I detta protokoll beskrivs en ny kolorimetrisk metod för detektion av mot malaria primaquin (PMQ) i syntetiska uriner och humana serum.
Primaquine (PMQ), en viktig anti-malaria läkemedel, har rekommenderats av Världshälsoorganisationen (WHO) för behandling av livshotande infektioner orsakade av P. vivax och ovale. Emellertid, PMQ har oönskade biverkningar som leder till akut hemolys hos patienter med glukos-6-fosfat dehydrogenas (G6PD) brist. Det finns ett behov av att utveckla enkla och pålitliga metoder för PMQ-bestämning med syftet att dosövervakning. I början av 2019 har vi rapporterat en UV-VIS-och naken-ögonbaserad metod för att kvantifiera PMQ kolorimetrisk. Upptäckten baserades på en Griess-liknande reaktion mellan PMQ och anilines, som kan generera färgade azo-produkter. Detektionsgränsen för direkt mätning av PMQ i syntetisk urin finns i nanomolar-sortimentet. Dessutom har denna metod visat stor potential för PMQ-kvantifiering från humana serumprover vid kliniskt relevanta koncentrationer. I detta protokoll kommer vi att beskriva de tekniska detaljerna kring synteser och karakterisering av färgade azofärger, reagenspreparationen och procedurerna för PMQ-bestämning.
PMQ är en av de viktigaste mot malaria droger, det fungerar inte bara som en vävnad schizontocide att förhindra återfall men också som en gametocytocide att avbryta sjukdomsöverföring1,2,3,4. Intravaskulär hemolys är en av de rörande biverkningarna av PMQ, som blir extremt allvarlig hos dem som har brist på G6PD. Det är känt att den G6PD genetiska sjukdomen distribueras över hela världen med en gen frekvens mellan 3-30% i malaria endemiska områden. Svårighetsgraden av PMQ-svaghet beror på graden av G6PD-brist samt på dosen och varaktigheten av PMQ-exponeringen5,6. För att minska risken, WHO har rekommenderat en enda låg dos (0,25 mg bas/kg) av PMQ för malaria behandling. Emellertid, detta är fortfarande utmanas av variationer i patientens läkemedels känslighet5,7. Dosövervakning är nödvändig för att bedöma farmakokinetiken efter administrering av PMQ, vilket kan påverka dosjustering för en lyckad behandling med begränsad toxicitet.
Högeffektiv vätskekromatografi (HPLC) är den mest använda tekniken för PMQ klinisk bestämning. Endoh et al. rapporterade ett HPLC-system med en UV-detektor för PMQ-serumkvantifiering med hjälp av en C-18 polymer gel kolumn8. I deras system var serumproteiner först utfälld med acetonitril, och sedan var PMQ i supernatanten separerad för HPLC. Kalibreringskurvan var linjär över koncentrationsintervallet 0,01-1,0 μg/mL8. En annan metod baserad på en omvänd fas HPLC med UV-detektion vid 254 nm har rapporterats för kvantifiering av PMQ och dess huvudmetaboliter9. Kalibreringskurvan för PMQ var linjär i intervallet 0,025-100 μg/mL. En ytterligare vätske-vätskeextraktion med blandad hexan och etylacetat som organisk fas användes för PMQ separation med procentuell återhämtning nådde 89%9. På senare tid har Miranda et al. utvecklat en UPLC-metod med UV-detektion vid 260 Nm för PMQ-analys i tablett formuleringar med en detektionsgräns på 3 μg/mL10.
Även om HPLC-metoder uppvisar lovande känslighet för läkemedels bestämning och känsligheten kan förbättras ytterligare om HPLC är utrustad med en masspektrometer, finns det fortfarande vissanackdelar. Direkta läkemedels mätningar i biologiska vätskor är oftast otillgängliga genom HPLC, eftersom många biomolekyler kan i hög grad påverka analysen. Ytterligare extraktioner krävs för att avlägsna endogena molekyler före HPLC-analys11,12. Dessutom utförs PMQ-detektering av en HPLC-UV-detektor normalt vid dess maximala absorptionsvåglängd (260 Nm). emellertid, det finns många endogena molekyler i biologiska vätskor med en stark absorbans vid 260 Nm (t. ex. aminosyror, vitaminer, nukleinsyror och urokrom pigment), vilket stör PMQ UV-detektion. Det finns ett behov av att utveckla enkla och kostnadseffektiva metoder för PMQ-bestämning med rimlig känslighet och selektivitet.
Griess reaktionen presenterades först i 1879 som ett kolorimetrisk test för nitritdetektering13,14,15,16. Nyligen har denna reaktion undersökts grundligt för att upptäcka inte bara nitrit utan även andra biologiskt relevanta molekyler17,18,19,20. Vi har tidigare rapporterat den första systematiska studien av en oväntad Griess-reaktion med PMQ (figur 1). I detta system kan PMQ bilda färgade azos i kombination med substituerade aniliner i närvaro av nitritjoner under sura förhållanden. Vi har ytterligare funnit att färgen på azos varierade från gult till blått när öka elektronen donera effekten av substituenten på anilines21. En UV-VIS absorption baserad kolorimetrisk metod för PMQ-kvantifiering har utvecklats genom den optimerade reaktionen mellan 4-Metoxianilin och PMQ. Denna metod har visat stor potential för känslig och selektiv detektion av PMQ i bio-relevanta vätskor. Här strävar vi efter att beskriva de detaljerade procedurerna för PMQ-bestämning utifrån denna kolorimetriska strategi.
Vi beskrev en kolorimetrisk metod för bekväm PMQ-kvantifiering. Det är potentiellt den mest enkla och kostnadseffektiva nuvarande metoden. Ännu viktigare, denna metod erbjuder möjliggör naken-Eye baserat PMQ mätning utan att använda någon utrustning.
Den optimerade Griess-reaktionen för PMQ-detektering kan generera en röd färg azo med en maximal absorption vid 504 nm. Den potentiella påverkan från UV-VIS absorption av endogena biomolekyler är begränsad, vilket gör metoden lova…
The authors have nothing to disclose.
Författarna erkänner start bidrag från Guangzhou University of kinesisk medicin och ungdom vetenskaplig forskning utbildning projekt av GZUCM (2019QNPY06). Vi erkänner också Lingnan Medical Research Center i Guangzhou University of kinesisk medicin för stöd på anläggningar.
4-Methoxyaniline | Aladdin | K1709027 | |
2,4-Dimethoxyaniline | Heowns | 10154207 | |
3,4-Dimethoxyaniline | Bidepharm | BD21914 | |
4-Methylaniline | Adamas-beta | P1414526 | |
4-Nitroaniline | Macklin | C10191447 | |
96-wells,Flat Botton | Labserv | 310109008 | |
Gaussian@16 software | Gaussian, Inc | Version:x86-64 SSE4_2-enabled/Linux | |
Hydrochloric acid | GCRF | 20180902 | |
Marvin sketch (software) | CHEMAXON | free edition: 15.6.29 | |
Phosphoric acid | Macklin | C10112815 | |
Primaquine bisiphosphate | 3A Chemicals | CEBK200054 | |
Sodium nitrite | Alfa Aesar | 5006K18R | |
Sulfonamides | TCI(shanghai) | GCPLO-BP | |
Varioskan LUX Plate reader | Thermo Fisher | Supplied with SkanIt Software 4.1 |