Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

התגובה האופטימיזציה של Griess עבור UV-Vis ו-עירום עין ההגדרה של אנטי מלאביאל Primaquine

doi: 10.3791/60136 Published: October 11, 2019
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה מטרית מקורית לאיתור מלריה (PMQ) בprimaquine הסינתטי ובסרומים האנושיים.

Abstract

Primaquine (PMQ), סם חשוב נגד מלריה, הומלץ על ידי ארגון הבריאות העולמי (מי) לטיפול בזיהומים סכנת חיים שנגרמו על ידי P. vivax ו ovale. עם זאת, PMQ יש תופעות לוואי לא רצויות להוביל המוליזיס חריפה בחולים עם גלוקוז-6-פוספט דהידרוגנאז (G6PD) מחסור. יש צורך לפתח שיטות פשוטות ואמינות לקביעת PMQ במטרה של ניטור המינון. בתחילת 2019, אנו דיווחו על גישה UV-Vis ו-עירום עין מבוסס על הקוונפיקציה מטרי צביעה PMQ. הזיהוי היה מבוסס על תגובה כמו Griess בין PMQ ו אנירינס, אשר יכול ליצור מוצרים בצבע אזו. מגבלת הזיהוי למדידה ישירה של PMQ בשתן סינתטי היא בטווח nanomolar. יתר על כן, שיטה זו הראתה פוטנציאל גדול עבור PMQ פיקציה מדגימות של סרום אנושי בריכוזים רלוונטיים קלינית. בפרוטוקול זה נתאר את הפרטים הטכניים לגבי הסינתזות והאפיון של מוצרי אזו צבעוניים, ההכנה הכימית וההליכים לקביעת PMQ.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

PMQ הוא אחד התרופות החשובות ביותר למניעת מלריה, זה עובד לא רק כschizontocide רקמות כדי למנוע נסיגה אלא גם כמו משחטוציטוסייד כדי להפריע שידור המחלה1,2,3,4. Intravascular המוליזה הוא אחד הקשורים לתופעות לוואי של PMQ, אשר הופך להיות רציני מאוד לקויה בG6PD. ידוע כי ההפרעה הגנטית G6PD מופץ ברחבי העולם עם תדר גנטי בין 3-30% באזורים אנדמיים מלריה. חומרת החולשה PMQ תלוי במידה של מחסור G6PD, כמו גם את המינון ואת משך החשיפה PMQ5,6. כדי להקטין את הסיכון, מי המליץ מינון נמוך אחד (0.25 mg בסיס/ק"ג) של PMQ לטיפול במלריה. עם זאת, זה עדיין מאתגר על ידי וריאציות של רגישות התרופה החולה5,7. ניטור המינון הכרחי כדי להעריך את הפרמקוקינטיקה לאחר PMQ הממשל, אשר יכול להשפיע על המינון התאמה לטיפול מוצלח עם רעילות מוגבלת.

כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים היא הטכניקה הנפוצה ביותר לקביעת PMQ קלינית. אנדוh ואח ' דיווח על מערכת מערכות המדידה עם גלאי UV לPMQ הסרום באמצעות מערך C-18 של ג'ל פולימרישמונה. במערכת שלהם, חלבונים הנסיוב היו זירז הראשון עם acetonitrile, ולאחר מכן PMQ בתוך הסופרנטאנט הופרד לצורך הערכות. עקומת הכיול היה ליניארי מעל טווח הריכוז מ 0.01-1.0 μg/mL8. שיטה נוספת המבוססת על בדיקות בשלב הפוך עם זיהוי UV ב 254 nm דווחה עבור הכמת של PMQ ואת מטבוליטים העיקריים שלה9. עקומת הכיול עבור PMQ היה ליניארי בטווח בין 0.025-100 μg/mL. מיצוי נוסף נוזלי נוזלי עם הקסאן מעורב ו אתיל אצטט כמו שלב אורגני שימש הפרדת PMQ עם שחזור אחוז הגיע 89%9. לאחרונה, מירנדה ואח ' פיתחה שיטת ה-, עם זיהוי UV ב 260 nm עבור ניתוח PMQ ב ניסוחים לוח עם מגבלת זיהוי ב 3 μg/mL10.

