Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Optimerad Griess reaktion för UV-VIS och naken-öga bestämning av anti-malarial Primaquine

doi: 10.3791/60136 Published: October 11, 2019
* These authors contributed equally

Summary

I detta protokoll beskrivs en ny kolorimetrisk metod för detektion av mot malaria primaquin (PMQ) i syntetiska uriner och humana serum.

Abstract

Primaquine (PMQ), en viktig anti-malaria läkemedel, har rekommenderats av Världshälsoorganisationen (WHO) för behandling av livshotande infektioner orsakade av P. vivax och ovale. Emellertid, PMQ har oönskade biverkningar som leder till akut hemolys hos patienter med glukos-6-fosfat dehydrogenas (G6PD) brist. Det finns ett behov av att utveckla enkla och pålitliga metoder för PMQ-bestämning med syftet att dosövervakning. I början av 2019 har vi rapporterat en UV-VIS-och naken-ögonbaserad metod för att kvantifiera PMQ kolorimetrisk. Upptäckten baserades på en Griess-liknande reaktion mellan PMQ och anilines, som kan generera färgade azo-produkter. Detektionsgränsen för direkt mätning av PMQ i syntetisk urin finns i nanomolar-sortimentet. Dessutom har denna metod visat stor potential för PMQ-kvantifiering från humana serumprover vid kliniskt relevanta koncentrationer. I detta protokoll kommer vi att beskriva de tekniska detaljerna kring synteser och karakterisering av färgade azofärger, reagenspreparationen och procedurerna för PMQ-bestämning.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

PMQ är en av de viktigaste mot malaria droger, det fungerar inte bara som en vävnad schizontocide att förhindra återfall men också som en gametocytocide att avbryta sjukdomsöverföring1,2,3,4. Intravaskulär hemolys är en av de rörande biverkningarna av PMQ, som blir extremt allvarlig hos dem som har brist på G6PD. Det är känt att den G6PD genetiska sjukdomen distribueras över hela världen med en gen frekvens mellan 3-30% i malaria endemiska områden. Svårighetsgraden av PMQ-svaghet beror på graden av G6PD-brist samt på dosen och varaktigheten av PMQ-exponeringen5,6. För att minska risken, WHO har rekommenderat en enda låg dos (0,25 mg bas/kg) av PMQ för malaria behandling. Emellertid, detta är fortfarande utmanas av variationer i patientens läkemedels känslighet5,7. Dosövervakning är nödvändig för att bedöma farmakokinetiken efter administrering av PMQ, vilket kan påverka dosjustering för en lyckad behandling med begränsad toxicitet.

Högeffektiv vätskekromatografi (HPLC) är den mest använda tekniken för PMQ klinisk bestämning. Endoh et al. rapporterade ett HPLC-system med en UV-detektor för PMQ-serumkvantifiering med hjälp av en C-18 polymer gel kolumn8. I deras system var serumproteiner först utfälld med acetonitril, och sedan var PMQ i supernatanten separerad för HPLC. Kalibreringskurvan var linjär över koncentrationsintervallet 0,01-1,0 μg/mL8. En annan metod baserad på en omvänd fas HPLC med UV-detektion vid 254 nm har rapporterats för kvantifiering av PMQ och dess huvudmetaboliter9. Kalibreringskurvan för PMQ var linjär i intervallet 0,025-100 μg/mL. En ytterligare vätske-vätskeextraktion med blandad hexan och etylacetat som organisk fas användes för PMQ separation med procentuell återhämtning nådde 89%9. På senare tid har Miranda et al. utvecklat en UPLC-metod med UV-detektion vid 260 Nm för PMQ-analys i tablett formuleringar med en detektionsgräns på 3 μg/mL10.

Även om HPLC-metoder uppvisar lovande känslighet för läkemedels bestämning och känsligheten kan förbättras ytterligare om HPLC är utrustad med en masspektrometer, finns det fortfarande vissanackdelar. Direkta läkemedels mätningar i biologiska vätskor är oftast otillgängliga genom HPLC, eftersom många biomolekyler kan i hög grad påverka analysen. Ytterligare extraktioner krävs för att avlägsna endogena molekyler före HPLC-analys11,12. Dessutom utförs PMQ-detektering av en HPLC-UV-detektor normalt vid dess maximala absorptionsvåglängd (260 Nm). emellertid, det finns många endogena molekyler i biologiska vätskor med en stark absorbans vid 260 Nm (t. ex. aminosyror, vitaminer, nukleinsyror och urokrom pigment), vilket stör PMQ UV-detektion. Det finns ett behov av att utveckla enkla och kostnadseffektiva metoder för PMQ-bestämning med rimlig känslighet och selektivitet.

Griess reaktionen presenterades först i 1879 som ett kolorimetrisk test för nitritdetektering13,14,15,16. Nyligen har denna reaktion undersökts grundligt för att upptäcka inte bara nitrit utan även andra biologiskt relevanta molekyler17,18,19,20. Vi har tidigare rapporterat den första systematiska studien av en oväntad Griess-reaktion med PMQ (figur 1). I detta system kan PMQ bilda färgade azos i kombination med substituerade aniliner i närvaro av nitritjoner under sura förhållanden. Vi har ytterligare funnit att färgen på azos varierade från gult till blått när öka elektronen donera effekten av substituenten på anilines21. En UV-VIS absorption baserad kolorimetrisk metod för PMQ-kvantifiering har utvecklats genom den optimerade reaktionen mellan 4-Metoxianilin och PMQ. Denna metod har visat stor potential för känslig och selektiv detektion av PMQ i bio-relevanta vätskor. Här strävar vi efter att beskriva de detaljerade procedurerna för PMQ-bestämning utifrån denna kolorimetriska strategi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. syntes av färgade Azos

  1. Lös anilin (0,1 mmol) och primaquin fosfat (45,5 mg, 0,1 mmol) i 10 ml H3Po4 -lösning (5% v/v) i en 25 ml rund botten flaska (RBF). Sätt RBF på ett isbad, tillsätt en röra bar med rätt storlek i lösningen, och sätta RBF på en rör plattan.
    Anmärkning: För syntesen av azo 3G (figur 2), Använd 0,2 mmol av primakin bisphosphate.
  2. Lös upp NaNO2 (6,9 mg, 0,1 mmol) i 1 ml kylt vatten och tillsätt sedan i reaktionsblandningen droppvis. Ta bort isbadet, och hålla reaktionsblandningen rörs vid rumstemperatur.
  3. Övervaka reaktionen med en kiselgel belagd tunnskiktskromatografi (TLC) tallrik. Använd en blandning av diklormetan (DCM)/metanol (MeOH) (Vol/Vol = 5:1) som elueringslösning för TLC. Azofärgprodukten uppvisar färgade fläckar på TLC-plattan, vilket är lätt att urskilja med blotta ögat. Stoppa reaktionen när PMQ-fläckarna försvinner på TLC.
  4. Justera reaktionsblandningen till pH > 10 av NaOH (2 M) på ett isbad. Använd en 50 mL separationstratt för att extrahera blandningen 3 gånger med 20 mL etylacetat för varje, kombinera och koncentrera den organiska fasen under vakuum med hjälp av en roterande indunstare.
    Anmärkning: Före extraktion, justera pH-värdet av reaktions lösningar över 10. Detta kan bibehålla den primära Amin som dess icke-joniserad form, vilket underlättar extraktion.
  5. Rengör resterna med blixt kromatografi med omvänd fas kiselgel under normalt tryck, med hjälp av MeOH/H2O som Eluent. Torka produkt lösningen genom frystorkat för att ge önskade azo-produkter.
    Anmärkning: Samma reaktion kan också utföras i utspädda HCl lösningar (0,2 M).

2. UV-VIS mätningar och teoretisk beräkning

  1. Lös upp ren azo (50 μM) i destillerat vatten eller i 5% H3Po4 -lösning (pH 1,1). Spela in UV-VIS Absorptionsspektra (250-700 nm) på en spektrofotometer i rumstemperatur (25 ° c). Exportera data som. xls/. xlsx-filer för vidare analys.
  2. Utför alla teoretiska beräkningar för PMQ själv och azofärgprodukter med Gaussian 16 programmet. Använd tid beroende densitet funktionell teori (TD-DFT) med en 6-31G bas uppsättning. Inkludera lösningsmedels effekter med polariserbara Continuum modell (PCM) formalism med hjälp av vatten.
    1. Använd programvara (t. ex. ChemDraw Office) för att rita strukturerna och spara sedan strukturen som en Gaussisk indatafil (. gif).
    2. Öppna GIF-filen med Gauss-vyn och klicka på knappen Beräkna. Välj Gaussisk Beräkningsinställning, opt + FREQoch Ground State-DFT-B3LYP-6-31g; Klicka sedan på Skicka. Geometri optimering kommer att generera en. log-fil.
    3. Använd Gauss View för att öppna loggfilen enligt proceduren ovan. Klicka på Beräkna-Gaussian beräkning setup och välj energi och TD-SCF-DFT-B3LYP-6-31g-singlet bara. Sedan Skicka. Energi beräkningen kommer att generera en annan loggfil och en kubfil.
    4. Använd Gauss View för att öppna loggfilen från energi beräkningen. Klicka på resultat-UV/VIS för att se förväntad absorption.
    5. Använd Gauss View för att öppna kubfilen. Klicka på resultatoch välj yta och konturer-ytåtgärder och ny yta för att se omloppsbanorna.
  3. Jämför resultaten från både experimentell mätning och Gaussian beräkning. Beräkna procent felet mellan de beräknade och uppmätta värdena enligt följande ekvation.
                  Fel = | (WMax Cal.-wMaxexper.) /WMaxexper. | × 100%
    där WMax Cal. representerar maximal absorbans våglängd från teoretisk beräkning och wMax exper. representerar våglängden från experimentellt resultat.

3. PMQ-bestämning

  1. PMQ-mätning med en 96-well-platta (figur 5)
    1. Lös 4-Metoxianilin i 0,2 M HCl för en 200 mM anilin lösning, R1. Lös upp natriumnitrit i destillerat vatten för att få en 5 mM lösning, R2. Förvara alla lösningar i kylskåpet vid 4 ° c före användning.
    2. Tillsätt 100 μL av R1 till en 96-brunn-platta och tillsätt 50 μL PMQ-prov som innehåller provet i plattan för att blanda med R1. Tillsätt sedan 50 μL av R2 i plattan. Blanda lösningarna genom upprepad pipettering.
    3. Håll plattan i rumstemperatur i 15 minuter och registrera sedan UV-VIS-absorbans vid 504 nm. Upprepa 3x för varje test.  Azofärgprodukten är stabil med ljus exponering i rummet. Det är inte nödvändigt att hålla plattan under mörker.
    4. Exportera data som. xls/. xlsx-filer för vidare analys.
  2. Kalibreringskurva för direkt PMQ-mätning i ett urinprov
    1. Bered PMQ-lösningar med syntetisk urin med PMQ-koncentrationer vid 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200 μM, respektive.
    2. Tillsätt 100 μL av R1 till en 96-brunn-platta och tillsätt 50 μL PMQ-urinlösning för att blanda med R1. Tillsätt sedan 50 μL av R2 till ovanstående blandning. Blanda lösningarna genom upprepad pipettering. Håll plattan i rumstemperatur i 15 minuter och registrera sedan UV-VIS-absorbans vid 504 nm.
    3. Generera en kalibreringskurva baserad på absorbans i504 -och PMQ-koncentrationer. Använd värdena från brunnarna utan PMQ som en tom och subtrahera de tomma värdena från alla tester före databearbetningen.
    4. Utför en linjär passning för att generera linjära ekvationer som y = ax + b, där y är absorbans intensitet vid 504 nm, X är koncentrationen av PMQ, a är lutningen, och b är y-skärningspunkten av den linjära linjen.
  3. Kalibreringskurva för direkt PMQ-mätning i ett humanserum prov
    1. Bered PMQ-lösningar med humant serum med PMQ-koncentrationer vid 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, μM.
    2. Tillsätt 100 μL av R1 i en 96-brunn-platta och tillsätt 50 μL PMQ-serumlösning för att blanda med R1. Tillsätt 50 μL av R2 till ovanstående blandning och blanda lösningarna genom upprepad pipettering. Förvara plattan i rumstemperatur i 15 minuter och registrera sedan UV-VIS-absorbans vid 504 nm. Exportera data som. xls/. xlsx-fil för vidare analys.
    3. Generera en kalibreringskurva baserad på absorbans i504 -och PMQ-koncentrationer. Använd värdena från brunnarna utan PMQ som en tom och subtrahera de tomma värdena från alla tester före databearbetningen.
    4. Utför en linjär passning för att generera linjära ekvationer som y = ax + b, där y är absorbans intensitet vid 504 nm, X är koncentrationen av PMQ, a är lutningen, och b är y-skärningspunkten av den linjära linjen.
  4. PMQ extraktion från serum
    1. Tillsätt en viss mängd PMQ i humanserum för att simulera PMQ-innehållande serum. För PMQ-extraktion, tillsätt 6 mL blandning av etylacetat/hexan (7:1 v/v) i 2 mL PMQ-innehållande serum i ett 15 mL centrifugertub.
    2. Tillsätt 100 μL natriumhydroxidlösning (2 M) till extraktionssystemet. Skaka röret våldsamt med en Vortex mixer i 30 s. samla det organiska skiktet och koncentrera det med hjälp av en roterande indunstare under vakuum.
    3. Redissolve återstoden med 200 μL destillerat vatten och avlägsna olösliga lipidkomponenter genom filtrering genom ett diskformad membran med 220 nm porstorlek. Använd den slutliga lösningen för test.
  5. Bestäm PMQ från serumet med extraktion
    1. Följ steg 3,2 eller 3,3 för att generera kalibreringskurvan för PMQ i destillerat vatten. Extrahera PMQ från PMQ-innehållande serum enligt steg 3,4.
    2. Tillsätt 100 μL av R1 och 50 μL PMQ-lösning till en 96-brunn-platta. Tillsätt 50 μL av R2 till ovanstående blandning och blanda lösningarna genom upprepad pipettering.
    3. Håll plattan i rumstemperatur i 15 min och anteckna UV-VIS absorbans vid 504 nm. Använd brunnarna med R1 och R2 men utan PMQ som reglage. Exportera data som. xls/. xlsx-filer för vidare analys.
    4. Subtrahera kontrollvärdena från absorbansvärdena i504 för varje test och Använd sedan resultatet för koncentrations beräkningar enligt linje ekvationen från kalibreringskurvan.
      Anmärkning: Detektionsgränsen (LOD) för PMQ i samtliga fall kan beräknas enligt en standardmetod22. Beräkningen baserades på kalibreringsfunktionen: LOD = 3,3 × SD/b, där SD är standardavvikelsen för blank och b är regressionslinjens lutning

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

För att optimera reaktions förhållandena (figur 2) användes olika aniliner för att parera med PMQ genom griess reaktionen. Vi har uppnått en serie azos med olika färger. Det har visat sig att anilines med en elektron donera substituent kan orsaka en röd-förskjutning i UV-VIS absorptionsspektrum. Teoretiska beräkningar utfördes genom tidsberoende densitet funktionell teori (TD-DFT). Som framgår av figur 2Avar beräkningsresultatet i god enighet med optiska mätningar med ett genomsnittligt fel på 3,1%. 4-Metoxianilin användes sedan för att utföra PMQ-detekterings reaktionen på grund av dess goda prestanda i reaktionshastighet, produktens löslighet och stabilitet21. Dessutom är azofärden från 4-Metoxianilin röd i färg, vilket är lätt att urskilja med blotta ögat. Därför ger denna reaktion potential för blotta ögat PMQ detektion (figur 3).

Figur 4a visar pH-effekten på den UV-VIS absorptionsspektrat av azo-produkten 3D. I504 ändras inte när du ökar pH-värdet från 1,0 till 6,0. I504 under pH 7,0 uppvisar en liten minskning, medan en grundläggande ph (8,0 och 9,0) kraftigt påverkar absorptionen. Figur 4b visar pH-effekterna av PMQ-lösningar på griess-reaktionen. PMQ (50 μM) i PBS-buffert med olika pHs (4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0) blandades individuellt med testreagens enligt beskrivningen i avsnitt 3,1. I504 mättes sedan efter 15 min vid rumstemperatur. Som anges kan grundläggande pHs (8,0, 9,0) av PMQ-lösningar potentiellt påverka reaktionen. Figur 5 visar det allmänna tillvägagångssättet för att utföra griess-reaktionen för PMQ-detektering. Enligt beskrivningen i avsnittet protokoll krävs fyra steg för att erhålla Absorptionsdata i504 för analys. I figur 6a och 6b visas kalibreringskurvor för direkt detektion av PMQ från urin-respektive serumprover, utan provförbehandling. Ett utmärkt linjärt förhållande (R2 = 0,998) hittades när PMQ i syntetisk urin varierar från 0 till 200 μm. I serumprovet påträffades ett linjärt samband mellan 10 och 200 μM.

Figur 7a visar proceduren för att extrahera PMQ från serum. Resterna var löses i destillerat vatten efter extraktion och koncentration, och sedan filtrerat. För att simulera ett verkligt PMQ-innehållande serum, sattes PMQ in i humanserum med slutliga koncentrationer vid 0, 0,2, 0,5, 1,0, 2,0 μM. Med hjälp av steg 3,4 och 3,5 konstaterades halterna av PMQ i serum vara 0,02, 0,14, 0,44, 0,90 respektive 1,78 μM (figur 7C). Baserat på resultatet visade sig andelen PMQ-återhämtning vara runt 90% när PMQ var över 0,5 μM i serum, vilket var jämförbart med tidigare rapporter9.

Figure 1
Figur 1: Schematisk av griess REAKTIONEN på PMQ. a) enklassisk griess-reaktion för nitritanalys. B) griess-reaktionen i den föreslagna PMQ-detekterings metoden. Denna siffra har modifierats med tillstånd från tidigare arbete21. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: foto fysikaliska egenskaper hos syntetiska azos. AUV-VIS-mätning och teoretisk beräkning av den maximala absorptionen av azos som genereras från olika aniliner. Numrerar utanför parenteserna föreställer för maximat absorbansmätningen i destillerat H2nolla nära neutralt pH villkorar; siffrorna i hakparenteserna avser mätningen i 5% H3Po4 lösning (pH ≈ 1,1). λABS/nm exper. representerar experimentdata och λABS/calc. representerar de teoretiska beräkningsdata. EEXC är magnetiseringen energi (EV), och f är oscillator styrka. Bfoto bilder av PMQ och azolprodukter med olika substituenter, 50 μm i 5% fosforsyra lösning. C) syntetiska produkters UV-VIS-spektra. Värdena normaliserades till ett intervall mellan 0 och 1. Denna siffra har modifierats med tillstånd från tidigare arbete21. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: kolorimetrisk bestämning av PMQ. A) övervakningav absorbansförändringarna vid maximalt504 i ett tidsberoende sätt. Reaktionen utfördes med 4-Metoxianilin, och PMQ användes vid 100 μM; B) färgförändringar av reaktionen med olika koncentrationer av PMQ: 400 μl av 4-Metoxianilin-lösningen (200 mM i 0,2 M HCL) och 200 μl natriumnitrit i vatten (5 mm), med 200 μl PMQ-lösning av olika koncentrationer (0, 1, 2,5 , 10, 20, 50, 100 μM). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: pH-effekt på PMQ-detektering. ApH-effekter på den UV-VIS-absorbans av azofärgprodukten 3D 50 μm, (B) pmq (50 μm) i PBS-buffert med olika pHs (4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0) användes för att utföra reaktionen enligt beskrivningen i steg 3,1. Femton minuter senare mättes absorbansen vid 504 nm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: PMQ-bestämning genom en griess-reaktion på ett 96-och plattbaserat system. R1 hänvisar till 200 mM 4-Metoxianilin lösning i 0,2 M HCl; R2 avser 5 mM natriumnitrit i destillerat vatten. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: KALIBRERINGSKURVOR för PMQ-bestämning från (a) syntetisk urin och (B) humana serumprover. Koncentrationen av PMQ varierar mellan 0-200 μM. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: PMQ-bestämning från serumprover. a) Schematisk illustration av PMQ-extraktion från serumprover för kvantitativ analys. B) det linjära förhållandet mellan i504 och PMQ-koncentrationen inom området från 0 till 100 μm. (C) PMQ i serum kvantifierades med den griess-reaktionsbaserade metoden i jämförelse med det exakta beloppet som sattes in i serumet. Denna siffra har modifierats med tillstånd från tidigare arbete21. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Table 1
Tabell 1. Teoretisk beräkning av log D och procentandelen vattendistribution av PMQ och CPMQ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vi beskrev en kolorimetrisk metod för bekväm PMQ-kvantifiering. Det är potentiellt den mest enkla och kostnadseffektiva nuvarande metoden. Ännu viktigare, denna metod erbjuder möjliggör naken-Eye baserat PMQ mätning utan att använda någon utrustning.

Den optimerade Griess-reaktionen för PMQ-detektering kan generera en röd färg azo med en maximal absorption vid 504 nm. Den potentiella påverkan från UV-VIS absorption av endogena biomolekyler är begränsad, vilket gör metoden lovande för direkt mätning av PMQ i biologiska vätskor. Som framgår av resultatet hittades ett utmärkt linjärt förhållande (R2 = 0,998) för urin-PMQ-detektion över koncentrationsintervallet på 0-200 ΜM (figur 6a). Detektionsgränsen (LOD) för PMQ konstaterades vara 0,63 μM. Denna metod har också visat stora potentialer för direkt mätning av PMQ i humanserum. En utmärkt linjär relation påträffades i koncentrationen mellan 10 och 200 μM för PMQ-detektion i serum (figur 6b). Vi kan ytterligare förbättra känsligheten genom att förbehandla serumprovet genom extraktion och koncentration. Som figur 7 visar med en enkel extraktionsprocess, kan denna metod kvantifiera serum PMQ vid kliniskt relevanta intervall. Baserat på reaktionsmekanismen kan den huvudsakliga karboxylmetaboliten av PMQ (CPMQ) potentiellt bilda en azo-produkt med liknande UV-VIS-egenskaper. Men vätska-vätskeextraktion under grundläggande pH-förhållanden kan potentiellt minimera interferensen från CPMQ. Tabell 1 Visar beräknad logg D och vatten fördelning för både PMQ och cpmq. Som visad, vid pH > 10, mindre än 6,33% av PMQ kommer att hittas i vattenfasen, medan över 98,54% av CPMQ kommer att vara i vattenfasen. Därför, teoretiskt, mer än 93,7% av PMQ och mindre än 1,56% av CPMQ kunde extraheras ut för test. Man kan dra slutsatsen att störningen från huvudmetaboliten CPMQ är begränsad.

Proceduren för PMQ-detektering är mycket lätt att hantera. Med 96-brunn plattan-baserat system som ett exempel, hela proceduren består av fyra steg: 1) lägga till 100 μL av 4-Metoxianilin lösning (200 mM i 0,2 M HCl) R1 till en 96-bra tallrik; 2) tillsats av 50 μL PMQ-koncentration-okänt prov för blandning med R1; 3) tillsats av 50 μL R2 (5 mM natriumnitritlösning) för att utföra reaktionen vid rumstemperatur. och 4) inspelning av UV-VIS absorption vid 504 nm med hjälp av en spektrometer. Koncentrationen av PMQ från ett okänt prov kan beräknas baserat på absorptionsintensiteten i504 och den linjära ekvationen från kalibreringskurvan. Hela proceduren utförs vid rumstemperatur utan behov av inkubering. En mörk miljö är inte nödvändigt för hela proceduren, eftersom den färgade produkten inte är känslig för rums ljus.

Det bör noteras att tiden för reaktions lösningen att nå sin mättade I504 är temperaturberoende. Som framgår av figur 3krävdes minst 12 minuter vid rumstemperatur (25 ° c). Reaktionstiden skulle vara längre om reaktionen utförs vid temperaturer under 25 ° c. Det grundläggande pH-villkoret för PMQ-lösningar kan potentiellt påverka absorbansen i504. Åtgärda problemet genom att justera pH-värdet för PMQ-lösning till mindre än 7,0. Annars behövs en ny kalibreringskurva för lösningen med pH över 7,0. Dessutom kan inneboende nitriter i de testade proverna påverka detekteringen. Detta kan dock endast inträffa när koncentrationen av inneboende nitriter är extremt hög eftersom en hög koncentration av nitrit (5 mM) användes i ett standardtest.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att deklarera.

Acknowledgments

Författarna erkänner start bidrag från Guangzhou University of kinesisk medicin och ungdom vetenskaplig forskning utbildning projekt av GZUCM (2019QNPY06). Vi erkänner också Lingnan Medical Research Center i Guangzhou University of kinesisk medicin för stöd på anläggningar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-Methoxyaniline Aladdin K1709027
2,4-Dimethoxyaniline Heowns 10154207
3,4-Dimethoxyaniline Bidepharm BD21914
4-Methylaniline Adamas-beta P1414526
4-Nitroaniline Macklin C10191447
96-wells,Flat Botton Labserv 310109008
Gaussian@16 software Gaussian, Inc Version:x86-64 SSE4_2-enabled/Linux
Hydrochloric acid GCRF 20180902
Marvin sketch (software) CHEMAXON free edition: 15.6.29
Phosphoric acid Macklin C10112815
Primaquine bisiphosphate 3A Chemicals CEBK200054
Sodium nitrite Alfa Aesar 5006K18R
Sulfonamides TCI(shanghai) GCPLO-BP
Varioskan LUX Plate reader Thermo Fisher Supplied with SkanIt Software 4.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fernando, D., Rodrigo, C., Rajapakse, S. Primaquine in vivax malaria: an update and review on management issues. Malar Journal. 10, 351 (2011).
  2. Deng, C., et al. Large-scale Artemisinin-Piperaquine Mass Drug Administration With or Without Primaquine Dramatically Reduces Malaria in a Highly Endemic Region of Africa. Clinical Infectious Diseases. 67, (11), 1670-1676 (2018).
  3. Pavic, K., et al. Primaquine hybrids as promising antimycobacterial and antimalarial agents. European Journal of Medical Chemistry. 143, 769-779 (2018).
  4. McQueen, A., et al. Synthesis, characterization, and cellular localization of a fluorescent probe of the antimalarial 8-aminoquinoline primaquine. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 27, (20), 4597-4600 (2017).
  5. Ashley, E. A., Recht, J., White, N. J. Primaquine: the risks and the benefits. Malaria Journal. 13, (1), 418 (2014).
  6. Watson, J., Taylor, W. R., Menard, D., Kheng, S., White, N. J. Modelling primaquine-induced haemolysis in G6PD deficiency. Elife. 6, (2017).
  7. Beutler, E. Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency: a historical perspective. Blood. 111, (1), 16-24 (2008).
  8. Endoh, Y. S., et al. High-performance liquid chromatographic determination of pamaquine, primaquine and carboxy primaquine in calf plasma using electrochemical detection. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 579, (1), 123-129 (1992).
  9. Dua, V. K., Kar, P. K., Sarin, R., Sharma, V. P. High-performance liquid chromatographic determination of primaquine and carboxyprimaquine concentrations in plasma and blood cells in Plasmodium vivax malaria cases following chronic dosage with primaquine. Journal of Chromatography B: Biomedical Applications. 675, (1), 93-98 (1996).
  10. Miranda, T. A., Silva, P. H. R., Pianetti, G. A., César, I. C. Simultaneous quantitation of chloroquine and primaquine by UPLC-DAD and comparison with a HPLC-DAD method. Malaria Journal. 14, 29 (2015).
  11. Tatsuno, M., Nishikawa, M., Katagi, M., Tsuchihashi, H. Simultaneous determination of illicit drugs in human urine by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Analytical Toxicology. 20, (5), 281-286 (1996).
  12. Erni, F. Use of high-performance liquid chromatography in the pharmaceutical industry. Journal of Chromatography A. 507, 141-149 (1990).
  13. Tsikas, D. Analysis of nitrite and nitrate in biological fluids by assays based on the Griess reaction: Appraisal of the Griess reaction in the l-arginine/nitric oxide area of research. Journal of Chromatography B. 851, (1), 51-70 (2007).
  14. Zurcher, D. M., Adhia, Y. J., Romero, J. D., McNeil, A. J. Modifying a known gelator scaffold for nitrite detection. Chemical Communications. 50, (58), 7813-7816 (2014).
  15. Kunduru, K. R., Basu, A., Tsah, T., Domb, A. J. Polymer with pendant diazo-coupling functionality for colorimetric detection of nitrates. Sensors and Actuators B: Chemical. 251, 21-26 (2017).
  16. Li, D., Ma, Y., Duan, H., Deng, W., Li, D. Griess reaction-based paper strip for colorimetric/fluorescent/SERS triple sensing of nitrite. Biosensors and Bioelectronics. 99, 389-398 (2018).
  17. Deng, T., et al. A novel strategy for colorimetric detection of hydroxyl radicals based on a modified Griess test. Talanta. 195, 152-157 (2019).
  18. Pang, H., et al. A photo-responsive macroscopic switch constructed using a chiral azo-calix[4]arene functionalized silicon surface. Chemical Communications (Camb). 54, (24), 2978-2981 (2018).
  19. Kaur, N., Dhaka, G., Singh, J. Simple naked-eye ratiometric and colorimetric receptor for anions based on azo dye featuring with benzimidazole unit. Tetrahedron Letters. 56, (9), 1162-1165 (2015).
  20. Liu, F., Lou, J., Hristov, D. X-Ray responsive nanoparticles with triggered release of nitrite, a precursor of reactive nitrogen species, for enhanced cancer radiosensitization. Nanoscale. 9, (38), 14627-14634 (2017).
  21. Deng, T., et al. An unexpected Griess reaction on the important anti-malarial drug primaquine and its application for drug determination. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 171, 8-14 (2019).
  22. Shrivastava, A., Gupta, V. Methods for the determination of limit of detection and limit of quantitation of the analytical methods. Chronicles of Young Scientists. 2, (1), 21-25 (2011).
Optimerad Griess reaktion för UV-VIS och naken-öga bestämning av anti-malarial Primaquine
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, Y., Wu, S., Huang, X. a., Zeng, Q., Deng, T., Liu, F. Optimized Griess Reaction for UV-Vis and Naked-eye Determination of Anti-malarial Primaquine. J. Vis. Exp. (152), e60136, doi:10.3791/60136 (2019).More

Wu, Y., Wu, S., Huang, X. a., Zeng, Q., Deng, T., Liu, F. Optimized Griess Reaction for UV-Vis and Naked-eye Determination of Anti-malarial Primaquine. J. Vis. Exp. (152), e60136, doi:10.3791/60136 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter