Reacción de griess optimizada para UV-Vis y determinación a vista desnuda de primaquina antipalúdica
Summary
Este protocolo describe un nuevo método colorimétrico para la detección de primaquinas antipalúdicas (PMQ) en orinas sintéticas y sueros humanos.
Abstract
Primaquina (PMQ), un importante medicamento antipalúdico, ha sido recomendado por la Organización Mundial de la Salud (OMS) para el tratamiento de infecciones potencialmente mortales causadas por P. vivax y ovale. Sin embargo, PMQ tiene efectos adversos no deseados que conducen a la hemólisis aguda en pacientes con deficiencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD). Hay una necesidad de desarrollar métodos simples y confiables para la determinación de PMQ con el propósito de la supervisión de dosis. A principios de 2019, hemos informado de un enfoque basado en UV-Vis y a simple vista para la cuantificación colorimétrica PMQ. La detección se basó en una reacción similar a la Griess entre PMQ y anilines, que puede generar productos azoicos de color. El límite de detección para la medición directa de PMQ en orina sintética está en el rango nanomolar. Además, este método ha demostrado un gran potencial para la cuantificación de PMQ a partir de muestras de suero humano a concentraciones clínicamente relevantes. En este protocolo, describiremos los detalles técnicos relativos a las síntesis y caracterización de los productos azo de color, la preparación del reactivo y los procedimientos para la determinación de PMQ.
Introduction
PMQ es uno de los fármacos antipalúdicos más importantes, funciona no sólo como un esquizontocida tisular para prevenir la recaída sino también como un gametocitocidio para interrumpir la transmisión de la enfermedad1,2,3,4. La hemólisis intravascular es uno de los efectos secundarios preocupantes de La PMQ, que se vuelve extremadamente grave en aquellos deficientes en G6PD. Se sabe que el trastorno genético G6PD se distribuye en todo el mundo con una frecuencia genética entre el 3 y el 30% en las zonas endémicas de la malaria. La gravedad de la debilidad de PMQ depende del grado de deficiencia de G6PD, así como de la dosis y de la duración de la exposición a PMQ5,6. Para reducir el riesgo, la OMS ha recomendado una dosis única baja (0,25 mg de base/kg) de PMQ para el tratamiento del paludismo. Sin embargo, esto todavía se desafia por las variaciones en la sensibilidad a los medicamentos del paciente5,7. El control de la dosis es necesario para evaluar la farmacocinética después de la administración de PMQ, lo que puede afectar el ajuste de dosis para un tratamiento exitoso con toxicidad limitada.
La cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) es la técnica más utilizada para la determinación clínica de PMQ. Endoh et al. informaron de un sistema HPLC con un detector UV para la cuantificación de PMQ sérica utilizando una columna de gel de polímero C-188. En su sistema, las proteínas séricas se precipitaron primero con acetonitrilo, y luego el PMQ en el sobrenadante se separó para HPLC. La curva de calibración fue lineal en el rango de concentración de 0,01-1,0 g/mL8. Otro método basado en un HPLC de fase inversa con detección UV a 254 nm se ha informado para la cuantificación de PMQ y sus principales metabolitos9. La curva de calibración para PMQ era lineal en el rango entre 0,025-100 g/ml. Se utilizó una extracción adicional líquido-líquido con hexano mezclado y acetato de etilo como fase orgánica para la separación de PMQ con una recuperación porcentual alcanzada al 89%9. Más recientemente, Miranda y otros desarrollaron un método UPLC con detección UV a 260 nm para el análisis de PMQ en formulaciones de comprimidos con un límite de detección a 3 g/mL10.
Aunque los métodos HPLC exhiben una sensibilidad prometedora en la determinación de fármacos y la sensibilidad puede mejorarse aún más si el HPLC está equipado con un espectrómetro de masas, todavía hay algunas desventajas. Las mediciones directas de fármacos en fluidos biológicos suelen ser inaccesibles por HPLC, ya que muchas biomoléculas pueden influir en gran medida en el análisis. Se requieren extracciones adicionales para eliminar moléculas endógenas antes del análisis de HPLC11,12. Además, la detección de PMQ por un detector HPLC-UV se realiza típicamente en su longitud de onda de absorción máxima (260 nm);; sin embargo, hay muchas moléculas endógenas en fluidos biológicos con una fuerte absorbancia a 260 nm (por ejemplo, aminoácidos, vitaminas, ácidos nucleicos y pigmentos urocromos), interfiriendo así con la detección UV PMQ. Es necesario desarrollar métodos simples y rentables para la determinación de PMQ con una sensibilidad y selectividad razonables.
La reacción griess fue presentada por primera vez en 1879 como una prueba colorimétrica para la detección de nitrito13,14,15,16. Recientemente, esta reacción ha sido ampliamente explorada para detectar no sólo nitrito, sino también otras moléculas biológicamente relevantes17,18,19,20. Hemos informado previamente del primer estudio sistemático de una reacción inesperada de Griess con PMQ(Figura 1). En este sistema, PMQ es capaz de formar azos de color cuando se combina con anilinas sustituidas en presencia de iones de nitrito en condiciones ácidas. Hemos encontrado además que el color de los azos variaba de amarillo a azul al aumentar el efecto de donación de electrones del sustituito en anilinas21. Se ha desarrollado un método colorimétrico basado en absorción UV para la cuantificación de PMQ a través de la reacción optimizada entre 4-metoxianilina y PMQ. Este método ha demostrado un gran potencial para la detección sensible y selectiva de PMQ en fluidos biorelevantes. Aquí, nuestro objetivo es describir los procedimientos detallados para la determinación de PMQ basados en esta estrategia colorimétrica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos descrito un método colorimétrico para la cuantificación conveniente de PMQ. Es potencialmente el método actual más simple y rentable. Lo que es más importante, este método ofrece la medición de PMQ basada en ojos desnudos sin utilizar ningún equipo.
La reacción Griess optimizada para la detección de PMQ puede generar un azo de color rojo con una absorción máxima a 504 nm. La influencia potencial de la absorción UV-vis de biomoléculas endógenas es limitada, lo que hace que…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen la beca Start-Up de la Universidad de Medicina China de Guangzhou y el proyecto de formación en investigación científica juvenil de GZUCM (2019QNPY06). También reconocemos el Centro de Investigación Médica Lingnan de la Universidad de Medicina China de Guangzhou por el apoyo en instalaciones.
Materials
| 4-Methoxyaniline | Aladdin | K1709027 | |
| 2,4-Dimethoxyaniline | Heowns | 10154207 | |
| 3,4-Dimethoxyaniline | Bidepharm | BD21914 | |
| 4-Methylaniline | Adamas-beta | P1414526 | |
| 4-Nitroaniline | Macklin | C10191447 | |
| 96-wells,Flat Botton | Labserv | 310109008 | |
| Gaussian@16 software | Gaussian, Inc | Version:x86-64 SSE4_2-enabled/Linux | |
| Hydrochloric acid | GCRF | 20180902 | |
| Marvin sketch (software) | CHEMAXON | free edition: 15.6.29 | |
| Phosphoric acid | Macklin | C10112815 | |
| Primaquine bisiphosphate | 3A Chemicals | CEBK200054 | |
| Sodium nitrite | Alfa Aesar | 5006K18R | |
| Sulfonamides | TCI(shanghai) | GCPLO-BP | |
| Varioskan LUX Plate reader | Thermo Fisher | Supplied with SkanIt Software 4.1 |
References
- Fernando, D., Rodrigo, C., Rajapakse, S. Primaquine in vivax malaria: an update and review on management issues. Malar Journal. 10, 351 (2011).
- Deng, C., et al. Large-scale Artemisinin-Piperaquine Mass Drug Administration With or Without Primaquine Dramatically Reduces Malaria in a Highly Endemic Region of Africa. Clinical Infectious Diseases. 67 (11), 1670-1676 (2018).
- Pavic, K., et al. Primaquine hybrids as promising antimycobacterial and antimalarial agents. European Journal of Medical Chemistry. 143, 769-779 (2018).
- McQueen, A., et al. Synthesis, characterization, and cellular localization of a fluorescent probe of the antimalarial 8-aminoquinoline primaquine. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 27 (20), 4597-4600 (2017).
- Ashley, E. A., Recht, J., White, N. J. Primaquine: the risks and the benefits. Malaria Journal. 13 (1), 418 (2014).
- Watson, J., Taylor, W. R., Menard, D., Kheng, S., White, N. J. Modelling primaquine-induced haemolysis in G6PD deficiency. Elife. 6, (2017).
- Beutler, E. Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency: a historical perspective. Blood. 111 (1), 16-24 (2008).
- Endoh, Y. S., et al. High-performance liquid chromatographic determination of pamaquine, primaquine and carboxy primaquine in calf plasma using electrochemical detection. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 579 (1), 123-129 (1992).
- Dua, V. K., Kar, P. K., Sarin, R., Sharma, V. P. High-performance liquid chromatographic determination of primaquine and carboxyprimaquine concentrations in plasma and blood cells in Plasmodium vivax malaria cases following chronic dosage with primaquine. Journal of Chromatography B: Biomedical Applications. 675 (1), 93-98 (1996).
- Miranda, T. A., Silva, P. H. R., Pianetti, G. A., César, I. C. Simultaneous quantitation of chloroquine and primaquine by UPLC-DAD and comparison with a HPLC-DAD method. Malaria Journal. 14, 29 (2015).
- Tatsuno, M., Nishikawa, M., Katagi, M., Tsuchihashi, H. Simultaneous determination of illicit drugs in human urine by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Analytical Toxicology. 20 (5), 281-286 (1996).
- Erni, F. Use of high-performance liquid chromatography in the pharmaceutical industry. Journal of Chromatography A. 507, 141-149 (1990).
- Tsikas, D. Analysis of nitrite and nitrate in biological fluids by assays based on the Griess reaction: Appraisal of the Griess reaction in the l-arginine/nitric oxide area of research. Journal of Chromatography B. 851 (1), 51-70 (2007).
- Zurcher, D. M., Adhia, Y. J., Romero, J. D., McNeil, A. J. Modifying a known gelator scaffold for nitrite detection. Chemical Communications. 50 (58), 7813-7816 (2014).
- Kunduru, K. R., Basu, A., Tsah, T., Domb, A. J. Polymer with pendant diazo-coupling functionality for colorimetric detection of nitrates. Sensors and Actuators B: Chemical. 251, 21-26 (2017).
- Li, D., Ma, Y., Duan, H., Deng, W., Li, D. Griess reaction-based paper strip for colorimetric/fluorescent/SERS triple sensing of nitrite. Biosensors and Bioelectronics. 99, 389-398 (2018).
- Deng, T., et al. A novel strategy for colorimetric detection of hydroxyl radicals based on a modified Griess test. Talanta. 195, 152-157 (2019).
- Pang, H., et al. A photo-responsive macroscopic switch constructed using a chiral azo-calix[4]arene functionalized silicon surface. Chemical Communications (Camb). 54 (24), 2978-2981 (2018).
- Kaur, N., Dhaka, G., Singh, J. Simple naked-eye ratiometric and colorimetric receptor for anions based on azo dye featuring with benzimidazole unit. Tetrahedron Letters. 56 (9), 1162-1165 (2015).
- Liu, F., Lou, J., Hristov, D. X-Ray responsive nanoparticles with triggered release of nitrite, a precursor of reactive nitrogen species, for enhanced cancer radiosensitization. Nanoscale. 9 (38), 14627-14634 (2017).
- Deng, T., et al. An unexpected Griess reaction on the important anti-malarial drug primaquine and its application for drug determination. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 171, 8-14 (2019).
- Shrivastava, A., Gupta, V. Methods for the determination of limit of detection and limit of quantitation of the analytical methods. Chronicles of Young Scientists. 2 (1), 21-25 (2011).