למרות ששיטות הזיהוי הללו מבטיחות רגישות מבטיחה בקביעת התרופה, והרגישות יכולה להשתפר עוד יותר אם השימוש בספקטרומטר ביטוולי מצויד בספיטוגרפיות מסה, עדיין יש כמה חסרונות. מדידות הסמים הישירות בנוזלים הביולוגיים אינן נגישות בדרך כלל באמצעות האבחון, מכיוון שbiomolecules רבים יכולים להשפיע רבות על האנליזה. שעקירות נוספים נדרשים להסרת מולקולות אנדוגנילפני ניתוחהאנליזה 11,12. יתר על כן, זיהוי PMQ על ידי גלאי האבחון-UV מבוצע בדרך כלל על אורך הגל המרבי שלה (260 nm).; עם זאת, ישנם מולקולות אנדוגניים רבים בנוזלים ביולוגיים עם ספיגה חזקה ב 260 ננומטר (למשל, חומצות אמינו, ויטמינים, חומצות גרעין פיגמנטים אורוכרום), ובכך מפריעה PMQ UV זיהוי. יש צורך לפתח שיטות פשוטות וחסכוניות לקביעת PMQ עם רגישות סבירה וסלקטיביות.

תגובת griess הוצגה לראשונה ב 1879 כמבחן צביעה לזיהוי חנקיתי13,14,15,16. לאחרונה, תגובה זו נחקרו בהרחבה כדי לזהות לא רק חנקיתי אלא גם אחרים מולקולות רלוונטיות ביולוגית17,18,19,20. בעבר דיווחו על המחקר הסיסטמטי הראשון של תגובת Griess בלתי צפויה עם PMQ (איור 1). במערכת זו, PMQ מסוגל ליצור azos צבעוניים כאשר ביחד עם אנינים הוחלף בנוכחות של יונים ניטקסים בתנאים חומצי. גילינו כי הצבע של azos מגוון מצהוב לכחול כאשר מגביר את השפעת האלקטרון לתרומת האפקט של מתמיר על אנירינס21. שיטת הספיגה המבוססת על הקליטה UV-vis עבור PMQ פיקציה פותחה באמצעות התגובה אופטימיזציה בין 4-methoxyaniline ו PMQ. שיטה זו הראתה פוטנציאל רב לזיהוי רגיש וסלקטיבי של PMQ בנוזלים הרלוונטיים לביו. כאן, אנו מכוונים לתאר את ההליכים המפורטים לקביעת PMQ בהתבסס על אסטרטגיית הצביעה הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. סינתזה של אזרוס צבעוניים

  1. ב 25 מ"ל בקבוקון תחתון עגול (RBF), לפזר אנילין (0.1 mmol) ו primaquine ביספופוספט (45.5 mg, 0.1 mmol) ל 10 מ ל של H3הפו4 פתרון (5% v/v). לשים את RBF על אמבט קרח, להוסיף בר מהומה עם הגודל הנכון לתוך הפתרון, ולשים את RBF על צלחת מהומה.
    הערה: לסינתזה של אזו 3g (איור 2), השתמש 0.2 mmol של primaquine ביספושנאה.
  2. התמוססות NaNO2 (6.9 mg, 0.1 mmol) ב 1 מ ל של מים מקורר ולאחר מכן להוסיף את התערובת התגובה dropwise. הסירו את אמבטיית הקרח ושמרו על תערובת התגובה מעורבב בטמפרטורת החדר.
  3. נטר את התגובה בעזרת צלחת סיליקה ג'ל מצופה כרומטוגרפיה בשכבה דקה. השתמש דיכלורומתאן (dcm)/methanol (meoh) תערובת (vol/vol = 5:1) כמו להתחמק עבור האהבה. מוצר אזו מציג כתמים צבעוניים על הצלחת והיא, אשר קל להבחין על ידי עיניים עירומות. להפסיק את התגובה כאשר כתמים PMQ נעלמים על אהבה.
  4. להתאים את תערובת התגובה ל-pH > 10 על ידי NaOH (2 M) על אמבט קרח. השתמש 50 mL הפרדת משפך כדי לחלץ את התערובת 3 פעמים עם 20 מ ל של אתיל אצטט עבור כל, לשלב ולרכז את השלב האורגני תחת ואקום באמצעות מאייד רוטרי.
    הערה: לפני החילוץ, להתאים את ערך ה-pH של פתרונות תגובה מעל 10. זה יכול לשמור על האמין העיקרי כצורתו הלא משלה, ובכך להקל על החילוץ.
  5. לטהר את הפסולת על ידי כרומטוגרפיה פלאש עם הפוך סיליקה ג'ל בשלב הלחץ הרגיל, באמצעות MeOH/H2O כמו להתחמק. לייבש את פתרון המוצר באמצעות ליטוליזציה לתת מוצרים מבוקשת של אזו.
    הערה: התגובה אותה ניתן גם לבצע בדילול פתרונות HCl (0.2 M).

