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Genetics

तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया कोशिकाओं में CRISPR/Cas9 Ribonucleoप्रोटीन द्वारा एक RUNX1 Intronic साइलेंसर की ट्रांसक्रिप्शनल भूमिका की जांच

Published: September 1, 2019 doi: 10.3791/60130
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Blood Cancer Cytogenetics and Genomics Laboratory, Department of Anatomical and Cellular Pathology, Prince of Wales Hospital, The Chinese University of Hong Kong, 2State Key Laboratory in Oncology in South China, The Chinese University of Hong Kong

Summary

पूर्व-संयोजित Cas9/guide RNA ribonucleoप्रोटीन परिसरों की प्रत्यक्ष वितरण hematopoietic कोशिकाओं में जीनोम संपादन के लिए एक तेज और कुशल साधन है। यहाँ, हम इस दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए एक RUNX1 intronic साइलेंसर को नष्ट करने और OCI-AML3 ल्यूकेमिक कोशिकाओं में ट्रांसक्रिप्शनल प्रतिक्रियाओं की जांच.

Abstract

मानव जीनोम के थोक ($98%) गैर-कोडिंग दृश्यों के शामिल है. Cis-नियामक तत्व (CREs) गैर-कोडिंग डीएनए अनुक्रम हैं जिसमें जीन अभिव्यक्ति को मॉड्युलेट करने के लिए ट्रांसक्रिप्शनल नियामकों के लिए बाध्यकारी साइटें होती हैं. सीआरई के परिवर्तन कैंसर सहित विभिन्न रोगों में फंसाया गया है। जबकि प्रमोटरों और enhancers जीन विनियमन के अध्ययन के लिए प्राथमिक CREs किया गया है, बहुत कम साइलेंसर की भूमिका के बारे में जाना जाता है, जो CRE का एक और प्रकार है कि जीन दमन मध्यस्थता है. मूल रूप से प्रोकैरियोट में एक अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली के रूप में पहचान की, CRISPR/Cas9 यूकैरियोटिक जीनोम संपादन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण होने के लिए शोषण किया गया है। यहाँ, हम मानव RUNX1 जीन में एक intronic साइलेंसर को नष्ट करने और OCI-AML3 ल्यूकेमिक कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति पर प्रभावों की जांच करने के लिए इस तकनीक का उपयोग प्रस्तुत करते हैं। हमारा दृष्टिकोण दो preassembled Cas9/guide RNA (gRNA) ribonucleoप्रोटीन (RNP) परिसरों के इलेक्ट्रोपोरोनेशन-मध्यस्थ वितरण पर निर्भर करता है दो डबल-स्ट्रैंड ब्रेक (डीएसबी) कि साइलेंसर पार्श्व बनाने के लिए. हटाने आसानी से टुकड़ा विश्लेषण द्वारा जांच की जा सकती है. वैकल्पिक प्रवर्तकों से लिखित विभिन्न एमआरनए का अभिव्यक्ति विश्लेषण प्रवर्तक-निर्भर प्रभावों का मूल्यांकन करने में सहायता करता है। इस रणनीति का उपयोग अन्य सीआरई का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है और हेमेटोपोएटिक कोशिकाओं के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है, जो अक्सर प्लाज्मिड-आधारित तरीकों के साथ ट्रांसफेक्ट करना मुश्किल होता है। एक प्लाज्मिड और वायरस मुक्त रणनीति का उपयोग जीन नियामक कार्यों के सरल और तेजी से आकलन की अनुमति देता है.

Introduction

Cis-नियामकतत्व (CREs) गैर-कोडिंग डीएनए अनुक्रम हैं जिनमें जीन अभिव्यक्ति1,2को नियंत्रित करने के लिए ट्रांसक्रिप्शनल नियामकों के लिए बाध्यकारी साइटें होती हैं. इन तत्वों को आम तौर पर कर रहे हैं 100 करने के लिए 1,000 आधार जोड़े (bp) लंबे. प्रमोटरों और enhancers सीआरई के दो सबसे विशेषता प्रकार हैं. प्रमोटरों प्रतिलेखन शुरू साइटों के करीब निकटता में मौजूद हैं और प्रतिलेखन की बुनियादी इकाई का गठन. अनेक जीनों में एक से अधिक प्रवर्तक होते हैं और उनके वैकल्पिक उपयोग का योगदान प्रतिलेखन विविधता तथा ऊतक विशिष्टता3,4में होता है . दूसरी ओर, enhancers प्रतिलेखन को सक्रिय करने और ऊपर, बहाव या लक्ष्य जीन के introns के भीतर स्थित किया जा सकता है. बढ़ाने दूर से कार्य कर सकते हैं (एक megabase से अधिक) और अभिविन्यास के स्वतंत्र1,2. सीआरई में साइलेंसर और इंसुलेटर5,6 भी शामिलहैं. पूर्व कार्य विपरीत enhancers के लिए ट्रांसक्रिप्शनल दमनकारी के लिए बाध्यकारी द्वारा जीन अभिव्यक्ति को बाधित करने के लिए, जबकि बाद में असतत topologically डोमेन में जीनोम विभाजन पड़ोसी डोमेन से अन्य CREs से जीन को बचाने के लिए. ये तत्व लघु और/या लंबी दूरी के क्रोमैटिन बातचीत के माध्यम से एक दूसरे के साथ मिलकर कार्य करते हैं और उचित spatiotemporal जीन अभिव्यक्ति को निर्देशित करने के लिए नियामक केन्द्रों में आयोजित किए जाते हैं। उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण तकनीकों में हाल की प्रगति ने कई सीआरई की पहचान और कार्यात्मक एनोटेशन को त्वरित किया है जिसने वंश-विशिष्ट जीन को निर्देशित करने वाले ट्रांसक्रिप्शनल नेटवर्क की हमारी समझ को बहुत आसान बना दिया है विभिन्न कोशिकाओं और ऊतकों में अभिव्यक्ति7,8,9,10,11,12.

