Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Generering av ventrikkel-lignende HiPSC-avledet Cardiomyocytes og høy kvalitet Cell forberedelser for kalsium håndtering karakterisering

Published: January 17, 2020 doi: 10.3791/60135
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Cardiovascular Research Center, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Summary

Her beskriver vi og validerer en metode for å konsekvent generere robuste menneskelige indusert pluripotent stilk celle-avledet cardiomyocytes og karakterisere deres funksjon. Disse teknikkene kan hjelpe i å utvikle mekanistisk innsikt i signalering trasé, gir en plattform for stor skala narkotika screening, og pålitelig modell hjertesykdommer.

Abstract

Human indusert pluripotent stilk cellen-avledet cardiomyocytes (iPSC-CMs) gir en verdifull menneskelig kilde for å studere grunnleggende vitenskapen om kalsium (ca2 +) håndtering og signalering trasé samt høy gjennomstrømming narkotika screening og toksisitet analyser. Heri gir vi en detaljert beskrivelse av metodene som brukes til å generere høy kvalitet iPSC-CMs som kan konsekvent reprodusere molekylære og funksjonelle egenskaper på tvers av ulike cellelinjer. I tillegg er en metode beskrevet for å pålitelig vurdere deres funksjonelle karakterisering gjennom evalueringen av ca2 + håndtering egenskaper. Lav oksygen (O2) forhold, melkesyre valg, og lengre tid i kulturen produsere høy renhet og høy kvalitet ventrikkel-lignende cardiomyocytes. Analog med isolere voksen rotten cardiomyocytes (ARCMs), 3-måneden-gamle iPSC-CMs forevise høyere ca2 + amplitude, hurtigere rate av ca2 + reopptak (forråtnelse-tau), og en positiv lusitropic svaret å β-adrenerge stimulering sammenlignet med dag 30 IPSC-CMS. Strategien er teknisk enkel, kostnadseffektiv og reproduserbar. Det gir en robust plattform for å modellere CARDIAC sykdom og for stor skala narkotika screening å målrette ca2 + håndtering proteiner.

Introduction

Humant indusert pluripotent Stem Cell-avledet cardiomyocytes (IPSC-CMs) er et attraktivt menneske-basert plattform for å modellere et stort utvalg av hjertesykdommer in vitro1,2,3,4,5,6,7,8. Dess, IPSC-CMs kan brukes for prediksjon av pasienten svar på romanen eller eksisterende rusmidler, til skjermen hit forbindelser, og utvikle nye personlige legemidler9,10. Imidlertid, til tross for betydelig fremgang, adskillige begrensninger og angripe nød å bli betraktet som når benytter iPSC-CMs11. Følgelig metoder for å forbedre CARDIAC differensiering protokoller, for å forbedre IPSC-CMs effektivitet og modning, og å generere spesifikke cardiomyocyte undergrupper (ventrikkel, atrieflimmer, og Nodal) har vært intenst studert og allerede ført til en rekke kultur strategier for å overvinne disse hekk12,13,14,15.

Til tross for robusthet av disse protokollene, er en stor bekymring for bruk av iPSC-CMs reproduserbarhet av lange og kompliserte prosedyrer for å oppnå høy kvalitet cardiomyocytes som kan sikre samme ytelse og reproduserbar resultater. Reproduserbarhet er ikke bare kritisk når du sammenligner cellelinjer med ulike genetiske bakgrunner, men også når du gjentar cellulære og molekylære sammenligninger av samme cellelinje. Celle variasjon, som brønn-til-brønn-forskjeller i iPSCs-tettheten, kan påvirke hjerte differensiering, generere lav ytelse og cardiomyocytes av dårlig kvalitet. Disse cellene kan fortsatt brukes til å utføre eksperimenter som ikke krever en ren befolkning av CMs (f. eks, når du utfører ca2 + transient målinger). Faktisk, når du utfører elektrofysiologisk analyse, vil ikke-CMs ikke slå, verken spontant eller under elektrisk stimulering, så det vil være lett å ekskludere dem fra analysen. Men på grunn av dårlig kvalitet, iPSC-CMs kan vise endrede elektrofysiologisk egenskaper (f. eks uregelmessig ca2 + transient, lav ca2 + amplitude) som ikke er på grunn av deres genetiske makeup. Derfor, spesielt når du bruker iPSC-CMs for å modellere hjertesykdom, er det viktig å ikke forvirre resultater fra en dårlig kvalitet CM med sykdommen fenotype. Nøye screening og eksklusjon prosesser er nødvendig før du fortsetter å elektrofysiologisk studier.

Denne metoden inkluderer optimaliserte protokoller for å generere høy renhet og høy kvalitet cardiomyocytes og for å vurdere deres funksjon ved å utføre ca2 + transient målinger ved hjelp av et kalsium-og contractility oppkjøp og analysesystem. Denne teknikken er en enkel, men likevel kraftig, måte å skille mellom høy effektivitet og lav effektivitet iPSC-CM forberedelser og gi en mer fysiologisk relevant karakterisering av menneskelig iPSC-CMs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Eksperimentene bruker voksen rotte cardiomyocytes i denne studien ble gjennomført med godkjent institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) protokoller av Icahn School of Medicine ved Sinai-fjellet. Den voksne rotte cardiomyocytes ble isolert fra Sprague Dawley rotte hjerter av den Langendorff-baserte metoden som tidligere beskrevet16.