2. UV-Vis מדידות וחישוב תיאורטי

  1. התמוססות הטהורה (50 μM) במים מזוקקים או בתוך 5% H3פו4 פתרון (pH 1.1), בהתאמה. שיא ספקטרום הקליטה של UV-vis (250-700 ננומטר) על ספקטרוסקופיה בטמפרטורת החדר (25 ° c). יצא את הנתונים כקבצי xls/. xlsx לצורך ניתוח נוסף.
  2. בצע את כל החישובים התיאורטיים עבור PMQ עצמה ומוצרי אזו באמצעות תוכנית ה -16 של גאוס. השתמש בתאוריה פונקציונלית של צפיפות הזמן (TD-DFT) עם ערכת בסיס של 6-31G. כלול אפקטי הממס על ידי מודל הרצף polarizable (PCM) פורמליזם באמצעות מים.
    1. השתמש בתוכנה (לדוגמה, Chemdraw Office) כדי לשרטט את המבנים ולאחר מכן לשמור את המבנה כקובץ קלט גאוסיאני (. gif).
    2. פתח את קובץ ה-gif עם תצוגת גאוס ולחץ על הלחצן חשב. בחר את הגדרת החישוב של גאוס, Opt + freq והמדינה הקרקעית-dft-B3LYP-6-31g; לאחר מכן לחץ על שלח. האופטימיזציה של הגיאומטריה תיצור קובץ יומן רישום.
    3. בעקבות ההליך שלעיל, השתמש בתצוגת גאוס כדי לפתוח קובץ יומן רישום זה. לחץ על הגדרת חישוב-גאוסיאנית ובחר אנרגיה ו- TD-SCF-dft-B3LYP-6-31g-סינגרק. . אז תגיש חישוב האנרגיה יפיק קובץ יומן רישום אחר וקובץ קוביה.
    4. השתמש בתצוגת גאוס כדי לפתוח את קובץ יומן הרישום מחישוב האנרגיה. לחץ על תוצאות-UV/Vis כדי לראות את הספיגה החזוי.
    5. השתמש בתצוגת גאוס כדי לפתוח את קובץ הקוביה. לחץ על תוצאהs ובחר משטח וקווי המתאר-פעולות משטח חדש כדי לראות את המסלולים.
  3. השוואת התוצאות הן מהמדידה הניסיונית והן מחישוב גאוס. חישוב שגיאת האחוז בין הערכים המחושבים והנמדדים, בהתאם למשוואה הבאה.
                  שגיאה = | (מקסימום cal.-wמקסexper.) /Wמקסימוםexper. | × 100%
    כאשר Wmax cal מייצג את אורך הגל המרבי של ספיגה מחישוב תיאורטי ו-wמקס exper. מייצג את אורך הגל מהתוצאה הניסיונית.

3. קביעת PMQ

  1. PMQ מדידה באמצעות צלחת 96-באר (איור 5)
    1. התמוססות 4-מתיונין ב 0.2 M הHCl עבור פתרון אנילין 200 מ"מ, R1. מפזר סודיום ניטקס במים מזוקקים כדי להשיג פתרון של 5 מ"מ, ארטו. שמרו את כל הפתרונות במקרר ב-4 ° c לפני השימוש.
    2. הוסף 100 μL של R1 לתוך הצלחת 96-באר, ולהוסיף 50 μL של PMQ המכיל דגימה לתוך הצלחת לערבב עם R1. לאחר מכן, הוסף 50 μL של R2 לתוך הצלחת. מערבבים את הפתרונות על ידי הפיג חוזרות ונשנות.
    3. שמרו את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות, ולאחר מכן הקליטו את ספיגת האולטרא-סגול ב504 ננומטר. חזור על 3x עבור כל בדיקה.  מוצר אזו יציב עם חשיפה לאור החדר; אין צורך להשאיר את הצלחת מתחת לחשיכה.
    4. יצא את הנתונים כקבצי xls/. xlsx לצורך ניתוח נוסף.
  2. עקומת כיול למדידת PMQ ישירה בדגימת שתן
    1. להכין פתרונות PMQ באמצעות שתן סינתטי עם ריכוזי PMQ ב 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200 μM, בהתאמה.
    2. הוסף 100 μL של R1 לתוך הצלחת 96-באר, ולהוסיף 50 μL של פתרון PMQ שתן לערבב עם R1. לאחר מכן, הוסף 50 μL של R2 לתערובת הנ ל. מערבבים את הפתרונות על ידי הפיג חוזרות ונשנות. שמרו את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות, ולאחר מכן הקליטו את ספיגת האולטרא-סגול ב504 ננומטר.
    3. צור עקומת כיול על בסיס הספיגה I504 ו PMQ ריכוזים. השתמש בערכים מבארות ללא PMQ כריקים, והפחת את הערכים הריקים מכל הבדיקות לפני עיבוד הנתונים.
    4. בצע התאמה ליניארית כדי ליצור את המשוואות הליניארית כ- y = aX + b, כאשר y הוא עוצמת הספיגה ב-504 nm, X הוא הריכוז של PMQ, a הוא השיפוע, ו- b הוא חיתוך-Y של הקו הליניארי.
  3. עקומת כיול למדידת PMQ ישירה בדגימת נסיוב אדם
    1. להכין פתרונות PMQ באמצעות סרום אנושי עם ריכוזי PMQ ב -0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, μM בהתאמה.
    2. הוסף 100 μL של R1 לתוך הצלחת 96-באר ולהוסיף 50 μL של פתרון PMQ סרום לערבב עם R1. הוסף 50 μL של R2 לתערובת שלעיל וערבב את הפתרונות על-ידי מלטף חוזר. שמרו את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות ולאחר מכן הקליטו את ספיגת האולטרא-סגול ב504 ננומטר. יצא את הנתונים כקובץ xls/. xlsx לצורך ניתוח נוסף.
    3. צור עקומת כיול על בסיס הספיגה I504 ו PMQ ריכוזים. השתמש בערכים מבארות ללא PMQ כריקים, והפחת את הערכים הריקים מכל הבדיקות לפני עיבוד הנתונים.
    4. בצע התאמה ליניארית כדי ליצור את המשוואות הליניארית כ- y = aX + b, כאשר y הוא עוצמת הספיגה ב-504 nm, X הוא הריכוז של PMQ, a הוא השיפוע, ו- b הוא חיתוך-Y של הקו הליניארי.
  4. חילוץ PMQ מנסיוב
    1. להוסיף כמות מסוימת של PMQ לתוך הנסיוב האנושי כדי לדמות סרום המכיל PMQ. להפקת PMQ, להוסיף 6 מ ל של תערובת של אתיל אצטט/הקסאן (7:1 v/v) לתוך 2 מ ל של הסרום PMQ המכיל 15 מ"ל שפופרת צנטריפוגה.
    2. הוסף 100 μL של נתרן הידרוקסיד (2 M) פתרון למערכת החילוץ. באלימות לנער את הצינור באמצעות מערבל מערבולת עבור 30 s. לאסוף את השכבה האורגנית להתרכז אותו באמצעות מאייד רוטרי תחת ואקום.
    3. לפזר מחדש את השאריות עם 200 μL של מים מזוקקים ולהסיר רכיבים שומנים מסיסים על ידי סינון דרך ממברנה בצורת דיסק עם 220 גודל הנקבובית ננומטר. השתמש בפתרון הסופי לבדיקה.
  5. קביעת PMQ מהנסיוב באמצעות חילוץ
    1. בצע את השלבים 3.2 או 3.3 כדי ליצור את עקומת הכיול עבור PMQ במים מזוקקים. לחלץ PMQ מ-PMQ המכיל סרומים על פי שלב 3.4.
    2. הוסף 100 μL של R1 ו 50 μL של פתרון PMQ לצלחת 96-באר. הוסף 50 μL של R2 אל התערובת, וערבב את הפתרונות על-ידי חזרה חוזרת.
    3. שמרו על הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות והקליטו את ספיגת האולטרא-סגול ב504 ננומטר. השתמש בבארות עם R1 ו-R2 אבל בלי PMQ כמו פקדים. יצא את הנתונים כקבצי xls/. xlsx לצורך ניתוח נוסף.
    4. הפחת את ערכי הבקרה מערכי הספיגה I504 עבור כל בדיקה, ולאחר מכן השתמש בתוצאה לחישובי ריכוז בהתאם למשוואה מתוך עקומת הכיול.
      הערה: מגבלת הזיהוי (לוד) עבור PMQ בכל המקרים ניתן לחשב לפי שיטה סטנדרטית22. החישוב התבסס על פונקציית הכיול: לוד = 3.3 × SD/b, כאשר SD היא סטיית התקן של הריק ו- b הוא השיפוע של קו הרגרסיה

