet werden. Obwohl diese Studie die EV-Oberflächenmoleküle nicht hervorhebt, ist ihre Identifizierung immer noch notwendig, um den Adressierungsprozess gegenüber Zielzellen und Geweben besser zu verstehen. Die proteomische Analyse in unserer Methodik ermöglicht den Zugriff auf diese Daten. Ansonsten haben wir in diesem Bericht die In-vitro-Produktion von Elektrofahrzeugen als vorteilhafte Cocktails dargestellt. Wir haben die besten Bedingungen nicht optimiert, um die Immunzellen vorher zu grundieren oder zu aktivieren. Dieser Punkt ist von entscheidender Bedeutung, da die Mikroumgebung in den Geweben einen direkten Einfluss auf die Immunzellen hat und letztlich zur Gestaltung der Biogenese ihrer Elektrofahrzeuge beiträgt. Im Falle des Glioblastoms beispielsweise wurde festgestellt, dass die Krebszellen ihre eigenen Elektrofahrzeuge produzieren und so dazu beitragen, die benachbarten TAMs an entzündungshemmenden Profilen und ihrer lokalen Immunsuppression44,45zu orientieren. Dies ist der Grund, warum sich die von Makrophagen abgeleiteten EVs in der Gliomumgebung von denen unterscheiden, die in einer einzigen Makrophagenkultur erzeugt werden. So verwendeten wir direkt Makrophagen-abgeleitete Elektrofahrzeuge, die separat aus einer einzigen Makrophagenkultur hergestellt wurden, um die Gliom-Sphäroid-Invasion zu kontrollieren, da eine Makrophagen-Glioma-Kokultur keine Kontrolle über das Tumorwachstum hat. Weitere therapeutische Strategien könnten diese In-vivo-Immunsuppression verhindern, indem pro-inflammatorische und antitumorale Elektrofahrzeuge verwendet werden, die in vitro aus aktivierten Makrophagen hergestellt werden. Eine ähnliche Strategie könnte im Kontext neurodegenerativer Erkrankungen durch die Verwendung von EVs aus Mikroglia richtig alarmiert verwendet werden, um eine neuroprotektive und entzündungshemmende Reaktion zu produzieren, die das neuronale Überleben begünstigt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Studien zur EV-vermittelten Kommunikation zwischen Immunzellen und der in vivo Mikroumgebung der Schlüssel sind, um ein besseres Verständnis der Pathogenese zu ermöglichen und innovative therapeutische Ansätze zu entwickeln.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Die vorgestellte Arbeit wurde von der Ministére de L'Education Nationale, de L'Enseignement Supérieur et de la Recherche und INSERM unterstützt. Wir danken der BICeL- Campus Scientific City Facility für den Zugang zu Instrumenten und technischen Ratschlägen. Wir danken Jean-Pascal Gimeno, Soulaimane Aboulouard und Isabelle Fournier für die Unterstützung der Massenspektrometrie. Wir danken Tanina Arab, Christelle van Camp, Francoise le Marrec-Croq, Jacopo Vizioli und Pierre-Eric Sautiére für ihren starken Beitrag zu den wissenschaftlichen und technischen Entwicklungen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels Bio-rad 4561045EDU  
Acetonitrile Fisher Chemicals A955-1  
Amicon 50 kDa centrifugal filter Merck UFC505024  
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich 9830  
HSP90 α/β antibody (RRID: AB_675659) Santa-cruz sc-13119  
B27 Plus supplement Gibco A3582801  
BenchMixer V2 Vortex Mixer Benchmark Scientific BV1003  
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bradford) Bio-Rad 5000006  
C18 ZipTips Merck Millipore ZTC18S096  
C6 rat glioma cell ATCC ATCC CCL-107  
Canonical tubes Sarstedt 62.554.002  
Centrifuge Eppendorf 5804000010  
CO2 Incubator ThermoFisher    
Confocal microscope LSM880 Carl Zeiss LSM880  
Cover glass Marienfeld 111580  
Culture Dish (60 mm) Sarstedt 82.1473  
Dithiothreitol Sigma-Aldrich 43819  
DMEM Gibco 41966029  
EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph ThermoFisher    
Electron microscope JEM-2100 JEOL    
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid Sigma-Aldrich 03777-10G  
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich ED-100G  
Exo-FBS Ozyme EXO-FBS-50A-1 Exosome depleted FBS
ExoCarta database (top 100 proteins of Evs)     http://www.exocarta.org/
Fetal Bovine Serum Gibco 16140071  
Fetal Horse Serum Biowest S0960-500  
Filtropur S 0.2 Sarstedt 83.1826.001  
Fisherbrand Q500 Sonicator with Probe Fisherbrand 12893543  
FlexAnalysis Brucker    
Fluorescence mounting medium Agilent S3023  
Formic Acid Sigma-Aldrich 695076  
Formvar-carbon coated copper grids Agar scientific Ltd AGS162-3  
Glucose Sigma-Aldrich G8769  
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich 340855  
Hoechst 33342 Euromedex 17535-AAT  
Idoacetamide Sigma-Aldrich I1149  
InstantBlue Coomassie Protein Stain Expedeon ISB1L  
Invert light microscope CKX53 Olympus    
L-glutamine Gibco 25030-024  
LabTek II 8 wells  Nunc 154534  
Laemmli 2x Bio-Rad 1610737  
Laminin Corning 354232  
MaxQuant software (proteins identification software)     https://maxquant.net/maxquant/
MBT Polish stell Brucker 8268711  
MEM 10x Gibco 21090-022  
Methylcellulose Sigma-Aldrich M6385-100G  
MiliQ water Merck Millipore    
Milk Regilait REGILAIT300  
Mini PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell Bio-Rad 1658000FC  
MonoP FPLC column GE Healthcare   no longer available
Nanosight NS300 Malvern Panalytical NS300  
NanoSight NTA software v3.2 Malvern Panalytical    
NanoSight syringe pump Malvern Panalytical    
Neurobasal Gibco 21103-049  
Nitrocellulose membrane GE Healthcare 10600007  
Nonidet P-40 Fluka 56741  
Nunc multidish 24 wells ThermoFisher 82.1473  
Paraformaldehyde Electro microscopy Science 15713  
PC-12 cell line ATCC ATCC CRL-1721  
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122  
Peptide calibration mix LaserBio Labs C101  
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 115-035-003  
Perseus software (Processing of identified proteins)     https://maxquant.net/perseus/
Phalloidin-tetramethylrhodamine conjugate Santa-cruz sc-362065  
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich 78830  
Phosphate Buffer Saline Invitrogen 14190094 no calcium, no magnesium
pluriStrainer M/ 60 µm pluriSelect 43-50060  
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407  
Polycarbonate centrifuge tubes Beckman Coulter 355651  
Protease Inhibitor Sigma-Aldrich S8830-20TAB  
PureCol Cell Systems 5005  
Q-Exactive mass spectrometer ThermoFisher    
rapifleX mass spectrometer Brucker    
Rat cortical neurons Cell Applications R882N-20 Cell origin : Derived from cerebral cortices of day 18 embryonic Sprague Dawley rat brains
Rat Macrophage & Microglia Culture Medium Cell Applications R620K-100 Cell orgin : Normal healthy Rat bone marrow
Rat primary macrophages Cell Applications R8818-10a  
Rat primary microglia Lonza RG535  
Sepharose CL-2B GE Healthcare 17014001  
Sequencing Grade Modified Trypsin Promega V5111  
Slide Dustsher 100204  
Sodium Chloride Scharlau SO0227  
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich L3771  
Sodium Fluoride Sigma-Aldrich S7920-100G  
Sodium hydroxide Scharlab SO0420005P  
Sodium pyrophosphate Sigma-Aldrich S6422-100G  
SpeedVac Vacuum Concentrator ThermoFisher    
String software (functional protein association networks)     https://string-db.org/
SuperSignal West Dura extended Duration Substrate ThermoFisher 34075  
Syringe 1.0 mL Terumo 8SS01H1  
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer cell Bio-Rad 1703940  
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508  
Tris Interchim UP031657  
Tris-Glycine Euromedex EU0550  
Tween 20 Sigma-Aldrich P2287  
Ultracentrifuge Beckman Coulter A95765  
Ultracentrifuge Rotor 70.1 Ti Beckman Coulter 342184  
Uranyl acetate Agar Scientific Ltd AGR1260A  
Whatman filter paper Sigma-Aldrich WHA10347510  
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Sigma-Aldrich C2020-25G  

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References

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Neurowissenschaften Ausgabe 160 Immunfunktionen Mikroglia Makrophagen Neuronen Gliomzellen extrazelluläre Vesikel
Charakterisierung von immunzellulären Vesikeln und Untersuchung der funktionellen Auswirkungen auf die Zellumgebung
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Lemaire, Q., Duhamel, M.,… More

Lemaire, Q., Duhamel, M., Raffo-Romero, A., Salzet, M., Lefebvre, C. Characterization of Immune Cell-derived Extracellular Vesicles and Studying Functional Impact on Cell Environment. J. Vis. Exp. (160), e60118, doi:10.3791/60118 (2020).

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