Dit protocol beschrijft een nieuwe colorimetrische methode voor Antimalarial Quine (PMQ) detectie in synthetische urinen en menselijke serums.
Primaquine (PMQ), een belangrijke anti-malaria drug, is aanbevolen door de World Health Organization (WHO) voor de behandeling van levensbedreigende infecties veroorzaakt door P. vivax en ovale. Echter, PMQ heeft ongewenste bijwerkingen die leiden tot acute hemolyse bij patiënten met glucose-6-fosfaat dehydrogenase (G6PD) deficiëntie. Er is behoefte aan het ontwikkelen van eenvoudige en betrouwbare methoden voor PMQ bepaling met het oog op de controle van de dosering. In het begin van 2019 hebben we een UV-VIS-en op blote ogen gebaseerde benadering gerapporteerd voor PMQ-colorimetrische kwantificering. De detectie was gebaseerd op een Griess-achtige reactie tussen PMQ en anilines, die gekleurde azo-producten kan genereren. De detectiegrens voor directe meting van PMQ in synthetische urine is in het nanomolair-bereik. Bovendien heeft deze methode een groot potentieel aangetoond voor PMQ-kwantificering van menselijke serummonsters bij klinisch relevante concentraties. In dit protocol beschrijven we de technische details met betrekking tot de syntheses en karakterisering van gekleurde azo-producten, de reagens voorbereiding en de procedures voor PMQ-bepaling.
PMQ is een van de belangrijkste Antimalarial drugs, het werkt niet alleen als een weefsel schizontocide om terugval te voorkomen, maar ook als een gametocytocide om de overdracht van de ziekte te onderbreken1,2,3,4. Intravasculaire hemolyse is een van de betreffende bijwerkingen van PMQ, die zeer ernstig wordt in die tekort aan G6PD. Het is bekend dat de G6PD genetische aandoening wereldwijd wordt gedistribueerd met een Genfrequentie tussen 3-30% in endemische gebieden van malaria. De ernst van de PMQ-zwakte hangt af van de mate van G6PD-deficiëntie, evenals de dosis en de duur van PMQ-blootstelling5,6. Om het risico te verlagen, de WHO heeft aanbevolen een enkele lage dosis (0,25 mg base/kg) PMQ voor behandeling van malaria. Echter, dit wordt nog steeds uitgedaagd door de variaties in de gevoeligheid van de drug van de patiënt5,7. Dosis controle is nodig om de farmacokinetiek na PMQ toediening, die kan effect aanpassing van de dosering voor een succesvolle behandeling met beperkte toxiciteit te beoordelen.
High-Performance vloeistofchromatografie (HPLC) is de meest gebruikte techniek voor klinische bepaling van PMQ. Endoh et al. rapporteerde een HPLC-systeem met een UV-detector voor serum PMQ-kwantificering met behulp van een C-18 Polymer gel column8. In hun systeem werden serumeiwitten eerst neergeslagen met acetonitril, en vervolgens werd de PMQ in het supernatant gescheiden voor HPLC. De ijkcurve was lineair over het concentratiebereik van 0,01-1,0 μg/mL8. Een andere methode op basis van een omgekeerde fase HPLC met UV-detectie bij 254 nm is gerapporteerd voor de kwantificering van PMQ en de belangrijkste metabolieten9. De ijkcurve voor PMQ was lineair in het bereik tussen 0,025-100 μg/mL. Een extra vloeistof-vloeistofextractie met gemengd hexaan en ethylacetaat als organische fase werd gebruikt voor PMQ scheiding met percentage terugwinning bereikt tot 89%9. Meer recentelijk ontwikkelde Miranda et al. een UPLC-methode met UV-detectie bij 260 nm voor PMQ-analyse in tabletformuleringen met een detectielimiet van 3 μg/mL10.
Hoewel HPLC-methoden een veelbelovende gevoeligheid vertonen bij de bepaling van het geneesmiddel en de gevoeligheid verder kan worden verbeterd als de HPLC is uitgerust met een massaspectrometer, zijn er nog steeds enkele nadelen. Directe geneesmiddelen metingen in biologische vloeistoffen zijn meestal niet toegankelijk via HPLC, omdat veel biomoleules de analyse sterk kunnen beïnvloeden. Aanvullende extracties zijn nodig om endogene moleculen te verwijderen vóór HPLC-analyse11,12. Bovendien wordt de PMQ-detectie door een HPLC-UV-detector meestal uitgevoerd bij de maximale absorptie golflengte (260 nm). Er zijn echter veel endogene moleculen in biologische vloeistoffen met een sterke extinctie bij 260 nm (bijv. aminozuren, vitaminen, nucleïnezuren en urochromen pigmenten), waardoor de PMQ UV-detectie wordt verstoord. Er is behoefte aan het ontwikkelen van eenvoudige en kosteneffectieve methoden voor de bepaling van PMQ met redelijke gevoeligheid en selectiviteit.
De Griess-reactie werd voor het eerst gepresenteerd in 1879 als een colorimetrische test voor nitriet detectie13,14,15,16. Onlangs is deze reactie uitgebreid onderzocht om niet alleen nitriet te detecteren, maar ook andere biologisch relevante moleculen17,18,19,20. We hebben eerder gerapporteerd de eerste systematische studie van een onverwachte Griess reactie met PMQ (Figuur 1). In dit systeem is PMQ in staat om gekleurde azos te vormen in combinatie met gesubstitueerde anilines in de aanwezigheid van nitriet ionen onder zure omstandigheden. We hebben verder ontdekt dat de kleur van azos varieerde van geel naar blauw bij het verhogen van het elektron donerende effect van de substituent op anilines21. Een UV-VIS absorptie gebaseerde colorimetrische methode voor PMQ kwantificering is ontwikkeld door de geoptimaliseerde reactie tussen 4-methoxyaniline en PMQ. Deze methode heeft een groot potentieel aangetoond voor gevoelige en selectieve detectie van PMQ in biorelevante vloeistoffen. Hier willen we de gedetailleerde procedures beschrijven voor de bepaling van PMQ op basis van deze colorimetrische strategie.
We beschreven een colorimetrische methode voor handige PMQ kwantificering. Het is mogelijk de meest eenvoudige en kosteneffectieve huidige methode. Wat nog belangrijker is, deze methode biedt de mogelijkheid om op blote ogen gebaseerde PMQ-meting te gebruiken zonder gebruik te maken van apparatuur.
De geoptimaliseerde Griess reactie voor PMQ detectie kan een rode kleur azo genereren met een maximale absorptie bij 504 nm. De potentiële invloed van UV-VIS absorptie van endogene biomoleules is b…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs erkennen de start-up subsidie van Guangzhou University of Chinese Medicine en het Youth Scientific Research training project van GZUCM (2019QNPY06). We erkennen ook het Lingnan Medical Research Center van de Guangzhou University of Chinese Medicine voor de ondersteuning van faciliteiten.
4-Methoxyaniline | Aladdin | K1709027 | |
2,4-Dimethoxyaniline | Heowns | 10154207 | |
3,4-Dimethoxyaniline | Bidepharm | BD21914 | |
4-Methylaniline | Adamas-beta | P1414526 | |
4-Nitroaniline | Macklin | C10191447 | |
96-wells,Flat Botton | Labserv | 310109008 | |
Gaussian@16 software | Gaussian, Inc | Version:x86-64 SSE4_2-enabled/Linux | |
Hydrochloric acid | GCRF | 20180902 | |
Marvin sketch (software) | CHEMAXON | free edition: 15.6.29 | |
Phosphoric acid | Macklin | C10112815 | |
Primaquine bisiphosphate | 3A Chemicals | CEBK200054 | |
Sodium nitrite | Alfa Aesar | 5006K18R | |
Sulfonamides | TCI(shanghai) | GCPLO-BP | |
Varioskan LUX Plate reader | Thermo Fisher | Supplied with SkanIt Software 4.1 |