प्रतिलेखन को विनियमित करने में CREs की मौलिक भूमिकाओं को देखते हुए, उनके परिवर्तन aberant जीन अभिव्यक्ति के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. यह दिखाया गया है कि सीआरई अक्सर मानव कैंसर के विभिन्न प्रकार में आनुवंशिक और epigenetic परिवर्तन द्वारा बाधित कर रहे हैं, जिससे ट्यूमर दीक्षा, प्रगति और आक्रामकता13,14के लिए योगदान . इसके अलावा, सीआरई बाध्यकारी कारकों अक्सर उत्परिवर्तित कर रहे हैं और / सीआरई भी संरचनात्मक विपथन से प्रभावित हो सकते हैं, जैसा कि इम्यूनोग्लोबुलिन भारी (आईजीएच) जीन बढ़ाने के लगातार गुणसूत्र पुनर्व्यवस्थाओं द्वारा उदाहरणदिया जाता है जिसके परिणामस्वरूप बी-सेल लिंफोमा में पड़ोसी ऑनकोजेन्स 16 की असामान्य सक्रियण होती है। घातक माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) में, गुणसूत्र 3Q पुनर्व्यवस्थाद्वारा एक एकल बढ़ाने की repositioning सहवर्ती GATA2 downregation और EVI1 सक्रियण, जो संभावित बढ़ाने कार्यों की शर्त अवरोध द्वारा लक्षित किया जा सकता है का कारण बनता है 17.हाल ही में, हम एक उपन्यास गुणसूत्र स्थानांतरण एक RUNX1 intronic साइलेंसर है कि एक बाल चिकित्सा रोगी18में एएमएल प्रगति के लिए योगदान कर सकते हैं के क्षोभ शामिल विशेषता . इस प्रकार, गैर-कोडिंग कैंसर जीनोम को समझने से रोग रोगजनन, बायोमार्कर खोज और चिकित्सीय हस्तक्षेपों को स्पष्ट करने के लिए उपयोगी अवसर प्रदान होते हैं, जो अंततः रोगी परिणामों में सुधार करते हैं।

CRISPR/Cas9 न्यूक्लिएस मार्ग, मूल रूप से प्रोकैरियोटिक कोशिकाओं में एक अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली के रूप में पहचान की, जीवित कोशिकाओं और जीवों में साइट-विशिष्ट जीनोमिक संपादन के लिए एक तेजी से और लागत प्रभावी साधन के रूप में शोषण किया गया है19,20 ,21,22. CRISPR/Cas9 प्रणाली दो प्रमुख घटक शामिल हैं: gRNA और Streptococus pyogenes- व्युत्पन्न Cas9 nuclease. GRNA लक्ष्य क्षेत्र पहचानता है और संपादन के लिए Cas9 निर्देशित प्रोटोस्पेसर नामक एक विशिष्ट अनुक्रम शामिल हैं। GRNA दो भागों से बना है: CRISPR आरएनए (crRNA), आम तौर पर एक 20-मर न्यूक्लिओटाइड अनुक्रम लक्ष्य डीएनए के पूरक, और एक ट्रांस सक्रिय crRNA (tracrRNA), जो nuclease के लिए एक बाध्यकारी पाड़ के रूप में कार्य करता है. एक प्रोटोस्पेसर आसन्न आकृति (PAM) (5'-NGG) तुरंत लक्ष्य साइट के निकट Cas9 दरार के लिए आवश्यक है और दरार साइट स्थित है 3 न्यूक्लियोटाइड PAM के ऊपर. CRISPR/Cas9-मध्यस्थ जीन संपादन आमतौर पर transfecting कोशिकाओं द्वारा किया जाता है एक प्लाज्मिड के साथ जो Cas9 को एन्कोड करता है और क्लोन gRNA23. हालांकि, यह दृष्टिकोण हेमेटोपोएटिक कोशिकाओं के लिए चुनौतीपूर्ण है, जो अक्सर ट्रांसफेक्ट करने के लिए मुश्किल होते हैं और लंबा वायरस-आधारित ट्रांसडक्शन तरीकों की आवश्यकता होती है। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण preassembled Cas9/gRNA RNP परिसरों24के प्रत्यक्ष सेलुलर वितरण है. आरएनपी वितरण के लिए एक आम विधि इलेक्ट्रोपोरण है, जो कोशिका झिल्ली में अस्थायी छिद्र उत्पन्न करता है, इस प्रकार कोशिकाओं में आरएनपी परिसरों के प्रवेश की अनुमति देता है25,26. इस दृष्टिकोण के लाभ में उपयोग में आसानी, कम ऑफ-लक्ष्य प्रभाव और आरएनपी परिसरों की स्थिरता शामिल है। यहाँ, हम OCI-AML3 ल्यूकेमिया सेल लाइन18में एक RUNX1 intronic साइलेंसर की ट्रांसक्रिप्शनल भूमिका की जांच करने के लिए आरएनपी वितरण विधि का उपयोग करने के एक प्रोटोकॉल का वर्णन, जो एक एएमएल रोगी के परिधीय रक्त से स्थापित किया गया था फ्रेंच-अमेरिकी-ब्रिटिश M4 उपप्रकार27के साथ का निदान | प्रोटोकॉल crRNA के डिजाइन, आरएनपी परिसरों की तैयारी, इलेक्ट्रोपोरेशन के साथ ही स्क्रीनिंग और वांछित क्लोन के बाद लक्षण शामिल हैं.

Protocol

1. CRRNA के डिजाइन

  1. डिजाइन दो crRNAs, एक 5' और लक्ष्य CRE के अन्य 3 ' एक वेब आधारित CRISPR डिजाइन उपकरण28,29,30,31का उपयोग कर. सुनिश्चित करें कि NGG के एक पीएएम Cas9 मान्यता के लिए लक्ष्य अनुक्रम के तुरंत नीचे स्थित है. RUNX1 साइलेंसर18 को हटाने के लिए दो crRNA (crRNA-1 और crRNA-2) का डिजाइन चित्र 1में दिखाया गया है।
    नोट: एक crRNA आम तौर पर लक्ष्य अनुक्रम के लिए पूरक है कि एक 20-मर प्रोटोस्पेसर शामिल हैं।
  2. एक ऑनलाइन जीनोम ब्राउज़र (उदा., NCBI 1000 जीनोम या UCSC जीनोम ब्राउज़र) के खोज बॉक्स में दृश्यों के जीनोमिक स्थानों में प्रवेश करके लक्ष्य और आसन्न पीएएम अनुक्रमों में एकल न्यूक्लिओटाइड बहुरूपता (एसएनपी) /इनडेल्स की उपस्थिति की जांच करें।
    नोट: सामान्य एसएनपी/इनडेलों में सामान्य जनसंख्या में कम से कम 1% की एक छोटी-सी एलीले आवृत्ति होती है।
  3. एक वाणिज्यिक विक्रेता के साथ संश्लेषण के लिए चयनित CRRNA दृश्यों सबमिट करें. इसके अलावा, GRNA डुप्लेक्स गठन के लिए tracrRNA खरीद.

2. विलोपन स्क्रीनिंग प्राइमर्स के डिजाइन

  1. प्राइमर की एक जोड़ी डिज़ाइन करें जो इच्छित विलोपन क्षेत्र के बगल में होती है। सुनिश्चित करें कि प्राइमर Cas9 दरार साइटों से कम से कम 50 बीपी हैं ताकि पीसीआर प्रवर्धन कम से कम दरार साइटों पर गठित indels से प्रभावित है.
  2. सुनिश्चित करें कि amplicon से छोटा है 1,200 बीपी (अधिमानतः बेहतर आकार संकल्प के लिए 600 बीपी से छोटा). इसके अलावा, एक फ्लोरोसेंट डाई के साथ प्राइमर में से एक लेबल (उदाहरण के लिए, 6 carboxyfluorescein (6-FAM)) का पता लगाने के लिए 5'अंत में. RUNX1 साइलेंसर विलोपन18 की स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया प्राइमर चित्र 1में दिखाए गए हैं।

3. Cas9/gRNA RNP परिसरों की तैयारी

  1. 1x TE बफर (10 एमएम Tris, 0.1 एमएम EDTA, पीएच 7.5) में CRRNAs और tracrRNA को 200 डिग्री एम की अंतिम सांद्रता के लिए पुन: निलंबित करें।
  2. प्रत्येक CRRNA के लिए, मिश्रण 2.2 $L के 200 $M crRNA, 2.2 $L के 200 $M tracrRNA और 5.6 $L 1x TE बफर (कुल 10 $L) एक 0.2 एमएल ट्यूब में 44 डिग्री सेल्सियस के एक अंतिम डुप्लेक्स एकाग्रता प्राप्त करने के लिए.
  3. एक thermocycler में 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। ट्यूब GRNA जटिल गठन के लिए कमरे के तापमान को ठंडा करने के लिए अनुमति दें।
  4. 62 डिग्री के रिकॉमबिनेंट Cas9 nuclease के Dilute 10.4 $L के साथ 7.6 $L 1x फॉस्फेट-बफरेड लवण (पीबीएस) के एक अंतिम nuclease एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 36 डिग्री एम.
    नोट: यह राशि दो Cas9/gRNA परिसरों की तैयारी के लिए पर्याप्त है.
  5. चरण 3-3 से प्राप्त प्रत्येक gRNA डुप्लेक्स के साथ पतला न्यूक्लेस के बराबर वॉल्यूम (8.5 डिग्री सेल्सियस) मिलाएं।
  6. RNP जटिल गठन की अनुमति देने के लिए 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट। मिश्रण को बर्फ पर तब तक रखें जब तक कि इलेक्ट्रोपोरेशन न हो जाए।

4. ओसीआई-एएमएल3 सेल में आरएनपी कॉम्प्लेक्स का विद्युतीकरण

  1. संस्कृति OCI-AML3 कोशिकाओं RPMI 1640 मध्यम 10 % गर्मी से सक्रिय भ्रूण गोवंश सीरम (FBS), 1x GlutaMAX, 100 इकाइयों /
  2. trypan नीले धुंधला का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना. सुनिश्चित करें कि इलेक्ट्रोपोरेशन के समय सेल व्यवहार्यता 90% से अधिक है।
  3. सेंट्रीफ्यूज 2.5 x 106 कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर एक 1.5 एमएल ट्यूब में। सुपरनेंट निकालें और 1x पीबीएस के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं को धो लें। कोशिकाओं को फिर से स्पिन करें और सभी अवशिष्ट सुपरनेट को हटा दें।
  4. फीनॉल लाल बिना आरपीएमआई 1640 मध्यम के 163 डिग्री एल में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।  प्रत्येक आरएनपी संकुल के 16.7 $L जोड़ें (चरण 3.6 से) और 3.6 $L के 100 $M इलेक्ट्रोपोरेशन बढ़ाने के लिए कोशिकाओं को (कुल मात्रा $ 200 $L). पाइपिंग द्वारा धीरे से मिलाएं।
    नोट: इलेक्ट्रोपोरेशन बढ़ाने संपादन दक्षता को बढ़ाने के लिए एक वाहक डीएनए है.
  5. मिश्रण को बिना किसी बुलबुले के 0.2 सेमी-गैप इलेक्ट्रोपोरेशन कव्टेट में स्थानांतरित करें। इलेक्ट्रोपोरेशन के साथ एक इलेक्ट्रोपोरेशन सिस्टम (मोड: घातीय; वोल्टेज :: 150 V; क्षमता ] 700 [F; प्रतिरोध [50 ]).
  6. कोशिकाओं को टी-25 टिशू कल्चर फ्लास्क में स्थानांतरित करें जिसमें 6 एमएल पूर्ण RPMI 1640 मध्यम और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 % CO2के साथ इनक्यूबेट होता है .

5. स्क्रीनिंग और Biallelic विलोपन के साथ सेल क्लोन का चयन

  1. विद्युत-प्रवर्तकता के बाद एक दिन पूर्ण RPMI 1640 मध्यम में 5 x 103/mL करने के लिए कोशिकाओं को पतला करें। 96-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेटों के प्रत्येक अच्छी तरह से में पतला सेल निलंबन के 100 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और कोशिकाओं 7-14 दिनों के लिए विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं।
  2. एक उच्च throughput शुद्धि प्रणाली का उपयोग कर कोशिकाओं से जीनोमिक डीएनए निकालें.
  3. एक 96 अच्छी तरह से निष्कर्षण प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए प्लेट बाइंडिंग और lysis बफर के 100 डिग्री एल जोड़ें। बफर करने के लिए 1x PBS के 10 डिग्री एल में फिर से निलंबित 5 x 104 कोशिकाओं जोड़ें और उन्हें pipeting द्वारा मिश्रण.
  4. कुओं के लिए जीनोमिक डीएनए की बाध्यकारी अनुमति देने के लिए 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
  5. अच्छी सतहों को स्क्रैप किए बिना कुओं से समाधान को प्रेरित करें। कुओं को 120 डिग्री सेल्सियस से धो लें।
  6. वायु बाध्य डीएनए वाले कुओं को सुखाती है।
  7. पीसीआर मिश्रण के 20 डिग्री एल (2 $L 10x उच्च फिडेलिटी बफर, 50 एमएम MgSO4के 0.8 डिग्री एल, 10 एम एम डीएनटीपी के 0.4 डिग्री एल, 10 एम एफ एम लेबल फॉरवर्ड प्राइमर के 0.4 डिग्री एल,0.4 $L के लिए 10 $M unlabeled प्राइम और 0.4 यूएई के लिए।
    नोट: प्रत्येक नमूने में अभिकर्मकों के मानकीकृत मात्रा के अलावा सुनिश्चित करने के लिए एक मास्टर मिश्रण तैयार करें.
  8. निष्कर्षण प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए पीसीआर मिश्रण जोड़ें और एक thermocycler में प्रतिक्रियाओं को चलाने (शर्तें: 2 मिनट के लिए प्रारंभिक 94 डिग्री सेल्सियस, 15 s के लिए 94 डिग्री सेल्सियस के 35 चक्र के बाद, 30 s के लिए 56 डिग्री सेल्सियस और 68 डिग्री सेल्सियस के लिए 1 मिनट).
  9. एक fluorometer का उपयोग नमूनों की एक चयनित संख्या में उनकी सांद्रता को मापने के द्वारा उत्पादों की मात्रा का अनुमान. न्यूक्लिएस-फ्री एच2से 0.5 एनजी/एल के साथ सभी नमूनों को विलेन करें।
  10. एक 96-वेल आनुवंशिक विश्लेषक के साथ संगत प्लेट में 8.5 डिग्री एल deionized formamide और फ्लोरोसेंट डाई लेबल आकार मानक के 0.5 डिग्री एल के साथ पतला पीसीआर उत्पादों के 1 डिग्री एल मिलाएं।
    नोट: deionized formamide और आकार मानक युक्त एक मास्टर मिश्रण तैयार करें।
  11. प्लेट को प्लेट सेप्टा से ढककर ले जाएं और थर्मोसाइकिलर में 3 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर नमूने विकृत करें। मशीन का ढक्कन बंद न करें।
  12. पहले वर्णित32के रूप में लेबल PCR उत्पादों को अलग करने के लिए केशिका जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस प्रदर्शन करते हैं।
  13. इलेक्ट्रोफोरोसिस के बाद, परिणामों का विश्लेषण करने के लिए विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलें।
  14. नई परियोजना पर क्लिक करें और माइक्रोसैटेलाइटका चयन करें. फिर ठीकक्लिक करें .
  15. प्रोजेक्ट में नमूने जोड़ें क्लिक करें और परिणाम फ़ाइलों का चयन करें (.fsa एक्सटेंशन शामिल हैं) फिर फ़ाइलों को आयात करने के लिए सूची में जोड़ें क्लिक करें.
  16. चयनित परिणाम फ़ाइलें दिखाने वाली तालिका में, विश्लेषण विधि स्तंभ में Microsatelite डिफ़ॉल्ट चुनें. साथ ही, आकार मानक स्तंभ में उपयोग किए गए आकार मानक का चयन करें. फिर विश्लेषण करें आइकन पर क्लिक करें, प्रयोग का नाम डालें और प्रयोग सहेजें.
  17. परिणाम देखने के लिए प्लॉट प्रदर्शित करें क्लिक करें और प्लॉट सेटिंग में खंड विश्लेषण चुनें.
  18. विश्लेषण के लिए उपयुक्त रंगीन चैनल चुनें. आकार बुला की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए आकार मानक में लेबल टुकड़े को देखने के लिए नारंगी आइकन की जाँच करें।
  19. लेबल किए गए PCR उत्पादों को देखने के लिए नीले आइकन की जाँच करें. उन चोटियों की पहचान करें जो जंगली-प्रकार और उत्परिवर्ती (यानी, अपेक्षित विलोपन वाले) उत्पादों के अनुरूप हैं। जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती चोटियों के तहत क्षेत्र की राशि से उत्परिवर्ती चोटी के तहत क्षेत्र विभाजित करके प्रत्येक नमूने में उत्परिवर्ती स्तर का अनुमान.
  20. आगे सीरियल कमजोर पड़ने के लिए अपेक्षित विलोपन के उच्च स्तर के साथ एकाधिक सेल पूल का चयन करें।
  21. डीएनए निष्कर्षण, फ्लोरोसेंट पीसीआर और केशिका इलेक्ट्रोफोरोसिस चरणों को दोहराएँ। उत्परिवर्ती स्तर के साथ सेल क्लोन का चयन करें और बाद के विश्लेषण के लिए biallelic विलोपन का प्रतिनिधित्व 95%.
  22. Sanger अनुक्रमण द्वारा चयनित क्लोन में विलोपन की पहचान सत्यापित करें.

6. वास्तविक समय मात्रात्मक आरटी-पीसीआर विश्लेषण द्वारा साइलेंसर विलोपन के कार्यात्मक विश्लेषण

  1. चयनित क्लोन से कुल आरएनए निकालें और पूरक डीएनए (cDNA) संश्लेषण प्रदर्शन करते हैं।
  2. 50 डिग्री सेल्सियस ओलिगो (डीटी)20 प्राइमर के 1 डिग्री एल के साथ आरएनए का 1 डिग्री ग्राम और 10 एम एम डीएनटीपी मिश्रण का 1 $एल, 10 डिग्री सेल्सियस की कुल मात्रा में इनक्यूबेट 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर और फिर कम से कम 1 मिनट के लिए बर्फ पर रखें।
  3. 10x आरटी बफर के 2 डिग्री एल, 25 एमएम एमजीसीएल2के 4 डिग्री एल, 0.1 एम डीटीटी के 2 डिग्री एल, आरएनसे अवरोधक के 1 डिग्री एल (40 यू/जेडएल) और रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज (200 यू/जेडएल) के 1 डिग्री एल युक्त सीडीएनए संश्लेषण मिश्रण जोड़ें। 50 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट और फिर एक थर्मोसाइकिलर में 5 मिनट के लिए 85 डिग्री सेल्सियस।
    नोट: रिवर्स प्रतिलेखन के लिए एक मास्टर मिश्रण तैयार करें.
  4. बर्फ पर नमूने ठंडा. 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर RNase H और इनक्यूबेट के 1 $L जोड़ें। -20 डिग्री सेल्सियस पर cDNA स्टोर करें।
  5. डिजाइन प्राइमर और TakMan जांच है कि विशेष रूप से वैकल्पिक प्रमोटरों से उत्पन्न व्यक्तिगत प्रतिलिपि वेरिएंट पहचान.
    नोट: पूर्व-डिजाइन किए गए ट्रांसक्रिप्ट-विशिष्ट प्राइमर/प्रोब सेट वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध हैं।
  6. क्लोन डीएनए टुकड़े प्लाज्मिड डीएनए में विशिष्ट प्रतिलिपि दृश्यों युक्त. प्रतिलिपि परिमाणीकरण के लिए मानक घटता के रूप में पुनः संयोजक प्लाज्मिड के एक 10 गुना तहलका श्रृंखला (106 से 10 प्रतियां) तैयार करें.
  7. प्रत्येक नमूने के लिए पीसीआर मिश्रण (0.5 जेडएल डीएनए टेम्पलेट के 0.5 जेडएल, 20x पूर्व डिजाइन TakMan जांच के 1 $L/ त्रिफला में प्रत्येक नमूने को मापें.
    नोट: वास्तविक समय पीसीआर के लिए एक मास्टर मिश्रण तैयार करें।
  8. एक वास्तविक समय पीसीआर मशीन में प्रतिक्रियाओं चलाने (शर्तें: 2 मिनट के लिए प्रारंभिक 50 डिग्री सेल्सियस और 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 15 s के लिए 94 डिग्री सेल्सियस के 40 चक्र और 1 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस के बाद).
  9. प्रवर्धन के बाद, डेटा का विश्लेषण करने के लिए सॉफ़्टवेयर में विश्लेषण चिह्न क्लिक करें. अभिक्रियाओं की दक्षता एवं रैखिकता का मूल्यांकन करने के लिए मानक वक्रों के प्रतिषेखत तथा सहसंबंध गुणांक की जाँच की जियेम की जाँच की जियेम की जाँच की जा सके। सुनिश्चित करें कि ढलानों -3.1 और -3.6 के बीच हैं और सहसंबंध गुणांक 0.99 से अधिक हैं।
  10. एक हाउसकीपिंग जीन (उदा., GAPDH)के साथ प्रत्येक नमूने में लक्ष्य प्रतिलिपि की प्रतिलिपि संख्या सामान्य.

Representative Results

इस प्रयोग का उद्देश्य RUNX1 जीन में एक intronic साइलेंसर को नष्ट करने और OCI-AML3 कोशिकाओं में RUNX1 प्रतिलेखन पर प्रभावों की जांच है. साइलेंसर की पहचान एक संयोजी आण्विक दृष्टिकोण द्वारा की गई थी और इसमें 209 बीपी कोर तत्व18था . RUNX1 अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने में इस कोर तत्व का अधिक सटीक मूल्यांकन सक्षम करने के लिए, crRNA (crRNA-1 और crRNA-2) इस क्षेत्र18 (चित्र 1) के लिए बारीकी से लक्ष्य करने के लिए डिजाइन किए गए थे। सीआरआरएनए-1 और CRRNA-2 द्वारा लाए गए अनुमानित Cas9 क्लीवेज साइटें क्रमशः कोर तत्व से 29 बीपी और 35 बीपी थीं (चित्र1)। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि जबकि दो CRRNAs के पीएएम साइटों विपरीत किस्में पर रहते हैं, डीएसबी PAM अनुक्रम स्थान से स्वतंत्र रूप से हो जाएगा. इस प्रकार, CRNA-1 और CRRNA-2 द्वारा निर्देशित दो Cas9/GRNA RNP परिसरों के सहवर्ती परिचय RUNX1 टिड्डी से साइलेंसर तत्व का उत्पादन करने की उम्मीद है।

नमूनों की एक बड़ी संख्या में वांछित विलोपन के लिए स्क्रीन करने के लिए, जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण किट के एक 96 अच्छी तरह से प्रारूप उच्च throughput शुद्धि के लिए इस्तेमाल किया गया था. इसके अलावा, निष्कर्षण प्लेटों के कुओं पर बाध्य डीएनए प्रत्यक्ष प्रवर्धन के अधीन किया जा सकता है, इस प्रकार त्रुटियों या प्रदूषण को बार-बार नमूना हस्तांतरण के कारण कम से कम। विलोपन18 की स्क्रीनिंग के लिए प्रयुक्त प्राइमर चित्र 1में दिखाए गए हैं . जंगली प्रकार पीसीआर उत्पाद की उम्मीद आकार के बारे में है 500 बीपी. के बाद से इरादा विलोपन 273 बीपी तक फैला है, उत्परिवर्ती उत्पाद के बारे में 230 बीपी होने की उम्मीद है. इस आकार रेंज केशिका जेल electrophoresis द्वारा सरल और तेजी से टुकड़ा विश्लेषण सक्षम बनाता है. कुल 160 प्रारंभिक सेल पूल की जांच की गई और 14 को कम से कम 70% के उत्परिवर्ती स्तर के साथ अपेक्षित विलोपन ले जाने के लिए पाया गया। पांच पूल तो आगे धारावाहिक कमजोर पड़ने के लिए biallelic विलोपन असर क्लोन की पहचान करने के लिए चुना गया. उत्परिवर्ती उत्पादों के विभिन्न स्तरों के साथ सेल क्लोन से प्रतिनिधि इलेक्ट्रोफेरोग्राम चित्र 2एमें दिखाए गए हैं। विलोपन की पहचान Sanger अनुक्रमण द्वारा सत्यापित किया गया था (चित्र 2बी) . जैसा कि उम्मीद थी, डीएसबी33 की मरम्मत में शामिल होने के गैर-समजात अंत द्वारा गठित indels हटाने क्लोन में अनुमानित दरार स्थलों पर मनाया गया. इसके परिणामस्वरूप अलग-अलग आकारों के उत्परिवर्ती उत्पादों का प्रवर्धन हुआ, जिसका पता केशिका इलेक्ट्रोफोरोसिस द्वारा भी लगाया जा सकता है (चित्र 2क)।

RUNX1 जीन में दो प्रवर्तक होते हैं, नामत दूरस्थ च1 तथा समसमी च2, जो साइलेंसर तत्व34को आश्रय देने वाले एक बडे़ अंतर्न द्वारा पृथक होते हैं। तीन प्रमुख MRNA प्रतिलिपि इन प्रमोटरों द्वारा उत्पादित कर रहे हैं: RUNX1c द्वारा P1 और RUNX1a और RUNX1b द्वारा P234. RUNX1c और RUNX1b के न्यूक्लिओटाइड अनुक्रम पूर्व को छोड़कर समान हैं एक अद्वितीय एन-टर्मिनस है, जिसमें से एक विशिष्ट TakMan जीन अभिव्यक्ति परख डिजाइन किया जा सकता है (चित्र 3ए) . RUNX1bको मापने के लिए , RUNX1b और RUNX1c दोनों को पहचानने वाला एक TakMan परख का उपयोग किया गया था (चित्र 3ए) . RUNX1b स्तर तो RUNX1cसे कुल RUNX1b/RUNX1c घटाकर निर्धारित किया गया. RUNX1a वैकल्पिक splicing के कारण एक स्पष्ट रूप से कम समरूप है और एक विशिष्ट TakMan परख इस संस्करण के लिए उपलब्ध है (चित्र 3ए). अतः च्1 तथा च्2 प्रवर्तकों की क्रियाकलाप का निर्धारण व्यक्तिगत रूप से किया जा सकता है। वास्तविक समय मात्रात्मक आरटी-पीसीआर से पता चला है कि साइलेंसर तत्व को हटाने से पी 1- और पी 2 व्युत्पन्न प्रतिलिपिओं दोनों के अभिव्यक्ति स्तर ों को काफी ऊपर रखा गया है (चित्र 3ठ)।

Figure 1
चित्र 1 : रणनीति RUNX1 intronic साइलेंसर को नष्ट करने के लिए। साइलेंसर (लाल बॉक्स) RUNX1 जीन के पहले intron में स्थित है दो प्रमोटरों P1 और P2 को अलग (hg19 निर्देशांक दिखाए जाते हैं). दो CRRNAs (CRRNA-1 और CRRNA-2) को साइलेंसर तत्व के बगल में डीएसबी को पेश करने के लिए डिजाइन किया गया था। भविष्यवाणी Cas9 दरार साइटों ऊर्ध्वाधर लाल लाइनों द्वारा संकेत कर रहे हैं और पीएएम साइटों (NGG) बैंगनी में हैं. विलोपन की स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया दो प्राइमर खुले तीर द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : विलोपन क्लोन की पहचान. (ए) उत्परिवर्ती पीसीआर उत्पादों (एमयूटी) के विभिन्न स्तरों को दर्शाने वाले सेल क्लोनों के प्रतिनिधि इलेक्ट्रोफेरोग्राम। उत्परिवर्ती उत्पादों का आकार क्लोन के बीच बदलता है क्योंकि दरार साइटों पर गठित indels के. WT - जंगली प्रकार. (ख) संगर अनुक्रमण द्वारा प्रतिनिधि क्लोनों से विलोपन का सत्यापन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : साइलेंसर विलोपन के कार्यात्मक परिणाम. (क) तीन प्रमुख RUNX1 समरूप (RUNX1a, RUNX1b और RUNX1c) दिखाए जाते हैं। इन विभिन्न रूपों में एक ही Runt डीएनए बाइंडिंग डोमेन लेकिन अलग N- (नारंगी) या सी-टर्मिनस (नीला) होते हैं। TakMan जांच / प्राइमर जोड़े के स्थान लाल लाइनों द्वारा संकेत दिया है. संख्याएं एमिनो अम्ल अवशेषों को इंगित करती हैं। (B) वास्तविक समय मात्रात्मक RT-PCR विश्लेषण RUNX1 P1- और P2 के साथ सेल आबादी में प्रतिलिपि (DEL) या बिना (WT) biallelic विलोपन18. GAPDH सामान्यीकरण के लिए इस्तेमाल किया गया था. * और * मान-व्हिटनी परीक्षण द्वारा क्रमशः पी एंड एलटी; 0.05 और पी एंड एलटी; 0.01 को इंगित करते हैं। यह आंकड़ा चेंग एट अल से संशोधित किया गया है18. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

CRISPR/Cas9 प्रणाली जीनोम संपादन अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला में इस्तेमाल किया गया है जैसे जीन नॉकआउट और दस्तक में अध्ययन35,36, प्रतिलेखन विनियमन37,38, विभिन्न की आनुवंशिक इंजीनियरिंग निलेश जीव39,40,41,42,43,44 और जीन चिकित्सा45,46. यहाँ, हम RUNX1 जीन पर एक intronic साइलेंसर को हटाने के कार्यात्मक परिणामों की जांच करने के लिए CRISPR/Cas9 के उपयोग का प्रदर्शन. हमारे दृष्टिकोण में CRISPR घटकों की डिलीवरी प्लाज्मिड डीएनए पर निर्भर नहीं था, gRNA या वायरस की क्लोनिंग लेकिन preassembled Cas9/gRNA RNP परिसरों के विद्युत poration. यह दिखाया गया है कि बहिर्जात डीएनए का उपयोग मेजबान जीनोम में विदेशी वेक्टर दृश्यों के अवांछनीय एकीकरण के साथ जुड़ा हो सकता है, विषाक्तता में वृद्धि हुई और कम दक्षता25,47,48, जबकि वायरस transduction तरीकों समय लेने वाली हैं. इसके अलावा, प्लाज्मिड डीएनए से Cas9 की लंबी अभिव्यक्ति बंद लक्ष्य प्रभाव48बढ़ा सकते हैं. इसके विपरीत, प्रत्यक्ष आरएनपी-आधारित वितरण दृष्टिकोण को पसंदीदा विधि के रूप में स्थापित किया गया है क्योंकि यह बेहतर संपादन दक्षता, चयनात्मकता और सेल व्यवहार्यता के साथ तेज और सीधा है। वास्तव में, lipofection49,50, इलेक्ट्रोपोरेशन25,51,नैनोकणों52, सेल-पेरेटिंग पेप्टाइड्स53, iTOP54 और TRIAMF के रूप में तरीकों की एक किस्म 55 कुशल CRISPR/Cas9 वितरण के लिए विभिन्न सेल प्रकार के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पशु और पौधों की प्रजातियों24,25,26,56,57 में विकसित किया गया है , 58 , 59 , 60 , 61 , 62 , 63.चूंकि गैर-कोडिंग डीएनए अनुक्रम आनुवंशिक विविधताओं के आकर्षण के केंद्र हैं64, लक्ष्य में सामान्य SNPs/indels की उपस्थिति की जाँच और पड़ोसी पीएएम दृश्यों विशेष रूप से प्रासंगिक है जब gRNA डिजाइन कि नियामक लक्ष्य तत्वों.

CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन में एक बाधा नमूने की एक बड़ी संख्या में वांछित उत्परिवर्ती क्लोन की स्क्रीनिंग शामिल है. हम फ्लोरोसेंट पीसीआर कार्यरत स्क्रीनिंग के लिए केशिका जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस के साथ मिलकर के रूप में लक्ष्य उत्परिवर्तन के बारे में 300 बीपी का एक छोटा सा जीनोमिक विलोपन है. इस विधि तेजी से और संवेदनशील है और एक उच्च throughput फैशन में किया जा सकता है. इसके अलावा, इस विधि उत्परिवर्ती स्तर और हटाने के आकार का सही आकलन एक साथ अनुमति देता है. इसके अलावा, विभिन्न फ्लोरोसेंट रंगों के साथ लेबल पीसीआर टुकड़े के मल्टीप्लेक्स विश्लेषण का समर्थन किया है। हम नियमित रूप से इस तकनीक का उपयोग माइलॉयड नियोप्लाज्म65,66में जीनोटाइप छोटे निवेशों/ हमारे अनुभव में, हम लगातार टुकड़ा आकार है कि उच्च परिशुद्धता और उत्परिवर्ती बोझ के साथ 4 बीपी से अलग कर रहे हैं का पता लगा सकते हैं $3 % करने के लिए नीचे. हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस विधि में 1,200 बीपी का एक टुकड़ा आकार सीमा है, और इस प्रकार यह बड़े विलोपन की स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त नहीं है। इसके अलावा, आधार प्रतिस्थापन (अपरिवर्तित टुकड़ा आकार में परिणाम) और अन्य जीनोमिक क्षेत्रों में संभावित ऑफ-लक्ष्य घटनाओं का पता नहीं लगाया जा सकता है। बाद के लिए, महंगा पूरे जीनोम अनुक्रमण व्यापक लक्ष्य क्लोन में वैश्विक अवांछनीय परिवर्तन प्रोफ़ाइल करने के लिए आवश्यक है। बड़े गैर-कोडिंग नियामक दृश्यों की जांच के लिए हमारे वर्तमान दृष्टिकोण को अपनाने के लिए (gt; 1,000 बीपी), एक विस्तृत विलोपन और putative प्रतिलेखन कारक बाइंडिंग साइटों के mutagenesis विश्लेषण इन विट्रो रिपोर्टर जीन परख का उपयोग कर प्रदर्शन किया जा सकता है CRISPR/Cas9 संपादन18के लिए न्यूनतम कार्यात्मक क्षेत्र को रेखांकित करने के लिए पहले से .

चूंकि कई जीनों में एक से अधिक प्रवर्तक3,4होते हैं , इसलिए लक्ष्य जीन टिड्डी में वैकल्पिक प्रवर्तकों के अस्तित्व के बारे में जागरूक होना महत्वपूर्ण है क्योंकि विनियामक तत्वों में हेर-फेर करने से प्रवर्तकों में अंतर प्रभावित हो सकता है। इस प्रकार, विभिन्न प्रमोटरों से व्युत्पन्न ट्रांसक्रिप्ट वेरिएंट को किसी भी प्रमोटर-विशिष्ट प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए अलग-अलग मापा जाना चाहिए। TakMan जांच आधारित परख का उपयोग बेहतर विशिष्टता और reproducibility की वजह से SYBR ग्रीन पर पसंद किया जाता है. यदि और अधिक उन्नत डिजिटल पीसीआर प्रणाली उपलब्ध है, प्रतिलिपि परिमाणीकरण मानक वक्र निर्माण की आवश्यकता के बिना और अधिक ठीक किया जा सकता है.

कैंसर सेल लाइनों में CRISPR/Cas9 प्रयोगों के प्रदर्शन में एक महत्वपूर्ण विचार loidy और लक्ष्य जीन प्रतिलिपि संख्या लगभग सभी कैंसर सेल लाइनों के रूप में इस्तेमाल किया कोशिकाओं में संरचनात्मक और प्रतिलिपि संख्या विविधताओं सहित आनुवंशिक परिवर्तन बंदरगाह है. हमारे मामले में, OCI-AML3 45 से 50 गुणसूत्रों के साथ एक hyperdipoid karyotype है. इसके अलावा, सेल लाइन एक सामान्य RUNX1 प्रतिलिपि संख्या ले के रूप में कैंसर सेल लाइन विश्वकोश67 और situ संकरीकरण अध्ययन में फ्लोरोसेंट से पता चला पाया गया18. प्रतिलिपि संख्या लाभ के साथ किसी जीन को लक्षित करते समय, वितरण विधि को संपादन के लिए CRISPR घटकों के पर्याप्त स्तर प्रदान करने के लिए ऑप्टिमाइज़ करने की आवश्यकता हो सकती है. इसके अलावा, अधिक क्लोन पूरी नॉकआउट की पहचान करने के क्रम में जांच करने की आवश्यकता हो सकती है। महत्वपूर्ण बात यह है कि यह दिखाया गया है कि प्रवर्धित जीनोमिक क्षेत्रों में लक्ष्यीकरण, विशेष रूप से संरचनात्मक पुनर्व्यवस्थाओं के कारण, कैंसर कोशिकाओं में जीन-स्वतंत्र एंटीप्रोलाइफल प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर कर सकता है, जिससे जीन में झूठे सकारात्मक परिणाम हो सकते हैं कार्यात्मक अध्ययन68,69,70. इस संबंध में, आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएई) नॉकडाउन और/या सीडीएनए ओवरएक्सप्रेशन जैसे वैकल्पिक दृष्टिकोणों को CRISPR निष्कर्षों को सत्यापित करने के लिए नियोजित किया जाना चाहिए। इसके अलावा, कई सेल लाइनों सेल लाइन विशेष लेकिन जीन स्वतंत्र CRISPR संपादन प्रभाव की गलत व्याख्या से बचने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.

CRISPR/Cas9 प्रणाली जीनोम संपादन के लिए एक सरल और कुशल साधन प्रदान करके बुनियादी और अनुवाद अनुसंधान में क्रांति ला दी है. यहाँ हम CRISPR/Cas9 का उपयोग करने में आसानी का प्रदर्शन करने के लिए एक कैंसर सेल लाइन में ट्रांसक्रिप्शनल अध्ययन के लिए एक intronic silencer बाधित. इस तकनीक के डीएनए स्तर पर CREs के अध्ययन के लिए अनुमति देता है और अंतर्जात संदर्भ में CRE कार्यों की जांच करने के अवसर प्रदान करता है बजाय पारंपरिक विषमगुण रिपोर्टर जीन. हाल ही में, एक CRISPR आधारित आरएनए संपादन प्रणाली भी71 की पहचान की गई है और नियामक तत्वों से लिखित आरएनए को लक्षित करके सीआरई का अध्ययन करने के लिए एक उपन्यास उपकरण के रूप में काम कर सकते हैं। गुणसूत्र रचना पर कब्जा तकनीक के साथ संयोजन करके, CRISPR/Cas9 निश्चित रूप से बदल जीनोम संगठन और जीन अभिव्यक्ति विभिन्न स्वास्थ्य समस्याओं से जुड़े में CREs की भागीदारी को समझने में मदद मिलेगी.

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों OCI-AML3 सेल लाइन प्रदान करने के लिए प्रो एमडी Minden (प्रिंस मार्गरेट कैंसर सेंटर, विश्वविद्यालय स्वास्थ्य नेटवर्क, टोरंटो, कनाडा) का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं. इसके अलावा, लेखक इस शोध के समर्थन में सुविधाएं और सहायता प्रदान करने के लिए कैंसर जीनोमिक्स और पैथोबायोलॉजी (चीनी विश्वविद्यालय हांगकांग) की कोर उपयोगिताएँ धन्यवाद देना चाहूंगा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 cm gap electroporation cuvette Bio-Rad 1652086
1×TE buffer, pH 7.5 Integrated DNA Technologies 11-01-02-02
10 mM dNTP mix Thermo Fisher Scientific 18427013
3500 Genetic Analyzer Thermo Fisher Scientific 4405673
6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer Thermo Fisher Scientific None
7300 Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific None
7300 System SDS Software Thermo Fisher Scientific None Version 1.3.1
Bio-Rad Gene Pulser Xcell system Bio-Rad 1652660
ChargeSwitch Direct gDNA Purification Kit, 96-well Thermo Fisher Scientific CS11205
crRNA-1 Integrated DNA Technologies Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA Components of the Cas9/gRNA complex
crRNA-2 Integrated DNA Technologies Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA Components of the Cas9/gRNA complex
Deionized formamide Thermo Fisher Scientific 4311320
Electroporation Enhancer Integrated DNA Technologies 1075915
Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 10270098
Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q32857
GeneMapper Software 5 Thermo Fisher Scientific 4475073
GeneScan 600 LIZ Size Standard Thermo Fisher Scientific 4408399
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061
PBS, 10x Solution, pH 7.4 Affymetrix 75889
Penicillin and streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity Thermo Fisher Scientific 11304029
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q32854
Recombinant S. pyogenes Cas9 nuclease Integrated DNA Technologies 1081058 Components of the Cas9/gRNA complex
RPMI 1640 medium Thermo Fisher Scientific 31800-022
RPMI 1640 medium without phenol red Thermo Fisher Scientific 11835030
RUNX1a TaqMan gene expression assays Thermo Fisher Scientific 4331182 Hs04186042_m1
RUNX1b/c TaqMan gene expression assays Thermo Fisher Scientific 4331182 Hs00231079_m1
RUNX1c TaqMan gene expression assays Thermo Fisher Scientific 4331182 Hs01021966_m1
SuperScript III First-Strand Synthesis System Thermo Fisher Scientific 18080051
TaqMan Universal PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific 4304437
tracrRNA Integrated DNA Technologies 1072533 Components of the Cas9/gRNA complex
TRIzol Reagent Thermo Fisher Scientific 15596018
Unlabeled PCR reverse primer Thermo Fisher Scientific None

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जेनेटिक्स अंक 151 CRISPR/CAS9 ribonucleoप्रोटीन इलेक्ट्रोपोर्शन cis-नियामक तत्व साइलेंसर ट्रांसक्रिप्शनल नियंत्रण ल्यूकेमिया
तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया कोशिकाओं में CRISPR/Cas9 Ribonucleoप्रोटीन द्वारा एक <em>RUNX1</em> Intronic साइलेंसर की ट्रांसक्रिप्शनल भूमिका की जांच
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Cheng, C. K., Wong, T. H. Y., Yung,… More

Cheng, C. K., Wong, T. H. Y., Yung, Y. L., Chan, N. C. N., Ng, M. H. L. Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells. J. Vis. Exp. (151), e60130, doi:10.3791/60130 (2019).

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