1. utarbeidelse av Media

  1. Klargjør hiPSC-mediet.
    1. Likevekt supplement og basal medium til romtemperatur (RT). Sørg for at tillegget har tint helt. Bland 400 mL av basal mediet og 100 mL av tillegget og filteret med et vakuum drevet filter på 0,22 μm. Oppbevares ved 4 ° c og likevekt til RT før bruk.
  2. Forbered RPMI + B27.
    1. Likevekt B27-tillegget og basal mediet (RPMI 1640) til RT. Kontroller at tillegget har tint helt. Bland 490 mL av basal mediet og 10 mL av 50x-tillegget og filteret ved hjelp av et vakuum drevet 0,22 μm-filter. Oppbevares ved 4 ° c og likevekt til RT før bruk.
  3. Klargjør RPMI + B27 (-) insulin.
    1. Likevekt B27 (-) insulin tillegget og basal mediet (RPMI 1640) til RT. Kontroller at tillegget har tint helt. Bland 490 mL av basal mediet og 10 mL av 50x-tillegget og filteret ved hjelp av et vakuum drevet 0,22 μm-filter. Oppbevares ved 4 ° c og likevekt til RT før bruk.
  4. Klargjør utvalgs medier (RPMI (-) glukose + B27 + melkesyre).
    1. Likevekt B27-tillegget og basal mediet (RPMI 1640 (-) glukose) til RT. Sørg for at tillegget har tint helt. Bland 490 mL av basal mediet og 10 mL av 50x-tillegget, tilsett 4 mM natrium melkesyre i sterilt vann, og Filtrer ved hjelp av et vakuum drevet 0,22 μm-filter. Oppbevares ved 4 ° c og likevekt til RT før bruk.
  5. Forbered RPMI 20.
    1. Likevekt den basale medium (RPMI 1640) til RT. Bland fosterets storfe serum (FBS) (20% endelig konsentrasjon) og RPMI. Filter med et vakuum drevet filter på 0,22 μm og oppbevares ved 4 ° c. Likevekt til RT før bruk.
  6. Forbered passaging medier ved å legge til Rho-assosiert, spiral-coil inneholdende protein kinase (ROCK)-hemmer (2 μM endelig konsentrasjon) til hiPSC Media.
  7. Klargjør D0 medier ved å legge til GSK-3-hemmere, CHIR 99021 til RPMI + B27 (-) insulin medier (10 μM endelig).
  8. Klargjør D3 og D4-mediene ved å blande RPMI + B27 (-) insulin medier med IWR-1 (5 μM-finalen).
    Merk: D1 og D5-mediet er konstituert av RPMI + B27 (-) insulin. D7 medier er konstituert av RPMI + B27.
  9. Klargjør blokkerings buffer (2% blod serum albumin [BSA], 2% FBS, 0,05% NP-40 i fosfat-bufret saltvann [PBS]): i et 50 mL konisk rør, tilsett 1 g BSA, 1 mL FBS, 49 mL av PBS og 250 μL av NP-40. Bland til helt oppløst.

2. utarbeidelse av Human embryonale Stem Cell (hESC)-kvalifiserte Matrix belagte plater og Coverslips

Merk: Utfør alle trinnene under en sterilisert vev kultur hette.

  1. Tin hESC-kvalifisert matrise lagerløsning over natten på is ved 4 ° c. Se produkt spesifikasjonsarket for å finne ut passende alikvot volumer, da dette kan variere avhengig av aksjen. Oppbevar disse alikvoter ved-20 ° c i 1,5 mL mikrosentrifugen rør.
  2. For å bruke matrisen for belegg plater eller glass coverslips, først tine en alikvot av hESC-kvalifisert matrise ved 4 ° c i 30 min.
  3. Alikvot 24 mL kaldt Dulbecco er modifisert Eagle medium (DMEM): næringsstoff blanding F-12 (DMEM/F: 12) medier i et 50 mL konisk rør.
  4. Bland den kalde DMEM/F: 12 medier med en 2 mL glass pipette for å kjøle ned overflaten av pipette.
  5. Ved bruk av samme pipette, ta opp ca. 500 − 700 μL av kaldt DMEM/F: 12 og bland med hESC-kvalifiserte matrise alikvot innenfor selve mikrosentrifugen røret.
  6. Når riktig blandet, overføre løsningen til 50 mL konisk rør som inneholder kaldt DMEM/F: 12 og bland igjen.
  7. For en standard 6 brønn plate, tilsett 1 mL av denne blandingen til hver brønn. Sørg for at brønnen er helt dekket. La platene på RT under vev kultur panseret i minst 30 min. Hvis ønskelig, Oppbevar ved 4 ° c umiddelbart etter plating i opptil 1 uke og likevekt til RT i 30 minutter før bruk.
  8. For å bruke platene, aspirer matrisen og Erstatt med aktuelle medier. Bruk umiddelbart.
  9. Oppbevar glass coverslips i et sterilt miljø (f.eks. inne i et sterilt vevs kultur deksel).
  10. Før belegg, tørk hver enkelt dekkglass med 70% etanol. Når dekkglass er tørr, plasserer den inne i en brønn av en steril 6 brønn plate.
  11. Ta 250 − 300 μL av hESC-kvalifisert matrise løsning og forsiktig dispensere den direkte på midten av glass dekkglass. La coverslips på RT under vev kultur panseret i minst 30 min før bruk.

3. utarbeidelse av små molekyler

Merk: Rekonstituer alle små molekyler og wnt modulatorer i DMSO med mindre annet er oppgitt.

  1. Forbered 10 mM alikvoter på 25 μL hver av IWR-1 og CHIR 99021 og oppbevares ved-20 ° c.
  2. Rekonstituer 10 mM alikvoter på 50 μL hver av Thiazovivin (ROCK-hemmer) og oppbevares ved-20 ° c.

4. vedlikehold og Passaging av iPSCs

Merk: Utfør alle de følgende trinnene under en steril vevs kultur hette.

  1. Oppretthold iPSCs i standard 6 brønn plater og utfør alle trinn under sterile forhold. Oppretthold cellene med 2 mL hiPSC-medier per brønn. Endre Media annenhver dag. Hold cellene på 37 ° c, 6% O2,5% co2. Passasje cellene når de er mellom 70 − 80% confluent.
  2. Likevekt PBS uten ca2 + og mg2 + til RT.
  3. For å starte passaging prosessen, tilsett 1 mL PBS uten ca2 + og mg2 + til brønnen som må passert. Ruge ved RT for 7 − 10 min. Kontroller cellene under mikroskopet for å sikre at PBS-behandlingen ikke har resultert i fullstendig dissosiasjon av monolag.
  4. Fjern PBS og Erstatt med 1 mL passaging medium. Bruk en celle løfter å forsiktig skrape og løfte cellene fra overflaten av brønnen.
  5. Mekanisk distansere cellene ved hjelp av en steril 2 mL glass pipette. Gjenta til cellene er godt dissosiert jevnt inn i små kolonier når observert under et mikroskop.
  6. Når cellene er tilstrekkelig dissosiert, tilsett 5 mL passaging medium for å splitte cellene 1:6. Juster mengden passaging medier som skal legges til for å samsvare med det foretrukne Delings forholdet.
  7. Aspirer den hESC-kvalifiserte matrisen fra den hESC-kvalifiserte matrise-belagte platen og Bytt ut med 1 mL passaging medium per brønn. Tilsett 1 mL dissosiert celler per brønn.

5. Cardiomyocyte differensiering

  1. Bruk hiPSC linjer som er veletablert (mer enn 20 passasjer) og viser en homogen morfologi før du starter hjerte differensiering.
  2. Sørg for at iPSCs er rundt 70 − 80% confluent.
  3. Vask cellene 1x i PBS uten ca2 + og mg2 +.
  4. Tilsett 2 mL D0 Media (trinn 1,7) per brønn og overføre cellene tilbake til inkubator.
  5. Etter 24 h, Erstatt med 3 mL D1 Media per brønn for 48 h.
  6. På dag 3, erstatte Media med 2 mL D3 Media per brønn. Gjenta med D4-mediet på dag 4.
  7. På dag 5 bytter du ut mediet med 3 mL D5-medier per brønn.
  8. På dag 7, erstatte Media med 3 mL D7 medier per brønn og overføre til en inkubator med 37 ° c, 5% CO2, og normal O2 konsentrasjon. Ombytte det D7 (RPMI + B27) Media enhver 2 dager.

6. valg prosedyre og iPSC-CM dissosiasjon

  1. Ti dager før du utfører ca2 + transient målinger eller noen funksjonell analyse, erstatte RPMI + B27 Media med 3 ml utvalg medier per brønn for 48 t.
  2. Bytt ut mediet med 3 mL utvalgs medier for en annen 48 h.
  3. Bytt ut mediet med 2 mL RPMI + B27-medium per brønn for 24 timer.
  4. Coat standard 6 brønn plater som beskrevet i avsnitt 2.
  5. Tilsett 1 mL steril 0,25% Trypsin med EDTA til hver brønn. Ruge platen ved 37 ° c i 5 min.
  6. Ved hjelp av en 1 000 μL pipette, mekanisk distansere cellene slik at enkeltceller kan sees når observert under et mikroskop.
  7. Overfør cellene til et sterilt 15 mL konisk rør og tilsett 2 mL RPMI 20 medier per brønn. Sentrifuger for 5 min ved 800 x g.
  8. Aspirer supernatanten og resuspend cellene i RPMI + B27 Media. Aspirer den hESC-kvalifiserte matrisen fra platene og Bytt ut med 1 mL RPMI + B27-medium.
  9. Ved bruk av en 1 000 mL pipette, distansere den mekaniske celle pellet til løsningen fremstår homogen.
  10. Overfør omtrent 500 000 celler til hver brønn. Overføring til inkubator for 24 h.
  11. Bytt ut mediet med 3 mL utvalgs medier per brønn for 48 t.
  12. Bytt ut mediet med 3 mL RPMI + B27 per brønn. Opprettholde celler i D7 medier (RPMI + B2 skiftende medier hver 2 dager til klar for funksjonell analyse.

7. utarbeidelse av iPSC-CMs for Flow flowcytometri

  1. Når cellene er av ønsket alder og har gjennomgått metabolske valg (§ 6), vaske cellene med PBS uten ca2 + og mg2 +.
  2. Tilsett 1 mL per brønn av Trypsin 0,25% og ruge i 5 − 7 min ved 37 ° c.
  3. Pipetter blandingen 5 − 10x med en P1000 tupp for å singularize cellene, og Overfør til et 15 mL rør som inneholder 2 mL RPMI 20.
  4. Snurr cellene på 600 x g i 5 minutter.
  5. Tilsett 100 μL av fiksering løsning (4% PFA) til cellen pellet. Legg løsningen dråpevis med kontinuerlig, skånsom virvlingen og deretter satt på isen i 15 min.
  6. Tilsett 1,5 mL PBS. Samle cellene ved sentrifugering og aspirer supernatanten.
  7. For hvert eksperiment, ta med en unstained kontroll per fiksering/permeabilization tilstand.
  8. Resuspend celler i 500-oppløsning μL av blokkerings løsning (2% FBS/2% BSA i PBS med 0,1% NP-40) i 30 minutter ved RT.
  9. Uten å fjerne blokkerings løsningen legger du til den primære antistoff MLC2V/MLC2A (5 mg/mL) og ruge 45 min ved RT.
  10. Vask med blokkering buffer. Samle celler ved sentrifugering og aspirer løsning.
  11. Legg til sekundært antistoff Alexa fluor 555/488 (1:750) fortynnet i blokkerings bufferen for 45 min ved RT eller over natten ved 4 ° c.
  12. Tilsett 1,5 mL PBS. Samle celler ved sentrifugering og aspirer løsning.
  13. Resuspend celler i 250 − 300 μL av PBS. Bruk en P1000 pipette for å disaggregate cellene.
  14. Forbered runde bunn rør med en 35 μm nylon mesh celle sil cap. Pre-Wet celle sil med 50 μL av PBS og sette røret på isen.
  15. Overfør løsningen med de disaggregated cellene til de runde bunn rørene med celle sil caps. La celle løsningen renne naturlig eller trykk på bunnen av røret mot en flat overflate, etter behov, for å sikre fullstendig drenering og Oppsamling av cellene i røret. Sørg for å sette røret tilbake på isen så snart som mulig.
  16. Skyll celle sil med 250 μL av PBS for å gjenopprette eventuelle gjenværende celler.
  17. Oppretthold rørene på is og dekk med aluminiumsfolie til Flow flowcytometri analyse.

8. plating Cardiomyocytes på glass Coverslips

Merk: Utfør alle trinn i et sterilt miljø.

  1. Klargjør glass coverslips som beskrevet i trinn 2,10 og 2,11.
  2. Når iPSC-CMs har blitt valgt og er av ønsket alder, Følg trinn 6.5 − 6,7 for å distansere iPSC-CMs.
  3. Aspirer supernatanten og resuspend cellene i en tilstrekkelig mengde av RPMI 20 medier til å ha omtrent 300 000 celler per 250 μL.
  4. Ved hjelp av en 2 mL glass pipette, mekanisk distansere celle pellet til løsningen vises homogen.
  5. Aspirer den hESC-kvalifiserte matrisen fra coverslips.
  6. Ved hjelp av en 1000 μL Pipetter, bland og trekk 250 μL av oppløsningen fra det 15 mL koniske røret.
  7. Dispensere langsomt 250 μL av oppløsningen på glass coverslips, og tar ekstra vare for å bare legge til området der hESC-kvalifisert matrise belegg er til stede.
  8. Overfør forsiktig til inkubator og la over natten, ta vare ikke å riste eller spre cellene på coverslips. Neste morgen, forsiktig legge til 2 mL av D7 (RPMI + B27) Media til hver brønn med dekkglass. Endre Media etter 24 timer og hver 2 dager etter det.

9. fikse celler

  1. Sørg for at en tilstrekkelig mengde PBS med ca2 + og mg2 + er equilibrated til 4 ° c.
  2. Forbered en 4% paraformaldehyde (PFA) løsning fortynnet i PBS med ca2 + og mg2 + og likevekt til 4 ° c.
  3. Når iPSC-CMs er av passende alder, har gjennomgått metabolske utvalg (§ 6), og har vært belagt på coverslips (§ 8), vaske cellene 3x med 1 mL kald PBS med ca2 + og mg2 + per brønn.
  4. Tilsett 1 mL kaldt 4% PFA og la cellene på RT under panseret i 15 min.
  5. Vask cellene med kald PBS å fjerne overflødig PFA.
  6. Tilsett 2 mL PBS med ca2 + og mg2 + og oppbevar ved 4 ° c.

10. Immunofluorescence farging

  1. Fjern PBS fra de faste cellene og tilsett 1 mL blokkerings buffer. Ruge for 1 time ved RT.
  2. Fjern blokkerings bufferen og Legg til det primære antistoff (5 mg/mL) fortynnet i blokkerings bufferen. Ruge over natten ved 4 ° c.
  3. Vask 3x i PBS med ca2 + og mg2 + for 5 min hver.
  4. Legg til sekundær antistoff fortynnet i blokkerings bufferen 1:1000.
  5. Dekkplaten med aluminiumsfolie for å beskytte den mot lys og ruge for 45 min ved RT. Hold aluminiumsfolie for følgende trinn.
  6. Vask 3x i PBS med ca2 + og mg2 +, 5 min hver.
  7. Legg til en tilstrekkelig mengde DAPI arbeider løsning for å fullstendig dekke cellene og ruge ved RT i 10 min.
  8. Vask prøven grundig med PBS med ca2 + og mg2 + for å fjerne overflødig DAPI.
  9. Ta nye glass lysbilder og legge en dråpe montering medier i midten. Bruk dråpetelleren til å fordele monterings mediene jevnt. Sett coverslips med cellene vendt ned på lysbildene.
    Merk: celler kan lagres i 30 dager hvis de er beskyttet mot lys.

11. vurdering av intracellulære ca2 + transienter

  1. Når iPSC-CMs er minst 3 måneder gammel, har gjennomgått metabolske valg (§ 6), og er belagt på coverslips, behandle dem med 2 μL av fura-2, AM (siste konsentrasjon: 1 μM) og ruge ved 37 ° c i 10 min.
    Merk: fura-2 er lysfølsom. Utfør alle lasting prosedyrer og eksperimenter i mørket.
  2. Forbered kalsium og contractility oppkjøp og analysesystem.
    1. Strømsystemet slik at lys bue lampen initieres (figur 1B).
    2. Plasser kammeret på systemet og koble rørene fra pumpen til riktig innløp og uttak og den elektriske ledningen fra stimulator til kammeret som vist i figur 1C.
    3. Fyll røret som renner gjennom den fluidic varme ovnen med 37 ° c prewarmed Tyrode ' s løsning.
    4. Juster kamera og innramming blenderåpning dimensjoner for å minimere bakgrunnen området.
  3. Monter et glass dekkglass med iPSC-CMs inn i kammeret og fest.
  4. Tilsett 500 μL av Tyrode løsning direkte på toppen av festet glass dekkglass forsiktig og start perfusing kammeret (1,5 mL/min) med Tyrode ' s løsning.
  5. Pace iPSC-CMs med 1 Hz felt stimulering ved hjelp av den elektriske stimulator (10 V, 4 MS).
  6. Ruge iPSC-CMs i kammeret med stimulering i minst 3 − 5 min for cellene å vaske fura-2 fargestoff og tilpasse seg miljøet og å vaske ut fluorescerende fargestoff.
  7. Juster visningsvinduet til venstre øvre del av glass dekkglass.
  8. Begynn innspillingen.
  9. Når du har samlet inn en jevn strøm på 5 − 10 topper, klikker du pause for å stoppe innspillingen midlertidig.
  10. For å sikre at verken fokuset eller dimensjonene i visningsvinduet endres, flytter du nivået for mikroskopet til det tilstøtende området, beveger deg mot den motsatte enden og fortsetter innspillingen.
  11. Gjenta trinn 11,9 og 11,10 for å skanne over dekkglass, først flytte til venstre, deretter nedover i en sikk-sakk mote å dekke hele dekkglass området. Dette består av 80 − 100 målinger per dekkglass.
    Merk: Begrens den totale målings tiden til 10 min ettersom sekundære faktorer forårsaker en reduksjon i ca2 + transient.
  12. Når ca2 + transienter er anskaffet, analysere data med fluorescens spor analyseprogramvare i henhold til produsentens instruksjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollen beskrevet i figur 1A genererte svært ren cardiomyocytes som erverve en ventrikkel/voksen-lignende fenotype med tid i kulturen. Som vurdert av immunofluorescence farging for atrieflimmer og ventrikkel myosin regulatoriske lys kjeden 2 isoformene (MLC2A og MLC2V, henholdsvis), de fleste av cellene som genereres av denne protokollen var MLC2A-positive på dag 30 etter induksjon av CARDIAC differensiering, mens MLC2V ble uttrykt i mye lavere beløp på samme tidspunkt (figur 2A, Top paneler). Ettersom tiden i kulturen økte (dag 60 og 90), ble det observert en fullstendig svitsj av MLC2 isoformene (MLC2A til MLC2V) (figur 2a, bunn paneler). For å kvantifisere MLC2A og MLC2V-positive celler, ble Flow flowcytometri analyse utført. I samsvar med immunofluorescence resultatene, flowcytometri strømmen data demonstrert tidlig stadium (dag 30) iPSC-CMs meste uttrykker MLC2A (29,8% MLC2A + vs. 1,9% MLC2V +) (se figur 2b, venstre panel), sammenlignet med sen etappe (dag 90) IPSC-CMs, som stort sett uttrykt MLC2V (41,3% MLC2V + vs 16,7% MLC2A +) (se figur 2B, høyre panel). Fordi uttrykket mønster av MLC2A og MLC2V er kjent for å være et kjennetegn på hjerte differensiering og modning, disse resultatene tyder på at langvarig kultur tid øker modning av iPSC-CMs og at flertallet av cellene ser ut til å være forpliktet til ventrikkel fenotype. Vi vurderte deretter tiden avhengighet av ca2 + håndtering modning. Ca2 + transient ble målt i IPSC-CMs ved de tre differensiering ganger (dag 30, 60, og 90), og sammenlignet med isolerte voksen rotte Cardiomyocytes (ARCMs). Ca2 + amplitude ble betydelig økt i IPSC-CMs på dag 90 og var lik den ARCMs (Figur 3A, B). Frekvensen av ca2 + reopptak (Decay-tau) på dag 90 var betydelig raskere sammenlignet med dag 30 IPSC-CMs, og nærmere ARCMs (Figur 3C). Effekten av β-adrenerge stimulering på ca2 + transienter ble ytterligere evaluert ved å behandle cellene med 10 nM ISOPROTERENOL (ISO) i 10 min ved 37 ° c. Som observert i ARCMs, ISO betydelig økt ca2 + transient og akselerert frekvensen av ca2 + reopptak i dag 90 IPSC-CMs. Ingen endringer ble observert i dag 30 iPSC-CMs (Figur 3D-F). Interessant, dag 90 iPSC-CMs var i stand til å følge økende elektrisk stimulering (fra 0,5 − 3 Hz), på en lignende måte som observert i ARCMs (Figur 4B). Til sammen viser disse resultatene at iPSC-CMs avledet fra denne metoden har lignende egenskaper til de sett i native CMs, spesielt ventrikkel-lignende fenotyper, modne ca2 + håndtering egenskaper, og positive β-adrenerge svar.

Forurensende noncardiac celler kan påvirke funksjonell modning av menneskelig iPSC-CMs under differensiering17. Figur 4a viser en sammenligning mellom 3 måneder gamle celler Hentet fra høy effektivitet differentiations (Top paneler, Video 1), robust uttrykker den spesifikke ventrikkel markør (MLC2V), og 3 måneder gamle celler Hentet fra lav effektivitet differentiations (bunn paneler, video 2), viser IPSC-CMs blandet med Alpha-glatt muskel utgangen (αSMA)-positive celler. Interessant, viste funksjonell analyse endret ca2 + transienter i blandet IPSC-CMS/non-CMS forberedelse i forhold til IPSC-CMS fra høy effektivitet differensiering. Spesielt, cellene innhentet fra lav effektivitet differentiations utstilt svært liten ca2 + amplitude og automatikk (Figur 4b, midtre panel) sammenlignet med ren IPSC-CMs (Figur 4b, top panel) og ARVCs (Figur 4b, nederste panel). I tillegg, celler fra lav effektivitet differentiations presentert arrhythmic mønstre (Figur 4C).

Det er viktig å merke seg at iPSC-CMs vist i toppen panel av Figur 4A også gjennomgikk metabolsk utvalg, som er et viktig skritt for å ytterligere berike en befolkning på IPSC-CMs som allerede er avledet fra en svært effektiv differensiering. Disse dataene tyder på at høy effektivitet CARDIAC differensiering protokoller som genererer høy kvalitet CMs er nødvendig for å nøyaktig recapitulate en CARDIAC fenotype in vitro.

Figur 5 viser variasjon i ca2 + amplitude gjennom ulike områder av CMs-monolag, plottet over en gang løpet av 1 200 s. Ca2 + amplituder målt i begynnelsen av en stimulering frekvens på 1 Hz (200 s) var svært variabel og ble mer konsistent etter hvert som stimulering fortsatte (200 − 900 s). Men etter en tidsperiode på 900 s ble ca2 + amplitude betraktelig redusert. Disse dataene tyder på at når du registrerer ca2 + transienter i IPSC-CMs, er det nødvendig å la cellene stabilisere seg ved 37 ° c under konstant stimulering i minst 200 s. i tillegg må opptakene begrenses til et bestemt tidsvindu (200 − 900 s) for å sikre reproduserbar resultater.

Figure 1
Figur 1: Overall skjematisk av IPK-CMs forberedelse og ca2 + transient instrumenter. (A) skjematisk av CARDIAC differensiering protokollen viser utviklingsmessige stadier av differensiering iPSCs. Scale bar = 50 μm. (B) kalsium og contractility oppkjøp og analysesystem. a) Peristalitic pumpe b) invertert mikroskop c) strømkilde for det digitale kameraet d) elektrisk stimulator e) fluorescens System Interface f) filter hjul kontroller (c) system kammer. a) system kammer kroppen. b) væskeinntak. c) væske uttak. d) Fluidic inline løsning Varmeapparat. f) elektroder som forbinder system kammeret med den elektriske stimulator. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: sammenligning av MLC2A og MLC2V uttrykk i IPSC-CMs på ulike dager med differensiering. (A) Immunofluorescence farging av IPSC-CMs på dag 30, 60 og 90 etter differensiering INDUKSJON for MLC2A og MLC2V. Scale bar = 20 μm. (B) Flow flowcytometri analyse av IPSC-CMS for MLC2V og MLC2A på 1 måned og 3 måneder etter differensiering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: sammenligning av IPSC-CMs egenskaper på ulike dager med differensiering. (A) representative ca2 + transient spor på ulike dager med differensiering. (B-C) Gjennomsnittlig ca2 + amplitude og ca2 + Decay elicited under stimulering ved 1 Hz. (D-F) effekten av isoproterenol (ISO, 10 nM) behandling i IPSC-CMs på ulike dager med differensiering. ARCMs indikere isolert rotte voksen cardiomyocytes. N = 70 − 100 områder; * p < 0,05; p < 0,001, som bestemmes av student t-test. Data representeres som Mean ± S.E.M. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: sammenligning mellom høy effektivitet og lav effektivitet differentiations av IPSC-CMs. (A) Immunofluorescence farging av IPSC-CMs for ΑSMA og MLC2V. Scale bar = 20 μm. (B) representative spor viser ca2 + transienter fra høy effektivitet (over) og lav effektivitet (midten) differentiations, og isolert rotte voksen cardiomyocytes (nedenfor). Myocytter ble stimulert ved 0,5 Hz, 1 Hz, 1,5 Hz, 2 Hz og 3 Hz. (C) representant spor som viser et arrhythmic mønster fra en dårlig differensiering. Piler angir punkt pacing. ARCMs indikerer isolert rotte voksen cardiomyocytes. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: tidsavhengig ca2 + amplitude fra en enkelt dekkglass. Ca2 + amplituder fra forskjellige områder i en dekkglass ble plottet i en tid-avhengig måte. Ikke-anbefalte tidsperioder for å måle ca2 + transient er angitt i de stiplede områdene (< 200 s eller > 900 s). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Video 1
Video 1: representative video som viser et eksempel på en høy effektivitet differensiering. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Video 2
Video 2: representative video som viser et eksempel på en lav virkningsgrad differensiering. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Video 3
Video 3: representative video som viser et eksempel på en homogen monolag fordeling av IPSC-CMs på et glass dekkglass. Denne videoen viser den anbefalte celle tettheten som skal brukes for funksjonell analyse. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Video 4
Video 4: representative video som viser et eksempel på celler fra en lav effektivitet differensiering belagt på et glass dekkglass. Cellene i videoen ble innhentet fra en lav effektivitet differensiering. Celler fra slike differentiations er vanligvis ikke distribueres homogent over dekkglass og det er vanskelig å konsekvent finne juling celler. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritiske skritt for å bruke humant iPSC-CMs som eksperimentelle modeller er: 1) genererer høy kvalitet cardiomyocytes (CMs) som kan sikre konsistent ytelse og reproduserbar resultater; 2) slik at cellene til å modnes i kultur i minst 90 dager til tilstrekkelig vurdere sine fenotype; 3) utføre elektrofysiologisk studier, for eksempel kalsium (ca2 +) transient målinger, for å gi en fysiologisk relevant funksjonell karakterisering av menneskelig IPSC-CMs. Vi utviklet en monolag-basert differensiering metode som produserer høy kvalitet ventrikkel-lignende iPSC-CMs. Vår metode er avhengig av flere avgjørende faktorer og er en variant av eksisterende protokoller14,18. I motsetning til andre protokoller, bruker denne en lav oksygen forhold (5% O2) for iPSCs vedlikehold så vel som i løpet av den første uken av deres differensiering i CMs. lave nivåer av oksygen etterligne den miljømessige tilstanden under embryonale og fosterets hjerte utvikling19. Hypoxic forhold har også vist seg å øke iPSCs spredning og deres påfølgende differensiering til CMs20. Seeding tetthet og riktig iPSCs passaging er også kritiske faktorer for en vellykket hjerte differensiering. Høy differensiering effektivitet er observert når 70 − 80% confluent iPSCs er dissosiert i små celle aggregater ved hjelp av en enzym-fri løsning, og seeded i et delt forhold på 1:6. CARDIAC differensiering kan startes når cellene når en confluency på 70 − 80%, forventet ca 4 dager etter splitting. CHIR99021 (10 μM) behandling i begynnelsen av differensiering vil føre til betydelig celle død. Celle spredning observeres imidlertid når CHIR99021 fjernes fra kulturen neste dag. En riktig balanse mellom celle død og spredning er avgjørende for å bevare en monolag kultur gjennom differensiering, som er en annen viktig faktor for en vellykket differensiering. Hvis iPSC-tettheten er enten for lav eller for høy, vil den påfølgende differensiering være en lav virkningsgrad av hjerte differensiering (Figur 4a, video 2). Figur 4A viser et eksempel på en lav virkningsgrad differensiering, der cardiomyocytes avledet fra en sunn donor blandes med andre celletyper, for eksempel α-glatte muskel utgangen-positive celler. Viktigere, ca2 + transienter registrert fra slike preparater viste endrede egenskaper, for eksempel lav ca2 + amplitude og arrhythmic mønstre, som lett kan bli misforstått som biologisk variasjon. En vellykket og høy effektivitet differensiering fra samme cellelinje, i stedet, genererte en ren befolkning av ventrikkel-lignende cardiomyocytes (Figur 4a, Video 1) sammen med vanlige ca2 + transienter (Figur 4B, top panel). Dermed spiller kvaliteten på differensiering en viktig rolle i den totale størrelsen, form, regularitet, og hyppigheten av en ca2 + transient.

En annen viktig del av en vellykket og effektiv differensiering er å få en beriket befolkning på cardiomyocytes. Mens udifferensierte stamceller og andre iPSC-avledede celletyper bruker glukose som en energikilde, kan CMs bruke melkesyre effektivt for ATP og glutamat produksjon21. Således, for å oppnå en enda renere befolkning på CMs, cellene er kultivert i melkesyre-supplert og glukose-utarmet kultur medium. Dyrking iPSC-CMs i denne velge Media i lang tid, men kan føre til funksjonell verdifall. Derfor, for å rense iPSC-CMs og fortsatt bevare sin funksjon, metabolske valg utføres bare for 10 dager, fra dager 80 − 90 siden differensiering induksjon. Etter denne perioden erstattes utvalgs mediet, og cellene vedlikeholdes i RPMI/B27-mediet. Mens utvalgs protokollen kan implementeres mye tidligere22 (f. eks rundt dag 15), er det tilrådelig å vente til dag 80, da dette kan hindre gjenværende iPSCs eller andre celletyper fra voksende av den tiden cellene er klar for funksjonell studier (dag 90). Det er derfor viktig at det tas hensyn til alle de ovennevnte faktorene for en vellykket, effektiv og robust hjerte differensiering.

I tillegg til robusthet og effektivitet av CARDIAC differensiering protokoller, modning og celle type spesifikasjon (for eksempel, atrieflimmer og ventrikkel celletyper) også utgjøre en stor utfordring for å bruke iPSC-CMs å modellere hjertesykdom. I løpet av de siste årene har det blitt rapportert om mange lovende modnings strategier, inkludert elektrisk stimulering, mekanisk Stretch og substrat stivhet23. Men langvarig in vitro kultur IPSC-CMs fortsetter å være en enkel og praktisk tilnærming for å generere voksen-lignende cardiomyocytes24,25.

I samsvar med andre publiserte rapporter12, IPSC-CMs generert av dette in vitro differensiering protokollen viser robust uttrykk for ventrikkel-spesifikke MLC2V og mye lavere nivåer av MLC2A på dag 90 (figur 2A, B). Mens Foster CMs inneholder både MLC2A og MLC2V isoformene, voksen ventrikkel CMs bare inneholde MLC2V. Denne bryteren i MLC isoformen prevalens oppstår under nyfødt scenen26.

Cardiomyocytes generert gjennom denne protokollen uttrykke ventrikkel bestemt markør, slik som MLC2V, som gradvis øker i overflod som cellene holdes i kultur lenger (figur 2A, B). Dette indikerer at en langvarig in vitro kultur forbedrer modning av CMs som ser ut til å være forpliktet til ventrikkel fenotype.

Tid i kultur også i stor grad påvirker ca2 + håndtering modning24,25. Tidligere rapporter beskrev at etter 20 dager med differensiering induksjon, var det ingen store endringer i calc ca2 + transienter som cellene vokste eldre25. Men cardiomyocytes generert fra protokollen detaljert her viser progressive endringer i ca2 + amplitude og ca2 + Decay over tre tiden poeng evaluert (30, 60, og 90 dager etter induksjon av hjerte differensiering) (Figur 3A-C). Interessant, disse dataene viser at ca2 + transient parametre, for eksempel ca2 + amplitude og ca2 + decay, målt i dag 90 IPSC-CMs var lik de målt i isolert rotte voksen cardiomyocytes (ARCMs). Videre 90 dager gamle iPSC-CMs var også i stand til å følge ulike elektriske stimuleringer spenner fra 0,5 Hz til 3 Hz konsekvent, ligner ARCMs (Figur 4B). I fremtidig arbeid, ville det være interessant å se hvordan en enda lengre tid i kulturen påvirker funksjonelle egenskapene til disse iPSC-CMs i forhold til ARCMs.

I tillegg, siden β-adrenerge reseptor signalering viser en distinkt tidsavhengig maturational mønster etter CARDIAC induksjon27, effekten av Isoproterenol på ca2 + transient i IPSC-CMs generert gjennom denne protokollen ble testet. Stimulering med isoproterenol førte til en positiv lusitropic respons i dag 90 iPSC-CMs, tilsvarende det som er observert i ARCMs (Figur 3D-F).

Den funksjonelle vurderinger av iPSC-CMs utført i denne studien har noen forskjeller og begrensninger i forhold til isolert voksen CMs. Den voksne CMs har godt utbygd og godt arrangert sarcomeres. Dette gjør det mulig for contractility målinger gjennom påvisning av sarkomerlengde bevegelse. Fordi ingen av de nåværende protokollene generere fullt modnet, voksen-lignende iPSC-CMs, contractility målinger gjennom sarkomerlengde deteksjon er ikke gjennomførbart. Mens det er mulig å oppdage bevegelse av celle kantene når celle kontraktene, er det betydelig mer utfordrende å spore disse bevegelsene på en presis måte i iPSC-CMs. Fra nå av er teknologiske fremskritt nødvendig for å muliggjøre nøyaktige vurderinger av contractility i disse cellene. På den annen side er det mulig å måle ca2 + transienter av IPSC-CMs ved hjelp av en ca2 + indikator som fura-2. I motsetning til voksen CMs, men iPSC-CMs er gruppert og ikke har en godt definert grensen. Derfor er det innspilte ca2 + transienter vanligvis ikke representerer en enkelt celle, men snarere en gruppe av celler i et bestemt område. Mens det er mulig å justere området størrelse, innspilling ca2 + transienter fra en enkelt celle er utrolig utfordrende. Det er viktig at når CMs er belagt på coverslips, tettheten er slik at de oppnår en homogen monolag fordeling (video 3), som gjør det mulig for konsekvent å finne områder med celler. Hvis cellene ikke distribueres som en monolag på dekkglass (video 4), vil det være områder uten celler, og hvis dekkglass er vist spesielt for områder med vibrerende celler for å utføre målinger, kan dette føre til en "utvalg bias". I stedet for å velge et bestemt område av vibrerende celler, anbefales det å samle inn data fra flere områder i hele dekkglass, som bare er mulig når cellene er fordelt som en homogen monolag. Målinger fra 100 slike ulike områder, som tar ca 10 min, er tilstrekkelig til å gi pålitelige funksjonelle egenskaper av cellene. Til slutt, som vist i figur 5, IPSC-CMs trenger tid til å justere til måling forhold. For pålitelige målinger, anbefales det at cellene skal stabiliseres ved måling forholdene i minst 3 min.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Denne forskningen ble støttet av AHA forsker Development Grant 17SDG33700093 (F.S.); Mount Sinai KL2 Scholars Award for klinisk og translational forskning karriereutvikling KL2TR001435 (F.S.); NIH r00 HL116645 og AHA 18TPA34170460 (C.K.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-Actin, α-Smooth Muscle antibody, Mouse monoclonal Sigma Aldrich A5228
Alexa Fluor 488 goat anti mouse Invitrogen A11001
Alexa Fluor 555 goat anti rabbit Invitrogen A21428
B27 Supplement Gibco 17504-044
B27(-) insulin Supplement Gibco A18956-01
CHIR-99021 Selleckchem S2924
DAPI nuclear stain ThermoFisher D1306
DMEM/F12 (1:1) (1X) + L- Glutamine + 15mM Hepes Gibco 11330-032
Double Ended Cell lifter, Flat blade and J-Hook Celltreat 229306
Falcon Multiwell Tissue Culture Plate, 6 well Corning 353046
Fluidic inline heater Live Cell Instrument IL-H-10
Fura-2, AM Invitrogen F1221
hESC-qualified matrix Corning 354277 Matrigel Matrix
hPSC media Gibco A33493-01 StemFlex Basal Medium
IWR-1 Sigma Aldrich I0161
Live cell imaging chamber Live Cell Instrument EC-B25
MLC-2A, Monoclonal Mouse Antibody Synaptic Systems 311011
Myocyte calcium and contractility system Ionoptix ISW-400
Myosin Light Chain 2 Antibody, Rabbit Polyclonal (MLC2V) Proteintech 10906-1-AP
Nalgene Rapid Flow Sterile Disposable Filter units with PES Membrane ThermoFisher 124-0045
PBS with Calcium and Magnesium Corning 21-030-CV
PBS without Calcium and Magensium Corning 21-031-CV
Premium Glass Cover Slips Lab Scientific 7807
RPMI medium 1640 (-) D-glucose (1X) Gibco 11879-020
RPMI medium 1640 (1X) Gibco 11875-093
Sodium L-lactate Sigma Aldrich L7022
StemFlex Supplement Gibco A33492-01
Thiazovivin Tocris 3845
Trypsin-EDTA (0.25%) ThermoFisher 25200056
Tyrode's solution Boston Bioproducts BSS-355w Adjust pH at 7.2. Add 1.2mM Calcium Chloride

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karakikes, I., et al. Correction of human phospholamban R14del mutation associated with cardiomyopathy using targeted nucleases and combination therapy. Nature Communications. 6, 6955 (2015).
  2. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).
  3. Davis, R. P., et al. Cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells recapitulate electrophysiological characteristics of an overlap syndrome of cardiac sodium channel disease. Circulation. 125 (25), 3079-3091 (2012).
  4. Fatima, A., et al. In vitro modeling of ryanodine receptor 2 dysfunction using human induced pluripotent stem cells. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 28 (4), 579-592 (2011).
  5. Novak, A., et al. Cardiomyocytes generated from CPVTD307H patients are arrhythmogenic in response to beta-adrenergic stimulation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (3), 468-482 (2012).
  6. Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
  7. Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
  8. Stillitano, F., et al. Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells. eLife. 6, (2017).
  9. Matsa, E., Burridge, P. W., Wu, J. C. Human stem cells for modeling heart disease and for drug discovery. Science Translational Medicine. 6 (239), (2014).
  10. Mordwinkin, N. M., Lee, A. S., Wu, J. C. Patient-specific stem cells and cardiovascular drug discovery. Journal of the American Medical Association. 310 (19), 2039-2040 (2013).
  11. Youssef, A. A., et al. The Promise and Challenge of Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Applications. Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 1 (6), 510-523 (2016).
  12. Cyganek, L., et al. Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Clinical Investigation: Insight. 3, 12 (2018).
  13. Keung, W., Boheler, K. R., Li, R. A. Developmental cues for the maturation of metabolic, electrophysiological and calcium handling properties of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research, Therapy. 5 (1), 17 (2014).
  14. Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e52010 (2014).
  15. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  16. Gorski, P. A., et al. Measuring Cardiomyocyte Contractility and Calcium Handling In Vitro. Methods in Molecular Biology. 1816, 93-104 (2018).
  17. Kim, C., et al. Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation. Stem Cells and Development. 19 (6), 783-795 (2010).
  18. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
  19. Patterson, A. J., Zhang, L. Hypoxia and fetal heart development. Current Molecular Medicine. 10 (7), 653-666 (2010).
  20. Correia, C., et al. Combining hypoxia and bioreactor hydrodynamics boosts induced pluripotent stem cell differentiation towards cardiomyocytes. Stem Cell Reviews. 10 (6), 786-801 (2014).
  21. Tohyama, S., et al. Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
  22. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
  23. Tu, C., Chao, B. S., Wu, J. C. Strategies for Improving the Maturity of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Circulation Research. 123 (5), 512-514 (2018).
  24. Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (14), 1991-2002 (2013).
  25. Hwang, H. S., et al. Comparable calcium handling of human iPSC-derived cardiomyocytes generated by multiple laboratories. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 85, 79-88 (2015).
  26. Scuderi, G. J., Butcher, J. Naturally Engineered Maturation of Cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 50 (2017).
  27. Jung, G., et al. Time-dependent evolution of functional vs. remodeling signaling in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and induced maturation with biomechanical stimulation. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 30 (4), 1464-1479 (2016).

Tags

Medisin indusert pluripotent stilk cellen-avledet cardiomyocytes (iPSC-CMs) iPSCs kalsium transient kalsium håndtering CARDIAC sykdom modellering cardiomyocyte modning
Generering av ventrikkel-lignende HiPSC-avledet Cardiomyocytes og høy kvalitet Cell forberedelser for kalsium håndtering karakterisering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Oh, J. G., Dave, J., Kho, C.,… More

Oh, J. G., Dave, J., Kho, C., Stillitano, F. Generation of Ventricular-Like HiPSC-Derived Cardiomyocytes and High-Quality Cell Preparations for Calcium Handling Characterization. J. Vis. Exp. (155), e60135, doi:10.3791/60135 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter