Denne protokol beskriver en ny kolorimetrisk metode til malaria primaquin (pmq) detektion i syntetiske uriner og humane sera.
Primaquine (PMQ), en vigtig anti-malaria stof, er blevet anbefalet af Verdenssundhedsorganisationen (WHO) til behandling af livstruende infektioner forårsaget af P. vivax og ovale. PMQ har imidlertid uønskede bivirkninger, der fører til akut hæmolyse hos patienter med glucose-6-fosfat dehydrogenase (G6PD-)-mangel. Der er behov for at udvikle enkle og pålidelige metoder til PMQ-bestemmelse med henblik på doserings overvågning. I begyndelsen af 2019, vi har rapporteret en UV-Vis og nøgen-øje baseret tilgang til pmq kolorimetriske kvantificering. Påvisning var baseret på en Griess-lignende reaktion mellem PMQ og aniliner, som kan generere farvede AZO produkter. Detektionsgrænsen for direkte måling af pmq i syntetisk urin er i nanomolær området. Desuden har denne metode vist et stort potentiale for PMQ-kvantificering fra humane serumprøver ved klinisk relevante koncentrationer. I denne protokol vil vi beskrive de tekniske detaljer vedrørende synteser og karakterisering af farvede AZO-produkter, reagens præparatet og procedurerne for PMQ-bestemmelse.
Pmq er en af de vigtigste malaria medicin, det virker ikke kun som en vævs schizontocide at forhindre tilbagefald, men også som en gametocytocide at afbryde sygdoms transmission1,2,3,4. Intravaskulær hæmolyse er en af de om bivirkninger af PMQ, som bliver meget alvorlig i dem mangelfuld i G6PD-. Det er kendt, at den G6PD-genetiske lidelse er fordelt over hele verden med en genfrekvens mellem 3-30% i malaria endemiske områder. Sværhedsgraden af pmq svaghed afhænger af graden af G6PD-mangel samt dosis og varigheden af pmq eksponering5,6. For at sænke risikoen, WHO har anbefalet en enkelt lav dosis (0,25 mg base/kg) af PMQ til malariabehandling. Men, dette er stadig udfordret af variationerne i patientens stof følsomhed5,7. Dosisovervågning er nødvendig for at vurdere farmakokinetikken efter PMQ administration, som kan påvirke dosisjustering for en vellykket behandling med begrænset toksicitet.
Højtydende væskekromatografi (HPLC) er den mest udbredte teknik til PMQ-klinisk bestemmelse. Endoh et al. rapporterede et HPLC-system med en UV-detektor for serum PMQ-kvantificering ved hjælp af en C-18 polymer gel kolonne8. I deres system blev serumproteiner først fældet med acetonitril, og derefter blev PMQ i supernatanten udskilt for HPLC. Kalibreringskurven var lineær over koncentrationsintervallet fra 0,01-1,0 μg/mL8. En anden metode baseret på en reverse-fase HPLC med UV-detektion ved 254 nm er blevet rapporteret for kvantificering af PMQ og dets vigtigste metabolitter9. Kalibreringskurven for PMQ var lineær i intervallet mellem 0,025-100 μg/mL. En yderligere væske-væskeekstraktion med blandet hexan og ethylacetat som organisk fase blev anvendt til PMQ-separation med en procentvis bedring nået til 89%9. For nylig udviklede Miranda et al. en UPLC-metode med UV-detektion ved 260 nm for PMQ-analyse i tabletformuleringer med en detektionsgrænse på 3 μg/mL10.
Selvom HPLC metoder udviser lovende følsomhed i narkotika bestemmelse og følsomheden kan forbedres yderligere, hvis HPLC er udstyret med et massespektrometer, der er stadig nogle ulemper. Direkte lægemiddel målinger i biologiske væsker er sædvanligvis utilgængelige for HPLC, da mange biomolekyler i høj grad kan påvirke analysen. Yderligere ekstraktioner er nødvendige for at fjerne endogene molekyler før HPLC-analyse11,12. Desuden udføres PMQ-detektion ved en HPLC-UV-detektor typisk ved dens maksimale absorptions bølgelængde (260 nm). der er dog mange endogene molekyler i biologiske væsker med en stærk absorbans ved 260 nm (f. eks. aminosyrer, vitaminer, nukleinsyrer og urochrompigmenter), hvilket forstyrrer PMQ UV-detektion. Der er behov for at udvikle enkle og omkostningseffektive metoder til PMQ-bestemmelse med rimelig følsomhed og selektivitet.
Den griess reaktion blev først præsenteret i 1879 som en kolorimetrisk test for nitrit detektion13,14,15,16. For nylig er denne reaktion blevet grundigt udforsket for at detektere ikke kun nitrit, men også andre biologisk relevante molekyler17,18,19,20. Vi har tidligere rapporteret den første systematiske undersøgelse af en uventet Griess reaktion med PMQ (figur 1). I dette system, PMQ er i stand til at danne farvede Azos, når kombineret med substituerede aniliner i nærværelse af nitrit ioner under sure betingelser. Vi har yderligere konstateret, at farven på Azos varierede fra gul til blå, når du øger elektron donere effekt af substituent på anilines21. En UV-Vis absorption baseret kolorimetrisk metode til PMQ kvantificering er blevet udviklet gennem den optimerede reaktion mellem 4-methoxyanilin og PMQ. Denne metode har vist et stort potentiale for følsom og selektiv påvisning af PMQ i Bio-relevante væsker. Her sigter vi mod at beskrive de detaljerede procedurer for PMQ-bestemmelse baseret på denne kolorimetriske strategi.
Vi beskrev en kolorimetrisk metode til bekvem PMQ kvantificering. Det er potentielt den mest enkle og omkostningseffektive nuværende metode. Endnu vigtigere er, at denne metode giver mulighed for nøgen-øje baseret PMQ-måling uden brug af udstyr.
Den optimerede Griess-reaktion for PMQ-detektion kan generere en rød farve AZO med en maksimal absorption ved 504 nm. Den potentielle påvirkning fra UV-Vis absorption af endogene biomolekyler er begrænset, hvilket gør metoden lovende for direkt…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkender start-up Grant fra Guangzhou University of kinesisk medicin og ungdoms videnskabelige forskning uddannelse projekt af GZUCM (2019QNPY06). Vi anerkender også Lingnan Medical Research Center af Guangzhou University of kinesisk medicin for støtte på faciliteter.
4-Methoxyaniline | Aladdin | K1709027 | |
2,4-Dimethoxyaniline | Heowns | 10154207 | |
3,4-Dimethoxyaniline | Bidepharm | BD21914 | |
4-Methylaniline | Adamas-beta | P1414526 | |
4-Nitroaniline | Macklin | C10191447 | |
96-wells,Flat Botton | Labserv | 310109008 | |
Gaussian@16 software | Gaussian, Inc | Version:x86-64 SSE4_2-enabled/Linux | |
Hydrochloric acid | GCRF | 20180902 | |
Marvin sketch (software) | CHEMAXON | free edition: 15.6.29 | |
Phosphoric acid | Macklin | C10112815 | |
Primaquine bisiphosphate | 3A Chemicals | CEBK200054 | |
Sodium nitrite | Alfa Aesar | 5006K18R | |
Sulfonamides | TCI(shanghai) | GCPLO-BP | |
Varioskan LUX Plate reader | Thermo Fisher | Supplied with SkanIt Software 4.1 |