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כדי לייעל את תנאי התגובה (איור 2), השתמשו באנינים שונים לזוג עם PMQ באמצעות תגובת griess. השגנו סדרה של azos עם צבעים שונים. זה כבר נמצא כי אנינים עם אלקטרון תורם מתמיר יכול לגרום משמרת אדומה בספקטרום הקליטה של UV-vis. חישובים תיאורטיים בוצעו באמצעות התיאוריה הפונקציונלית צפיפות הזמן (TD-DFT). כפי שהוצג באיור 2A, תוצאת החישוב היתה בהסכמה טובה עם מדידות אופטית עם השגיאה הממוצעת של 3.1%. 4-methoxyaniline היה להשתמש לאחר מכן לנהל את תגובת זיהוי PMQ בשל ביצועים טובים שלה בקצב התגובה, מסיסות המוצר, ויציבות21. יתר על כן, המוצר של אזו מ 4-מתיונין מהאיללין הוא אדום בצבע, אשר קל להבחין עם עיניים עירומות. לפיכך, תגובה זו מציעה פוטנציאל לזיהוי PMQ עין עירומה (איור 3).

איור 4A מראה את האפקט pH על הספקטרום של UV-vis של מוצר אזו 3d. I504 אינו משתנה בעת הגדלת ה-pH מ 1.0 ל 6.0. אני504 תחת ph 7.0 מציג ירידה קלה, בעוד pH בסיסי (8.0 ו-9.0) משפיע מאוד על הספיגה. איור 4B מציג את השפעות ה-pH של פתרונות PMQ על תגובת griess. PMQ (50 μM) ב-PBS מאגר עם האלפים השונים (4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0) היו מעורבים באופן אינדיבידואלי עם מגיב בדיקה כמתואר בסעיף 3.1. אני504 לאחר מכן נמדד לאחר 15 דקות בטמפרטורת החדר. כפי שמצוין, האלפים הבסיסיים (8.0, 9.0) של פתרונות PMQ משפיעים על התגובה. איור 5 מראה את ההליך הכללי לבצע את תגובת griess עבור זיהוי PMQ. כפי שמתואר בסעיף הפרוטוקול, נדרשים ארבעה שלבים כדי להשיג את נתוני הספיגה504 לצורך ניתוח. איור 6A ו- 6a להראות את עקומות כיול לזיהוי ישיר של PMQ מתוך דגימות שתן וסרום, בהתאמה, ללא מדגם טרום טיפולים. קשר מצוין ליניארי (R2 = 0.998) נמצא כאשר PMQ בשתן סינתטי נע בין 0 ל 200 μm. במונח של דגימת הנסיוב, מערכת יחסים קווית נמצאה בריכוז הנע בין 10 ל-200 μM.

איור 7A מראה את ההליך לחלץ PMQ מן הסרום. הפסולת התפרקה במים מזוקקים לאחר השאיבה והריכוז, ולאחר מכן הייתה מפוקקת. כדי לדמות PMQ אמיתי המכיל סרום, PMQ התווסף לסרום אנושי עם ריכוזי הסופי ב 0, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0 μM. באמצעות שלבים 3.4 ו 3.5, ריכוזי PMQ ב סרומים נמצאו 0.02, 0.14, 0.44, 0.90 ו-1.78 μm, בהתאמה (איור 7c). בהתבסס על התוצאה, אחוז ההתאוששות PMQ נמצא סביב 90% כאשר PMQ היה מעל 0.5 μM בסרום, אשר היה דומה דוחות הקודם9.

Figure 1
איור 1: סכמטית של התגובה GRIESS על PMQ. (א) תגובת griess קלאסית לניתוח ניריט. (ב) תגובת griess בשיטת זיהוי PMQ המוצעת. דמות זו שונתה עם הרשאה מעבודה קודמת21. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: תכונות פוטופיסיים של azos סינתטיים. (א) מדידה של UV-vis וחישוב תיאורטי של ספיגה מקסימלית של azos שנוצר מאנינים שונים. המספרים שמחוץ לסוגריים מייצגים את מידת הספיגה המקסימלית ב-H2O מזוקקים בתנאים של חומציות נייטרלית; המספרים בסוגריים מתייחסים למדידה של 5% H3PO4 פתרון (pH ≈ 1.1). λabs/nm. מייצג את נתוני הניסוי ו- λabs/calc, מייצג את נתוני החישוב התיאורטי. Eללא הוא האנרגיה עירור (eV), ו-f הוא כוח מתנד. (ב) תמונה תמונות של PMQ ואת מוצרי אזו עם תחליאנטים שונים, 50 μm ב 5% חומצה זרחתית הפתרון. (ג) UV-vis ספקטרום של המוצרים הסינתטיים. הערכים הנורמו לטווח בין 0 ל-1. דמות זו שונתה עם הרשאה מעבודה קודמת21. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: קביעת מטרי הגדרה של PMQ. (א) ניטור שינויי הספיגה במקסימום I504 בדרך התלויה בזמן. התגובה בוצעה באמצעות 4-methoxyaniline, ו PMQ שימש ב 100 μM; (ב) שינויי צבע של התגובה עם ריכוזים שונים של PMQ: 400 μl של 4-methoxyaniline פתרון (200 mM ב 0.2 M HCl) ו 200 μl של נתרן חנקיתי במים (5 מ"מ), עם 200 μl של הפתרון PMQ של ריכוזים שונים (0, 1, 2, 5 , 10, 20, 50, 100 μM). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: האפקט PH על זיהוי PMQ. (א) השפעות חומציות על ספיגת UV-vis של מוצר התלת-ממד של אזו (50 μm); (ב) PMQ (50 μm) במאגר ה-PBS עם האלפים השונים (4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0) שימשו לביצוע התגובה כמתואר בשלב 3.1. 15 דקות מאוחר יותר, הספיגה של 504 ננומטר הייתה מוערכת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: קביעת PMQ באמצעות תגובת griess על מערכת מבוססת צלחת 96. R1 מתייחס 200 mM 4-מתיונין הפתרון ב 0.2 M HCl; ארטו מתייחס ל -5 מילימטר נתרן ניטקס במים מזוקקים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: כיול עקומות לקביעת PMQ מתוך (א) שתן סינטטי ו (ב) דגימות של נסיוב אדם. הריכוז של PMQ נע בין 0-200 μM. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: קביעת PMQ מדגימות סרום. (א) אילוסטרציה סכמטית של הוצאת PMQ מדגימות סרום לניתוח הכמותי. (ב) קשר ליניארי נמצא בין I504 ו PMQ ריכוז בתוך טווח מ -0 עד 100 μm. (ג) PMQ בסרום היה כמת על ידי שיטת התגובה griess בהשוואה עם הסכום המדויק שנוסף לתוך הסרום. דמות זו שונתה עם הרשאה מעבודה קודמת21. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Table 1
. שולחן 1 חישוב תיאורטי של Log D ואת אחוזי הפצת המים של PMQ ו-CPMQ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

תיארנו שיטת צביעה עבור כימות PMQ נוח. זה פוטנציאל השיטה הפשוטה והחסכונית ביותר. חשוב מכך, שיטה זו מציעה מאפשר מדידה PMQ בעין עירומה מבלי להשתמש בציוד כלשהו.

תגובת Griess אופטימיזציה עבור זיהוי PMQ יכול ליצור בצבע אדום אזו עם ספיגה מקסימלית ב 504 ננומטר. ההשפעה הפוטנציאלית מפני קליטת UV-vis של biomolecules אנדוגני מוגבל, ובכך עושה את השיטה מבטיחה מדידה ישירה של PMQ בנוזלים ביולוגיים. כפי שצוין על ידי התוצאה, קשר מצוין ליניארי (R2 = 0.998) נמצא לזיהוי שתן PMQ על טווח הריכוז של 0-200 μm (איור 6a). מגבלת הזיהוי (לוד) עבור PMQ נמצאה כ0.63 μM. שיטה זו הראתה גם פוטנציאל גדול למדידה ישירה של PMQ בסרום אנושי. קשר מצוין ליניארי נמצא בריכוז החל 10 עד 200 μM עבור סרום PMQ (איור 6B). אנו יכולים לשפר עוד יותר את הרגישות על-ידי טיפול מקדים בדגימת הסרום דרך החילוץ והריכוז. כמו איור 7 מראה עם תהליך החילוץ פשוט, שיטה זו יכולה לכמת סרום PMQ בטווחים רלוונטיים קלינית. בהתבסס על מנגנון התגובה, מטבוליט קרבוקסילי הראשי של PMQ (CPMQ) יכול ליצור מוצר אזו עם תכונות דומות UV-Vis. עם זאת, החילוץ נוזלי נוזלי תחת תנאי pH בסיסיים יכול למזער את ההפרעה מ CPMQ. טבלה 1 מציגה את הרישום המחושב D והפצת המים הן של PMQ והן של CPMQ. כפי שמוצג, ב-pH > 10, פחות מ 6.33% של PMQ יימצא בשלב המים, ואילו מעל 98.54% CPMQ יהיה בשלב המים. לכן, תיאורטית, יותר מ 93.7% של PMQ ופחות מ 1.56% CPMQ יכול להיות מופק לבדיקה. ניתן להסיק כי ההפרעה מן המטטבוליט הראשי CPMQ מוגבל.

ההליך לזיהוי PMQ קל מאוד לטיפול. לקיחת 96-היטב מערכת מבוססת-צלחת כדוגמה, ההליך כולו מורכב מארבעה שלבים: 1) הוספת 100 μL של 4-methoxyaniline פתרון (200 מ"מ בתוך 0.2 M HCl) R1 לתוך הצלחת 96-באר; 2) הוספת 50 μL של ריכוז PMQ-מדגם לא ידוע לערבב עם R1; 3) הוספת 50 μl של R2 (5 מילימטר הפתרון חנקיתי) כדי לבצע את התגובה בטמפרטורת החדר; ו -4) הקלטת את קליטת UV-vis ב 504 ננומטר באמצעות ספקטרומטר. ריכוז PMQ מתוך מדגם לא ידוע ניתן לחישוב על בסיס עוצמת הספיגה I504 והמשוואה הלינארית מעקומת הכיול. התהליך כולו מבוצע בטמפרטורת החדר ללא צורך בדגירה. סביבה אפלה אינה נחוצה עבור ההליך כולו, מאחר שהמוצר הצבעוני אינו רגיש לאור החדר.

יצוין כי הזמן לפתרון התגובה להגיע רווי I504 הוא תלוי טמפרטורה. כפי שמוצג באיור 3, נדרש 12 דקות לפחות בטמפרטורת החדר (25 ° c). זמן התגובה יהיה ארוך יותר אם יבצע את התגובה בטמפרטורות מתחת ל -25 ° c. מצב ה-pH הבסיסי של פתרונות PMQ עלול להשפיע על ספיגת ה504. כדי לטפל בבעיה זו, התאם את הפתרון ה-pH של PMQ כדי להיות קטן מ-7.0. אחרת, עקומת כיול חדשה נדרשת עבור הפתרון עם pH על 7.0. בנוסף, הניטקסים הפנימיים בדגימות שנבדקו יכולים להשפיע על הגילוי. עם זאת, זה יכול להתרחש רק כאשר ריכוז של הניטקסים פנימיים הוא גבוה מאוד מאז ריכוז גבוה של הניטקס (5 מ"מ) שימש במבחן רגיל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה להצהיר

Acknowledgments

המחברים מכירים את מענק סטארט-Up מאוניברסיטת גואנגג'ואו של הרפואה הסינית והנוער מחקר מדעי הפרויקט של GZUCM (2019QNPY06). אנו מכירים גם את מרכז המחקר הרפואי יגנאן של אוניברסיטת גואנגג'ואו של הרפואה הסינית לתמיכה במתקנים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-Methoxyaniline Aladdin K1709027
2,4-Dimethoxyaniline Heowns 10154207
3,4-Dimethoxyaniline Bidepharm BD21914
4-Methylaniline Adamas-beta P1414526
4-Nitroaniline Macklin C10191447
96-wells,Flat Botton Labserv 310109008
Gaussian@16 software Gaussian, Inc Version:x86-64 SSE4_2-enabled/Linux
Hydrochloric acid GCRF 20180902
Marvin sketch (software) CHEMAXON free edition: 15.6.29
Phosphoric acid Macklin C10112815
Primaquine bisiphosphate 3A Chemicals CEBK200054
Sodium nitrite Alfa Aesar 5006K18R
Sulfonamides TCI(shanghai) GCPLO-BP
Varioskan LUX Plate reader Thermo Fisher Supplied with SkanIt Software 4.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fernando, D., Rodrigo, C., Rajapakse, S. Primaquine in vivax malaria: an update and review on management issues. Malar Journal. 10, 351 (2011).
  2. Deng, C., et al. Large-scale Artemisinin-Piperaquine Mass Drug Administration With or Without Primaquine Dramatically Reduces Malaria in a Highly Endemic Region of Africa. Clinical Infectious Diseases. 67, (11), 1670-1676 (2018).
  3. Pavic, K., et al. Primaquine hybrids as promising antimycobacterial and antimalarial agents. European Journal of Medical Chemistry. 143, 769-779 (2018).
  4. McQueen, A., et al. Synthesis, characterization, and cellular localization of a fluorescent probe of the antimalarial 8-aminoquinoline primaquine. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 27, (20), 4597-4600 (2017).
  5. Ashley, E. A., Recht, J., White, N. J. Primaquine: the risks and the benefits. Malaria Journal. 13, (1), 418 (2014).
  6. Watson, J., Taylor, W. R., Menard, D., Kheng, S., White, N. J. Modelling primaquine-induced haemolysis in G6PD deficiency. Elife. 6, (2017).
  7. Beutler, E. Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency: a historical perspective. Blood. 111, (1), 16-24 (2008).
  8. Endoh, Y. S., et al. High-performance liquid chromatographic determination of pamaquine, primaquine and carboxy primaquine in calf plasma using electrochemical detection. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 579, (1), 123-129 (1992).
  9. Dua, V. K., Kar, P. K., Sarin, R., Sharma, V. P. High-performance liquid chromatographic determination of primaquine and carboxyprimaquine concentrations in plasma and blood cells in Plasmodium vivax malaria cases following chronic dosage with primaquine. Journal of Chromatography B: Biomedical Applications. 675, (1), 93-98 (1996).
  10. Miranda, T. A., Silva, P. H. R., Pianetti, G. A., César, I. C. Simultaneous quantitation of chloroquine and primaquine by UPLC-DAD and comparison with a HPLC-DAD method. Malaria Journal. 14, 29 (2015).
  11. Tatsuno, M., Nishikawa, M., Katagi, M., Tsuchihashi, H. Simultaneous determination of illicit drugs in human urine by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Analytical Toxicology. 20, (5), 281-286 (1996).
  12. Erni, F. Use of high-performance liquid chromatography in the pharmaceutical industry. Journal of Chromatography A. 507, 141-149 (1990).
  13. Tsikas, D. Analysis of nitrite and nitrate in biological fluids by assays based on the Griess reaction: Appraisal of the Griess reaction in the l-arginine/nitric oxide area of research. Journal of Chromatography B. 851, (1), 51-70 (2007).
  14. Zurcher, D. M., Adhia, Y. J., Romero, J. D., McNeil, A. J. Modifying a known gelator scaffold for nitrite detection. Chemical Communications. 50, (58), 7813-7816 (2014).
  15. Kunduru, K. R., Basu, A., Tsah, T., Domb, A. J. Polymer with pendant diazo-coupling functionality for colorimetric detection of nitrates. Sensors and Actuators B: Chemical. 251, 21-26 (2017).
  16. Li, D., Ma, Y., Duan, H., Deng, W., Li, D. Griess reaction-based paper strip for colorimetric/fluorescent/SERS triple sensing of nitrite. Biosensors and Bioelectronics. 99, 389-398 (2018).
  17. Deng, T., et al. A novel strategy for colorimetric detection of hydroxyl radicals based on a modified Griess test. Talanta. 195, 152-157 (2019).
  18. Pang, H., et al. A photo-responsive macroscopic switch constructed using a chiral azo-calix[4]arene functionalized silicon surface. Chemical Communications (Camb). 54, (24), 2978-2981 (2018).
  19. Kaur, N., Dhaka, G., Singh, J. Simple naked-eye ratiometric and colorimetric receptor for anions based on azo dye featuring with benzimidazole unit. Tetrahedron Letters. 56, (9), 1162-1165 (2015).
  20. Liu, F., Lou, J., Hristov, D. X-Ray responsive nanoparticles with triggered release of nitrite, a precursor of reactive nitrogen species, for enhanced cancer radiosensitization. Nanoscale. 9, (38), 14627-14634 (2017).
  21. Deng, T., et al. An unexpected Griess reaction on the important anti-malarial drug primaquine and its application for drug determination. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 171, 8-14 (2019).
  22. Shrivastava, A., Gupta, V. Methods for the determination of limit of detection and limit of quantitation of the analytical methods. Chronicles of Young Scientists. 2, (1), 21-25 (2011).
התגובה האופטימיזציה של Griess עבור UV-Vis ו-עירום עין ההגדרה של אנטי מלאביאל Primaquine
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, Y., Wu, S., Huang, X. a., Zeng, Q., Deng, T., Liu, F. Optimized Griess Reaction for UV-Vis and Naked-eye Determination of Anti-malarial Primaquine. J. Vis. Exp. (152), e60136, doi:10.3791/60136 (2019).More

Wu, Y., Wu, S., Huang, X. a., Zeng, Q., Deng, T., Liu, F. Optimized Griess Reaction for UV-Vis and Naked-eye Determination of Anti-malarial Primaquine. J. Vis. Exp. (152), e60136, doi:10.3791/60136 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter